PT94805B - Processo para a preparacao de um macrolido antiparasitario relacionado com as milbemicinas - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A PREPARAçSO DE UM MACRÓLIDO ΑΝΤΪPARASITARIO RELACIONADO COM AS MILBEHICIMAS

ME •iur

DESCRITIVA

Resumo

O presente invento diz respeito preparação de um composto antibiótico com a a um proceso para a fórmulas-

que é um agente antiparasitário activo contra pragas de insectos, ácaros, nemátodos vivendo livres e endo- e ectoparasitas» 0 referido composto é preparado pela fermentação usando o microorganisino Str eptomyc es driseochromoqenes ATCC 53928»

I

Este invento relaciona-se com um novo agente antiparasitário e em particular com um novo macrólido relacionado com as milbemicinas, cos um processo para a sua preparação, e com composições que o contêm»

As milbemicinas formam um grupo importante de agentes antiparasitários de amplo espectro possuindo actividade anti-helmíntica, ectoparasiticida, insecticida, antibacteriana, anti-fungica e promotora do crescimento com aplicação em áreas da saúde animal e humana, da agricultura e da borticultura» São produzidas por fermentação de certos microorganismos do género Streptomyces em condições asróbicas e num meio nutritivo sólido contendo sais inorgânicos e fontes assimiláveis de carbono e de azoto. Por exemplo, a fermentação do microorganismo S treptomyces hyqroscopicus spp aureolacrimosus B-4Í-146 tal como é descrita na

Apresentação da Patente Britânica

390336 produz uma família de milbemicinas conhecidas colectivamente como os compostos B-4Í. Num outro exemplo, a fermentação de S treptomyces Cyaneoqriseus, spp noncyanoqenus tal como é descrita na apresentação da PatenteEuropeia EP-A-0170006 produz uma outra família de milbemicinas conhecida colectivamente como os compostos LL-F28249,

Os compostos relacionados com as milbemicinas são descritos em EP-A-0254583» São obtidos por fermentação de microorganismos Streptomyces conhecidos como Streptomyces £225 e Streptomyces E225B.

Descobrimos sctualmente um novo macrólido aqui designado como UK-86.956 que pode ser produzido pela cultura de novos microorganismos Streptomyces qriseochromoqenes N859-Í24 tal como é descrito mais abaixo, 0 composto muito activo UK-86,956 possui um espectro amplo de actividade contra as pragas de insectos, de ácaros5 de nemátodos vivendo livres e que atormentam animais e seres humanos.

de endo- e ectoparasitas

Assim um aspecto do presente invento proporciona o composto UK-86»95à_? que se pensa ter a fórmula Cíis

UK-3Ó.956 distingue-se da composto LL-~F2Q249íí descrita em EP~-A~0170®®6 por possuir um substituinte hidroxi na posição C-22 em vez de na posição 0-23 = Também se distingue dos compostas apresentados em EP-A—0254583 por terem um radical 1,3—dimetilbut— -1-enilo na posição 25 em vez de um radical 1-metiiprop-l-enilo.

UK-Bó«95ó pode ser produzido pela fermentação aeróbica submersa em meios nutritivos aquosos ou por uma fermentação de agar sólido em condições aeróbicas de um microorganismo isolado a partir de uma amostra de solo recolhida em Itoh City, Shizuoka Prefecture, Japan. Estes microorganismos foram depositados na American Type Culture Coílection, 123® í Parklawn Drive, Rockvílle, Maryland 20S52, USA sob o número de acesso ATCC 53928 em 29 de Junho de 1939. É aqui designada como cultura MS59-124» Foi caracterizada como se segues

I τ

A cultura N859-124 foi plantada a partir ds um plano inclinado num caldo ATCC #172 e feita crescer durante quatro dias a 28*C num -agitador» Foi então centrifugada durante 2ô minutos, lavada três vezes com agua estéril e plantada em meio habitualmente usado para identificação de membros dos Actinomycetales»

