KR20010049728A

KR20010049728A - Ｌ-리신을 생산하는 코리네박테리아 및 리신을 제조하는방법

Info

Publication number: KR20010049728A
Application number: KR1020000038607A
Authority: KR
Inventors: 크로이처카롤리네; 멕켈베티나; 페페를레발터; 에겔링로타르; 삼헤르만; 파테크미로슬라브
Original assignee: 데구사-휠스 악티엔게젤샤프트; 아달베르트 베. 플라텐타이히, 하; 포르슝스젠트룸 율리히 게엠베하
Priority date: 1999-07-07
Filing date: 2000-07-06
Publication date: 2001-06-15
Also published as: EP1067193B8; BR0002445A; ID26461A; MXPA00006491A; AU3938600A; EP1619252B1; CN100451104C; ATE307210T1; DE19931314A1; HUP0002584A2; ES2247987T3; CA2310890A1; CN1280185A; KR100782867B1; JP2001037495A; DE50014448D1; CN1847389A; CN1231574C; ATE365806T1; EP1619252A1

Abstract

본 발명은 pyc 유전자(피루베이트 카복실라제 유전자)가 증폭되고, 추가로 dapA 유전자(디하이드로디피콜리네이트 신타제 유전자), lysC 유전자(아스파르테이트 키나제 유전자), lysE 유전자(리신 배송 운반체 유전자) 및 dapB 유전자(디하이드로디피콜리네이트 리덕타제 유전자)로 이루어진 그룹중에서 선택된 유전자, 특히 dapA 유전자가 증폭, 특히 과발현된 코리네박테리아의 L-리신-생산 균주, 및 L-리신을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

Ｌ-리신을 생산하는 코리네박테리아 및 리신을 제조하는 방법{L-Lysine-producing corynebacteria and process for the preparation of lysine}

〈110〉 Degussa-Huls AG

Forschungszentrum Julish GmbH

〈120〉 L-lysine-producing corynebacteria and process for the preparation

of lysine

〈130〉 5-1999-024333-4; 5-1998-082611-0

〈150〉 DE 199 31 314.8

〈151〉 1999-07-07

〈160〉 6

〈170〉 KOPATIN 1.5

〈210〉 1

〈211〉 795

〈212〉 DNA

〈213〉 Corynebacterium glutamicum

〈220〉

〈221〉 -35_signal

〈222〉 (774)..(779)

〈223〉 DNA upstream from dapB

〈400〉 1

ctgcagcaat gagaccgagt aatttcgggg ttgaccagat acaccaatga gaacttggga 60

acgggcttca aaaatactgg tgaagttgat gtcttcaaca atgcctgcac caggatatga 120

tccggtatcg atacctggaa cgacaacctg atcaggatat ccagtgcctt gaatattgac 180

gttgaggaag gaatcaccag ccatctcaac tggaagacct gacgcctgct gaattggatc 240

agtggcccaa tcgacccacc aaccaggttg gccattaccg gcgatatcaa aaacaactcg 300

tgtgaacgtt tcgtgctcgg caacgcggat gccagcgatc gacatatcgg agtcaccaac 360

ttgagcctgc tgcttctgat ccatcgacgg ggaacccaac ggcggcaaag cagtggggga 420

aggggggagt ttggtgcact ctgaaccgag tggtctctga agtggtaggc gacggggcag 480

ctatctgaag gcgtgcgagt tgtggtgacc gggttagcgg tttcagtttc tgtcacaact 540

ggagcaggac tagcagaggt tgtaggcgtt gagccgcttc catcacaagc acttaaaagt 600

aaagaggcgg aaaccacaag cgccaaggaa ctactgcgga acgggcggtg aagggcaact 660

taagtctcat atttcaaaca tagttccacc tgtgtgatta atccctagaa cggaacaaac 720

tgatgaacaa tcgttaacaa cacagaccaa aacggtcagt taggtatgga tatcagcacc 780

ttctgaacgg gtacg 795

〈210〉 2

〈211〉 1815

〈212〉 DNA

〈213〉 Corynebacterium glutamicum

〈220〉

〈221〉 -35_signal

〈222〉 (774)..(779)

〈220〉

〈221〉 -10_signal

〈222〉 (798)..(803)

〈220〉

〈221〉 CDS

〈222〉 (851)..(1594)

