HUT57832A - Process for producing macrolide compound and parasiticidal composition comprising same as active ingredient - Google Patents

Description

A találmány tárgya új parazitaölő készítmény és eljárás milbemicin típusú új makrolid és a vegyületet tartalmazó készítmény előállítására.

A milbemicinek antelmintikus ektoparaziticid inszekticid antibakteriális gombaölő és növekedést elősegítő hatású szélesspektrumú szerek, amelyeket humán és állatgyógyászat, megőgazdaság és kertészet területén alkalmazhatunk. Előállításuk a Streptomyces genushoz tartozó mikroorganizmusok aeerob körülmények közötti fermentálásával történik vizes vagy szilárd táptalajban, amely szervetlen sókat és szén- és nitrogén asszimilálható forrásokat tartalmaz. így például a Streptomyces hygroscopicus spp aureolacrimosus B-41-146 mikroorganizmus, melynek leírása a 13 90 336 számú nagy-britannniai szabadalmi leírásban található, fermentálásával B-41 vegyületekként ismert milbemicinek családját kapjuk. Egy másik példa szerint a 0170006 számú európai szabadalmi leírásban található a Streptomyces cyaneogriseus spp noncyanogenus fermentálásának leírása, melynek során az LLF28249-es vegyületekként ismert másik milbemicin család jön létre.

A milbemicinekhez tartozó vegyületek leírása megtalálható a 025 45 83 számú európai szabadalmi bejelentésben is. Ezek előállítása Streptomyces E225 és Streptomyces E225B Streptomyces mikroorganizmusokból történik fermentálás útján.

Azt találtuk, hogy az UK 86 956 számú új makrolid az alább részletezett új Streptomyces griseochromogenes N859-124 mikroorganizmus tenyésztésével állítható elő. Az igen aktív UK 86-956 vegyület széles spektrumú hatással rendelkezik • ·

- 3 rovarkártevők, atkák, szabadon élő nématódák, endo- és ektoparaziták ellen, melyek az állatot és az embert támadják meg.

így tehát (I) képletű UK-86 956 számú vegyületet állítunk elő, amely annyiban különbözik a 017 0006 számú európai szabadalmi leírásban leírt LL-F28249a vegyülettől, hogy a C-22 helyzetben tartalmaz hidroxil szubsztituenst a C-23 helyzet helyett. Az is megkülönbözteti a 0254583 számú európai szabadalmi leírásban említett vegyületektől, hogy a 25-helyzetben 1,3-dimetil-but-l-enil gyököt tartalmaz az 1-metil-prop-l-enil csoport helyett.

Az UK 86,956 számú vegyületet vizes táptalajban merített aerob fermentálással állíthatjuk elő, vagy pedig aerob feltételek mellett egy Japánban (Itoh City, Shizuoka Prefecture) gyűjtött talajmintából izolált mikroorganizmus ' szilárd agar fermentálásával állíthatjuk elő. Ez utóbbi mikroorganizmust az American Type Culture Collection-ben deponáltuk (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 USA ATCC 53928 számon 1989. június 29-én). Ezt a tenyészetet a továbbiakban N859-124-nek jelöljük. Jellemzői a következők:

Az N859-124 tenyészetet egy ferde tenyészetből ültettük át az ATCC 172 fermentlébe, és 4 napig tenyésztettük 2 8 °C-on egy rázókészülékben. Ezután 20 percig centrifugáltuk, háromszor steril vízzel mostuk, és az Actinomycetales tagjainak azonosítására szokásos közegbe helyeztük. A tenyészetet 28 °C-on inkubáltuk, és az eredményeket változó időpontokban olvastuk le, többnyire 14 naponként. A színeket az ismert terminológiával írtuk le, de a pontos színeket összehasonlítással határoztuk meg Color Harmony Manual 4. kiadása alapján szín chipek segítségével. Az egész sejt aminosav és cukoranalízis módszereinek leírása megtalálható Becker B és mtsai [Appl. Microbiol., 12: 421-423, 1964; és Lechevalier, M.P., J. Láb. Clin. Med. , 71: 934-944, 1968] irodalmi helyen. Összehasonlítási célokra a Streptomyces griseochromogenes ATCC 14511 és az S. durhamensis ATCC 23194 számú törzstípusokat szereztük be az American Type Culture Collection-ből, Rockville, Maryland.