A cultura foi incubada a 28°C s os resultados foram lidos em vários tempos mas mais habitualmente foram lidos aos 14 dias» As cores foram descritas com terminologia comum, mas as cores exactas foram determinadas por comparações com peças coloridas do Color Harmony Manual,, quarta edição» Os métodos das análises do amino ácido e do açúcar da célula total são os descritos em Decker, B» et al»,, Appl» Microbiol», 12s 421-423, 1964|e em Lecbevalier, M.P», J» Lab» Clin» Med», 7is 934-944, 1968» Com finalidades comparativas, as estirpes tipo Sreptomvces qriseochromooenes ATCC 14511 e S» durbamensis ATCC 23194 foram compradas á American Type Culture Collection em Rockville, Maryland»

Os meios de identificação usados para a das cu 1 tu.ras seques e referencias para a sua composição são como se

í. Caldo tíe Extracto de Triptona-Levedura - ímeio IBP #1, Difco5»

Agar Extracto de levedura~Extracto de Malte - (meio IBP #2, Difco)»

Agar de Farinha de Aveia - (meio IBP #3, Difco)»

Agar Sais Inargãnicos-Araitío - (meio IBP #4, Difco) r

5, ftgsr b'IIcerol™Asparagina - (meio ISP #5_? Difca) .

h, Agar Peptona-Extracto de Levedura de Ferro - (meio ISP #6,

Difca)«

7, Agar Czapek-Sucrose - S» A. Waksman, The Aotinomycetes, Vol. 2, meia no« 1, p» 328, 19ól =

8. Agar Blucose-Asparagina - Ibid, meio no» 2, p. 328»

9« Agar de Bennett - Ibid, meia na- 30, p, 33110, Agar de Emerson - Ibid, meio no» 28, p, 331» íl« Agar Nutriente - Ibid, meio no» 14, p» 330»

12« Agar Tirosina de Bordon and Smith - R« E= Bordon and Μ- M» Smith, J» Bacteriol» 69» 147-150, 1955»

13« Agar de Caseina - Ibid»

14» Agar de Malato de Cálcio - S. A» Waksman, Bacteriol»

Rev» 21s 1-29, 1957»

15« Gelatina - R» E = Gordon and 3. M» Mihffl, 3»

Bacteriol» 73s 15-27, 1957,

16» Amido - Ibid

17» Caldo de Nitrato Orgânico - Ibid»

18» Caldo de Nitrato de Dextrose - 8» A» Waksman, The Actinomycetes, Vol» 2, meio no» 1, p. 328, 1981, ϊ ¥

com 30 g de sucross substituídos por 3 g de dextrose e omitindo-se o -agar»

19, Agar de Batata e Cenoura - Μ. P» Lechevalier, J. Lab» and Clinicai Med, 7ís 934-944, 1968, mas usando apenas 30 g de batatas, 2,5 g de cenouras e 20 g de agar»

2@, Agar em 2% de Agua da Torneira,

21, Leite Magro - Difco,

22, Utilização da Celuloseaí H, L, Jensen, Proc, Linn, Soc» N=S,W« 55s 231-248, 193Ô.

b) M, Levine and H, W = Schoenlein, A Compilation of Culture Media, meio no, 2511, 1930»

23, Utilização de Hidrato de carbono — meio ISP #9, Difco,

24, Variação da temperatura — meio ISP #2 mais 50 ml por litro tis leite de côco,

Agar de Extracto de Levedura-Extracto de Malte- Bom crescimento, branco a cinzento claro {séries 2 ba, 3 ba quase cinzentas), levantado, macio, micélio aéreo igual ao superficial? reverso amarelada a castanho amarelado (2 1c, 3 ic>? pigmento amarelado solúvel (2 1c),

Agar de farinha de Aveia — Crescimento moderado? cinzento, cinzento escuro a cinzento rosada (séries quase cinzentas 3 dc, 3 fe, 5 fe, 5 ih, 4 ig)? ligeira a moderadamente levantado macio, micélio aéreo igual ao superficial? reverso cinzento amarelado Cl 1/2 gc, 1 1/2 ic) ? pigmento solúvel nenhum a creme Cca 1 1/2).