〈400〉 2

ctgcagcaat gagaccgagt aatttcgggg ttgaccagat acaccaatga gaacttggga 60

acgggcttca aaaatactgg tgaagttgat gtcttcaaca atgcctgcac caggatatga 120

tccggtatcg atacctggaa cgacaacctg atcaggatat ccagtgcctt gaatattgac 180

gttgaggaag gaatcaccag ccatctcaac tggaagacct gacgcctgct gaattggatc 240

agtggcccaa tcgacccacc aaccaggttg gccattaccg gcgatatcaa aaacaactcg 300

tgtgaacgtt tcgtgctcgg caacgcggat gccagcgatc gacatatcgg agtcaccaac 360

ttgagcctgc tgcttctgat ccatcgacgg ggaacccaac ggcggcaaag cagtggggga 420

aggggggagt ttggtgcact ctgaaccgag tggtctctga agtggtaggc gacggggcag 480

ctatctgaag gcgtgcgagt tgtggtgacc gggttagcgg tttcagtttc tgtcacaact 540

ggagcaggac tagcagaggt tgtaggcgtt gagccgcttc catcacaagc acttaaaagt 600

aaagaggcgg aaaccacaag cgccaaggaa ctactgcgga acgggcggtg aagggcaact 660

taagtctcat atttcaaaca tagttccacc tgtgtgatta atccctagaa cggaacaaac 720

tgatgaacaa tcgttaacaa cacagaccaa aacggtcagt taggtatgga tatcagcacc 780

ttctgaacgg gtacgtctag actggtgggc gtttgaaaaa ctcttcgccc cacgaaaatg 840

aaggagcata atg gga atc aag gtt ggc gtt ctc gga gcc aaa ggc cgt gtt 892

Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val

1 5 10

ggt caa act att gtg gca gca gtc aat gag tcc gac gat ctg gag ctt 940

Gly Gln Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu

15 20 25 30

gtt gca gag atc ggc gtc gac gat gat ttg agc ctt ctg gta gac aac 988

Val Ala Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn

35 40 45

ggc gct gaa gtt gtc gtt gac ttc acc act cct aac gct gtg atg ggc 1036

Gly Ala Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly

50 55 60

aac ctg gag ttc tgc atc aac aac ggc att tct gcg gtt gtt gga acc 1084

Asn Leu Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly Thr

65 70 75

acg ggc ttc gat gat gct cgt ttg gag cag gtt cgc gac tgg ctt gaa 1132

Thr Gly Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Asp Trp Leu Glu

80 85 90

gga aaa gac aat gtc ggt gtt ctg atc gca cct aac ttt gct atc tct 1180

Gly Lys Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Ser

95 100 105 110

gcg gtg ttg acc atg gtc ttt tcc aag cag gct gcc cgc ttc ttc gaa 1228

Ala Val Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Glu

115 120 125

tca gct gaa gtt att gag ctg cac cac ccc aac aag ctg gat gca cct 1276

Ser Ala Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro

130 135 140

tca ggc acc gcg atc cac act gct cag ggc att gct gcg gca cgc aaa 1324

Ser Gly Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg Lys

145 150 155

gaa gca ggc atg gac gca cag cca gat gcg acc gag cag gca ctt gag 1372

Glu Ala Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu Glu

160 165 170

ggt tcc cgt ggc gca agc gta gat gga atc ccg gtt cat gca gtc cgc 1420

Gly Ser Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg

175 180 185 190

atg tcc ggc atg gtt gct cac gag caa gtt atc ttt ggc acc cag ggt 1468

Met Ser Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln Gly

195 200 205

cag acc ttg acc atc aag cag gac tcc tat gat cgc aac tca ttt gca 1516

Gln Thr Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala

210 215 220

cca ggt gtc ttg gtg ggt gtg cgc aac att gca cag cac cca ggc cta 1564

Pro Gly Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu

225 230 235

gtc gta gga ctt gag cat tac cta ggc ctg taaagg ctcatttcag 1610

Val Val Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu

240 245

cagcgggtgg aattttttaa aaggagcgtt taaaggctgt ggccgaacaa gttaaattga 1670

gcgtggagtt gatagcgtgc agttctttta ctccacccgc tgatgttgag tggtcaactg 1730

atgttgaggg cgcggaagca ctcgtcgagt ttgcgggtcg tgcctgctac gaaacttttg 1790

ataagccgaa ccctcgaact gcttc 1815

〈210〉 3

〈211〉 248

〈212〉 PRT

〈213〉 Corynebacterium glutamicum

〈400〉 3

Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala

20 25 30

Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala

35 40 45

Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu

50 55 60

Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly

65 70 75 80

Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Asp Trp Leu Glu Gly Lys

85 90 95

Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Ser Ala Val

100 105 110

Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Glu Ser Ala

115 120 125

Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro Ser Gly

130 135 140

Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ala

145 150 155 160

Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg Met Ser

180 185 190

Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln Gly Gln Thr

195 200 205

Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly

210 215 220

Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu Val Val

225 230 235 240

Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu

245

〈210〉 4

〈211〉 79

〈212〉 DNA

〈213〉 Corynebacterium glutamicum

〈220〉

〈223〉 dapA wild-type promoter

〈400〉 4

gttaggtttt ttgcggggtt gtttaacccc caaatgaggg aagaaggtaa ccttgaactc 60

tatgagcaca ggtttaaca 79

〈210〉 5

〈211〉 79

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of the synthetic sequence: dapA promoter of C. glutam

icum with the MC20 mutation

〈220〉

〈221〉 mutation

〈222〉 (45)..(45)

〈400〉 5

gttaggtttt ttgcggggtt gtttaacccc caaatgaggg aagatggtaa ccttgaactc 60

tatgagcaca ggtttaaca 79

〈210〉 6

〈211〉 80

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of the synthetic sequence: dapA promoter of C. glutam

icum with the MA16 mutation

〈220〉

〈221〉 mutation

〈222〉 (35)..(53)

〈400〉 6

gttaggtttt ttgcggggtt gtttaacccc caaaatgagg gaagaaggta taattgaact 60

ctatgagcac aggtttaaca 80

L-리신은 특히 동물 영양 섭취를 위한 사료 첨가제로서 사용되는 상업적으로 중요한 L-아미노산이다. 최근에, 이에 대한 수요가 점차 증가되고 있다.

L-리신은, L-리신을 생산하는 코리네박테리아 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)을 사용하는 발효 공정에 의해 제조될 수 있다. 이 생산물이 대단히 중요하기 때문에, 제조 공정을 개선하기 위한 시도가 계속되어 왔다. 이러한 공정에 대한 개선은, 발효 기술(예: 교반 및 산소 공급), 영양 배지의 조성(예: 발효중의 당의 농도), 제품 형으로의 후처리(예: 이온 교환 크로마토그래피), 또는 미생물 자체의 고유 생산성 특징과 관련된 수단에 관한 것이다.

이들 미생물의 생산성 특징은, 돌연변이유발법, 선별법 및 돌연변이체 선택법을 사용하여, 항대사물질(예: S-(2-아미노에틸)시스테인)에 내성을 갖거나 아미노산(예: L-루이신)에 대한 영양요구성이며, L-리신을 생산하는 균주를 수득함으로써 개선될 수 있다.

각각의 생합성 유전자를 증폭시키고 L-리신 생산에 미치는 효과를 연구하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 L-리신 생산-균주를 개량하기 위해, 수 년간 재조합 DNA 기술을 사용하여 왔다.

문헌[EP-A-0 088 166]의 보고에 의하면, 아미노에틸시스테인에 내성을 부여하는 DNA 단편의 증폭 후 생산성이 증가된다. 문헌[EP-B-0 387 527]의 보고에 의하면, 피드백(feedback)-내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 대립유전자(allele)의 증폭 후 생산성이 증가된다. 문헌[EP-B-0 197 335]의 보고에 의하면, 디하이드로디피콜레이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자의 증폭 후 생산성이 증가된다. 문헌[EP-A-0 219 027]의 보고에 의하면, 아스파르테이트 세미알데히드 디하이드로게나제를 암호화하는 asd 유전자의 증폭 후 생산성이 증가된다. 문헌[Pisabarro et al., Journal of Bacteriology 175(9), 2743-2749 (1993)]에는 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제를 암호화하는 dapB 유전자가 기술되어 있다.

L-리신 생산에 미치는 주요 대사 유전자의 증폭 효과가 연구되어 왔다. 문헌[EP-A-0 219 027]의 보고에 의하면, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제를 암호화하는 aspC 유전자의 증폭 후 생산성이 증가된다. 문헌[EP-B-0 143 195 및 EP-B-0 358 940]의 보고에 의하면, 포스포엔올피루베이트 카복실라제를 암호화하는 ppc 유전자의 증폭 후 생산성이 증가된다. 문헌[DE-A-198 31 609]의 보고에 의하면, 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자의 증폭 후 생산성이 증가된다. 피루베이트 카복실라제에 의해 촉매화된 보전(anaplerotic) 반응은, 포스포엔올피루베이트 카복실라제에 의해 촉매화된 반응에 비해 특히 중요하다. 즉, 문헌[Wendisch et al., FEMS Microbiology Letters 112, 269-274 (1993)]은 균주 MH20-22B의 리신 생산성이 ppc 유전자의 비발현에 의해 손상되지 않음을 보여주고 있다.

최종적으로, 문헌[DE-A-195 48 222 공개공보]의 기술에 의하면, lysE 유전자에 의해 암호화된 L-리신 배송 운반체의 활성이 증가됨으로써 리신 생산이 촉진된다.

각각의 유전자를 증폭시키기 위한 상기 시도들 외에, 2 이상의 유전자를 동시에 증폭시켜 코리네박테리아의 L-리신 생산를 개선하려는 시도가 있어 왔다. 따라서, 문헌[DE-A-38 23 451 공개공보]의 보고에 의하면, 에스체리키아 콜라이로 부터의 dapA 유전자와 asd 유전자의 동시 증폭 후 생산성이 증가된다. 문헌[DE-A-39 43 117 공개공보]의 기술에 의하면, 피드백-내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 대립유전자 및 dapA 유전자의 동시 증폭 후 생산성이 증가된다. 문헌[EP-A-0 841 395]의 보고에 의하면, 특히 피드백-내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 대립유전자 및 dapB 유전자의 동시 증폭 후 생산성이 개선되며, dapB, lysA 및 ddh 유전자를 추가로 증폭함으로써 더욱 개선될 수 있다. 문헌[EP-A-0 854 189]의 기술에 의하면, 피드백-내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 대립유전자 및 dapA, dapB, lysA 및 aspC 유전자의 동시 증폭 후 생산성이 증가된다. 문헌[EP-A-0 857 784]의 보고에 의하면, 특히 피드백-내성 효소를 암호화하는 lysC 대립유전자 및 lysA 유전자의 동시 증폭 후 생산성이 증가되며; ppc 유전자를 추가로 증폭함으로써 더욱 개선될 수 있다.

종래의 기술 수준으로 기술된 여러 방법으로 부터, 새로운 시도를 개발할 필요성 및 코리네박테리아를 사용하여 리신를 생산하는 현재의 방법을 개선할 필요성이 요청됨이 자명하다.

본 발명자가 이루고자 하는 목적은 L-리신을 생산하는 새로운 코리네박테리아 균주 및 L-리신의 제조 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 pEC7dapB(참조: 실시예 4)를 도시한다.

도 2는 pEC7lysE(참조: 실시예 5)를 도시한다.

도 3은 pEC7pyc(참조: 실시예 6)를 도시한다.

도 4는 pEC7dapBpyc(참조: 실시예 8)를 도시한다.

도 5는 pEC7dapBlysEpyc(참조: 실시예 9)를 도시한다.

도면에서 사용된 약어는 다음과 같이 정의된다:

Cm: 클로르암페니콜 내성 유전자

dapB: 코리네박테리움 글루타미쿰으로 부터의 dapB 유전자

lysE: 코리네박테리움 글루타미쿰으로 부터의 lysE 유전자

pyc: 코리네박테리움 글루타미쿰으로 부터의 pyc 유전자

OriE: 플라스미드-암호화된 이. 콜라이의 복제원

pBL: 플라스미드 pBL1의 DNA 단편

EcoRI: 제한효소 EcoRI의 절단 부위

EcoRV: 제한효소 EcoRV의 절단 부위

HincII: 제한효소 HincII의 절단 부위

HincIII: 제한효소 HincIII의 절단 부위

KpnI: 제한효소 KpnI의 절단 부위

SalI: 제한효소 SalI의 절단 부위

SmaI: 제한효소 SmaI의 절단 부위

SphI: 제한효소 SphI의 절단 부위

PvuII: 제한효소 PvuII의 절단 부위

BamHI: 제한효소 BamHI의 절단 부위

L-리신은 동물 영양 섭취를 위한 사료 첨가물로서 특별히 사용되는 상업적으로 중요한 L-아미노산이다.

