KR20000047833A - 코리네포름 박테리아를 이용한 ｄ-판토텐산의 발효적 제조방법 - Google Patents

코리네포름 박테리아를 이용한 ｄ-판토텐산의 발효적 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 코리네박테륨(Corynebacterium)으로부터 유도되고 다음 그룹:
a) 서열 1로 나타낸, panB 유전자(케토판토에이트 하이드록시메틸트랜스퍼라제)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열,
b) 서열 1로 나타낸, panC 유전자(판토테네이트 신테타제), 특히 panBC 오페론을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 임의로
c) 서열 4로 나타낸, ilvD 유전자(디하이드록시산 데하이드라타제)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 중에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 함유하는, 코리네박테륨 속 미생물내에서 복제가능한 임의의 재조합 DNA; 및 언급된 유전자를 증강시키는 코리네박테륨 속 미생물을 이용하여 D-판토텐산을 발효적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

코리네포름 박테리아를 이용한 Ｄ-판토텐산의 발효적 제조 방법{Process for the fermentative production of D-pantothenic acid using coryneform bacteria}
판토텐산은 화장품, 의약, 사람 영양물 및 동물 영양물에 응용되고 있는 상업적으로 중요한 비타민을 구성하고 있다.
판토텐산은 화학적으로 합성하여 제조하거나, 적합한 영양 용액에서 적합한 미생물을 발효시킴으로써 생물공학적으로 제조할 수 있다. 미생물을 이용한 생물공학적 제조 방법의 이점은 목적하는 입체-이성체성 D-형태의 판토텐산이 형성된다는 것이다.
각종 유형의 박테리아, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 코리네박테륨 에리트로게네스(Corynebacterium erythrogenes), 브레비박테륨 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes) 및 효모, 예를 들면, 데바로마이세스 카스텔리이(Debaromyces castellii)가 EP-A 0 493 060에 제시된 바와 같이, 글루코즈, DL-판토산 및 β-알라닌을 함유하는 영양 용액에서 D-판토텐산을 생성시킨다. 또한, EP-A 0 493 060에는 에스케리키아 콜라이의 경우에는, 플라스미드 pFV3 및 pFV5를 이용하여 판토텐산 생합성용 유전자를 증폭시킴으로써 D-판토텐산의 형성을 증진시킨다고 제시되어 있다.
EP-A 0 590 857은 각종 항대사물, 예를 들면, 살리실산, α-케토부티르산, β-하이드록시아스파르트산 등에 대한 내성을 지니고 있고 글루코즈와 β-알라닌을 함유하는 영양 용액에서 D-판토산과 D-판토텐산을 생성시키는 에스케리키아 콜라이의 균주에 관한 것이다. 또한, EP-A 0 590 857에는, 이. 콜라이(E. coli)에서의 D-판토산과 D-판토텐산의 생성이 판토텐산을 생합성시키기 위한 이. 콜라이로부터의 유전자(이는 더 이상 상세히 정의되지 않으며 플라스미드 pFV32 상에 포함되어 있음)를 증폭시킴으로써 증진될 수 있다고 기재되어 있다.
또한, WO 97/10340에는, 판토텐산을 형성하는 에스케리키아 콜라이의 돌연변이체에서는, 발린 생합성 효소인 효소 아세토하이드록시산 신타제 Ⅱ의 활성을 증진시킴으로써 판토텐산의 생성을 추가로 증가시킬 수 있다고 기재되어 있다.
본 발명의 목적은 코리네포름 박테리아의 보조하에 D-판토텐산을 발효적으로 제조하기 위한 개선된 방법에 대한 새로운 기본 원리를 이용가능하게 만드는 것이다.
도 1은 pUR1의 제한 지도화 및 서열화된 단편의 위치를 도시한 것이다.
도 2는 플라스미드 pEKEx2panBC의 제한 지도이다.
도 3은 플라스미드 pECM3ilvBNCD의 제한 지도이다.
비타민 판토텐산은 화장품, 의약, 사람 영양물 및 동물 영양물에 응용되고 있는 상업적으로 중요한 생성물을 구성하고 있다. 따라서, 일반적인 관심은 판토텐산의 제조에 이용할 수 있는 개선된 방법을 개발하는데 있다. 다음 본문에서 D-판토텐산이나 판토텐산 또는 판토테네이트 중의 어떠한 것이 언급되든지 간에, 이들은 유리 산 뿐만 아니라 D-판토텐산의 염, 예를 들면, 칼슘, 나트륨, 암모늄 또는 칼륨 염을 의미한다.
본 발명은 코리네박테륨으로부터 유도되고 다음 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열 중의 한 가지 이상을 함유하는, 코리네박테륨 속 미생물내에서 복제가능한 임의의 재조합 DNA를 제공한다:
a) 서열 1로 나타낸, panB 유전자(케토판토에이트 하이드록시메틸트랜스퍼라제)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열,
b) 서열 1로 나타낸, panC 유전자(판토테네이트 신테타제), 특히 panBC 오페론을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 임의로
c) 서열 4로 나타낸, ilvD 유전자(디하이드록시산 데하이드라타제)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열.
본 발명은,
(ⅰ) 서열 1 및 서열 4에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는
(ⅱ) 유전적 암호의 변성 범위내에서 각각의 서열 (ⅰ)에 상응하는 서열들 중의 하나 이상의 서열, 또는
(ⅲ) 각각의 서열 (ⅰ) 또는 (ⅱ)에 상보적인 서열과 하이브리드화되는 서열들 중의 하나 이상의 서열, 및 임의로
(ⅳ) (ⅰ)에서 작용적 중성 센스 돌연변이를 포함하는, 청구항 1에 따라서 유사하게 복제가능한 DNA를 제공한다.
또한, 복제가능한 하나 이상의 DNA 단편을 도입함으로써 형질전환시킨 코리네포름 미생물, 특히 코리네박테륨 속 미생물이 청구되어 있다. 본 발명은 또한, 유전자 panB 및 panC를 개별적으로 또는 서로 조합하여, 임의로 ilvA 유전자에서 결함있는 돌연변이와 조합하거나 유전자 ilvBN, ilvC 또는 ilvD의 증강과 조합하여 증강, 특히 과발현시키는, 이미 D-판토텐산을 생성시키는 코리네포름 박테리아를 사용하여 D-판토텐산을 제조하는 방법을 제공한다.
본문에서의 용어 "증강"은 예를 들면, 강력한 프로모터를 사용하거나 고활성을 지닌 상응하는 효소를 암호화하는 유전자를 사용하여 유전자(들)의 복사수를 증가시킴으로써 및 임의로 이러한 조처들을 조합시킴으로써, 상응하는 DNA에 의해 암호화되는 미생물내에서의 하나 이상의 효소의 세포내 활성 증가를 지칭한다.
본 발명의 대상인 미생물은 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 프럭토즈, 말토즈, 당밀, 전분, 셀룰로즈, 또는 글리세린 및 에탄올, 특히 글루코즈 또는 슈크로즈로부터 판토텐산을 생성시킬 수 있다. 이는 코리네박테륨 또는 아르트로박터(Arthrobacter) 속의 코리네포름 박테리아의 문제이다. 코리네박테륨 속의 경우에는, 특히 아미노산 형성 능력이 가장 뛰어난 것으로 공지된 코리네박테륨 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 종이 언급되어야 한다. 이러한 종에는 야생형 균주, 예를 들면, 코리네박테륨 글루타미쿰 ATCC13032, 브레비박테륨 플라븀(Brevibacterium flavum) ATCC14067, 코리네박테륨 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola) ATCC17965 및 이들로부터 유도된 균주가 포함된다.
본 발명자들은 효소 케토판토에이트 하이드록시메틸트랜스퍼라제 및 판토테네이트 신테타제를 암호화하는, 코리네박테륨 글루타미쿰으로부터 개별적으로 또는 연합하여(panBC 오페론) 새로이 분리된 D-판토테네이트 생합성용 유전자 panB 및 panC를 증강, 특히 과발현시킨 후에 D-판토테네이트를 개선된 방식으로 생성시킬 수 있다는 사실을 밝혀내었다.