A tenyészetek jellemzésére a következő azonosítási közegeket és a készítmények irodalmi forrásaiként a következőket használtuk:

1. Trypton-élesztő extraktum fermentlé (ISP 1 közeg, Difco)

2. Élesztő-extraktum - maláta extraktum agar (ISP 2 közeg, Difco)

3. Zabliszt agar (ISP 3 közeg, Difco)

4. Szervetlen só - keményítő agar (ISP 4 közeg, Difco)

5. Glicerin-aszparagin agar - (ISP 5 közeg, Difco)

6. Pepton-élesztő extraktum vas agar - (ISP 6 közeg, Difco)

7. Czapek-szacharóz agar - S. A. Waksman, The Actinomycetes,

2. kötet, 1. sz. közeg, 328. oldal, 1961.

8. Glükóz-aszparagin agar - uo., 2. sz. közeg, 328. oldal

9. Bernnett agar - uo., 30. sz. közeg, 331. oldal.

10. Emerson agar - uo., 28. sz. közeg, 331. oldal,

11. Táp agar - uo., 14. sz. közeg, 330. oldal,

12. Gordon és Smith tirozin agar - R.E. Gordon és M.M. Smith,

J. Bacteriol. 69: 147-150, 1955.

13. Kazein agar - uo.

14. Kalcium-agar - S. A. Waksman, Bacteriol.

Rév. 21: 1-29, 1957.

15. Zselatin - R. E. Gordon és J. M. Mihm, J. Bacteriol.

73: 15-27, 1957.

16. Keményítő - uo.

17. Szerves nitrát fermentlé - uo.

18. Dextróz nitrát fermentlé - S. A. Waksman, The Actinomycetes, 2. kötet, 1. sz. közeg, 328. old., 1961, g dextróz 30 g szacharóz helyett és agar nincsen.

19. Burgonya sárgarépa agar - Μ. P. Lechavalier, J. Láb. és Clinical Med. 71: 934-944, 1968, de csak 30 g burgonyát,

2,5 g sárgarépát és 20 g agart használunk.

20. 2 %-os csapvíz agar.

21. Fölözött tej - Difco.

22. Cellulóz hasznosítás -

a) H. L. Jensen, Proc. Linn. Soc. N.S.W. 55: 231-248, 1930.

b) M. Levine és H. W. Schoenlein, A Compilation of Culture Media, 2511. sz. közeg, 1930.

23. Szénhidrát hasznosítás - (ISP 9 közeg, Difco)

24. Hőmérsékleti tartomány - ISP 2 táptalaj plusz 50 ml/ kókusztej litere.

Élesztőextraktum - malátaextraktum agar - növekedés jó, fehértől halványszürkéig (közel szürke sorozatok 2ba, 3ba), emelkedett, sima, eriális micélium, ugyanolyan mint a felület; fordított sárgás - sárgásbarna (2 le, 3 ic); oldékony pigment sárgás (2 le).

Zabliszt agar - Mérsékelt növekedés, szürke, sötétszürke rózsaszínszürke (közel szürke sorozatok 3 de, 3 fe, 5 fe, 5 ih, 4 ig); enyhétől mérsékleten emelkedett sima, eriális micélium, ugyanolyan mint a felület; fordított sárgás szürke (1 1/2 gc,

1/2 ic); oldható pigment semmitől krémszínűig (1 1 /2 ca). Szervetlen só-keménvítő aqar - növekedés jó; halványszürke, szürke - sötétszürke (közel szürke sorozatok 3 de, 3 fe, 3 ih); emelkedett, sima eriális micélium, olyan mint a felület; fordított halványsárgás (2 ca, 2 ea); oldékony pigment krémszínű (2 ca).

Glicerin-aszparagin aqar - növekedés gyenge - mérsékelt, fehéres-halványsárgás (s ca 2 ea), enyhén emelkedett, sima vagy izolált telepeken jelenik meg, eriális micélium fehéres; fordított halványsárgás (2 ea, 2 ca); nem oldékony pigment. Czapek-szacharóz aqar - növekedés mérsékelt, krémszínű (2 ca) halvány fehéres szürke eriális micéliumokkal (közel szürke sorozatok 3 de, 3 fe); vékony, sima; fordított színtelen-krémszínű (2 ca); nem oldékony pigment.