L-리신 또는 리신이 후술되는 본원에서 언급되는 경우, 이는 염기 뿐만 아니라 적당한 염(예: 리신 하이드로클로라이드 또는 리신 설페이트)을 의미하는 것으로 의해된다.

본 발명은 pyc 유전자(피루베이트 카복실라제 유전자)가 증폭되고, 추가로 dapA 유전자(디하이드로디피콜리네이트 신타제 유전자), lysC 유전자(아스파르테이트 키나제 유전자), lysE 유전자((리신 배송 운반체 유전자) 및 dapB 유전자(디하이드로디피콜리네이트 리덕타제 유전자)로 이루어진 그룹중에서 선택된 유전자, 특히 dapA 유전자가 증폭, 특히 과발현된 코리네박테리아의 L-리신-생산 균주를 제공한다.

dapB 유전자의 상부(5' 말단)에 위치한 새로운 DNA 서열이, dapB 프로모터의 -35 영역을 수반하며, dapB 유전자의 발현에 유리하다는 것이 밝혀졌다. 이는 서열 1에 도시되어 있다.

따라서, 서열 1에 도시된 뉴클레오티드 서열을 지닌, 복제능의 상응하는 DNA가 또한 청구될 수 있다.

또한, 본 발명은, DSM12868 및 DSM12867 균주로 기탁된, 서열 5 및 서열 6에 도시된 dapA 프로모터의 MC20 및 MA16 돌연변이를 제공한다.

또한, 본 발명은 pyc 유전자가 증폭되고, 추가로 dapA 및 dapB 유전자가 동시에 증폭, 특히 과발현된 코리네박테리아의 L-리신-생산 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 pyc 유전자가 증폭되고, 추가로 dapA, dapB 및 lysE 유전자가 동시에 증폭, 특히 과발현된 코리네박테리아의 L-리신-생산 균주를 제공한다.

본원중에서, "증폭"이란 용어는, 강한 프로모터를 사용하거나 고활성의 적당한 효소를 암호화하는 유전자를 사용하거나, 임의로 이들 수단을 결합하여 당해 유전자의 복사체 수를 증가시킴으로써, 적당한 DNA에 의해 암호화되는 하나 이상의 효소의 세포내 활성을 미생물내에서 증가시키는 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기한 박테리아를 사용하여 L-리신을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명이 제공하는 미생물은 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 당밀, 전분 또는 셀룰로즈로 부터, 또는 글리세롤 및 에탄올로 부터 특히 글루코즈 또는 수크로즈로부터 L-리신을 생산할 수 있다. 이러한 미생물은 코리네박테리아, 특히 코리네박테리움 속의 미생물이다. 코리네박테리움 속중에서도, 특히 아미노산을 생산할 수 있는 이의 능력에 대해 당업자에게 공지된 코리네박테리움 글루타미쿰 종이 언급될 수 있다. 이러한 종에는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 코리네박테리움 멜라스세콜라(melassecola) ATCC 17965와 같은 야생형 균주 및 이로 부터 유래된 균주 또는 돌연변이체가 포함된다. 코리네박테리아의 L-리신-생산 돌연변이체의 예로는 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709, 브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708, 브레비박테리움 락토페르멘툼(lactofermentum) FERM-P 1712, 브레비박테리움 플라붐 FERM-P 6463 및 브레비박테리움 플라붐 FERM-P 6464, 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 5714 및 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 12866가 있다.

본 발명에 이르러, 발명자들은 pyc 유전자에 추가하여 lysE 유전자, 피드백-내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 대립유전자, dapB 유전자, 특히 dapA 유전자를 독립적으로 또는 함께 추가로 증폭 발현시키면, L-리신 생산이 더욱 개선됨을 밝혀내었다.

또한, pyc 유전자가 과발현되는 경우, dapA 및 dapB 유전자를 추가로 동시에 증폭 발현시키는 것이 L-리신의 생산에 매우 유리하다는 것으로 밝혀졌다.

최종적으로, pyc 유전자가 과발현되는 경우, dapA, dapB 및 lysE 유전자를 추가로 동시에 증폭 발현시키는 것이 L-리신의 생산에 매우 유리하다는 것으로 본 발명자에 의해 밝혀졌다.

증폭(과발현)은, 적당한 유전자의 복사체 수를 증가시키거나, 또는 구조 유전자의 상부에 위치한 리보좀 결합 부위 또는 프로모터 및 조절 영역을 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다. 구조 유전자의 상부에 삽입된 발현 카세트는 동일한 방식으로 작용한다. 추가로, 유도성 프로모터에 의해, 발효에 의한 L-리신 생산의 과정중에 당해 발현이 증가될 수 있다. mRNA의 수명을 연장시키는 수단도 또한 당해 발현을 증가시킬 수 있다. 또한, 효소 활성은 효소 단백질의 분해를 방지함으로써 증가될 수 있으며, 유전자 또는 유전자 작제물은 다양한 복사체 수의 플라스미드(왕복 벡터)내에 위치하거나, 또는 염색체내에 통합되어 증폭될 수 있다. 달리, 배지의 조성 및 배양 기술을 변화시킴으로써 목적 유전자의 과발현을 달성할 수도 있다.

당업자는 특히 문헌[Martin et al., Bio/Technology 5, 137-146 (1987); Guerrero et al., Gene 138, 35-41 1994); Tsuchiya and Morinaga Bio/Technology 6, 428-430 (1988); Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991); EP 0 472 869; US 4,601,893; Schwarzer and Puhler, Bio/Technology 9, 84-87(1991), Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994); LaBarre et al., Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993); WO 96/15246 특허원; Malumbres et al., Gene 134, 15-24 (1993); JP-A-10-229891 공개공보; Jensen and Hammer, Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)], 또는 편람["Manual of Method for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981)] 및 유전학 및 분자 생물학에 관한 교과서에서 적당한 지침을 발견할 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 코리네박테리움 글루타미쿰으로 부터의 유전자가 기술되어 있으며, 공지된 방법에 의해 분리, 제조 또는 합성될 수 있다.

국소 돌연변이 유발법이 특히 히구치 등(Higuchi et al.)[Nucleic Acids Research 16, 7351-7367 (1988)] 또는 실버 등(Silver et al.)에 의해 "PCR Strategies" 제목의 Innis, Glefand and Sninsky(eds)에 의한 편람(Academic Press, London, UK, 1995)에 기술되어 있다.

코리네박테리움 글루타미쿰으로 부터 목적 유전자를 분리하는 제1 단계는 예를 들면 이. 콜라이 또는 임의로 코리네박테리움 글루타미쿰중에 상기 미생물의 유전자 라이브러리를 작제하는 것이다. 유전자 라이브러리의 작제는 통상적으로 공지된 교과서 및 편람에 기술되어 있다. 언급될 수 있는 예로는 교과서[Winnacker, Genes to Clones, Introduction to Gene Technology(Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990)] 또는 편람[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]이 있다. 문헌[Bathe et al., Molecular and General Genetics, 252: 255-265 (1996)]에는, 이. 콜라이 K-12 NM554[참조 문헌: Raleigh et al., Nucleic Acids Research 16: 1563-1575(1988)]중의 코스미드 벡터 SuperCos I[참조 문헌: Wahl et al., Proceedings of the National Acadmy of Sciences USA 84, 2160-2164 (1987)]을 사용하여 작제한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 유전자 라이브러리가 기술되어 있다. 또한, 문헌[Bormann et al., Molecular Microbiology 6(3), 317-326]에는, 코스미드 pHC79[참조 문헌: Hohn and Collins, Gene 11, 291-298 (1980)]를 사용한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 유전자 라이브러리가 기술되어 있다. 이. 콜라이중의 코리네박테리움 글루타미쿰의 유전자 라이브러리는 pBR322[참조 문헌: Bolivar, Life Sciences 25, 807-818 (1979)] 또는 pUC19[참조 문헌: Norrander et al., Gene 26: 101-106 (1983)]와 같은 플라스미드를 사용하여 작제할 수 있다. 동일한 방법으로, 이. 콜라이와 코리네박테리움 글루타미쿰에서 복제될 수 있는 왕복 벡터, 예를 들면 pJC1[참조 문헌: Cremer et al., Molecular and General Genetics 220, 478-480 (1990)] 또는 pEC5[참조 문헌: Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991)]를 사용할 수 있다. 제한- 및/또는 재조합- 결함 균주가 특히 적당한 균주이며, 이의 예로는 이. 콜라이 균주 DH5αmcr[참조 문헌: Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87, 4645-4649 (1990)]가 있다. 그밖의 예로는 제한-결함성 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 RM3 및 RM4[참조: Schafer et al., Applied and Environmental Microbiology 60(2), 756-759 (1994)]가 있다.

