FI80071B

FI80071B - Antacyklinderivat, deras mikrobiologiska framstaellningsfoerfarande och deras anvaendning som cellgifter.

Info

Publication number: FI80071B
Application number: FI842523A
Authority: FI
Inventors: Hans-Harald Sedlacek; Hans Peter Kraemer; Hans-Wolfram Fehlhaber; Hans Gerd Berscheid; Werner Aretz; Gerhard Huber; Bimal Naresh Ganguli; Ratan Sagar Sood; Julia Gandhi; Gauknapalli Chandrasekha Reddy
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1983-06-25
Filing date: 1984-06-21
Publication date: 1989-12-29
Also published as: DE3323025A1; PH22276A; NO160011C; KR850000529A; NO842546L; PT78784B; HU195979B; ES533631A0; FI842523A0; AU2981284A; EP0131181A3; FI80071C; DK306584A; MX7303E; PT78784A; DE3481515D1; NO160011B; ES8601230A1; GR81630B; CA1244364A

Description

1 80071

Menetelmä sytostaattisestl vaikuttavien antrasykliinijohdannaisten valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää sytostaattisestl vai-5 kuttavien antrasykliinijohdannaisten valmistamiseksi, joilla on kaava I

O OH OR.

4 .. il Jl 1 CH „-CH ~ I | OH 1 OH O OH OR3 15 jossa, silloin kun R4 merkitsee sokeriyhdistelmää Roa-Rod-Rod, R3 on Roa-Rod-Rod, Roa-dF-Cin A tai Roa-Rod-Acu, tai silloin kun R4 merkitsee sokeriyhdistelmää Roa-Rod-Acu, R3 on Roa-Rod-Acu tai Roa-dF-Cin A, tai silloin kun R4 mer-20 kitsee sokeriyhdistelmää Roa-dF-Rod, R3 on Roa-Rod-Rod tai Roa-dF-Rod, jolloin Roa = rodosamiini dF = deoksifukoosi Rod = rodinoosi 25 Acu = asuloosi ja

Cin A = sineruloosi A

sekä niiden fysiologisesti hyväksyttävien happoadditiosuo-lojen valmistamiseksi käymisen sekä siitä seuraavan eristämisen ja puhdistamisen avulla. Joillakin näistä uusista 30 antrasykliini-yhdisteistä on bakteerienvastaista vaikutusta grampositiivisia bakteereita kohtaan ja tämän lisäksi ne ovat tehokkaita erilaisia kasvaimia kohtaan.

Streptomyces purpurascens Y-11472 eristettiin tunnetulla tavalla maanäytteestä käyttämällä elatusainetta, 35 jonka pH oli 6,5- 8,5 ja johon oli lisätty antibioottia 2 80071 tai joka ei sisältänyt antibioottia. Streptomyces Y-11472 eristetään maanäytteestä käyttämällä lähinnä elatusainet-ta, jonka pH on 6,5- 7,0. Antibiootteina, joita kyseessä olevassa tapauksessa lisätään elatusaineeseen, käytetään 5 etupäässä ampisilliiniä ja amfoterisiini B:tä. Antibiootit estävät bakteereiden ja sienien kasvun. Antibiootteina voidaan edelleen käyttää streptomysiiniä, penisilliiniä tai nystatiinia.

Elatusaine koostuu hiili- ja typpilähteistä sekä 10 epäorgaanisista ravintosuoloista. Hiilen lähteiksi soveltuvat glukoosi tai tärkkelys. Typenlähteinä voidaan käyttää peptonia, hiivauutetta, lihauutetta, mallasuutetta tai kaseiinia. Jähmettämiseen voidaan käyttää agaria. Epäorgaanisiksi ravintosuoloiksi soveltuvat esimerkiksi nat-15 rium-, kalium-, magnesium-, kalsium-, fosfori- tai rikki-suolat.

Näin saatu mikro-organismi Y-11472 talletettiin 24.5.1983 numerolla DSM 2658 talletuslaitokseen DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) D-300 Göttinge-20 nissä (Grisebachstr. 8).

Mikro-organismi Streptomyces purpurascens Y-11472 kuuluu Actinomycetales-lahkoon, Streptomycetaceae-lajiin sekä Streptomyces-sukuun. Erilaisista, kirjallisuudessa kuvatuista Streptomyces-lajeista tiedetään, että ne muo-25 dostavat antrasykliiniyhdisteitä. Näistä yhdisteistä käytetään jo daunomysiiniä ja adriamysiiniä ihmisiä hoidettaessa syöväntorjuntaan.

Rodomysinoni-, iso-rodomysinoni- sekä rodomysiini-sukulaisantibiootteja kuvataan julkaisuissa Chem. Ber. 88, 30 1782-1818 (1955); Chem. Ber. 101, 1341-1348 (1968); J.