ΐ

Ag ar Sais Inorgânicos-Am ida - Bom crescimento 5 cinzento cl-aro, cinzento a cinzento escuro (séries quase cinzentas 3 dc, 3 fe, 3 ih); levantado, macio, micélio aéreo igual ao su.perfic.ial5 reverso amarelado claro (2 ca, 2 ea); pigmento solúvel creme (2 ca ) h

Aqar Glicerol-Asparaqina - Crescimento fraco a moderado, esbranquiçado a amarelado claro Cs ca, 2 ea), ligeiramente levantado, macio ou aparecendo como colónias isoladas, micélio aéreo esbranquiçado; reverso amarelado claro (2 ea, 2 ca); nenhum pigmento solúvel,

Aqar C zapek—-Sucrose — Crescimento moderado, creme <2 ca) com algum micélio aéreo cinzento esbranquiçado claro (séries quase cinzentas 3 dc, 3 fe), delgado, macio; reverso incolor a crema (2 ca); nenhum pigmento solúvel,

Aqar BIucose-Asparaq ina - Bom crescimento; branco, cinzento claro a cinzento (séries quase cinzentas 3 dc, 3 fe 3 cb); levantadas, macias, micélio aéreo igual ao da superfície; reverso amarelado (2 ga, 2 ia, 2 1c);pigmento solúvel amarelado claro (2 ea),

Aqar Tirosina de Bordon and Smith - Moderado crescimento, castanho escuro (3 nl), ligeiramente levantado, macio a granular, sem micélio aéreo; reverso castanho escuro (3 nl); pigmento solúvel castanho escuro (3 nl),

Aqar de Caseína - Bom crescimento, cinzento amarelado a cinzento alaranjado (2 ie, 2 lg, 4 ie) com algum micélio aéreo branco para o fim da faixa, moderadamente levantado, enrugado; reverso amarelada (2 1c); pigmento solúvel castanha escuro C 3 ni).

X ΐ

Aqar de Bennett - Bom crescimento, branco á cinzento claro (séries quase cinzentas 3 cb, 3 dc), levantados, macios mas podem ser ligeiramente enrugados nos bordos, com exsudado hialino, micélio aéreo igual ao da superfície? reverso castanho escura <3 li)? pigmento solúvel castanho C3 ng)«

Agar de Emerson - Bom crescimento, cinzento amarelado a cinzento (2 ni, 2 li), levantado, enrugado, sem micélio aéreo? reverso castanho escuro (3 ni, 3 li)? pigmento solúvel castanho escuro <3 η 1, ύ ρη)«

Agar Nutritivo - Fraco delgada a ligeiramente colónias isoladas, sem 31g)§ pigmento solúvel levantado, macio, castanho amarelado (3

,o?	castanho <3	ig).
ou	aparecendo	como
'50	castanho (3	ie,
IC η	i S / a

Agar Malato de Cálcio — Moderado crescimento, cinzento a cinzento escuro (séries quase cinzentas 3 fe, 3 ih), ligeiramente levantados, macios, micélio aéreo igual ao da superfície? reverso cinzento claro a cinzento (séries quase cinzentas 3 dc, 3 fe)? nenhum pigmento solúvel.

Agar de Selatina - Moderado a bom crescimento, branco a castanho amarelado (3 ec), moderadamente levantado, macio a enrugado, sem micélio aéreo? reverso amarelado (2 ga, 2 ic)? pigmenta solúvel amarelado escuro (2 ne>.

Aqar de Amido - Moderado a bom crescimento, verde amarelado escuro (1 1/2 ic, í í/2 le), moderadamente levantado, macio a enrugado, sem micélio aéreo? reverso amarelado (2 ic)?

solúvel castanho amarelado (3 pe).

pigmento

Aqar de Batata g Cenoura - Fraco a moderado crescimento? creme a cinzento claro (2 ca, séries quase cinzentas 3 cb delgado, macio, com micélio aéreo branco a cinzenta branco, 3 dc), c1aro ?

reverso incolor a creme (2 ca)? sem pigmento solúvel»

Aqar de Água da Torneira - Fraco crescimento, cinzento claro (séries quase cinzentas 3 cb, 3 dc), delgado, macio, micélio aéreo cinzento claro? reverso incolor a cinzento claro (séries quase cinzentas 3 cb, 3 dc)? sem pigmento solúvel»

Propriedades Morfolóqicas - As observações morfológicas foram feitas com agar de farinha de aveia após 14 dias de incubaçãos a massa de esporos em séries de cSr Cinzenta, cadeias de esporos em Cortes ds Espirais, fortemente ou ligeiramente abertamente espiraladas com até 7 movimentos circulares, Í0 a 5© esporos por cadeia de esporos? esporóforos ramificados monopodialmente, raramente ramificados verticiladamente? esporos globosos, ovais a elípticos, com £»,9—1,3 um diam» ou 1,2-1,8 x 0,9-1,3 um? espinhosos tal como foi revelado por microscopia electrónica de varredura»