이어서, 당해 유전자 라이브러리를 형질전환[참조: Hanahan, Journal of Molecular Biology 166, 557-580 (1983)] 또는 전기천공[참조: Tauch et al., FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)]에 의해 지시(indicator) 균주로 이송한다. 지시 균주의 특징은 검출가능한 표현형(예: 영양요구성)을 유발하는 목적 유전자중에 돌연변이를 갖는다는 점이다. 이러한 지시 균주 또는 돌연변이체는 공개된 공급원 또는 균주 수집물[예: 미국 코네티컷주 뉴 해븐에 소재하는 예일 대학의 제네틱 스톡 센터(Genetic Stock Center)]로 부터 구입하거나, 필요한 경우 특별히 제조한다. 언급될 수 있는 이러한 지시 균주의 예로는, dapA 유전자중에 돌연변이(dapA::Mu)를 수반하는 메소디아미노피멜산을 요구하는 이. 콜라이 균주 RDA8[참조 문헌: Richaud et al., C.R. Acad. Sci. Paris Ser. III 293:507-512 (1981)]이 있다.

목적 유전자를 수반하는 재조합 플라스미드로 지시 균주를 형질전환시키고 목적 유전자를 발현시킨 후, 지시 균주는 적당한 특징면에서 원영양성(prototrophic)이 된다. 클로닝된 DNA 단편이, 예를 들면 S-(2-아미노에틸)시스테인과 같은 항대사물질에 대한 내성을 부여하는 경우, 재조합 플라스미드를 수반하는 지시 균주를 적당히 보충된 영양 배지상에서 선별하여 동정할 수 있다.

목적 유전자 영역의 뉴클레오티드 서열이 공지되었거나 또는 데이타 뱅크로 부터 입수할 수 있는 경우, 염색체 DNA는 공지된 방법[참조: Eikmanns et al., Microbiology 140, 1817-1828 (1994)]에 의해 분리될 수 있으며, 목적 유전자를 적당한 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 합성하여, 적당한 플라스미드 벡터, 예를 들면 네덜란드 그로닌겐 소재의 Invitogen사의 pCRIITOPO내로 클로닝할 수 있다. PCR 방법의 요약은 문헌[Newton and Graham, "PCR" (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994]에서 찾아볼 수 있다.

뉴클레오티드 서열에 대한 공공연히 입수가능한 데이타 뱅크의 예로는 독일 하이델베르크소재의 European Molecular Biologies Laboratories (EMBL) 또는 미국 미들랜드주 베테스다에 소재하는 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 데이타 뱅크를 들 수 있다.

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로 부터 pyc 유전자를 분리하여 클로닝하는 방법이 문헌[DE-A-198 31 609 및 Koffas et al., Applied Microbiology and Biotechnology 50, 346-352 (1998)]에 기술되어 있다. pyc 유전자의 뉴클레오티드 서열은 수탁번호 제AF038548호 또는 제Y09548호 하에 입수될 수 있다.

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로 부터 lysE 유전자를 분리하여 클로닝하는 방법이 문헌[DE-A-195 48 222 공개공보]에 기술되어 있다. lysE 유전자의 뉴클레오티드 서열은 수탁번호 제X96471호 하에 입수될 수 있다.

코리네박테리움 글루타미쿰의 각종 균주로 부터 dapA 유전자를 분리하여 클로닝하고, 서열분석하는 방법이 문헌[Cremer et al., Molecular and General Genetics 200: 478-480 (1990); Pisabarro et al., Journal of Bacteriology 175: 2743-2749 (1993) 및, Bonnassie et al., Nucleic Acids Reserach 18: 6421 (1990)]에 기술되어 있다. 문헌[DE-A-39 43 117]의 보고에 의하면, 플라스미드 pJC23를 사용하여 dapA 유전자를 증폭시킨다. dapA 유전자의 뉴클레오티드 서열은 수탁번호 제X53993호 하에 입수될 수 있다.

브레비박테리움 락토페르멘툼으로 부터 dapB 유전자를 분리하여 클로닝하고, 서열분석하는 방법이 문헌[Pisabarro et al., Journal of Bacteriology 175: 2743-2749 (1993)]에 기술되어 있다. dapB 유전자의 뉴클레오티드 서열은 수탁번호 제X67737호 하에 입수될 수 있다.

피드백-내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 대립유전자를 분리하여 클로닝하고, 서열분석하는 방법이 여러 저자에 의해 보고되고 있다. 즉, 문헌[Kalinowski et al., Molecular and General Genetics 224: 317-324 (1990)]에는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DM58-1로 부터의 lysC 대립유전자가 보고되어 있다. 문헌[DE-A-39 43 117]의 보고에 의하면, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 MH20으로 부터 lysC 대립유전자를 클로닝한다. 문헌[Follettie et al., Joural of Bacteriology 175: 4096-4103]에는 코리네박테리움 플라붐 균주 NC13으로 부터의 lysC 대립유전자(이는 상기 문헌에서는 ask로 불린다)가 보고되어 있다. lysC 유전자 및 각종 lysC 대립유전자의 뉴클레오티드 서열은 특히 수탁번호 제X57226호 및 제E06826호 하에 입수될 수 있다.

이 후, 상기와 같은 방법으로 입수된 유전자를 특히 플라스미드 벡터, 예를 들면 pJC1[참조: Cremer et al., Molecular and General Genetics 220, 478-480 (1990)] 또는 pEC5[참조: Eikmanns et al., Gene, 102, 93-98 (1991)]내로 독립적으로 또는 적당히 조합하여 삽입한 후, 형질전환[참조: Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1998)] 또는 전기천공[참조: Dunican and Shivnan(Bio/Technology 7, 1067-1070 (1980)]에 의해 목적하는 코리네박테리아 균주, 예를 들면 균주 MH20-22B[참조: Schrumpf et al., Applied Microbiology and Biotechnology 37: 566-571 (1992)]로 이송하여, 발현시킨다. 선택될 균주도 마찬가지로 목적 유전자(들)를 각각 포함하는 두 개의 플라스미드로 형질전환시킬수 있으므로, pyc 유전자의 공지된 증폭외에 2 이상의 유전자를 유리하게 동시에 증폭 발현시킬 수 있다.

상기와 같은 균주의 예는 다음과 같다:

·균주 MH20-22B/pJC23/pEC7pyc; pyc 및 dapA 유전자가 동시 증폭에 의해 발현된다.

·균주 MH20-22B/pJC33/pEC7pyc; pyc 및 lysC(FBR) 대립유전자가 동시에 증폭, 특히 과발현된다.

·균주 MH20-22B/pJC23/pEC7dapBpyc; pyc, dapA 및 dapB 유전자가 동시에 증폭, 특히 과발현된다.

·균주 MH20-22B/pJC23/pEC7lysEdapBpyc; pyc, dapA, dapB 및 lysE 유전자가 동시에 증폭, 특히 과발현된다.

본 발명에 따라 제조된 미생물은, L-리신의 생산을 위해, 배치 공정, 공급 배치 공정 또는 반복적 공급 배치 공정에 의해 연속적으로 또는 불연속적으로 배양될 수 있다. 공지된 배양 방법의 요약은 크미엘(Chmiel)의 교과서[Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioengineering) (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)] 및 스토하스(Storhas)의 교과서[Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Bioreactors and Peripheral Equipment) (View Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)]에 제공되어 있다.