Med. Chem. 20, 957-960 (1977); Pharmacie 27, 782-789 (1972); Zeit. Allg. Mikrobiol., 14, 551-558 (1974); Tetra-hedr. Lett, no 38, 3699-3702 (1973); Folia Microbiol., 24, 293-295 (1979); sekä J. Antibiotics, 32, 420 (1979).

35 Aklasinomysiini A:ta kuvataan US-patentissa nro li 3 80071 3 988 315 ja Oki et ai. kuvaavat sitä myös julkaisussa J. Antibiotics 28, 830 (1975) ja 32, 791-812 (1979).

Sinerubiini A:ta ja B:tä kuvataan GB-patentissa nro 846 130, US-patentissa nro 3 864 480, sekä julkaisuissa 5 Keller-Schierlein et ai. "Antimicrobial Agents and Chemo-terapy", s. 68 (1970), Chemical Abstracts 54, 1466i (1960) sekä J. Antibiotics 28, 830 (1975).

Muita antrasykliini-antibiootteja kuvataan yksityiskohtaisesti tai yhteenvetona teoksessa "Index of An-10 tibiotics from Actinomycetes", jonka julkaisija on Hamao Umezawa, University Park Press, State College, Pennsylvania, USA (1967), seuraavasti esitetyllä tavalla: Antibiootti Sivunumero

Aklasinomysiini A ja B 101-102 15 Adriamysiini 122

Carminomysiini I 255

Galirubiini S-D 405-408

Rodomysiini X-Y 879-880 β-rodomysiini 881-885 20 γ-rodomysiini 886-892

Steffimysiini 945

Kirjaan "Antibiotics", osa I Mechanism of Action, julkaisijat David Gottlieb sekä Paul D. Shaw, Springer-Verlag New York, Inc., N.Y. (1967) sisältyy sivuille 190-25 210 A. DiMacron tutkielma, jonka nimi on "Daunomycin and

Related Antibiotics".

"Information Bulletin", nro 10, International Center of Antibiotics, yhteistyössä WHO:n kanssa koskee ant-rasykliinejä sekä niiden johdannaisia.

30 Streptomyces purpurascens Y-11472:n ominaisuuksia kuvataan tämän julkaisun taulukossa 1.

4 80071 t C Ή i ra i m ρ 3 e c p c p a ρ 3 ρ 3 its p e ns en p a r-l e 3 e 3 ra c op m tn 3 3 ή era

3 -H S3 a P 0 QJ P

-π P Di 3 G G -H G 3 PO Ρ P 3 O > --(a ra Di a C w p ra (0¾

.yiti (ti 3 p C O C M

I C > 3 0) 3 0)3 3 ((aw a> (0 p .y c a p .y a ¾ p >i cp e c ra e p in c e ίο p p .q c ra ra e ra p 3 ra ra pra o ra ra ra ra p ra ra ρ ra ra p ,y ,y ,y e ρ p ra ρ p ra .y ή p ,y 3 ra ή ra racra o c ω rac ρ p 3 ra ra ιθ3<ο -p 3 c rara o »o pipe > >a> > ap >e (01 P i i • 1 P 1 1 I I i ΓΟΟ i i i >i i -p 2 ra p i 2 g .

p -P p -p > -P ra IS rara ra 2? £ o ra « ra rararac i c ρ ^ p c 3 p e e .y p y s 3 * c p « ra *-> (rara prara p raa cc ® - p c c ra »o ra c c « ra - c c rara ra p e > ra 3 T> P « yPPCCyCSC cc p >i ra 3 q a c era rararara raraw pp ra > e s p e 3 pp esc cc cc ·(“> s rao s ra p a ra 3 ra .cp ra p 3 p p ra p 3 Ey ra y ra s tn p »op ppararapra « p pp p g « p 3 ra > p oppcScpS cc pra p * 3 c p 3 c ra p p ra 3 ra 3 p p ra ra p> p e a ra ρ p p ccn (n>E(n.ca>PC(ti rac >raccrac S ora ra 303 3c 3 p p S Sra 3 c 3 p s ra

0 I > 3(03 (03 3 ra Ρ P OP 3P(0P(dP

ra o o a 1 p -n m aspra in p 3 a ra 3 ρ in ρ c rap 3 cc 3 ra 3 p ra 3 S33cra ·· rap p »rara '3 «m 3 «y p « ρ p 3 ra y es p ra ra «0 c p «o m *ra 1 p * 'ra p >ra p c p tn c c« O n S>PP>C>CPCC>(03 >P(tipP(ti -r-ι o p>i(tira>i(ti>(raorara>ira3 >1 ra ra o ra ra p p MpPppPpcpccppa ,c s s y s p p - 3 1 ra ra c >H -1—1 p P Q) 3 p 1 ra 1 c en o « p 1 ra to ra ra cpo ra 3 ra p ra c r-<rarap p a > ra >c p o y p occ ra ra o ra (O p p 3 »o 3 p »o ra c y ra pp p > tnpap pto 3 y ρ pra pc 3 to c p (op a 33 p di ora 3»0 3ra »ora c pa ra 3 > PStop Sp ra 3 p »oi ara c Ό30 ;op p 03 pto :op rac p 3 p ra Prara 3