본 발명자들은 효소 디하이드록시산 데하이드라타제를 암호화하는, 코리네박테륨 글루타미쿰으로부터의 신규의 발린-생합성 유전자 ilvD의 발현을 증강시키는 것이 D-판토테네이트의 형성을 증가시키는데 도움을 준다는 사실을 추가로 관찰하였다. 본 발명에 따르면, 이러한 유전자 이외에, 효소 아세토하이드록시산 신타제를 암호화하는 ilvBN 유전자와 효소 이소머로리덕타제를 암호화하는 ilvC 유전자의 발현을 증가시키는 것이 또한, 코리네박테륨 글루타미쿰에서 D-판토테네이트의 형성을 증가시킬 수 있다.
증강(과발현)을 달성하기 위하여, 예를 들면, 상응하는 유전자의 복사수를 증가시키거나, 또는 구조 유전자의 상단에 위치한 프로모터 및 조절 영역을 돌연변이시킨다. 구조 유전자의 상단에 혼입된 발현 카셋트가 유사한 방식으로 작용한다. 유도성 프로모터를 이용하여, D-판토테네이트의 발효적 형성 과정 동안에 상기 발현을 증강시키는 것 또한 가능하다. mRNA의 수명을 연장시키기 위한 조처를 통하여, 상기 발현을 또한 증진시킨다. 더욱이, 효소 단백질의 분해를 방지함으로써, 효소 활성을 또한 증강시킨다. 유전자(들) 작제물이 이러한 경우에 상이한 복사수의 플라스미드 벡터내에 존재하거나 염색체에 통합되어 증폭된다. 또한, 당해 유전자를 과발현시키는 것은 배지의 조성을 변화시키고 배양이 조절되는 방식을 변화시킴으로써 획득할 수 있다. 이에 대한 지시 사항은 당해 분야의 숙련인에 의해, 특히 다음 문헌에서 발견할 수 있다[참조: Martin et al., Bio/Technology 5, 137-146(1987); Guerrero et al., Gene 138, 35-41(1994); Tsuchiya and Morinaga, Bio/Technology 6, 428-430(1988); Eikmanns et al., Gene 102, 93-98(1991); 유럽 특허 명세서 EP 0 472 869; 미국 특허 제4,601,983호; Schwarzer 및 Puhler, Bio/Technology 9, 84-87(1991); Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132(1994); LaBarre et al., Journal of Bacteriology 175, 1001-1007(1993); 국제 특허원 WO 96/15246; Jensen 및 Hammer, Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195(1998); "Manual of Methods for General Bacteriology"(American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981 발간); 및 유전학 및 분자 생물학에 관한 공지된 교과서].
씨. 글루타미쿰(C. glutamicum)으로부터 유전자 panB 및 panC를 분리하기 위하여, 먼저 이러한 유전자의 이. 콜라이에서의 유전자 뱅크를 정립한다. 이러한 유전자 뱅크의 정립은 일반적으로 공지된 교과서와 매뉴얼에 기록되어 있다. 예로써, 교과서[참조: Winnacker, Gene und Klone, Eine Einfuhrung in die Gentechnologie(Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990] 또는 매뉴얼[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Labratory Press, 1989]을 언급할 수 있다. 공지된 유전자 뱅크는 코하라(Kohara) 등[참조: Cell 50, 495-508(1987)]에 의해 λ-벡터에서 설정된 이. 콜라이 K-12 균주 W3110의 것이다. 문헌[참조: Bathe et al., Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996]에는 이. 콜라이 K-12 균주 NM554[참조: Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575]에서 코스미드 벡터 SuperCos Ⅰ[참조: Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164]의 보조하에 제조된 씨. 글루타미쿰 ATCC13032의 유전자 뱅크가 기재되어 있다. 이. 콜라이에서 씨. 글루타미쿰의 유전자 뱅크를 생성시키기 위하여, pBR322[참조: Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818(1979)] 또는 pUC19[참조: Norrander et al., 1983, Gene, 26:101-106] 등을 사용할 수 있다. 숙주로서 특히 적합한 것은 제한-결함성이고 재조합-결함성인 이. 콜라이 균주이다. 이들의 한 예가 문헌[참조: Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87(1990) 4645-4649]에 기재된 균주 DH5αmcr이다.
유전자 뱅크를 형질전환[참조: Hanahan, Journal of Molecular Biology 166, 557-580, 1983] 또는 전기천공[참조: Tauch et al., 1994, FEMS Microbiological Letters, 123:343-347]에 의해 인디케이터(indicator) 균주내로 연속적으로 혼입시킨다. 이러한 인디케이터 균주는 이것이 탐지가능한 표현형, 예를 들면, 생장요구성을 야기시키는, 관심있는 유전자에서 돌연변이를 지닌다는 사실로써 구별된다. 이러한 인디케이터 균주 또는 돌연변이체는 공개된 공급원 또는 스톡 콜렉션으로부터 수득할 수 있거나 임의로 생성된 그 자체일 수 있다. 본 발명의 범주내에서, panC 유전자에 돌연변이를 보유하는 이. 콜라이 돌연변이체 DV39[참조: Vallari 및 Rock, Journal of Bacteriology 1985, 164:136-142]가 특히 관심있다. 판토텐산을 요구하는 이. 콜라이 돌연변이체의 또 다른 예는 panB 유전자에 돌연변이를 보유하고 예일 대학교의 유전자 스톡 센터(Genetic Stock Center; New Haven, Connecticut, USA)로부터 구입할 수 있는 균주 SJ2이다. 또 다른 예는 디하이드록시산 데하이드라타제를 암호화하는 ilvD 유전자에 결함이 있는, 본 발명의 범주내에서 분리된 씨. 글루타미쿰 돌연변이체 R127/7이다. 인디케이터 균주, 예를 들면, panB 돌연변이체 SJ2를 관심있는 유전자, 예를 들면, panB 유전자를 보유하는 재조합 플라스미드로 형질전환시키고 이러한 문제의 유전자를 발현시킨 후, 인디케이터 유전자는 상응하는 특성, 예를 들면, 판토텐산에 대한 요구성에 대하여 프로토트로피성(prototrophic)이 된다.
이러한 방식으로 분리한 유전자 또는 DNA 단편은, 예를 들면, 문헌[참조: Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA, 74:5463-5467, 1977]에 기재된 바와 같이 서열을 결정함으로써 특성화시킬 수 있다.
이러한 방식으로, 유전자 panB 및 panC를 암호화하는 씨. 글루타미쿰의 신규한 DNA 서열을 본 발명의 구성 요소인 서열 1로서 수득한다. 더욱이, 상응하는 효소의 아미노산 서열은 상기 언급된 방법을 사용하여 본 발명의 DNA 서열로부터 유도한다. 서열 2에는, panB 유전자 생성물, 즉 케토판테에이트 하이드록시메틸트랜스퍼라제의 아미노산 서열이 제시되어 있고, 서열 3에는, panC 유전자 생성물, 즉 판토테네이트 신테타제의 아미노산 서열이 제시되어 있다. 더욱이, 이러한 방식으로, ilvD 유전자를 암호화하는 씨. 글루타미쿰의 신규한 DNA 서열을 본 발명의 구성 요소인 서열 4로서 수득한다. 서열 5에는, ilvD 유전자 생성물, 즉 디하이드록시산 데하이드라타제의 아미노산 서열이 제시되어 있다.