사용될 배양 배지는 특정 균주의 요구를 적당히 충족시켜야 한다. 각종 미생물의 배양 배지에 대한 기술은 편람["Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981)]에서 찾아볼 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원은 당류와 탄수화물(예: 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈 프락토즈, 말토즈, 당밀, 전분 및 셀룰로즈), 오일과 지방(예: 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코낫 지방), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올), 및 유기산(아세트산)이다. 이들 물질은 독립적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원은 유기 질소-함유 화합물(예: 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침적액, 대두분, 요소), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)이다. 질소원은 독립적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 인 공급원은 이수소인산 칼륨, 수소인산 이칼륨, 또는 상응하는 나트륨 염이다. 또한, 배양 배지는 성장에 필수적인 금속 염(예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유해야 한다. 최종적으로, 필수 성장-촉진 물질, 예를 들면 아미노산 및 비타민이 상기 언급된 물질에 추가하여 사용될 수 있다. 상기 공급 물질들은 상기 배지에 1회에 모두 가해지거나, 또는 배양중에 적당히 공급될 수 있다.

배지의 pH는 염기성 화합물, 예를 들면 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아, 또는 산성 화합물, 예를 들면 인산 또는 황산을 적당히 사용하여 조절한다. 발포는 소포제, 예를 들면 지방산 폴리글리콜 에스테르를 사용하여 조절할 수 있다. 플라스미드의 안정성은 적당히 선택적으로 작용하는 물질, 예를 들면 항생제를 배지에 가함으로써 유지될 수 있다. 호기성 조건은 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물(예: 공기)를 배지에 도입함으로써 유지될 수 있다. 배지의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. L-리신의 형성이 최대에 이를 때까지, 배양을 계속한다. 이러한 목표는 통상적으로 10 시간 내지 160 시간내에 달성될 수 있다.

형성된 L-리신의 농도를, 이온 교환 크로마토그래피 및 닌하이드린 검출에 의한 칼럼후(postcolumn) 반응을 사용하여 아미노산 분석기로 측정할 수 있다[참조 문헌: Spackmann et al., Analytical Chemistry 30, 1190 (1958)].

하기 미생물은 부다페스트 조약하에 독일 브라운쉬바이크에 소재하는 국제기탁기관[Deutsche Sammlung fur Mikrorganismen und Zellkulturen(DSMZ)]에 기탁되었다:

·에스체리키아 콜라이 K-12 균주 DH5α/pEC7pyc(수탁번호: DSM 12866)

·에스체리키아 콜라이 K-12 균주 DH5α/pEC7dapBpyc(수탁번호: DSM 12873)

·에스체리키아 콜라이 K-12 균주 DH5α/pEC7lysEdapBpyc(수탁번호: DSM 12874)

·코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5715/pJC23(수탁번호: DSM 12869)

·코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5715aecD::dapA(MA16)(수탁번호: DSM 12867).

·코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5715aecD::dapA(MC20)(수탁번호: DSM 12868).

·코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DM678(수탁번호: DSM 12866)

·에스체리키아 콜라이 K-12 균주 DH5α/pEC7lysEpyc

·에스체리키아 콜라이 K-12 균주 DH5α/pEC7lysE(수탁번호: DSM 12871)

·에스체리키아 콜라이 K-12 균주 DH5α/pEC7dapBlysE(수탁번호: DSM 12875)

실시예

본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명될 것이다.

실시예 1

lysE를 암호화하는 DNA의 제조

염색체 DNA를 통상의 방법[참조: Eikmanns et al., Microbiology 140: 1817-1828 (1994)]에 의해 균주 ATCC 13032로 부터 분리한다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)를 사용하여 lysE 유전자를 수반하는 DNA 단편을 증폭시킨다. 하기의 프라이머 올리고뉴클레오티드를, 코리네박테리움 글루타미쿰에 대해 공지된 lysE 유전자 서열[참조: Vrljic et al., Molecualr Microbiology 22(5), 815-826 (1996)](수탁번호: 제X96471호)을 기준으로 하여 선택하여 PCR을 수행한다:

LysBam1:

5' CTC GAC AGC (GGA TCC) GCG CTG ACT CAC C 3'

LysBam2:

5' GGA GAG TAC GGC (GGA TCC) ACC GTG ACC 3'

도시된 프라이머는 독일 에베르스베르크에 소재하는 MWG Biotech에 의해 합성되었고, PCR을 문헌[Innis et al., PCR protocols. A guide to methods and application, 1990, Academic Press]의 표준 PCR 방법을 사용하여 수행한다. 상기 프라이머를 이용하여 lysE 유전자를 수반하는 약 1.1kb DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 또한, 상기 프라이머는, 상기 뉴클레오티드 서열에서 괄호로 표시된, 제한 엔도뉴클리아제 BamHI의 절단 부위에 대한 서열을 포함한다.

lysE 유전자를 수반하는, 증폭된 약 1.1kb DNA 단편을 0.8% 아가로즈 겔에서의 전기영동에 의해 동정하여, 겔로 부터 분리하고, 독일 힐덴에 소재하는 Quiagen사의 QIAquick Gel Exrtaction Kit(cat. no. 28704)로 정제한다.

이어서, 상기 단편을 독일 만하임에 소재하는 Boehringer Mannheim사의 T4 DNA 리가제를 사용하여 벡터 pUC8[참조: Norrander et al., Gene (26) 101-106 (1983)]에 결합시킨다. 이는 제한 엔도뉴클리아제 SmaI으로 벡터 pUC18을 완전히 절단하고 이를 알카린 포스파타제(독일 만하임에 소재하는 Boehringer Mannheim)로 처리하여 수행한다. 당해 결합 혼합물로 이. 콜라이 균주 DH5α[참조: Hanahan, in: DNA cloning. A practical approach. Vol. I IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA]을 형질전환시킨다. 플라스미드-수반 세포를, 앰피실린 50mg/l를 보충시킨 LB 아가[참조: Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]상에 형질전환 혼합물을 플레이팅시켜 선별한다. 플라스미드 DNA를 형질전환체로 부터 분리하고, 제한효소 BamHI로 처리한 후 아가로즈 겔 전기영동에 의해 확인한다, 당해 플라스미드를 pUC18lysE로 칭한다.

실시예 2

dapB의 제조

염색체 DNA를, 실시예 1에 지시된 바와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC 13032로 부터 분리한다. 코리네박테리움 글루타미쿰으로 부터의 서열과 같은 dapB 유전자의 서열이 공지되어 있다(수탁번호 제X67737호). 그러나, 공개된 DNA 서열은 해독 개시점으로 부터 상부 56bp만을 포함하므로, 해독 개시점으로 부터의 상부 5' 말단의 서열을 추가로 분석한다.

상기 서열분석을, 공지된 dapB 서열(수탁번호 제X67737호)의 영역중에 결합하는 프라이머 올리고뉴클레오티드를 사용하여 플라스미드 pJC25[참조: EP-B 0435 132]로써 수행한다. 사용된 서열분석 프라이머의 서열은 다음과 같다:

5' GAA CGC CAA CCT TGA TTC C 3'

상기 서열분석을, 쇄 종결법[참조: Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (74) 5463-5467 (1997)]으로 수행한다. 서열분석 반응을 AutoRead Sequencing Kit(Pharmacia, Freiburg)를 이용하여 수행한다. 전기영동 분석 및 서열분석 생성물의 검출을 독일 프라이부르크에 소재하는 Pharmacia사의 A.L.F. DNA 서열분석기를 사용하여 수행한다.

전사 개시점 상부의 서열 데이타를 추가로 수득하기 위하여, 수득된 상기 DNA 서열을 사용하여 제2의 프라이머를 선택한다. 다음 프라이머가 이러한 목적으로서 선택된다:

5' CTT TGC CGC CGT TGG GTT C 3'

서열분석 반응을 상기한 바와 같이 수행한다. dapB 유전자 상부의 새로운 서열이 서열 1로서 도시된다. dapB 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함한 서열은 서열 2로서 도시된다.

폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 dapB 유전자를 증폭시킨다. 이러한 목적을 위해, dapB 유전자의 공지된 DNA 서열을 기준으로 하여 선택된 두 개의 프라이머 올리고뉴클레오티드가 MWG Biotech에 의해 합성되었다:

P-dap:

5' (AAG CTT) AGG TTG TAG GCG TTG AGC 3'

dapall:

5' TTA ACT TGT TCG GCC ACA GC 3'

5' 프라이머 (프라이머 P-dap)는 상기 서열에서 괄호로 표시된 HindIII 절단 부위를 포함한다. PCR을 실시예 1에서와 같이 수행한다. dapBd 유전자를 수반하고 각 말단에 제한 엔도뉴클리아제 HindIII에 대한 절단 부위를 포함하는 약 1.1 kb DNA 단편을 상기와 같은 방법으로 증폭시킨다. 수득된 PCR 단편을 0.8% 아가로즈 겔(독일 힐덴에 소재하는 Qiagen사의 QIAquick Gel Extraction Kit)로 부터 정제하고, TOPO TA Cloning Kit(네덜란드 레에크에 소재하는 Invitrogen사, cat. no. K4550-01)를 사용하여 클로닝 벡터 pCR2.1TOPO(네덜란드 레에크에 소재하는 Invitrogen사)내로 클로닝시킨다. 결합 혼합물로 Invitrogen사의 이. 콜라이 균주 TOP10F'를 형질전환시키고, 형질전환 혼합물을 카나마이신(50mg/l), IPTG(0.16mM) 및 X-Gal(64mg/l)를 함유하는 LB 아가상에 플레이팅한 후, 백색 클로니를 분리한다. 플라스미드 DNA를, Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 이용하여 형질전환체로 부터 분리하고, 제한효소 HindIII로 절단한 후 아가로즈 겔 전기영동을 수행하여 확인한다. 증폭된 DNA 단편의 DNA 서열을 서열분석에 의해 확인한다. PCR 생성물의 서열은 서열 1에 도시된 서열과 일치한다. 수득된 플라스미드를 pCR2.1TOPOdapB로 칭한다.

실시예 3

pyc를 암호화하는 DNA의 제조

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC 13032를 염색체 DNA의 공여자로서 사용한다. 염색체 DNA를 실시예 1에 기술된 바와 같이 균주 ATCC 13032로부터 분리한다. 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 pyc 유전자를 수반하는 DNA 단편을 증폭시킨다. 하기의 프라이머 올리고뉴클레오티드를, 코리네박테리움 글루타미쿰에 대해 공지된 pyc 유전자 서열[참조: Peters-Wendisch et al., Microbiology 144, 915-927 (1998)](수탁번호: 제Y09548호)을 기준으로 하여 선택하여 PCR을 수행한다:

5-PYC-IN:

5' GC(T CTA GA)A GTG TCG CAA CCG TGC TTG A 3'

3-PYC-IN:

5' GC(T CTA GA)T TGA GCC TTG GTC TCC ATC T 3'

도시된 프라이머는 MWG Biotech에 의해 합성되었고, PCR 반응을 문헌[Innis et al., PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press]의 표준 PCR 방법을 사용하여 수행한다. 상기 프라이머를 이용하여 pyc 유전자를 수반하는 약 3.8kb DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 또한, 상기 프라이머는, 상기 뉴클레오티드 서열에서 괄호로 표시된, 제한 엔도뉴클리아제의 XbaI의 절단 부위에 대한 서열을 포함한다.

pyc 유전자를 수반하는, 증폭된 약 3.8kb DNA 단편을 0.8% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 동정하고, 겔로 부터 분리한 후, 통상의 방법(독일 힐덴에 소재하는 Quiagen사의 QIAquick Gel Exrtaction Kit)으로 정제한다.

이어서, 상기 단편을 Dual Promotor Topo TA Cloning Kit(네덜란드 리에크에 소재하는 Invitrogen사, cat. no. K4600-01)을 사용하여 벡터 pCRII-TOPO에 결합시킨다. 당해 결합 혼합물로 이. 콜라이 균주 TOP10(네덜란드 레에크에 소재하는 Invitrogen사)을 형질전환시킨다. 플라스미드-수반 세포를, 카나마이신 50mg/l 및 X-Gal 64mg/l를 함유한 LB 아가상에 형질전환 혼합물을 플레이팅하여 선별한다.

DNA의 분리 후, 수득된 플라스미드를 제한효소 절단으로 확인하고 아가로즈 겔에서 동정한다, 당해 플라스미드를 pCRII-TOPOpyc로 칭하고, 클로닝된 삽입체의 DNA 서열을 대조 목적으로 서열분석한다. pCRII-TOPOpyc중의 pyc 삽입체의 판정된 서열이 유전자 라이브러리 집합물의 서열과 일치하기 때문에, 이러한 플라스미드는 후속적으로 사용된다.

실시예 4

벡터 pEC7내로의 dapB의 클로닝

dapB 유전자를 수반하는 약 1.1kb DNA 단편을 플라스미드 pCR2.1TOPOdapB(실시예 2)로 부터 분리한다. 이를 위하여, 플라스미드 pCR2.1TOPOdapB를 제한효소 HindIII로 완전히 분해하고, dapB 유전자를 수반하는 약 1.1kb DNA 단편을 분리한다.

dapB 단편을 벡터 pEC7내로 삽입한다. 벡터 pEC7는 이. 콜라이 - 코리네박테리움 글루타미쿰 왕복 벡터 pEC5[참조: Eikmanns et al., 102: 93-98 (1991)]를 기초로 한 것이다. 폴리링커에 위치한 BamHI 절단 부위 not를 하기 방법으로 플라스미드 pEC5로 부터 제거한다: 플라스미드 pEC5를 제한효소 BamHI으로 부분적으로 절단한다. 약 7.2kb DNA 단편을 아가로즈 겔로 부터 분리하고, 돌출 말단을 클레노우(Klenow) 폴리머라제(Boehringer Mannheim)를 사용하여 메운다. 생성된 DNA 단편을 결합시킨다(T4 리가제, Boehringer Mannheim). 결합 혼합물로 이. 콜라이 균주 DH5α를 형질전환시키고, 카나마이신(50mg/l)을 함유하는 LB 아가상에서 카나마이신-내성 콜로니를 분리한다. 플라스미드 DNA를 형질전환체로 부터 분리하고( Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit 이용), 제한효소 BamHI 및 PstI으로 제한 절단하여 확인한다. 생성된 플라스미드를 pEC6으로 칭한다.

플라스미드 pEC6을 제한효소 XhoI으로 완전히 절단한다. trp 테미네이터를 수반하는 DNA 단편을 벡터 DNA 단편에 결합시킨다(T4 리가제, Boehringer Mannheim). 결합 혼합물로 이. 콜라이 균주 DH5α를 형질전환시키고, 카나마이신(50mg/l)을 함유하는 LB 아가상에서 카나마이신-내성 콜로니를 분리한다. 플라스미드 DNA를 형질전환체로 부터 분리하고(Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit 이용), 제한효소 BamHI 및 XohI으로 제한 절단하여 확인한다. 생성된 플라스미드를 pEC7로 칭한다.

수득된 dapB-수반 DNA 단편을, 제한효소 HindIII로 완전히 분해하고 알카린 포스파타제(Boehringer Mannheim)로 처리되어진 벡터 pEC7에 결합시킨다(T4 리가제, Boehringer Mannheim). 결합 혼합물로 이. 콜라이 균주 DH5α를 형질전환시키고, 카나마이신(50mg/l)을 함유하는 LB 아가상에서 카나마이신-내성 콜로니를 분리한다. 플라스미드 DNA를 형질전환체로 부터 분리하고(Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit 이용), 제한효소 HindIII로 제한 절단하여 확인한다. 생성된 플라스미드를 pEC7dapB(도 1)로 칭한다. 수득된 에스체리키아 콜라이 균주를 DH5α/pEC7dapB로 칭한다.

실시예 5

벡터 pEC7내로의 lysE의 클로닝

실시예 1에 기술된 플라스미드 pUC18lysE를 제한효소 BamHI으로 완전히 분해하고, lysE 유전자를 수반하는 BamHI 단편을 실시예 1에서와 같이 분리한다. 벡터 pEC7을 마찬가지로 제한효소 BamHI으로 완전히 절단하고 알카린 포스포타제로 처리한다. BamHI 벡터 단편 및 BamHI lysE 단편을 결합시키고(Rapid DNA Ligation Kit, Boehringer Mannheim), 이. 콜라이 균주 DH5α를 형질전환시킨다. 플라스미드-수반 형질전환체를 클로르암페니콜(10mg/l)을 함유하는 LB 아가상에서 선별한다. 플라스미드 DNA를 분리하고(Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit 이용), 제한효소 BamHI으로 제한 절단하여 확인한다. 생성된 플라스미드를 pEC7lysE(도 2)로 칭한다. 플라스미드 pEC7lysE로 이. 콜라이 균주 DH5α를 형질전환시킴으로써 수득된 균주를 DH5α/pEC7lysE로 칭한다.