Glukóz-aszparaqin aqar - növekedés jó; fehér, halványszürke szürke (közel szürke sorozatok 3 de, 3 fe, 3 eb); emelkedett, sima, eriális micélium, olyan mint a felület; fordított sárgás (2 ga, 2 ia, 2 le); oldékony pigment halványsárgás (2 ea). Gordon és Smith-féle tirozin aqar - növekedés mérsékelt, sötétbarna (3 ni), enyhén emelkedett, sima - szemcsés, nem eriális micélium; fordított sötétbarna (3 ni); oldékony pigment sötétbarna (3 ni).

Kazein aqar - a növekedés jő, sárgásszürke - narancsszürke (2 ie, lg, 4 ie), valami fehér eriális micéliummal, a vonalas nyom vége felé, mérsékelten emelkedett, ráncos; fordított sárgás (2 le); oldékony pigment sötétbarna (3 ni).

Bennett-aqar - növekedés jó, fehér - halványszürke, (közel szürke sorozatok 3 eb, 3 de), emelkedett, sima, de enyhén ráncos is lehet a széle fele, üvegszerü váladék, eriális micélium, olyan mint a felület, fordított sötétbarna (3 li); oldékony pigment barna (3 ng).

Emerson-féle agar - növekedés jó, sárgásszürke - szürke (2 ni, 2 li), emelkedett, ráncos, nem eriális micélium; fordított sötétbarna (3 ni, 3 li); oldékony pigment sötétbarna (3 ni, 3 pn) .

Tápagar - növekedés gyenge - mérsékelt, barna (3 lg), vékony enyhén emelkedett, sima, vagy izolált telepekként jelenik meg, nem eriális micélium; fordított barna (3 ie, 3 lg); oldékony pigment sárgásbarna (3 ic, 3 le).

Kalcium almasavsó agar - növekedés mérsékelt, szürke - sötétszürke (közel szürke sorozatok 3 fe, 3 ih), enyhén emelkedett, sima, eriális micélium, olyan mint a felület; fordított halványszürke - szürke (közel szürke sorozatok 3 de, 3 fe); nem oldékony pigment.

Zselatin agar - növekedés mérsékelt - jó, fehér - sárgásbarna (3 ec), mérsékelten emelkedett, sima - ráncos, nem eriális micélium, fordított sárgás (2 ga, 2 ic); oldékony pigment sötét sárgás (2 ne).

Keményítő agar - növekedés mérsékelt - jó, sötét sárgászöld (1 1/2 ic, 1 1 /2 le), mérsékelten emelkedett, sima - ráncos, nem eriális micélium; fordított sárgás (2 ic); oldékony pigment sárgásbarnás (3 pe).

Burgonya sárgarépa agar - növekedés gyenge - mérsékelt, fehér, krémszínű - halványszürke (2 ca, közel szürke sorozatok 3 eb, 3 de), vékony, sima, fehér - halványszürke eriális micélium; fordított színtelen - krémszínű (2 ca); nem oldékony pigment. Csak víz agar - növekedés gyenge, halványszürke (közel szürke sorozatok 3 eb, 3 de), vékony, sima, eriális micélium halványszürke; reverz színtelen - halványszürke (közel szürke sorozatok 3 eb, 3 de); nem oldékony pigment.

Morfológiai tulajdonságok

A morfológiai megfigyeléseket zabliszt agaron végeztük 14 nappal az inkubálás után: spóratömeg szürke színsorozatokban, spóra láncok szekció spirálokban, sorosan vagy enyhén nyíltan felcsavarva maximum 7 fordulatban; 10 - 50 spóra/spóralánc, sporoforák monopodiálisan elágazva, ritkán örvösen elágazva, gömbalakú, ovális - elliptikus spórák, átmérő 0,9 - 1,3 μιη vagy 1,2-1,8 x 0,8-1,3 Mm, tüskés, a letapogató elektronmikroszkópia alapján.

Biokémiai tulajdonságok

Melanin termelés; hidrogén-szulfid termelés nincs; zselatin cseppfolyósított; keményítő hidrolizált; dextróz nitrát, de nem nitráttá redukált szerves vegyület; gyenge növekedés Jensen-féle cellulóz fermentlén, de nincs növekedés Levin és Schoenlein-féle cellulóz fermentlében, bomlás nincs egyik cellulóz fermentlén sem; tisztulás, de nincs koaguláció és nincs peptonizáció tejen, kazein emésztés pozitív; tirozin emésztés negatív; kalcium-malát,emésztés negatív.