변성된 유전적 암호를 통하여 서열 1 및/또는 서열 4로부터 발생된 DNA 서열을 암호화하는 것 역시 본 발명의 한 구성 요소이다. 마찬가지 방식으로, 서열 1 및/또는 서열 4와 하이브리드화하는 DNA 서열도 본 발명의 한 구성 요소이다. 또한, 숙련가에게 보존적 아미노산 교환, 예를 들면, 단백질의 활성, 즉 작용적으로 중성인 기본 활성 변화는 야기시키지 않는 "센스 돌연변이"로서 단백질내의 글리신을 알라닌으로 교환하거나 아스파르트산을 글루탐산으로 교환이 공지되어 있다. 더욱이, 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 대한 변화는 이의 기능을 실질적으로 손상시키지 않거나 심지어 이를 안정화시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다. 이에 관한 상세한 설명은 당해 분야의 숙련인에 의해, 특히 문헌[참조: Ben-Bassat et al., Journal of Bacteriology 169:751-757(1987); O'Regan et al., Gene 77:237-251(1989); Sahin-Toth et al., Protein Sciences 3:240-247(1994); Hochuli et al., Bio/Technology 6:1321-1325(1988); 및 유전학 및 분자 생물학에 관한 공지된 교과서]에서 발견될 수 있다. 상응하는 방식으로 서열 2, 서열 3 및/또는 서열 5로부터 발생된 아미노산 서열 역시 본 발명의 한 구성 요소이다.
이러한 방식으로 특성화된 유전자는 적합한 미생물내에서 개별적으로 또는 다른 것과 조합하여 연속적으로 발현시킬 수 있다. 유전자를 발현 또는 과발현시키는 것으로 공지된 방법은 이러한 유전자를, 발현 시그날이 부여될 수 있는 플라스미드 벡터의 보조하에 증폭시키는 것을 포함한다. 플라스미드 벡터를 통하여, 상응하는 미생물내에서 복제가능한 것들을 우선적으로 고려한다. 코리네박테륨 글루타미쿰의 경우에는, 예를 들면, 벡터 pEKEx1[참조: Eikmanns et al., Gene 102:93-98(1991)], pZ8-1[참조: 유럽 특허 명세서 제0 375 889호], pEKEx2[참조: Eikmanns et al., Microbiology 140:1817-1828(1994)] 또는 pECM2[참조: Jager et al., Journal of Bacteriology 174(16):5462-5465(1992)]이 고려된다. 이러한 유형의 플라스미드의 예는 균주 DH5αmcr/pEKEx2panBC 및 DH5αmcr/pECM3ilvBNCD내에 포함된 pEKEx2panBC 및 pECM3ilvBNCD이다. 플라스미드 pEKEx2panBC는 유전자 panB 및 panC를 보유하는 이. 콜라이/씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터이다. 플라스미드 pECM3ilvBNCD는 ilvD 유전자 이외에도 유전자 ilvBN 및 ilvC를 보유하는 이. 콜라이/씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터이다.
본 발명자들은 유전자 panB 및 panC를 개별적으로, 연결하여 또는 유전자 ilvBN, ilvC 및 ilvD와 조합하여 증강시키는 것이 아미노산 트레오닌 및 이소로이신의 합성 저하를 나타내는 미생물에 유리한 효과를 지닐 수 있다는 사실을 추가로 밝혀내었다. 이러한 합성 저하는 상응하는 생합성 효소 또는 이의 활성을 약화시키거나 제거시킴으로써 획득할 수 있다. 이를 위하여, 예를 들면, 효소 호모세린 데하이드로게나제, 호모세린 키나제, 트레오닌 신타제 또는 심지어 트레오닌 데하이드라타제를 고려할 수 있다. 효소 및 이의 활성을 약화시키거나 제거시키는 한 가지 가능한 방법은 돌연변이 과정이다.
이러한 과정에는 돌연변이시키기 위하여 화학 시약, 예를 들면, N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아니딘을 사용하거나, 또는 UV 조사하는 비-지시적 과정이 포함되는데, L-트레오닌 또는 L-이소로이신에 대한 요구성에 바람직한 미생물에 대한 조사가 지속적으로 이루어지고 있다. 돌연변이를 유발시키기 위한 과정 및 돌연변이체를 조사하는 과정은 일반적으로 공지되어 있고 특히 다음 문헌[참조: Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992) 또는 "Manual of Methods for General Bacteriology" published by the American Society for Bacteriology(Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아볼 수 있다.
추가로, 이들 과정에는 또한, 지시적 재조합 DNA 기술이 포함된다. 이들 방법의 도움으로, 예를 들면, 트레오닌 데하이드라타제 ilvA를 암호화하는 유전자를 염색체에서 결실시킬 수 있다. 이에 적합한 방법은 문헌[참조: Schafer et al., Gene(1994) 145:69-73; 또는 Link et al., Journal of Bacteriology (1998) 179:6228-6237]에 기재되어 있다. 또한, 유전자의 일부만이 결실될 수 있거나, 트레오닌-데하이드라타제의 돌연변이된 단편이 교환될 수 있다. 결실이나 교환 결과, 이러한 방식으로 트레오닌-데하이드라타제 활성이 상실되거나 저하된다[참조: Mockel et al., (1994) Molecular Microbiology 13:833-842; Morbach et al., (1996) Applied Microbiology and Biotechnology 45:612-620]. 이러한 유형의 돌연변이체의 한 예는 ilvA 유전자에서의 결실을 보유하는 씨. 글루타미쿰 균주 ATCC13032△ilvA이다.
본 발명에 따라서 생성되는 미생물은 판토텐산을 제조하기 위하여 연속적으로 배양하거나, 배치 공정, 공급-배치 공정 또는 반복된 공급-배치 공정으로 불연속적으로 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법에 관한 요약이 다음 교과서[참조: Chmiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991); 또는 Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)]에 기재되어 있다.
사용될 배양 배지는 적합한 방식으로 각각의 미생물의 요구 사항을 충족시켜야 한다. 각종 미생물에 대한 배양 배지에 관한 기재가 매뉴얼["Manual of Methods for General Bacteriology" published by the American Society for Bacteriology(Washington D.C., USA, 1981)]에 제시되어 있다. 탄소 공급원으로써, 당 및 탄수화물, 예를 들면, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 프럭토즈, 말토즈, 당밀, 전분 및 셀룰로즈; 오일 및 지방, 예를 들면, 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛 지방; 지방산, 예를 들면, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산; 알콜, 예를 들면, 글리세린 및 에탄올; 및 유기산, 예를 들면, 아세트산을 사용할 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 사용하거나 혼합물 형태로 사용할 수 있다. 질소 공급원으로써, 유기 질소 함유 화합물, 예를 들면, 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침출액, 콩가루 및 우레아; 또는 무기 화합물, 예를 들면, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄을 사용할 수 있다. 이러한 질소 공급원은 개별적으로 사용하거나 혼합물 형태로 사용할 수 있다. 인 공급원으로써, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 사용할 수 있다. 배양 배지는 성장에 필요한 금속 염, 예를 들면, 황산마그네슘 또는 황산철을 추가로 함유해야만 한다. 최종적으로, 상기 언급된 물질 이외에, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장-조절 물질을 이용할 수 있다. 더욱이, 판토텐산의 생성을 증가시키기 위하여, 판토텐산의 전구체, 예를 들면, 아스파르테이트, β-알라닌; 케토-이소발레레이트, 케토판토에이트, 판토에이트 및 임의로 이들의 염을 배양 배지내로 혼합할 수 있다. 언급된 공급 물질을 단일 충전물의 형태로 배양물에 가할 수 있거나 적합한 방식으로 배양 동안에 공급할 수 있다.
배양물의 pH를 조절하기 위하여, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 등의 염기성 화합물, 또는 인산 또는 황산 등의 산성 화합물을 적합한 방식으로 이용할 수 있다. 포말 형성을 제어하기 위하여, 소포제, 예를 들면, 지방산 폴리글리콜 에스테르를 이용할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위하여, 선택적으로 작용하는 적합한 물질, 예를 들면, 항생제를 배지에 가할 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위하여, 산소 또는 산소 함유 기체 혼합물, 예를 들면, 공기를 배양물내에 충전시킨다. 배양물의 온도는 통상적으로 약 20 내지 50℃, 바람직하게는 약 25 내지 45℃이다. 최대량의 판토텐산이 형성되는 시간까지 배양을 지속한다. 10시간 내지 160시간내에 본 목적물이 통상 획득된다.