Propriedades Bioquímicas — Melanina produzida? sulfureto de hidrogénio não produzido, gelatina liquefeita, amido hidrolisado? nitrato de dextros© mas não nitrato orgânico reduzido a nitrato? fraco crescimento em caldo de celulose de Jensen mas sem crescimento em caldo de celulose de Levin e de Schoenlein? sem decomposição em ambos os caldos de celulose? clarificação mas nenhuma coagulação e nenhuma peptonização sobre o leite? digestão da caseina positiva? digestão da tirosina negativa? digestão negativa do malato de cálcio» Utilização dos hidrates de carbonos utilizados glucose, arabinoss, fructose, inositol, manitol, rafinose, sucrose e xilose? ramnose não utilizada»

S t

Moderado Bom Bom Sem

Crescimento Crescimento Crescimento Crescimento

Análise da Parede celular - Os hidrolisados da célula total continham ácido LL-diaminopimélico e glucose»

A cultura N359-Í24 é caracterizada pelos esporos cinzentos em massa, pela reacçao de melanina positiva, pelas cadeias espirais de esporos, e pelos esporos espinhosos» Os hidrolisados das células totais indicam a presença de ácido LL-daiminopimélico e a ausência de açucares diagnósticos» SSo utilizados glucose, arabinose, fructose, inositol, manitol, rafinose, sucrose, xilose, mas não ramnose. Assim, a cultura pertence ao género Streptomyces»

Quando comparada com as espécies descritas de Streptomyces. a cultura NS59—124 asse-me 1 ha-se intimamsnte à S» durhamensis ATCC 2-3Í94 e S qriseochromoqenes ATCC 14511 em propriedades culturais, morfológicas e bioquímicas» Consequentemente, as três culturas foram comparadas lado a lado para se verificar as suas relações»

A cultura NS59-124 foi semelhante à S« durhamensis na maior parte das suas propriedades bioquímicas» A primeira difere da última, contudo, na incapacidade de produzir sulfureto de hidrogénio, na capacidade para reduzir o nitrato de dextrose em nitrito, na icapacidade de coagular e peptonizar o leite, e na incapacidade de crescer a 45°C„ Foram verificadas algumas diferenças culturais» Por exempo, em agar de farinha de aveia.

agar sais inorgânicos-amido, e agar glucose-asparagina, as colónias da uma coloração acinzentada mais escura» 1-asparagina e no agar Czspek-sucrose, 8« durhamensis produziu micélio aéreo cultura NS57“Í24 revelaram Além disso, no -agar glicero a cultura N<%)-124 mas não cinzento claro, respectivamente.

A cultura N859 -124 foi idântíca & 5. g r í seoc h r omoqen es na produção de melanina, liquefação da gelatina, hidrólise do amido, redução do nitrato, reacção sobre o leite, variação da temperatura para o crescimento, e o modelo de utilização do hidrato de carbono» 0 sulfureto de hidrogénio vestigial foi produzido por 5, qriseoch romoqenes mas não por N859-124. Embora ambas as culturas tenham revelado propriedades morfológicas e culturais semelhantes, foram verificadas algumas diferenças culturais de menor importância» No agar sais orgânicos-amido e agar glucose-asparagina, as colónias da cultura N859-124 eram cinzentas em vez de brancas devido à esporulação. Com a cultura N859—124, foi produzida mais micélio aéreo branco a cinzento claro em agar Czapek-sucrose» As colónias da cultura N859-124 eram macias em vez de enrugadas em agar extracto de levedura-extracto de malte e espalharam—se menos do que as de S. qriseochromoqenes em agar Czapek-sucrose.