♦ ·

- 9 Szénhidrát hasznosítás: glükóz, arabinóz, fruktóz, inozit, mannit, raffinóz, szacharóz és xilóz, hasznosítva, ramnóz nem hasznosul.

Hőmérsékleti viszonyok ο ο ο o

C 28 C 37 C 45 C növekedés: mérsékelt jó jó nincs

Seitfal analízis

Az egész-sejt hidrolizátumok LL-diamino-pimelinsavat és glükózt tartalmaznak.

Az N859-127 tenyészetet tömegben szürke spórák jellemzik, valamint a pozitív melamin reakció, a spirális spóraláncok és a tüskés spórák. Az egész-sejt hidrolizátumok jelzik az LLdiamino-pimelinsav jelenlétét, és a diagnosztikai cukrok távollétét. Hasznosulnak a glükóz, arabinóz, fruktóz, inozit, mannit, raffinóz, szacharóz, xilóz, de nem hasznosul a ramnóz. így a tenyészet a Streptomyces genushoz tartozik.

Ha a leírt Streptomyces speciesekhez hasonlítjuk, akkor az N859-124 tenyészet erősen hasonlít az S. durhamensis ATCC 23194-hez és az S. griseochoromogenes ATCC 14511-hez tenyésztési, morfológiai és biokémiai tulajdonságukban. Ennek megfelelően a három tenyészetet összehasonlítottuk az összefüggések megállapítására.

Az N859-124 tenyészet hasonlított legtöbb biokémiai tulajdonságát tekintve az S. durhamensishez, az előbbi az utóbbitól annyiban különbözik, hogy nem termel hidrogén-szulfidőt, nincs az a képessége, hogy redukálja a dextróz-nitrátot nitritté, és nem koagulálja és peptonizálja a tejet, valamint nem növekszik 45 °C-on. Bizonyos tenyésztési különbségeket is észleltünk, így például zabliszt-agaron szervetlen só-keményítő agaron és glükóz-aszparagin agaron az N859-124 tenyészet telepei sötétebb szürkés szint mutattak. Ezen felül a glicerin-aszparagin agaron és a Czapek-szacharóz agaron az N859-124 tenyészet az S. durhamensistől eltérően fehér és halványszürke eriális micéliumokat termelt.

Az N859-124-es tenyészet azonos az S. griseochromogenesszel melanin termelésben, zselatin cseppfolyósításban, keményítő hidrolízisban, nitrát redukcióban, a tejen végbemenő reakcióban, a növekedési hőmérsékleti tartományban és a szénhidrát hasznosítás módjában. Hidrogén-szulfid nyomokat termel az S. griseochromogenes, azonban az N859-124 nem. Míg mindkét tenyészet hasonló morfológiai és tenyésztési tulajdonságokat mutat, bizonyos kisebb mértékű tenyésztési különbségeket észleltünk. A szerves só - keményítő agaron és a glükóz - aszparagin agaron az N859-124 tenyészet telepei szürkék voltak inkább, mint fehérek a spóraképződés miatt. Az N859-124 több fehér-halványsárga eriális micéliumot termel Czapek-szacharóz agaron. Az N859-124 tenyészet telepei inkább simák, mint ráncosak élesztőextraktum - maláta-extraktum agaron és kevésbé terjednek, mint az S. griseochromogenes Czapek-szacharóz agaron.

A fenti eredmények alapján az N859-124 tenyészetet új Streptomyces griseochromogenes Fukunaga törzsnek tekintjük.

Az UK—86,956 makrolid tenyésztését és izolálását hasonló körülmények között végezhetjük, mint amilyeneket általában alkalmazunk antibiotikumok előállítására fermentáció útján. A tenyésztést vizes táptalajban végezhetjük, amely megfelelő szén, nitrogén forrásokat és nyomelemeket tartalmaz több napig aerob körülmények között 24-36 °C-os hőmérsékleti tartományban. Mint a legtöbb fermentáció esetében, az UK 86 956 mennyisége a fermentálás körülményeivel változik, különösen a táptalaj komponenseire való tekintettel a levegőzési körülmények és a pH függvényében. A micélium terméket centrifugálással, szűréssel vagy acetonos vagy metanolos extrahálással nyerjük ki. Az oldószer extraktumot bepároljuk, és a kívánt termékeket vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, például metilén-kloriddal, etil-acetáttal, kloroformmal, butanollal vagy metil-izobutil-ketonnal extraháljuk. Az oldószer extraktumot bepároljuk és a nyersterméket szükség esetén kromatografálással tovább tisztítjuk. Az UK 86,956-os termék végső tisztítását ismételt oszlopkromatografálással vagy reverz fázisú, nagynyomású folyadékkromatográfiásán vagy preparatív vékonyréteg kromatográfiásan végezhetjük.