형성된 판토텐산의 농도는 공지된 과정[참조: Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560(1992)]에 따라서 측정할 수 있다. 판토텐산을 미생물학적으로 측정하기 위하여, 균주 락토바실러스 플랜타룸(Lactoabcillus plantarum) ATCC8014를 통상 이용한다[참조: U.S. Pharmacopeia 1980; AOAC International 1980]. 추가로, 판토테네이트 농도를 미생물학적으로 측정하기 위하여, 기타 시험용 유기체, 예를 들면, 페디오코쿠스 아시디락티시(Pediococcus acidilactici) NCIB6990를 또한 이용할 수 있다[참조: Sollberg 및 Hegna; Methods in Enzymology 62, 201-204(1979)].
다음 미생물이 부다페스트 조약에 따라서 다음 기탁기관[German Collection of Micro-Organisms and Cell Cultures(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen)(DSMZ, Braunschweig, Germany)]에 기탁되어 있다:
에스케리키아 콜라이 K12 균주 DH5αmcr/pEKEx2panBC(수탁 번호 DSM 12456)
에스케리키아 콜라이 K12 균주 DH5αmcr/pECM3ilvBNCD(수탁 번호 DSM 12457)
코리네박테륨 글루타미쿰 ATCC13032△ilvA(수탁 번호 DSM 12455)
실시예
본 발명은 양태 실시예를 기준으로 하여 다음에 보다 상세히 제시되어 있다.
실시예 1
씨. 글루타미쿰으로부터의 판토테네이트 생합성용 유전자 panB 및 panC의 클로닝, 서열화 및 발현
1. panB 및 panC 유전자의 클로닝
씨. 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체성 DNA를 문헌[참조: Schwarzer 및 Puhler, Bio/Technology 9(1990) 84-87]에 기재된 바와 같이 분리하고 제한 엔도뉴클레아제 Sau3A로 절단한다. 겔-전기영동하여 분리한 후, DNA 단편을 3 내지 7kb 및 9 내지 20kb의 크기 범위로 추출한 다음, 벡터 pBR322의 단복 BamHI 계면에 연결시킨다. 이. 콜라이 균주 DH5αmcr[참조: Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of American USA, 87(1990) 4645-4649]를 상기 연결 충전물로 형질전환시킨다[참조: Hanahan, Journal of Molecular Biology 166(1983) 557-580]. 테트라사이클린 10㎍/ml를 함유하는 LB 한천판 위에 접종시킨 후 이들의 테트라사이클린 감도를 기준으로 하여 삽입체-보유 콜로니를 동정한다. 합한 클론에 대한 플라스미드 제조[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory manual(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press]를 이용하여, 각각 400개의 플라스미드를 함유하고 삽입체 크기가 9 내지 20kb인 8가지 그룹과 각각 500개의 플라스미드를 함유하며 삽입체 크기가 3 내지 7kb인 9가지 그룹을 분리한다. 이. 콜라이 panB 돌연변이체 SJ2[참조: Cronan et al., 1982, Journal of Bacteriology 149:916-922]를 전기천공법[참조: Wehrmann et al., 1994, Microbiology 140:3349-3356]을 이용하여 상기 유전자 뱅크로 형질전환시킨다. 이러한 형질전환 충전물을, 15g/ℓ 한천을 함유하는 CGXII 배지에 직접적으로 도말한다[참조; Keilhauer et al., Journal of Bacteriology(1993) 175:5595-5603]. 판토테네이트 보충 없이도 성장할 수 있는 클론으로부터 플라스미드 DNA를 분리한다[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory manual(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press]. 8가지 플라스미드의 경우에는, 이. 콜라이 돌연변이체 SJ2의 panB 결함을 이종적으로 보충해주는 능력이 재형질전환에 의해 확인할 수 있다.
이들 8가지 플라스미드를 이용하여 제한 지도화를 수행한다. 연구된 플라스미드 벡터 중의 하나(이는 pUR1으로 후술됨)는 길이가 9.3kb인 삽입체를 함유하고 있다(도 1). 이. 콜라이 panC 돌연변이체 DV39[참조: Vallari 및 Rock 1985, Journal of Bacteriology 164:136-142]를 형질전환시킨 결과, 벡터 pUR1이 또한 이러한 돌연변이체의 panC 결함을 보충해줄 수 있는 것으로 나타났다.
2. panB 및 panC 유전자의 서열화
pUR1의 삽입체 크기가 2.2kb인 단편(도 1)을 다음 문헌의 디데옥시 연쇄-종결법에 따라서 서열화한다[참조: Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74:5463-5467]. 이를 위하여, 표준 프라이머(Boehringer Mannheim, Germany에 의해 제조된 보편적인 프라이머 및 역 프라이머)의 보조하에 서열화시킨 엑소뉴클레아제 Ⅲ을 이용하여 먼저 아클론을 생성시킨다. 아머샴 파르마시아 바이오텍(Amersham Pharmacia Biotech; Uppsala, Sweden)에 의해 제작된 자동화 레이저 형광 서열화 기기(A.L.F.)를 이용하여 상기 서열화 충전물을 겔 전기영동하여 분석한다. 수득된 뉴클레오티드 서열을 프로그램 패키지 HUSAR(Release 4.0, EMBL, Cambridge, GB)로 분석한다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 서열 1로서 재현된다. 분석 결과, 2개의 개방 판독 프레임이 동정되었다. panB 유전자로서 동정된, 길이가 813bp인 1개의 개방 판독 프레임은 271개 아미노산의 폴리펩타이드를 암호화하고 서열 2로서 재현된다. panC 유전자로서 동정된 2번째 개방 판독 프레임은 837개 염기쌍을 포함한다. 이는 서열 3으로서 재현되는, 279개 아미노산의 폴리펩타이드를 암호화한다.
3. panB 및 panC 유전자의 발현
유전자 panB 및 panC를 씨. 글루타미쿰 발현 벡터 pEKEx2[참조: Eikmanns et al., 1994, Microbiology 140:1817-1828(1994)]내로 클로닝시키는데, 여기서 2개의 유전자가 IPTG에 의해 유도될 수 있는 강력한 tac 프로모터의 조절하에 존재한다. 이러한 클로닝을 2단계로 수행한다. 먼저, panB 유전자의 출발부를 PCR에 의해 증폭시킨다. 이를 위하여, SalI 계면을 상응하는 프라이머 19의 보조하에 panB의 출발 코돈 앞에 삽입시킨다(프라이머 1: 5' GATCGTCGACCATCACATCTATACTCATGCCC 3'). panB-내부 EcoRI 계면이 증폭된 단편내에 함유되도록 제2의 프라이머를 선택한다(프라이머 2: 5' ACCCGATGTGGCCGACAACC 3'). PCR은 어닐링 온도 62℃를 이용하고 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory manual(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press]에 따라서 매트릭스로서 플라스미드 pUR1을 사용하여 수행한다. 이로써 생성된 크기가 468bp인 PCR 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 SalI 및 EcoRI로 절단하고 유사하게 처리된 벡터 pEKEx2에 연결시킨다. 이. 콜라이 균주 DH5αmcr을 이러한 연결 충전물로 형질전환시킨다. 벡터 pEKEx2panB'를 유형 DH5αmcr/pEKEx2panB'의 형질전환체로부터 분리한다.
이어서, 플라스미드 pUR1로부터, panB 집락의 2번째 절반을 함유하고 크기가 1761bp인 EcoRI 단편을 제한 분해를 통하여 절단한다. 이러한 단편을, 이미 panB PCR 생성물을 함유하고 있고 앞서 EcoRI로 선형화시킨 pEKEx2panB' 벡터내로 클로닝시킨다.