Tendo como base os resultados anteriormente referidos, a cultura SM859-124 é considerada como uma nova estirpe de Streptomyces qriseochromogenes Fukunaga»

A cultura e isolamento do macrólido UK-86.9O6 pode ser realizada em condições semelhantes è.s geralmente utilizadas para produzir antibióticos por fermentação. A cultura pode ter luqar num meio nutritivo aquoso contendo fontes apropriadas de carbono, azoto e elementos vestigiais durante um período de tempo de vários dias em condições aeróbicas a uma temperatura variando

entre 24 e 36°C» Tal cona com a maioria das fermentações a quantidade de UK-Bó.956 variará com a mudança das condições de fermentação especialmente no que se refere a componentes nutritivos, condições de arejamento e pH» 0 produto micelial é então recuperado por centrifugação ou filtração e extraído com acetona ou metanol» D extracto solvente é concentrado e os produtos desejados são extraídos para ura solvente orgânico não miscível com a água, tal como cloreto de metileno, acetato de etilo, clorofórmio, butanol ou cetona metilisobutílica. □ extracto solvente é concentrado e o produto crú é ainda purificado como necessária por cromatografia» A purificação final de UK Só.956 pode ser realizada por meio de cromatografia de coluna repetida ou usando uma técnica tal como cromatografia líquida ds elevada performance de fase reversa CHPLO, ou por cromatograf ia de placa, delgada preparativa.

Alternativamente, a cultura pode ter lugar em placas de agar de um meio apropriado era condições asróbicas a uma temperatura variando entre 24 e 3ó^c‘C durante vários dias» 0 agar com o crescimento micelial é então extraído com um solvente orgânico tal como metanol, filtrado, sendo o filtrado concentrado» Posterior enriquecimento e separação de UK-86.95Ó são então realizado tal como foi descrito anteriormente»

Assim o presente invento proporciona um processo para a produção de um composto designado UK-Só.956 que compreende a cultura do microorganismo ΝΘ59—124, ou de um mutante, genéticamente transformado ou de uma sua forma recombinante tendo a captacidade de produzir o referido compiosto, em meios de cultura de agar sólido aquosos submersos contendo uma fonte assimilável» de carbono, azoto e sais inorgânicos, em condições de fermentação aerébica até se obter uma quantidade recuperável do referido composto.

A expressão mutante inclui qualquer estirpe de mutante que apareça expontSneamente ou pela aplicação de técnicas conhecidas, tais como exposição a radiação de ionização, luz ultravioleta, e/ou mutagénios químicos tais como N-metil-N-nitroso-uretano, nitrosoguanidina e sulfato de metano etano, etc» Formas genéticamente transformadas e recombinantes incluem mutantes e variantes genéticas produzidos por técnicas de engenharia genética, incluindo por exemplo recomhinação, transformação, transdução, e fusão protoplástica, etc» 0 inventa também se estende a UK-86.95Ó produzido pelo referido processo»

Tal como foi anteriormente mencionada o composto da invento è um agente antiparasitário de amplo espectro sendo particularmente útil como um anti-helmíntioo, ectoparasiticida, insecticida, acaricitia e promotor do crescimento animal»

Assim UK-86.956 é eficaz no tratamento de uma série de situações causadas por endoparasitas incluindo, em particular, helmintiase que é mais frequentemente causada por um grupo de vermes parasitários descritos como nemátodos e que podem causar graves perdas económicas em porcos, carneiros, cavalos e gado vacum podendo também afectar animais domésticos e criação» O composto é também eficaz contra outros nemátodos que afectam várias espécies de animais incluindo, por exemplo, Direfilaria em cães e vários parasitas que podem infectar o ser humano incluindo parasitas gastrointestinais tais como Ancylostoma, Necator» Ascaris, Sronqyloides, Trichinella,, Capillaria, Trioburis, Enterobíus, e parasitas que são encontrados no sangue ou noutros tecidos e orgãos tais como vermes da filária e os estádios extra intestinais de Stronqyloides e Trichinella.

composto é também importante para o tratamento de infecções ectoparasitárias incluindo em particular ectoparasitas arlrópodos de animais e aves tais como, carrapatos, ácaros, piolhos, pulgas, moscas varejeiras, insectos que picam e larvas de dipteros migratórios que podem afectar o gado e cavalos» composto é também um insecticida activo contra pragas domésticas tais como baratas, traças, escaravelhos dos tapetes s mosca doméstica sendo também útil contra pragas de insectos de cereais armazenados é de plantas agrícolas tais como aracnídeos, afídios, lagartas e de novo ortópteros migratórios tais como gafanhotos»