A tenyésztés megfelelő táptalaj agarlemezein mehet végbe aerob körülmények között 24 - 36 °C-on, és a tenyésztést több napig végezhetjük. A micéliális tenyészettel az agart szerves oldószerrel, például metanollal extraháljuk, szűrjük és a szűrletet bepároljuk. További dúsítást, és az UK 86,956-os vegyület izolálását a fent leírt módon végezhetjük.

A találmány szerint tehát UK 86,056-os vegyületet állítunk elő oly módon, hogy az N859-124-es mikroorganizmust vagy mutánsát vagy genetikailag transzformált vagy rekombinált formáját, amely ezt a vegyületet képes előállítani, merített *« • · · · · · · :.:. / .· .·

- 12 vizes vagy szilárd agar táptalajban tenyésztünk, amely táptalaj asszimilálható szén, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmaz, aerob fermentációs körülmények között, amíg visszanyerhető mennyiséget nem kapunk a vegyületből.

A mutáns fogalom bármilyen mutáns törzsre vonatkozik, amely spontán jön létre, vagy az ismert technológiák alkalmazásával, például úgy, hogy ionizáló sugárzásnak, ultraibolya fénynek és/vagy kémiai mutagének hatásának, például N-metil-Nnitrozo-uretánnak, nitrozo-guanidinnak és etán-metán-szulf átnak tesszük ki. A genetikailag transzformált és rekombináns formák közé tartoznak a mutánsok és a géntechnológiai módszerekkel kapott genetikai variánsok, ide tartoznak például a rekombinációval, transzformációval, transzdukcióval és protoplaszt fúzióval kapott termékek. A találmány kiterjed az ilyen eljárással kapott UK 86 956-ra is.

Mint már említettük, a találmány szerint előállított vegyület igen hatásos széles spektrumú parazitaölő szer, amely különösen hasznos mint antelmintikum, ektoparaziticid, inszekticid, akaricid és állati növekedést elősegítő szer.

Az UK 86,956 különböző állapotok kezelésére hatásos, melyeket endoparaziták idéznek elő, különösen helmintiázis kezelésére hasznos, amelynek okozója leggyakrabban egy parazita féregcsoport, melyeket nematódáknak nevezünk, és amely komoly gazdasági veszteséghez vezethet sertés, bárány, ló és szarvasmarha állományban, valamint kihat a háziállatokra és baromfira is. A vegyület más nematódák ellen is hatékony, melyek különböző állatfajtákat támadnak meg, ilyen például a Dirofilaria kutyán és különböző paraziták, melyek az embert is megfertőzik,

beleértve a gasztrointesztinális parazitákat, például Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius és olyan paraziták, melyek a vérben vagy más szövetekben vagy szervekben találhatók, például fonalférgek és a Strongyloides és Trichinella bélen kívüli stádiumai.

A vegyület értékes továbbá olyan ektoparazita fertőzések kezelésében is, mint amilyenek különösen az ízeltlábú ektoparaziták állatokban és madarakban, például kullancs, tetű, bolha, kék dongólégy, csípő rovarok és mozgó diptera lárvák, melyek a szarvasmarhára és a lóra lehetnek kártékonyak.

A vegyület hatékony inszekticid is háztartási kártevők ellen, mint például a svábbogár, a ruhamoly, a szőnyegbogár és a házilégy, valamint a tárolt gabona rovarkártevői ellen és a mezőgazdasági növények kártevői ellen is használhatók, mint például a takácsatka, a levéltetű, a hernyó és a mozgó ortopteránok, például sáskák.