이. 콜라이 균주 DH5αmcr을 상응하는 연결 충전물로 형질전환시킨다. 유형 DH5αmcr/pEKEx2panBC의 형질전환체로부터, 벡터 pEKEx2panBC(도 2)를 분리하는데, 여기서는 panBC 유전자 집락이 tac 프로모터의 조절하에 존재한다.
실시예 2
디하이드록시산 데하이드라타제를 암호화하는 씨. 글루타미쿰으로부터의 ilvD 유전자의 클로닝 및 서열화
1. 씨. 글루타미쿰의 ilvD 돌연변이체의 분리
균주 씨. 글루타미쿰 R127[참조: Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61:329-334]을 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아니딘으로 돌연변이시킨다[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory manual(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press]. 이를 위하여, 밤새 성장시킨 씨. 글루타미쿰 배양물 5ml를 250㎕ N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아니딘(5mg/ml 디메틸포름아미드)과 혼합하고 30℃ 및 200rpm에서 30분 동안 배양한다[참조: Adelberg 1958, Journal of Bacteriology 76:326]. 당해 세포를 NaCl 멸균 용액(0.9%)으로 연속적으로 2회 세척한다. 한천 15g/ℓ를 함유하는 최소-배지 플레이트 CGXII 상의 레플리카 도말을 통하여[참조: Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175:5595-5603], L-발린, L-이소로이신 및 L-로이신(각 0.1g/ℓ)의 첨가하에서만 성장하는 돌연변이체를 분리한다.
이들 돌연변이체의 조 추출물에서 디하이드록시산 데하이드라타제의 효소 활성을 측정한다. 이를 위하여, 상기 클론을 60ml LB 배지에서 배양하고 지수 생장기에서 원심분리하여 제거한다. 세포 펠렛을 0.05M 인산칼륨 완충액으로 1회 세척한 다음 동일한 완충액에 재현탁시킨다. 10분 동안 초음파 처리하여 세포를 파쇄시킨다[참조: Branson-Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co., Danbury, USA]. 연속적으로, 13,000rpm 및 4℃에서 30분 동안 원심분리함으로써 상기 세포 데브리스를 분리하고, 상등액을 효소 시험에서 조 추출물로써 이용한다. 이러한 효소 시험용 반응 충전물은 0.25M 트리스/HCl, pH 8, 0.2ml, 조 추출물 0.05ml 및 65mM α,β-디하이드록시-β-메틸발레레이트 0.15ml를 함유한다. 시험용 충전물을 30℃에서 배양하고, 10분, 20분 및 30분 후에 200㎕ 샘플을 취하며, HPLC 분석법을 이용하여 이의 케토메틸발레레이트 농도를 측정한다[참조; Hara et al., 1985, Analytica Chimica Acta 172:167-173]. 표 1에 제시된 바와 같이, 균주 R127/7은 어떠한 디하이드록시산-데하이드라타제 활성을 나타내지 않은 반면, 이소머로리덕타제 및 아세토하이드록시산-신타제 활성이 측쇄 아미노산 합성을 위한 추가의 효소로서 여전히 존재한다.
씨. 글루타미쿰 균주에서 각종 효소의 고유 활성(μmol/분 및 mg 단백질)
균주 디하이드록시산 데하이드라타제 이소머로리덕타제 아세토하이드록시산 신타제
R127 0.003 0.05 0.07
R127/7 0.000 0.06 0.09
2. 씨. 글루타미쿰의 ilvD 유전자의 클로닝
씨. 글루타미쿰 R127로부터의 염색체성 DNA를 문헌[참조: Schwarzer 및 Puhler, Bio/Technology 9(1990) 84-87]에 기재된 바와 같이 분리한다. 이러한 DNA를 제한 효소 Sau3A(Boehringer Mannheim)로 절단하고 슈크로즈 밀도-구배 원심분리에 의해 분리한다[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory manual(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press]. 단편 크기 범위가 약 6 내지 10kb인 분획을 벡터 pJC1[참조: Cremer et al., Molecular and General Genetics 220(1990) 478-480]과의 연결을 위해 이용한다. 이를 위하여, 벡터 pJC1을 선형화시키고 BamHI로 탈포스포릴화시킨다. 이의 5ng을 언급된 염색체성 DNA 분획 20ng과 연결시킴으로써, 돌연변이체 R127/7을 전기천공시켜 형질전환시킨다[참조: Haynes 및 Britz, FEMS Microbiology Letters 61(1989) 329-334]. 이러한 형질전환체를 대상으로 하여, 측쇄 아미노산의 첨가없이도 CGXII 한천 플레이트 상에서 성장하는 능력이 있는지를 알아보기 위해 시험한다. 시험된 5,000개 형질전환체 중에서, 8개 클론이, 레플라카 도말하고 30℃에서 2일 동안 배양한 후에 최소-배지 플레이트 상에 성장하였다. 이들 클론으로부터, 문헌[참조: Schwarzer et al., Bio/Technology 9(1990) 84-87]에 기재된 바와 같이 플라스미드 제조를 수행한다. 플라스미드 DNA를 제한 분석한 결과, 동일한 플라스미드(pRV로서 후술됨)가 8개 클론 모두에 함유되어 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 플라스미드는 4.3kb의 삽입체를 보유하고 있으며, ilvD 돌연변이체 R127/7를 보충하는 능력을 알아보기 위해 이를 재형질전환시켜 시험한다. 아클로닝을 통하여, 돌연변이체 R127/7의 보충과 관련된 영역이 2.9kb ScaI/XhoI 단편으로 한정되었다.
3. ilvD 유전자의 서열화
다음 문헌의 디데옥시 연쇄-종결법에 따라서 2.9kb ScaI/XhoI 단편의 핵산 서열을 수행한다[참조: Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74:5463-5467]. 이러한 방법을 이용하는 경우에는, 자동-판독 서열화 키트[Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden]를 사용한다. 아머샴 파르마시아 바이오텍(Uppsala, Sweden)에 의해 제작된 자동화 레이저 형광 서열화 기기(A.L.F.)를 이용하여 겔 전기영동적 분석을 수행한다. 수득된 뉴클레오티드 서열을 프로그램 패키지 HUSAR(Release 4.0, EMBL, Cambridge, GB)로 분석한다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 서열 4로서 재현된다. 분석 결과, ilvD 유전자로서 동정되고 612개 아미노산의 폴리펩타이드를 암호화하는, 서열 5로서 재현되는 1836개 염기쌍의 개방 판독 프레임이 확인되었다.
실시예 3
씨. 글루타미쿰의 ilvA 결실 돌연변이체의 작제
문헌[참조; Schafer et al., Gene 145:69-73(1994)]에 기재된 유전자 교환용 시스템에 따라서, 코리네박테륨 글루타미쿰 ATCC13032의 ilvA 유전자내에서 하나의 결실이 일어나게 한다. 불활성화 벡터 pK19mobsacB△ilvA를 작제하기 위하여, 먼저 벡터 pBM21[참조: Mockel et al., 1994, Molecular Microbiology 13:833-842] 중의 EcoRI 단편 상에 존재하는 ilvA 유전자로부터 내부 241bp BglII 단편을 제거한다. 이를 위하여, 상기 벡터를 BglII로 절단한 다음, 아가로즈-겔 전기영동에 의해 ilvA-내부 BglII 단편을 분리한 후에 이를 재연결시킨다. 연속적으로, 상기 벡터로부터 불완전한 유전자를 EcoRI 단편으로서 분리한 다음, EcoRI로 선형화시킨 벡터 pK19mobsacB내로 연결시킨다[참조; Schafer 1994, Gene 145:69-73]. 수득된 불활성화 벡터 pK19mobsacB△ilvA를 이. 콜라이 균주 S 17-1내로의 형질전환에 의해 도입하고[참조: Hanahan, Journal of Molecular Biology 166(1983) 557-580] 씨. 글루타미쿰 ATCC13032와 접합시켜 전이시킨다[참조: Schafer et al., 1990, Journal of Bacteriology 172: 1663-1666]. 상기 불활성화 벡터가 게놈내에 통합되어 존재하는 씨. 글루타미쿰의 카나마이신-내성 클론을 수득한다. 벡터의 절단 위치를 선별하기 위하여, 카나마이신-내성 클론을, 15g/ℓ 한천, 2% 슈크로즈/10% 슈크로즈를 갖는 슈크로즈-함유 LB 배지[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory manual(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press] 상에 도말하고, 2번째 재조합 사건의 결과로서 벡터를 다시 상실한 콜로니를 수득한다[참조: Jager et al., 1992, Journal of Bacteriology 174: 5462-5465]. 2mM L-이소로이신 함유 및 비함유, 및 50㎍/ml 카나마이신 함유 및 비함유 최소-배지 플레이트[15g/ℓ 한천을 갖는 배지 CGXII(Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175(1993) 5595-5603 참조)] 상에 접종한 결과, 벡터 절단의 결과로서 카나마이신-민감성이고 이소로이신-생장 요구성이며, 불완전한 ilvA 유전자(△ilvA 대립유전자)가 게놈 상에 존재하는 36개 클론을 분리한다. 이들 클론 중의 하나를 균주 ATCC13032△ilvA로서 명명하고 추가로 사용한다.