O composto UK-8ó»956 pode ser administrado como uma formulação apropriada para a utilização específica encarada e para a espécie particular de animal hospedeiro a ser tratada e para o parasita ou insecto envolvido» Para utilização como anti-belmíntico o composto é de preferencia administrado por injecção, quer suhcutSnearaente quer intramuscularmente, podendo alternativamente ser administrado por derramamento ou oralmente sob a forma de uma cápsula, bolus, comprimido ou rega líquida, ou pode ser administrado como um implante» As formulações para derramamento e injecção são preparadas de um modo convencional de acordo com a prática veterinária padrão» Cápsulas, bolus ou comprimidos podem ser preparados misturando o ingrediente activo com um diluente ou veículo finamente dividido apropriado, contendo adicionalmente um agente de desintegração e/ou agente de ligação tal como amido, lactose, talco, ou estearato de magnésio» Uma formulação para rega pode ser preparada por dispersão do ingrediente activo numa solução aquosa juntamente com agentes de dispersão ou de humidificação e podem ser preparadas formulações injectáveis sob a forma de uma solução ou emulsão estéril» Estas formulações variarão de acordo com o peso do composto activo, com a espécie de animal hospedeiro a ser tratado, com a gravidade e tipo de lnfecção e com o peso corporal do hospedeiro» Seralmente •ϊ ez.

para administração oral uma dose variando entre cerca de ®_?0®1 e ί© mg por kg do peso corporal do animal fornecida como uma única dose ou dividida em doses para um período variando entre 1 e 5 dias será satisfatória mas evidentemente pode haver casos em que sejam indicadas variações de dosagem mais elevadas ou mais baixas, variações essas que se situam no âmbito deste invento.

Como uma alternativa o composto pode ser administrado com a ração animal e com este fim pode-se preparar um aditivo alimentar concentrado ou prémistura para mistura com a ração animal normal»

Para utilização como um insscticida e para o tratamento das pragas agrícolas o composto é aplicado em pulverizações, poeiras, formulações para derramamento, emulsões, etc», de acordo com a prática agrícola padrão»

Para utilização como um promotor do crescimento ou para melhorar a relação entre a carne magra e a gordura em animais de rebanhos ou. domésticos, o composto pode ser administrado com a ração animal ou com a água para, faeber» Alternativamente pode ser administrado oralmente sob a forma de cápsula, bolus, comprimido ou rega líquida, ou parentéricamente por injecção ou como um implante» Essas formulações são preparadas de um modo convencional de acorda com a prática veterinária padrão.

Para utilização no ser humano o composto é administrado como uma formulação farmaceuticamente aceitável de acordo com a prática médica normal» invento é ilustrado pelos que o Exemplo í descreve a. preparação, exemplos que se seguem em isolamento e identificação d e UK—tíó»956, o Exemplo descreve a actividatíe anti-helmíntica t >

de UK-S6.956 e o Exemple 3 descreve a actividade insecticida de UK—86.956.

Ne Exemple í, peptona Oxoid e Qxoid Lab Lemco foram fornecidos por Oxoid Limited, Wade Road, Basingstoke, Hampshire, U.K.

Os espectros ultravioleta foram registados usando um espectrofoiómetro ds faixas de díodo Hewlett Packard 8452A»

A espectroscopia de massa realizada usando um espectrómetro ds de impacto de electrSes massa /0701- modelo VG» foi

A espectroscopia de massa por bombardeamento atómico rápido foi realizada usando um espectrómetro de massa 7070E modelo VG. As amostras foram introduazidas usando uma matriz consistindo em glicerol, tioglicerol, cloreto de sódio e água»

A rotação óptica foi determinada num Polarimetro Perkin

Elmer 141»

Os dados do espectro de ressonância magnética nuclear foram obtidousando um espel ómetro SN500 da General Electric»

-\

Exemplo ί microorganismo Sreptomyces qriseqchromoqenes N859-124 CATCC 53928) foi feito crescer a 2S°C num plano inclinado de agar com a seguinte composiçãos Amido 2>3 gZl, glucose 10gZl, Bacto-casitona (fornecida por Difco Co«, Detroit, USA) 5 gZl, Extracto de