A 86 956 számú hatóanyagot megfelelő készítmény formájában használhatjuk fel, attól függően, hogy a kezelendő gazdaállat milyen, és hogy a szóbanforgó parazita vagy rovar milyen. Antelmintikumként történő felhasználáskor a hatóanyagét előnyösen injektálás útján szubkután vagy intramuszkulárisan vagy pedig ráöntéssel vagy orálisan adagolhatjuk kapszula, bolus, tabletta vagy folyékony itatóelegy formájában, vagy pedig beültetve is adagolhatjuk. A pour on és az injekciós készítmények előállítása a standard állatgyógyászati gyakorlattal összhangban történik. A kapszulát, bolust vagy tablettát úgy állíthatjuk elő, hogy a hatóanyagot megfelelően finom el- 14 oszlású hígítóval vagy hordozóval összekeverjük, majd hozzáadjuk a szétesést elősegítő szert és/vagy kötőanyagot, például keményítőt, laktózt, talkumot vagy magnézium-sztearátot. Az itatóelegy készítményt úgy állítjuk elő, hogy a hatóanyagot vizes oldatban diszpergáló vagy nedvesítőszerrel együtt diszpergáljuk, az injektálható készítményt pedig steril oldat vagy emulzió formájában állítjuk elő. Ezek a készítmények változóak lehetnek a hatóanyag tömegétől, a gazdaállat fajtájától, a fertőzés komolyságától és típusától és a gazda testtömegétől függően. Az orális adagolásra a dózis általában 0,001 - 10 mg/testtömeg kg állatok esetén, egyszeri dózisként vagy osztott dózisként 1-5 napig, de természetesen bizonyos esetekben ettől a dózistartománytól el lehet térni felfelé vagy lefelé, és ez is a találmány tárgyához tartozik.

A hatóanyagot az állati takarmánnyal együtt is adagolhatjuk, és ebből a célból koncentrált takarmány adalékot vagy premixet állíthatunk elő a normális állati táppal összekeverés céljából.

Ha inszekticidként vagy mezőgazdasági kártevők ellen kívánjuk a vegyületet használni, akkor az alkalmazás történhet spray, por, pour készítmény, emulzió stb. formájában a standard mezőgazdasági gyakorlatnak megfelelően. Ha növekedést elősegítő szerként kívánjuk használni, vagy a sovány hús zsírhoz viszonyított arányát akarjuk a gazdaságban vagy a háziállatoknál elérni, akkor a hatóanyagot az állati takarmánnyal vagy az ivóvízzel együtt adagolhatjuk. Adagolhatjuk orálisan kapszula, bolus, tabletta vagy itatóelegy formájában, vagy parenterális injekció útján, vagy beültetésként. Az ilyen készítményeket ismert módon állítjuk elő az állatgyógyászati gyakorlatnak megfelelően.

Humán felhasználásra a vegyületet gyógyászatilag elfogadható készítmény formájában a gyógyászati gyakorlatnak megfelelően adagoljuk.

A találmány további részleteit a következő példákkal illusztráljuk. Az 1. példa az előállítást, izolálást és az Uk 86,956 azonosítását tartalmazza, a 2. példa leírja az UK 86,956-os vegyület antelmintikus hatását és a 3. példa pedig az inszekticid hatását.

Az 1. példában használt oxoid peptont és Oxoid Láb Lemco-t az Oxoid Limited, Wade Road, Basingstoke, Hampshire, Nagy-Britannia szállítja.

Az ultraibolya színképeket Hewlett Packard 8452A dióda rendszerű spektrofotométerrel mértük.

Az elektron ütközés tömegspektropszkópiát VG 7070F tömegspektrométer modellen mértük.

A gyors atom bombázási tömegspektroszkópiát a 7070E régi modellű tömegspektrométerrel mértük. A mintákat glicerinből, tioglicerinből, nátrium-kloridból és vízből álló mátrix alkalmazásával vezettük be.

Az optikai forgatóképességet Perkin Elmer 141 Polariméteren mértük.

A magmágneses rezonancia szinképelemzési adatokat Generál Electric GN500 spektrométeren kaptuk.