실시예 4
씨. 글루타미쿰에서의 유전자 ilvBN, ilvC 및 ilvD의 발현
아세토하이드록시산 신타제의 유전자(ilvBN) 및 이소머로리덕타제의 유전자(ilvC)[참조: Cordes et al., 1992, Gene 112: 113-116 및 Keilhauer et al., 1993, Journal of Bacteriology 175: 5595-5603], 및 디하이드록시산 데하이드라타제의 유전자(ilvD)(실시예 2)를 발현시키기 위하여 벡터 pECM3에 클로닝시킨다. 벡터 pECM3은 BamHI/BglII DNA 단편의 결실(길이가 약 1kbp이다)의 결과로서 발생되고 카나마이신-내성 유전자를 보유하는, pECM2[참조: Jager et al., 1992, Journal of Bacteriology 174: 5462-5465]의 유도체이다.
벡터 pKK5[참조: Cordes et al., 1992, Gene 112: 113-116]에서는, 유전자 ilvBNC가 이미 벡터 pJC1[참조: Cremer et al., 1990, Molecular and General Genetics 220: 478-480]내에 클로닝된 형태로 존재하고 있다. 상기 벡터로부터 5.7kb XbaI-ilvBNC 단편을 분리한 다음, ilvD 유전자를 함유하는 벡터 pRV의 3.1kb XabI 단편과 함께, XbaI로 선형화시킨 벡터 pECM3내로 도입한다. 이러한 경우 연결 충전물을 이. 콜라이 균주 DH5αmcr내로 형질전환시킨다. 유형 DH5αmcr/pECM3ilvBNCD의 형질전환체로부터 플라스미드 pECM3ilvBNCD(도 3)를 수득한다.
전기천공[참조: Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61: 329-334] 및 클로로암페니콜 내성에 대한 선별을 이용하여, 플라스미드 pECM3ilvBNCD를 균주 ATCC13032△ilvA내로 도입하고, 균주 ATCC13032△ilvA/pECM3ilvBNCD를 수득한다. 추가로, 전기천공[참조: Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61: 329-334] 및 카나마이신 내성에 대한 선별을 이용하여, 플라스미드 pEKEx2panBC를 균주 ATCC13032 및 균주 ATCC13032△ilvA내로 도입하고, 균주 ATCC13032/pEKEx2panBC 및 ATCC13032△ilvA/pEKEx2panBC를 수득한다. 플라스미드 pEKEx2panBC 및 pEKEX2를 전기천공[참조: Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61: 329-334] 및 카나마이신과 클로로암페니콜 내성에 대한 선별을 통하여 균주 ATCC13032△ilvA/pECM3ilvBNCD내로 도입한다. 이러한 방식으로, 균주 ATCC13032△ilvA/pECM3ilvBNCD pEKEX2 및 ATCC13032△ilvA/pECM3ilvBNCD pEKEx2panBC가 발생되었다.
실시예 5
판토텐산을 요구하는 씨. 글루타미쿰의 panC 돌연변이체의 작제
불활성화 벡터 pK18mob[참조: Schafer et al., 1994, Gene 145: 69-73]의 보조하에, 씨. 글루타미쿰 R127 panC 돌연변이체를 생성시킨다.
panC 불활성화 벡터를 작제하기 위하여, 먼저 크기가 168bp인 씨. 글루타미쿰의 panC 유전자의 중앙 단편(837bp를 포함하는 유전자의 뉴클레오티드 265 내지 432)을 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 통하여 증폭시킨다. 매트릭스로서, 벡터 pUR1(실시예 6 참조)을 사용하고; 프라이머로서, 2개의 20량체 프라이머 1 및 프라이머 2를 이용한다: 프라이머 1; 5' GTTCGCACCCGATGTGGAGG 3', 프라이머 2; 5' ATGCACGATCAGGGCGCACC 3'. 어닐링 온도 55℃를 이용하여 PCR을 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory manual(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press]에 따라서 수행한다. 수득된 단편을, 불활성화 벡터 pK18mob[참조: Schafer et al., 1994, Gene 145: 69-73]내로 EcoRI/SalI 단편으로서 지시된 벡터 pUC18의 SmaI 계면내로 중간 클로닝시킨 후에 연결시킨다. 이러한 방식으로 수득된 벡터 pK18mob'panC'를 이. 콜라이 균주 S 17-1의 형질전환에 사용한 다음, 연속적으로 접합시켜 씨. 글루타미쿰 R127에 도입한다. 카나마이신 내성에 대한 선별 결과로서, 동종 재조합 사건을 통하여 통합 벡터를 panC 유전자내로 통합시키는 방식으로 씨. 글루타미쿰 R127의 클론을 수득한다. 이러한 방식으로 수득된 균주 R127panC::pK18mob'panC'는 D-판토테네이트를 측정하는데 적합하다.
실시예 6
D-판토테네이트의 정량적 측정
D-판토테네이트를 정량적으로 측정하기 위하여, 씨. 글루타미쿰 panC 돌연변이체 R127panC::pK18mob'panC'를 작제하는데(실시예 5 참조), 이의 성장은 배지의 D-판토테네이트 농도에 직접적으로 의존한다. 이러한 균주는 판토텐산에 대하여 생장 요구성이고 β-알라닌 및 D-판토에이트가 보충된 경우에는 전혀 성장하지 않았다.
이러한 인디케이터 균주를 이용하여 판토테네이트를 측정하기 위하여, CGXII 배지[참조: Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603]를 시험용 배지로서 이용한다. 이를 위하여, 각 경우에, 배양 튜브[Falcon 2057, Becton and Dickinson, New Jersey, USA]에서 4/3의 비율로 농축된 3ml CGXII 배지를 1ml의 멸균성 구경 측정용 용액 또는 판토텐산을 함유하는 시험 용액과 혼합한 다음, 인디케이터 균주를 접종한다. 접종물로서, 각 경우에 인디케이터 균주의 글리세린 배양물 60㎕를 이용한다. 30℃에서 40시간 동안 배양한 후, 시험 충전물의 세포 밀도(OD600)(Novaspec 4049 분광계, LKB Biochrom, Cambridge, GB)를 측정하고, 구경 측정 곡선을 통하여 판토텐산 농도를 확인한다. 25㎍/ℓ의 농도까지, 상기 균주는 판토테네이트 농도에 대한 성장 의존성을 직접적으로 나타냈으며, 광밀도는 0.5 내지 10이다. 인디케이터 균주의 글리세린 배양물을 제조하기 위하여, 이러한 균주를 보충되지 않은 CGXII 배지 상에서 24시간 동안 배양한다(D-판토테네이트가 고갈됨). 이러한 배양물 1,050㎕를 연속적으로 글리세린 700㎕와 혼합한다. 이러한 글리세린 배양물 중에서, -70℃에서 중간 동결시킨 60㎕을 앞서 기재된 바와 같이 D-판토테네이트를 측정하기 위해 사용한다. 참조물로서, Sigma[Deisenhofen, Germany)로부터 수득된 Na 판토테네이트를 사용한다.