실시예 6

벡터 pEC7내로의 pyc의 클로닝

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로 부터의 pyc 유전자를 수반하는 3.8kb DNA 단편을, 제한효소 XbaI으로 절단하여 플라스미드 pCRII-TOPOpyc(실시예 3 참조)로 부터 수득한다. 3.8kb DNA 단편을 겔 전기영동으로 동정하고, 겔로 부터 분리한 후 통상의 방법으로 정제하며, 돌출 말단을 클레노우 폴리머라제를 사용하여 메운다. 벡터 pEC7을 마찬가지로 제한효소 SmaI으로 완전히 절단하고 알카릴 포스파타제로 처리한다. 클레노우 폴리머라제로 처리된 SmaI 벡터 단편 및 XbaI pyc 단편을 결합시키고(T4 리가제, Boehringer Mannheim), 이. 콜라이 균주 DH5α를 형질전환시킨다. 플라스미드-수반 형질전환체를 클로르암페니콜(10mg/l)을 함유하는 LB 아가상에서 선별한다. 플라스미드 DNA를 분리하고(독일 힐덴에 소재하는 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit 이용), 제한효소 SalI으로 제한 절단하여 확인한다. 생성된 플라스미드를 pEC7pyc(도 3)로 칭한다. 플라스미드 pEC7pyc로 이. 콜라이 균주 DH5α를 형질전환시킴으로써 수득된 이. 콜라이 균주를 DH5α/pEC7pyc로 칭한다.

실시예 7

lysE 및 dapB를 포함하는 플라스미드의 제조

dapB 유전자를, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로 부터의 dapB 유전자를 포함하는 플라스미드 pCR2.1TOPOdapB로 부터 HindIII 단편으로서 분리한다. 이를 위하여, 플라스미드를 제한효소 HindIII으로 완전히 분해하고, dapB-수반 DNA 단편을 0.8% 아가로즈 겔(QIAquick Gel Extration Kit, Qiagen)로 부터 분리한다.

또한, 벡터 pEC7lysE를 제한효소 HindIII으로 완전히 분해하고, 알카린 포스파타제로 처리한다. dapB를 포함하는 1.1kb 단편을 생성된 선형 벡터 단편에 결합시키고(T4 리가제, Boehringer Mannheim), 결합 혼합물로 이. 콜라이 균주 DH5α를 형질전환시킨다. 플라스미드-수반 형질전환체를 클로르암페니콜(10mg/l)을 함유하는 LB 아가상에서 선별한다. 플라스미드 DNA를 분리하고(독일 힐덴에 소재하는 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit 이용), 제한효소 HindIII으로 제한 절단하여 확인한다.

생성된 플라스미드를 pEC7lysEdapB로 칭한다. 이 플라스미드는 에스체리키아와 코리네박테리움 글루타미쿰에서 자가 복제능을 지니며, 이의 숙주에서 항생제 콜로르암페니콜에 대해 내성을 부여한다.

플라스미드 pEC7lysEdapB는 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제를 암호화하는 dapB 유전자와 리신 배송체를 암호화하는 lysE 유전자를 동시에 포함한다.

pEC7lysEdapB로 이. 콜라이 DH5α를 형질전환시킴으로써 수득된 균주는 기탁되었다.

실시예 8

dapB와 pyc를 동시에 포함하는 플라스미드의 제조

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로 부터의 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자를 수반하는 플라스미드를 제한효소 XbaI으로 완전히 절단하고, 돌출 말단을 실시예 6에 기술된 바와 같이 클레노우 폴리머라제를 사용하여 메움으로써, 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 유전자를 포함하는 3.8kb DNA 단편을 분리할 수 있다.

또한, 플라스미드 pEC7dapB(실시예 4 참조)를 제한효소 SmaI으로 완전히 절단하고, 당해 말단을 알카린 포스포타제로 처리한다. 생성된 선형 벡터 단편을 T4 리가제(독일 만하임에 소재하는 Boehringer Mannheim)를 사용하여 pyc 유전자를 포함하는 3.8kb DNA 단편에 결합시킨다. 이로써 코리네박테리아로 부터의 dapB 유전자 및 pyc 유전자 둘다를 모두 포함하는 플라스미드가 생성된다. 플라스미드-수반 형질전환체를 클로르암페니콜(10mg/l)을 함유하는 LB 아가상에서 선별한다. 플라스미드 DNA를 분리하고(독일 힐덴에 소재하는 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit 이용), 제한효소 SalI으로 제한 절단하여 확인한다. 당해 플라스미드는 도 4에 도시되어 있으며, 이를 pEC7dapBpyc로 칭한다. 플라스미드 pEC7dapBpyc로 이. 콜라이 균주 DH5α를 형질전환시킴으로써 수득된 이. 콜라이 균주를 DH5α/pEC7dapBpyc로 칭한다.

실시예 9

lysE, dapB 및 pyc를 동시에 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드의 제조

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로 부터의 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자를 수반하는 플라스미드 pCRII-TOPOpyc(실시예 3 참조)를 실시예 6에 기술된 바와 같이 제한효소 XbaI으로 완전히 절단하고 클레노우 폴리머라제로 처리함으로써, 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 유전자를 포함하는 3.8kb DNA 단편을 분리할 수 있다.

또한, 플라스미드 pEC7dapBlycE를 제한효소 SmaI으로 완전히 절단하고, 당해 말단을 알카린 포스포타제로 처리한다. 생성된 선형 벡터 단편을 T4 리가제(Boehringer Mannheim)를 사용하여 pyc 유전자를 포함하는 3.8kb DNA 단편에 결합시킨다. 이로써 코리네박테리움 글루타미쿰으로 부터의 lysE 유전자, dapB 유전자 및 pyc 유전자를 모두 포함하는 플라스미드가 생성된다. 플라스미드-수반 형질전환체를 클로르암페니콜(10mg/l)을 함유하는 LB 아가상에서 선별한다. 플라스미드 DNA를 분리하고(독일 힐덴에 소재하는 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit 이용), 제한효소 SalI으로 제한 절단하여 확인한다. 당해 플라스미드는 도 5에 도시되어 있으며, 이를 pEC7dapBlysEpyc로 칭한다. 플라스미드 pEC7dapBlysEpyc로 이. 콜라이 균주 DH5α를 형질전환시킴으로써 수득된 이. 콜라이 균주를 DH5α/pEC7dapBlysEpyc로 칭한다.

실시예 10

플라스미드 pJC23 및 pJC33에 의한 균주 MH20-22B의 형질전환

플라스미드 pJC1은 에스체리키아 콜라이와 코리네박테리움 글루타미쿰에서 복제능을 갖는 플라스미드이다[참조: Cremer et al., Molecular and General Genetics 220: 478-480 (1990)]. 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 MH20-22B로 부터의 lysC(Fbr) 유전자를 수반하는 플라스미드 pJC3[참조: Cremer et al., Applied and Environmental Microbiology 57(6), 1746-1752 (1991)]은 상기 플라스미드로 부터 유래된다.

또한, 플라스미드 pJC23은 벡터 pJC1를 기초로 하며, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로 부터의 dapA 유전자를 수반한다[참조: Cremer et al., Molecular and General Genetics 220: 478-480 (1990)](EP-B 0435 132). 플라스미드 pJC1, pJC33 및 pJC23을 전기천공법에 의해 균주 MH20-22B내로 도입한다[참조: Haynes and Britz, FEMS Microbiology Letters (61) 329-334 (1989)]. 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 MH-20-22B는 수탁번호 제DSM 5715호 하에 기탁된 AEC-내성 리신 생산자이다.

전기천공에 의해 수득된 형질전환체를, 카나마이신 15mg/l를 함유하는 선별 아가[LBHIS 아가(뇌-심장(brain-heart) 주입 브로쓰 18.5g/l, 0.5M 소르비톨, 박토 트립톤 5g/l, 박토 효모 추출물 2.5g/l, NaCl 5g/l, 박토 아가 18g/l)]상에서 분리한다. 플라스미드 DNA를 통상의 방법[참조: Peters-wendisch et al., Microbiology 144, 915-927 (1998)]으로 분리하고, 적당한 제한 엔도뉴클리아제로 절단하여 확인한다. 수득된 균주를 MH20-22B/pJC1, MH20-22B/pJC33 및 MH20-22B/pJC23으로 칭한다.