*·*

1. Példa

A Streptomyces griseochromogenes N859-124 (ATCC 53928) mikroorganizmust 28 °C-on tenyésztettük agar ferdetenyészeten, melynek összetétele a következő: 20 g/1 keményítő, 10 g/1 glükóz, 5 g/1 Bacto-kaziton (Difco Co. , Detroit, USA), 5 G/1 Difco élesztő extraktum, 1 g/1 kalcium-karbonát, 20 g/1 agar, és a pH-t 7,1-re állítjuk. Hét nap múlva az eriális tenyészetet arra használjuk, hogy beoltunk hat 500 ml Erlenmeyer-lombikot, melyek mindegyike 100 ml következő összetételű táptalajt tartalmaz: 24 g/1 keményítő, 5 g/1 Oxoid pepton, 5 g/1 Oxoid élesztő extraktum, 4 g/1 kalcium-karbonát, 3 g/1 láb Lemco és 1 g/1 glükóz. A lombikokat 28 °C-on rotációs rázókészüléken inkubáljuk, amely 4 napig percenként 200 fordulatszám mellett működik. Az oltóanyagbból 5 ml-t ezután mind a 117 agar lemez felületére helyezzük (245 x 245 mm, Nunc) , amely 250 ml táptalajt tartalmaz és az összetétel a következő: 10 g/1 szójababliszt, 10 g/1 cerelóz, 10 g/1 keményítő, 5 g/1 desztillálhatóú oldékony anyag, 5 g/1 nátrium-klorid, 1 g/1 kalcium-karbonát, 10 mg/1 kobalt-klorid, 20 g/1 agar, a pH-t 7,2-re állítjuk. Ezeket a lemezeket 28 °C-on inkubáljuk 5-7 napig, majd valamennyi anyagot 30 1 metanollal extrahálunk. A kapott szuszpenziót leszűrjük, és vákuumban bepárolva 1 liter vizes oldatot kapunk. Ezt az oldatot háromszor extraháljuk 1 liter etilacetáttal, és a szerves oldatot szárazra pároljuk. A maradékhoz 10 ml metanolt adunk, és az oldatot Sephadex LH 20 oszlopra visszük fel, melynek mérete 4 x 85 cm (Pharmmacia) és 2 liter metanollal eluáljuk. Az oldószert vákuumban lepároljuk, és a maradékot szilicium-dioxid oszlopon kromatografál juk (Kieselgél

- 17 «♦

60, 70-230 Mesh, Merek) (4,5 x 30 cm). Először 500 ml kloroformmal, majd kloroform és etil-acetát 20:1 arányú elegyével eluáljuk (500 ml). Az UK 86 956 vegyületet tartalmazó frakciókat vékonyrétegkromatográfiásan határozzuk meg, és vákuumban szárazra pároljuk. A végső tisztítást preparatív szilicium-dioxid rétegkromatográfiásan végezzük, előhívó szerként kloroform és etil-acetát 3:1 arányú elegyét használjuk. 64 mg tiszta UK 86 956-ot kapunk.

Az így kapott UK 86 956 minta a következő fizikai és spektroszkópikus tulajdonságokkal rendelkezik:

-25 o

a) Fajlagos forgatóképesség [O] + 95,0 C (c = 0,16, aceton)

b) Ultraibolya abszorpció spektrum 238 ( = 24,600)

252((sh) ( = 17,500)

c) Elektron ütközés tömegspektrum ionok: 612 (M⁺),594 (M-H₂O) 576 (M-2H₂O)⁺, 466, 151.

d) FAB tömegspektrum 635 (M + Na⁺) (elméleti 635)

e) Protonmágneses rezonancia spektrum (CDC1₃) részletekben: jól rezolvált jelek δ = 5,79 (dm, J = 11,4, 1H), 5,73 (dd, J = 13,8, 11,4, 1H), 5,41 (széles s, 1H), 5,12 (d, J = 8,1, 1H),

3,36 (m, 1H(, 3,95 (d, J = 6,2, 1H), (d, J = 10,2, 1H), 3,26

1,87 (széles s, 3H), 1,57 (m, J = 2,3, 1H), 2,56 (m, 1H),

3H),

0,70 (d, J = 6,6, 3H).

• t «··»

- 18 A magmágneses rezonancia adatok részletes analízise alapján a kapott vegyület relatív sztereokémiája a következő: (II) képlet.

2. Példa

Az UK-86,956 antelmintikus hatását Caenorhabditis elegáns ellen vizsgáltuk in vitro screenelési teszttel, melynek leírása megtalálható a következő irodalmi helyen: K. G. Simpkin and G. L. Coles inParasitology, 1979, 79, 19. A vegyület a férgek 100 %-át megölte, 0,01 ppm koncentráció mellett.