실시예 7
각종 씨. 글루타미쿰 균주를 이용한 D-판토테네이트의 제조
판토테네이트를 형성하는지를 연구하기 위하여, 균주 ATCC13032, ATCC13032/pEKEx2panBC, ATCC13032△ilvA 및 ATCC13032△ilvA/pEKEx2panBC를 60ml 뇌 심장 주입 배지(Difco Laboratories, Detroit, USA)에서 30℃하에 14시간 동안 예비배양한다. 연속적으로, 상기 세포를 0.9% NaCl 용액(w/v)으로 2회 세척한 다음, OD600이 0.5에 이르도록 CGXII 배지의 매 60ml마다 상기 현탁액을 접종한다. 상기 배지는 문헌[참조: Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603]에 기재된 배지와 동일하지만, 부가적으로 2mM L-이소로이신을 함유하고 있다. 상기 문헌[Keilhauer et al.]에 기재된 배지 CGXII는 표 2에 제시한다.
배지 CGXII의 조성
성분 농도
(NH4)2SO4 20g/ℓ
우레아 5g/ℓ
KH2PO4 1g/ℓ
K2HPO4 1g/ℓ
Mg2O4*7H2O 0.25g/ℓ
3-모르폴리노프로판설폰산 42g/ℓ
CaCl2 10mg/ℓ
FeSO4*7H2O 10mg/ℓ
MnSO4*H2O 10mg/ℓ
ZnSO4*7H2O 1mg/ℓ
CuSO4 0.2mg/ℓ
NiCl2*6H2O 0.02mg/ℓ
비오틴(pH 7) 0.2mg/ℓ
글루코즈 40g/ℓ
프로토카테큐산 0.03mg/ℓ
균주 ATCC13032/pEKEx2panBC 및 ATCC13032△ilvA/pEKEx2panBC를 배양하는 과정에 있어서, 5시간 후에 상기 배지를 1mM 이소프로필티오-β-D-갈락토시드와 부가적으로 혼합한다. 24시간 동안 배양한 후, 샘플을 취하고, 세포를 원심분리하며, 상등액을 멸균 여과시킨다. 실시예 6에 기재된 판토테네이트 시험의 도움으로 상등액의 판토테네이트 농도를 측정한다. 결과는 표 3에 제시한다.
각종 씨. 글루타미쿰에서 D-판토테네이트의 형성
균주 D-판토테네이트(mg/ℓ)
ATCC13032 0.01
ATCC13032/pEKEx2panBC 0.03
ATCC13032△ilvA 0.06
ATCC13032△ilvA/pEKEx2panBC 0.3
실시예 9
β-알라닌의 첨가하에 각종 씨. 글루타미쿰 균주를 이용한 D-판토테네이트의 제조
판토테네이트의 형성을 정량화하기 위하여, 균주 ATCC13032△ilvA/pECM3ilvBNCD pEKEx2 및 ATCC13032△ilvA/pECM3ilvBNCD pEKEx2panBC를 카나마이신 25mg/ℓ와 클로로암페니콜 3mg/ℓ를 함유하는 60ml 뇌 심장 주입 배지(Difco Laboratories, Detroit, USA)에서 30℃하에 14시간 동안 예비배양하고, 0.9% NaCl 용액(w/v)으로 2회 세척한 다음, OD600이 0.5에 이르도록 CGXII 배지의 매 60ml마다 상기 현탁액을 접종한다. 이러한 경우, 상기 배지는 20mM의 최종 농도에서 2mM L-이소로이신, 25mg/ℓ 카나마이신, 3mg/ℓ 클로로암페니콜 및 β-알라닌을 함유한다. 5시간 동안 배양한 후, 각 경우에 있어서 IPTG(이소프로필티오-β-D-갈락토시드)를 상기 배지에 1mM의 최종 농도로 가한다. 49시간 및 74시간 후, 샘플을 꺼내고, 세포를 원심분리한 다음, 상등액을 멸균 여과시킨다. 실시예 6에 기재된 바와 같이 상등액의 판토테네이트 농도를 측정한다. 결과는 표 4에 제시한다.
씨. 글루타미쿰의 각종 균주에서 D-판토테네이트의 축적
균주 49시간 배양후의D-판토테네이트[mg/ℓ] 74시간 배양후의D-판토테네이트[mg/ℓ]
ATCC13032△ilvA/pECM3ilvBNCD pEKEx2 80 100
ATCC13032△ilvA/pECM3ilvBNCD pEKEx2panBC 920 980
본 발명에 따라 유전자 panB 및 panC를 개별적으로 또는 서로 조합하여, 임의로 ilvA 유전자에서 결함있는 돌연변이와 조합하거나 유전자 ilvBN, ilvC 또는 ilvD의 증강과 조합하여 증강, 특히 과발현시키는, 이미 D-판토텐산을 생성시키는 코리네포름 박테리아를 사용하여 D-판토텐산을 개선된 방식으로 생성시킬 수 있다.

Claims (21)

  1. 코리네박테륨(Corynebacterium)으로부터 유도되고 다음 그룹:
    a) 서열 1로 나타낸, panB 유전자(케토판토에이트 하이드록시메틸트랜스퍼라제)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열,
    b) 서열 1로 나타낸, panC 유전자(판토테네이트 신테타제), 특히 panBC 오페론을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 임의로
    c) 서열 4로 나타낸, ilvD 유전자(디하이드록시산 데하이드라타제)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 중에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 함유하는, 코리네박테륨 속 미생물내에서 복제가능한 임의의 재조합 DNA.
  2. 제1항에 있어서, (ⅰ) 서열 1, 서열 4에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는
    (ⅱ) 유전적 암호의 변성 범위내에서 각각의 서열 (ⅰ)에 상응하는 서열들 중의 하나 이상의 서열, 또는
    (ⅲ) 각각의 서열 (ⅰ) 또는 (ⅱ)에 상보적인 서열과 하이브리드화되는 서열들 중의 하나 이상의 서열, 및 임의로
    (ⅳ) (ⅰ)에서 작용적 중성 센스 돌연변이를 포함하는 복제가능한 DNA.
  3. 제1항 또는 제2항에 따르는 하나 이상의 복제가능한 DNA의 도입에 의해 형질전환된 미생물, 특히 코리네박테륨 속 미생물.
  4. 이. 콜라이 DH5αmcr/pECM3ilvBNCD로서 수탁 번호 DSM 12457로 기탁된, 도 3에 재현된 제한 지도를 특징으로 하는 셔틀 벡터 pECM3ilvBNCD.
  5. 이. 콜라이 DH5αmcr/pEKEx2panBC로서 수탁 번호 DSM 12456으로 기탁된, 도 2에 재현된 제한 지도를 특징으로 하는 셔틀 벡터 pEKEx2panBC.
  6. panB 및 panC 유전자, 및 상응하는 효소를 암호화하는 임의의 추가 뉴클레오티드 서열을 코리네박테륨 속 미생물내에서 증강(과발현)시키고, 이들 미생물을 발효 목적에 이용함을 특징으로 하여, 판토텐산을 제조하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, ilvD 유전자를 추가로 증강(과발현)시킴을 특징으로 하는 제조 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 유전자 ilvBNCD를 추가로 증강(과발현)시킴을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, 증강을 달성하기 위하여, 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 플라스미드 벡터로 형질전환시킴으로써 미생물 중의 유전자 또는 뉴클레오티드 서열의 복사수를 증가시킴을 특징으로 하는 방법.