실시예 11

플라스미드 pEC7pyc, pEC7dapBpyc 및 pEC7dapBlysEpyc에 의한 형질전환

실시예 10에서 제조된 균주가 후속적으로 제2 플라스미드에 제공된다.

다음의 플라스미드를 전기천공법에 의해 기술된 균주 MH20-22B/pJC1, MH20-22B/pJC33 및 MH20-22B/pJC23에 도입한다:

·pEC7pyc (참조: 실시예 6)

·pEC7dapBpyc (참조: 실시예 7)

·pEC7dapBlysEpyc (참조: 실시예 8)

형질전환된 박테리아를 이들이 포함하는 플라스미드의 항생제 내성을 기준으로 하여 선별한다. 전기천공에 의해 수득된 형질전환체를 선별 아가(카나마이신 15mg/l 및 클로르암페니콜 7.5mg/l를 함유하는 LBHIS 아가)상에서 분리한다. 플라스미드 DNA를 분리하고, 적당한 제한 엔도뉴클리아제로 절단하여 확인한다.

수득된 균주의 목록은 다음과 같다:

DSM5715/pJC1/pEC7pyc,

DSM5715/pJC33/pEC7pyc,

DSM5715/pJC23/pEC7pyc,

DSM5715/pJC23/pEC7dapBpyc,

DSM5715/pJC23/pEC7lysEdapBpyc.

실시예 12

L-리신의 제조

실시예 10에서 수득된 각종 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 리신 생산에 적합한 영양 배지에서 배양하고, 배양 상층액의 리신 함량을 측정한다.

이는, 1차로 각종 균주를 적당한 항생제를 포함하는 아가[카나마이신(25mg/l) 및 클로르암페니콜(10mg/l)을 함유하는 뇌-심장 아가] 플레이트상에서 24 시간 동안 33℃에서 배양함으로써 이루어진다. 이들 아가 플레이트 배양물을 사용하여 예비배양물(100ml의 원뿔형 플라스크중의 배지 10ml)을 접종한다. 완전 배지 CgIII를 예비배양 배지로서 사용한다. 카나마이신 25mg/l와 클로르암페니콜 10mg/l를 가한다. 예비배양물을 240rpm의 진탕기내에서 33℃로 24시간 동안 배양한다. 이 예비배양물을 사용하여 주 배양물을 접종함으로써 초기 OD(660nm) 0.2를 수득한다. 배지 MM을 주 배양을 위해 사용한다.

배지 MM:

CSL 5g/l

MOPS 20g/l

글루코즈 50g/l(오토클레이브 별도)

염:

(NH₄)₂SO₄25g/l

KH₂PO₄0.1g/l

MgSO₄ ^*7H₂O 1.0g/l

CaCl₂ ^*2H₂O 10mg/l

FeSO₄ ^*7H₂O 10mg/l

MnSO₄ ^*H₂O 5.0mg/l

비오틴 0.3mg/l(멸균-여과)

티아민^*HCl 0.2mg/l(멸균-여과)

CaCO₃25mg/l

약어:

CSL: 옥수수 침적액

MOPS: 모르폴리노프로판설폰산

CSL, MOPS 및 염 용액을 수성 암모니아를 사용하여 pH 7로 조정하고, 오토클레이빙한다. 이어서, 멸균 기질과 비타민 용액 및 오토클레이빙 건조된 CaCO₃를 가한다.

배양을, 배플이 있는 100ml의 원뿔형 플라스크에서 10ml 용량으로 수행한다. 카나마이신 25mg/l 및 클로르암페니콜 10mg/l를 가한다. 배양을 33℃ 및 80% 대기 습도에서 진행한다.

72 시간 후, OD를 660nm의 파장에서 측정한다. 형성된 리신의 양을, 이온 교환 크로마토그래피 및 닌하이드린 검출에 의한 칼럼후 유도화를 통해 독일 함부르크에 소재하는 Eppendorf BioTronik사의 아미노산 분석기를 사용하여 측정한다. 글루코즈 함량은 독일 에르켈렌츠에 소재하는 Skalar Analytik GmbH사의 당 분석기를 사용하여 측정한다.

실험 결과는 표 1에 주어진다.

균주	유전자	OD(660)	리신-HCl g/l
DSM5715/pJC1/pEC7pyc	pyc	9.3	11.3
DSM5715/pJC33/pEC7pyc	pyc, lysC(Fbr)	9.2	11.9
DSM5715/pJC23/pEC7pyc	pyc, dapA	9.3	14.4
DSM5715/pJC23/pEC7dapBpyc	pyc, dapA, dapB	9.3	16.9
DSM5715/pJC23/pEC7lysEdapBpyc	pyc, dapA, dapB, lysE	9.1	17.6

본 발명의 코리네박테리아를 이용하여 L-리신을 보다 개선된 방법으로 생산할 수 있다.

Claims

pyc 유전자가 증폭되고, 추가로 dapA 유전자, lysC 유전자, lysE 유전자 및 dapB 유전자로 이루어진 그룹중에서 선택된 유전자가 독립적으로 또는 함께 증폭, 특히 과발현된 L-리신-생산 코리네박테리아.
제1항에 있어서, dapA 유전자 및 임의로 dapB 유전자가 증폭, 특히 과발현된 코리네박테리아.
제1항에 있어서, dapA 유전자, dapB 유전자 및 lysE 유전자가 증폭, 특히 과발현된 코리네박테리아.
제1항에 있어서, 서열 5 및 서열 6에 도시된 dapA 프로모터의 MC20 또는 MA16 돌연변이를 포함하는 코리네박테리아.
제1항에 있어서, 서열 1에 도시된, dapB 유전자의 해독 개시점 상부의 5' 말단을 추가로 포함하는 dapB 유전자가 증폭, 특히 과발현된 코리네박테리아.
서열 1에 도시된, dapB 유전자의 해독 영역 상부의 5' 말단을 포함하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 코리네박테리아에서 복제능을 지닌 코리네박테리움 기원의 바람직한 재조합 DNA.
제5항에 있어서, 서열 1에 도시된 뉴클레오티드 서열을 지닌 복제능의 DNA.
pyc 유전자가 증폭되고, 추가로 dapA 유전자, lysC 유전자, lysE 유전자 및 dapB 유전자로 이루어진 그룹중에서 선택된 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 독립적으로 또는 함께 증폭, 특히 과발현된 코리네박테리아를 사용하는 발효에 의해 L-리신을 제조하는 방법.
제8항에 있어서, dapA 유전자 및 임의로 lysC 유전자가 동시에 증폭, 특히 과발현된 박테리아를 사용하는 방법.
제8항에 있어서, dapA 유전자 , dapB 유전자 및 lysE 유전자가 동시에 증폭, 특히 과발현된 박테리아를 사용하는 방법.
제8항에 있어서, 증폭될 하나 이상의 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 수반하는 하나 이상의 플라스미드 벡터로 형질전환된 균주를 사용하는 방법.
제8항에 있어서, pyc, dapA, dapB 및 lysE 유전자로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상의 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 수반하는 하나 이상의 플라스미드 벡터로 형질전환된 균주를 사용하는 방법.
제8항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 박테리아를 사용하는 방법.
제8항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서,

a) 상기한 유전자가 증폭된 L-리신-생산 박테리아를 발효시키는 단계,

b) 배지중에 또는 박테리아 세포중에 L-리신을 농축시키는 단계, 및

c) L-리신을 분리하는 단계를 수행하여, 발효에 의해 L-리신을 제조하는 방법.
수탁번호 제DSM 12871호로 기탁된 에스체리키아 콜라이 K-12 균주 DH5α/pEC7lysE.
수탁번호 제DSM 12875호로 기탁된 에스체리키아 콜라이 K-12 균주 DH5α/pEC7dapBlysE.
수탁번호 제DSM 12869호로 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5715/pJC23.
수탁번호 제DSM 12867호로 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5715aecD::dapA(MA16).
수탁번호 제DSM 12868호로 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5715aecD::dapA(MC20).
수탁번호 제DSM 12866호로 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DM 678.
서열 5에 도시된 뉴클레오티드 서열 MC20을 지닌 복제능의 DNA.
서열 6에 도시된 뉴클레오티드 서열 MC16을 지닌 복제능의 DNA.