3. Példa

Az UK-86,956-os inszekticid hatását Lucilia cuprina (Q törzs) rovar lárva állapotában értékeltük ki standard módszerrel, amelyben először a lárvákat tesztvegyülettel kezelt szűrőpapírral hozzuk érintkezésbe. A tesztvegyületet először a papírra visszük, acetonos oldat formájában. A kezelt szűrőpapírt ezután 1 ml újszülött borjúszérumot tartalmazó kémcsőbe helyezzük, és az első imágókat beletesszük. Az UK2

86,056 vegyület a lárvák 100 %-át megölte, 10 mg/m dózisban a szűrőpapírra alkalmazva.

Claims (7)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás (I) képletű antibiotikum előállítására, azzal jellemezve, hogy egy ATCC 53928 Streptomyces griseochromogenes mikroorganizmust vagy mutánsát, vagy genetikailag transzformált vagy rekombináns formáját, amely a vegyületet képes termelni, tenyésztjük vizes merített táptalajban vagy szilárd agar táptalajban, amely szén és nitrogén asszimilálható forrást és szerves sókat tartalmaz aerob fermentálási körülmények között, ameddig a kinyerhető mennyiséget nem nyerjük, majd ezt kinyerjük, izoláljuk és tisztítjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény (I) általános képletű antibiotikum előállítására, melynek relatív sztereokémiáját a (II) képlet mutatja, azzal jellemezve, hogy a megfelelő tenyésztést hajtjuk végre.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás Streptomyces griseochromogenes ATCC 53928 vagy mutánsa vagy genetikailag transzformált vagy rekombináns formája előállítására fermentálás útján, azzal jellemezve, hogy a vegyület fizikai és spektroszkópiai tulajdonságai a következők:

   , 25 o

   a) Fajlagos forgatóképesség [O] +95,0 C (c = 0,16, aceton)

   b) Ultraibolya abszorpció spektrum 238 ( = 24,600) max 244 ( = 27,000)

   252((sh) ( = 17,500)

   c) Elektron ütközés tömegspektrum ionok: 612 (M⁺),594 (M-I^O) 576 (M-2H₂O)⁺, 466, 151.

   d) FAB tömegspektrum 635 (M + Na⁺) (elméleti 635) ·· ·*·· · • · · ·

   e) Protonmágneses rezonancia spektrum (CDC1₃) részletekben: jól rezolvált jelek δ = 5,79 (dm, J = 11,4, 1H), 5,73 (dd, J = 13,8, 11,4, 1H), 5,41 (széles s, 1H), 5,12 (d, J = 8,1, 1H), 4,69 (dd, J = 14,3, 2,1, 1H), 4,65 (dd, J =14,3, 2,1, 1H), 4,29

   (m, 1H(, 3,95 (d, J = 6,2, 1H), 3,36 (d, J = 10,2, 1H), 3,26 (m, J = 2,3, 1H) , 2,56 (m, 1H), 1,87 (széles S, 3H), 1,57 (széles s, 3H), 1 ,54 (széles s, 2H) , 1,40 (q, J = 12, 1H), 1,03 (d, J = 6,6, 3H), 1,00 d, J = 6 ,6, 3H), 0,93 (d, J = 6,7, 3H), 0,70 (d, J = 6,6, 3H) .
4. 4. Biológiailag tiszta Streptomyces genus törzs tenyészet, melynek jellemzői az ATCC 53928 vagy mutánsának vagy genetikailag transzformált vagy rekombináns formájának felelnek meg, és a mikroorganizmus az 1., 2. vagy 3. igénypontok szerinti antibiotikum előállítására alkalmas visszanyerhető mennyiségben vizes táptalajban történő tenyésztéssel, amely asszimilálható szén, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmaz.
5. 5. Streptomyces griseoichromogenes ATCC 53928.
6. 6. Parazitaölő készítmény, azzal jellemezve, hogy 0,1 - 99 tömeg% mennyiségben (I) képletű antibiotikumot és a szokásos hordozóanyagokat tartalmazza.
7. 7. Eljárás gyógyszerkészítmény illetve állatgyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerint előállított (I) általános képletű vegyületet gyógyászatilag elfogadható hordozókkal összekeverünk és gyógyszerkészítménnyé- alakítunk.