Levedura Difco 5qZl, carbonato de cálcio iqZl agar g /1 ’ -J . — ajustada para pH 7,1, Após sete dias o crescimento aéreo foi usado para inocular seis frascos de Erlenmeyer de 500 ml contendo cada ura IO© ml de ura meio cora a composição que se segues Amido 24 gZl, Peptona Oxoid 5gZl, Extracto de Levedura Oxoid 5gZl, carbonato de cálcio 4 gZl Lab lemco 3gZl e glucose 1 gZl. Estes frascos foram incubados a 2S°C num agitador rotativo operando a 200 rpm durante 4 dias, Adicionou~se então 5 ml deste inóculo à superfície de cada uma das 117 placas de agar (245 x 245 rara, Nunc) contenda 250 ml de ura meio compreendendo farinha de soja 10 gZl, cerelose 10 gZl, amido 10 gZl, Destiladores solúveis 5 gZI_s cloreto de sódio 5 gZl, carbonato de cálcio 1 gZl, clorato de cobalto 10 mgZl e agar 20 gZl ajustado para pH 7,2» Estas placas foram incubadas a 28°C entre 5 e 7 dias antes da extracção de todo o material com metanol (30 1), A suspensão resultante foi filtrada e concentrada sob vácuo para dar origem a 1 1 de solução aquosa. Esta foi extraída três vezes com 1 1 de acetato de etilo e a solução orgânica foi concentrada até à secura, Adicionou-se ao resíduo 10 ml de metanol e esta solução foi aplicada a uma coluna de sephadex L.H 2G (4 x 85 cm) (Pharmacia) e eluida cora 2 1 de metanol, O solvente foi evaporado sob vácuo e o resíduo foi cromatoqrafado sobre coluna de sílica

CKieselgel 60, malha :© cm) fazendo—se a eluição inicialmente

70-230, Merck) (4,5 com clorofórmio (500 ml) e finalmente cora clorofórmio-acetato de etilo 20sl (500 ml), FracçSes contendo UK-B6,95ó tal como foi determinado por cromatografia de placa delgada foram concentradas até à secura sob vácuo, Foi realizada purificação fina por cromatografia de camada de sílica preparativa, desenvolvendo com clorofórmio-acetato de etilo 3sl para proporcionar 64 mg ds UK-86,956 puro»

A amostra pura de UK-86-956 assim obtida possui as seguintes características físicas e propriedades espectroscópicass

a) Rotação óptica específica Cc-cl''’ ·* 95_?-0* Cc = 0,íó_? acetona)

b) Espectro de absorção ultravioleta 238 C = 24.690) ®ax 244 C = 27-999)

252ísh)< =17.599)

c) ISes principais no espectro de massa de impacto ds electrão 612 írC), 594 CM~f<,Q)

576 CM~2H^0)⁺,

d) FAB - espectro de massa 635 CM -s- Na ) CTeóricos 635)

e) Espectro de ressonância magnética protónica CCDC1„) em partes sinais bem separados a 5=5,79 Cdm, 3=11,4, ÍH), 5,73 Cdd, 3=13,8, 11,4, ÍH), 5,41 Cbs, ÍH), 5,12 Cd, 3=8,1, 1H), 4,69 Cdd, 0=14,3, 2,1, ÍH), 4,65 Cdd, 3=14,3, 2,1, ÍH), 4,29 Cm, ÍH) , 3,95 Cd, 3=6,2, ÍH), 3,36 Cd, 3=19,2, ÍH), 3,26 Cm, 3=2,3, ÍH), 2,56 Cm, 1H>, 1,87 Cbs, 3H), 1,57 Cbs, 3H), 1,54 Cbs, 2H), 1,49 Cq, 3=12, 1H), 1,92« Cd, 3=6,6, 3H), 1,0® Cd, 3=6,6, 3H) , ®,93 Cd, 3=6,7, 3H), 9,7© Cd, 3=6,6, 3H)„

Pela análise detalhada dos dados de ressonância magnética nuclear pensa—se que o composto obtido tem a estereoquimica relativa que se segues

(II)

Exemplo

A actividade an ti—helmíntics do composto Uí<—86=956 obtido tai como no Exemplo 1 foi avaliada contra Caenorhabditis eleqans usando teste de análise in vitro descrito por K. 8. Simpkin e 6. L« Coles em Parasitology₃ 1979, 79₅ 19» 0 composto matou 100% dos vermes numa concentração no recipiente de >3,01 parte por milhão»

Exemplo 3 contra o

A actividade insecticida de UK~S6«9hó foi avaliada estádio de larva da mosca varejeira Luci1 ia cuprina (estirpe Q) usando um processo padrão em que as primeiras larvas instar são mantidas em contacto com papel de filtro tratado com composto do teste» 0 composto do teste é aplicado primeiro ao papel sob a forma de uma solução de acetona» 0 papel de filtro tratado è então colocado num tubo contendo 1 ml de soro de vitelo recém-nascido e adicionam-se as primeiras larvas instar» + 1.