  10. 제6항 또는 제7항에 있어서, 증강을 달성하기 위하여, 구조 유전자의 상단에 위치한 프로모터와 조절 영역을 돌연변이시킴을 특징으로 하는 방법.
  11. 제6항 또는 제7항에 있어서, 증강을 달성하기 위하여, 발현 카셋트를 구조 유전자의 상단에 혼입시킴을 특징으로 하는 방법.
  12. 제6항 또는 제7항에 있어서, 증강을 달성하기 위하여, 매트릭스로써 전술한 서열로부터 판독되는 mRNA의 수명을 연장시키고/시키거나 상응하는 효소 단백질(들)의 분해를 방지함을 특징으로 하는 방법.
  13. 제6항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1항에 따르는 유전자를 대사물-내성 또는 항대사물-내성 돌연변이를 추가로 나타내는 코리네박테리아에서 과발현시킴을 특징으로 하는 방법.
  14. 제6항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 과발현을 달성하기 위하여, 배양 배지 및/또는 발효가 조절되는 방식을 변화시킴을 특징으로 하는 방법.
  15. 제6항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 판토테네이트(판토텐산)의 형성을 저하시키는, 미생물내에서의 한 가지 이상의 대사 경로를 제거함을 특징으로 하는 방법.
  16. 제6항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 유전자 이외에, 판토텐산 형성과 관련된 대사 경로에 대한 나머지 유전자를 개별적으로 또는 결합하여 과발현시키는 미생물을 이용함을 특징으로 하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, ilvA 유전자를 대사 경로에서 제거함을 특징으로 하는 방법.
  18. 제6항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 셔틀 벡터 pECM3ilvBNCD를 함유하는 코리네박테륨 속 미생물을 이용함을 특징으로 하는 방법.
  19. 제6항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 셔틀 벡터 pEKEx2panBC를 함유하는 코리네박테륨 속 미생물을 이용함을 특징으로 하는 방법.
  20. a) 유전자 panB 또는 panc 중의 하나 이상의 유전자, 바람직하게는 panBC를 임의로 ilvD 유전자와 조합하여 증강(과발현)시키고,
    b) 배지 중 또는 미생물의 세포 중에서 판토텐산을 풍부하게 만든 다음,
    c) 판토텐산을 분리함을 특징으로 하여, 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 따르는 코리네박테륨 속 미생물의 발효에 의해 판토텐산을 제조하는 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 발효 동안, 아스파르테이트, β-알라닌, 케토-이소발레레이트, 케토판토에이트 또는 판토에이트 그룹 중에서 선택된 판토텐산의 전구체를 혼합함을 특징으로 하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022005225A1 (ko) * 2020-07-01 2022-01-06 씨제이제일제당 (주) 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물, 및 이의 용도

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19907567B4 (de) * 1999-02-22 2007-08-09 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Valin
US8232081B2 (en) * 1999-09-21 2012-07-31 Basf Se Methods and microorganisms for production of panto-compounds
SK5222002A3 (en) * 1999-09-21 2003-03-04 Basf Ag Methods and microorganisms for production of panto-compounds
DE10026758A1 (de) * 2000-05-30 2001-12-06 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung corymeformer Bakterien
DE10030702A1 (de) 2000-06-23 2002-01-03 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien
AU2002218164A1 (en) * 2000-09-20 2002-04-02 Basf Aktiengesellschaft Animal feed supplement containing d-pantothenic acid and/or its salts, improved method for the production thereof, and its use
DE10047142A1 (de) * 2000-09-23 2002-04-11 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien
US6911329B2 (en) 2000-09-23 2005-06-28 Degussa Ag Process for the fermentative preparation of D-pantothenic acid using coryneform bacteria
AU2001291825A1 (en) * 2000-09-30 2002-04-15 Degussa A.G. Process for the fermentative preparation of d-pantothenic acid using coryneform bacteria
JP4217070B2 (ja) 2001-01-19 2009-01-28 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア パントテネートの産生増強法
US7244593B2 (en) * 2001-01-19 2007-07-17 Basf Aktiengesellschaft Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate
ATE432338T1 (de) * 2002-01-18 2009-06-15 Novozymes As Alanin-2,3-aminomutase
US20040048343A1 (en) * 2002-01-19 2004-03-11 Theron Hermann Method and microorganisms for the production of 3-(2-hydroxy-3-methyl-butyrylamino)-propionic acid (hmbpa)
CA2491145A1 (en) * 2002-07-03 2004-01-15 Basf Aktiengesellschaft Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate
DE10344200A1 (de) * 2003-09-22 2005-05-04 Basf Ag Verfahren zur Herstellung eines D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement
CN1993377A (zh) 2004-07-30 2007-07-04 卡吉尔公司 丙氨酸2,3氨基变位酶
US8273558B2 (en) 2005-10-26 2012-09-25 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols
UA96928C2 (ru) 2005-10-26 2011-12-26 Э.И. Дю Пон Де Немур Энд Компани Ферментативное продуцирование спиртов с четырьмя атомами углерода
US9303225B2 (en) 2005-10-26 2016-04-05 Butamax Advanced Biofuels Llc Method for the production of isobutanol by recombinant yeast
WO2007131750A1 (en) 2006-05-16 2007-11-22 Dsm Ip Assets B.V. Process for the production of panthenol
BRPI0913552B1 (pt) 2008-09-29 2020-09-29 Butamax Advanced Biofuels Llc Método para produção de isobutanol e método para conversão de 2,3-dihidroxi isovalerato
NZ591244A (en) 2008-09-29 2013-03-28 Butamax Tm Advanced Biofuels IDENTIFICATION AND USE OF BACTERIAL [2Fe-2S] DIHYDROXY-ACID DEHYDRATASES
CA2736420A1 (en) * 2008-09-29 2010-04-01 Butamaxtm Advanced Biofuels Llc Enhanced dihydroxy-acid dehydratase activity in lactic acid bacteria
US9169499B2 (en) 2009-09-29 2015-10-27 Butamax Advanced Biofuels Llc Flux to acetolactate-derived products in lactic acid bacteria
CN102782119B (zh) 2010-02-17 2016-03-16 布特马斯先进生物燃料有限责任公司 改善需Fe-S簇蛋白质的活性
WO2014106107A2 (en) 2012-12-28 2014-07-03 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Dhad variants for butanol production
US9580705B2 (en) 2013-03-15 2017-02-28 Butamax Advanced Biofuels Llc DHAD variants and methods of screening
CN106676051B (zh) * 2016-10-31 2019-07-05 中国科学院微生物研究所 一种制备高效合成泛酸基因工程菌的方法及其应用
CN109868254B (zh) * 2019-03-14 2021-02-19 浙江工业大学 一种高产泛酸的基因工程菌、构建方法及应用
CN110317768B (zh) * 2019-07-10 2020-09-04 江南大学 一种消减4-甲基苯酚的乳酸菌及其在酿造体系中的应用
KR102589135B1 (ko) * 2021-05-10 2023-10-12 씨제이제일제당 (주) 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물, 및 이의 용도
CN114149981B (zh) * 2021-12-09 2024-02-02 浙江工业大学 一种比活提高的泛酸合成酶突变体及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3710497B2 (ja) * 1992-09-25 2005-10-26 ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト Ｄ−パント酸、ｄ−パントテン酸およびそれらの塩の製造法
DE19855313A1 (de) * 1998-12-01 2000-06-08 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure durch Verstärkung des panD-Gens in Mikroorganismen
DE19907567B4 (de) * 1999-02-22 2007-08-09 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Valin
KR100878334B1 (ko) * 1999-06-25 2009-01-14 백광산업 주식회사 대사 경로 단백질을 코딩하는 코리네박테리움 글루타미쿰유전자

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022005225A1 (ko) * 2020-07-01 2022-01-06 씨제이제일제당 (주) 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물, 및 이의 용도

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