UK-S6.9OÓ matou 100% das larvas quando aplicada ao papel de filtro a uma taxa de 10 mg por metro quadrado.

Claims (5)

1. REIVINDICACoESg lã - Procssso para a preparação de um composto antibiótica tenda a fórmulas (I) caracterizado por compreender a cultur do ai croorqan xsmo

   Streptomyces grisepcbromogenes ATCC 53928, ou de um mu tan te, de uma sua forma transformada genéticamente ou recombinante, tendo a capacidade de produzir o referido composto, em meios de cultura ds agar sólido aquosos submersos contendo uma fonte assimilável de carbono, azoto e sais inorgânicos em condiçSes de aeróbica até se obter uma quantidade recuperável composto, e recuperando, isolando e composto» f sraien tação do referido o referido purifiçando
2. 2ã - Processo de acordo com a reivindicação í para a preparação de um composto antibiótica tendo a fórmula (I) caracterizado por a estereoquímica relativa ser ts.l como é indicada pela fórmula CIDs — (II)
3. 3ê- - Processo de acorde com a reivindicação 1 para a preparação de um composto caracterizado pela fermentação do microorganismo Srep tomyces qriseochr ornoqenes ATCC 53928, ou ds um mutante, ou de uma sua forma transformada genéticamente ou recombinante, e pelas propriedades físicas e espectroscópicas que se seguem s·

   a) Rotação óptica específica Ε«3'^{ϊ 1}' + 95,0° Cc = 0,16, acetona)

   i) Espectro de absorção ultravioleta 238 CS = 24.600) max 244 (S = 27.000)

   252 { s h í í € ™ 17«500)

   c) ISes principais no espectro de massa, de impacto de electrão 612 CM*), 594 CM~H.__sO)

   576 ίΜ-2Η,,0>\ 466, 151.

   d) FAB - espectro de massa 635 CM + Na‘) CTeóricos 635)

   e) Espectro de ressonância magnética protónica CCBCl^) em partes sinais bem separados a £=5,79 ídm, 3=11,4, 1H), 5,73 Cdd, 3=13,8, 11,4, IH), 5,41 Cbs, ÍH), 5,12 Cd, 3=8,1, 1H), 4,69 Cdd, 3=14,3, fr.

   £1 “ ΪΟ ' ..... * - ú ; · 2,1 5 1H> , .a A5 Ctid, 3=14 •ζΤ 5 ¥ O | <Zm SJ X SJ ÍH), 4,29 Cm, ÍH), 3 ,95 í d, 3=6 ,2, 1H) ¥ 5 36 Cd, •3=10 O 9 «£· 5 ÍH), 3,26 Cm, 3=2,3, ÍH) , 2 ,56 Cm, 1H) , í,87 ( bs, 3H), 1 g í-ί Z í bs. 3H), 1,54 C bs, 2H), í,40 C q 5 ci “ X λΙ. 5 1H) , 1,03 Cd, J H. 3H> ₅ í . 00 C d , 3=6,6, 3H), θ,93 Cd, J—A₅ 7 ₃ 3H) e 0,70 Cd, 56 íl 3H) _a
4. 4s - Cultura biologicamente pura de uma estirpe do gênero Sreptomyces caracterizada por apresentar características de identificação de ATCC 53928, ou de um mutante, ou de uma sua forma transformada genéticamente ou recombinante, sendo o referido microorganismo capaz de produzir os compostos antibióticos definidos na reivindicação i, 2 ou 3 numa quantidade recuperável após cultura num meio nutritivo aquoso contendo uma fonte assimilável de carbono, azoto e sais inorgânicos»
5. 5ã - Microorganismo caracterizado por ser o Streqtomyces qriseochromoqenes ATCC 53928»

   Lisboa, 24 de Julho de 1990