Ha y ra pp rarapp> ra p 3»; <l> a pp era pc p era y p e y a to pp «oc opprac ra pora p ra ara «0 3 rara »oras 3 »o rap 3 o s y a >c>pa p > p p a >, e 1 S ra ra ra o (0 > p ra P p p p e > e a p p p ra p «ra ra päp e « «ra »3 «-ra e p 3 ra p irac>cji(erap ρ p 3 ra O' >1 rara p ra ppp >, co Prara a PCpc«rarao a ä e 1 a p p ,y p e a a .e a orap >1 p p p ra 3 3 o >1 y S e p pp«pcyyy p ρ ρ 3 »o 3 p ra «pp 3 «ra «03ra3>i «ra «ra «ra «ra »o di > (O > »o > ρ ρ p a »o > (O p »o > »e > pora to > ρ > ρ λ Ρ λ a > p > tn > ρ > p (0ΡΡ (0 >1 3 >1 3 o P O >1 >1 3 >1 o >1 3 >1 3 a Di ra y ,c y ,c y y p y p o ϋ o ä o λ a .y >i o a p y ρ ω ra o ra ό p • p 1 ra ra 1 to ρ p 3 so p 1 ra 1 raocto ra ό rapa p i ρ p pS-pp 1 θ' p ra ra to ra ra ra ra Pra to ra o Di ra ρ o > σ> σ> ρ »o ρ e ra 1 3010 op ra ra ra p s ra ρ p o tn 1 p 01 y ρ ρ 1 p a «e m a p a p tn e ra 3 pop e D> CO E-t !>i O ra 3 p >i p I P I Di C ρ o PNraS ra (oppp d» p ra p y p ra · di p e 1 -n rarape ra cip o o y p ra PO ra p y ra p e orain ra ρ y P «0 o ra > p ra y m p dp-p-po a p o .e y ρ m p 3 cp >1 di p ra a e p ra o 3 o ra p 3 p ra ρ«ορο ra di ra ra >» n soy to > p rc y Spop a ra a p H u ra -—. —. P · ·· * * * · ra ja w otrora· lt> >d r- cd 5 80071 c) Fysiologiset ominaisuudet I. Kasvun lämpötila-alue: kasvaa hiiva-mallas-agarilla 24-40°C:n lämpötila-alueella, optimi kasvun tapahtuessa 30eC:ssa 5 2. Nitraatin pelkistyminen: positiivinen 3. Melaniinin muodostuminen: " 4. Gelatiinin käyttökyky: " 5. Tärkkelyksen hydrolyysi: " 6. Tyrosiinin hydrolyysi " 10 7. Natriumkloridin sietokyky: > 7,0 % mutta < 10 % 8. Kaseiinin hydrolyysi: positiivinen 9. Gelatiinin nesteytyminen: " 10. Ureaasin valmistus II. Streptomysiiniesto: Estyminen konsentraa- 15 tiolla 12,5 pg/ml 12. pH-herkkyys:

Substraattihuovasto ja diffundoituva pigmentti ovat herkkiä pH:n suhteen. Violetti (purppuranpunainen) aikalisissä olosuhteissa, punainen (ruusunpunainen) happamissa 20 olosuhteissa.

d) Hiilen käyttö D-glukoosia, L-arabinoosia, sakkaroosia, D-ksyloo-sia, I-inositolia, D-manniittia, D-fruktoosia, ramnoosia, raffinoosia, galaktoosia, salisiinia, maltoosia, sello-25 bioosia, riboosia, Na-glutamaattia ja sorbiittia käytettiin kasvuun. Selluloosan käyttö ei ole yksiselitteinen.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että mikro-organismia Streptomyces purpurascens Y-11472 (DSM 2658) fermentoidaan tavanomaisella tavalla aerobisis-30 sa olosuhteissa elatusaineen läsnäollessa ja muodostuneet yhdisteet eristetään viljelynesteestä sekä huovastosta tavanomaisella tavalla uuttamalla orgaanisilla liuottimilla sekä sitä seuraavan suoritettavan kromatografian tai jakautumisen avulla.

35 Streptomyces purpurascens Y-11472 fermentoidaan 6 80071 hiili- ja typpilähteitä sekä hivenaineita sisältävässä elatusaineessa ja yhdisteet eristetään viljelynesteestä ja huovastosta tunnetulla tavalla, kuten seuraavassa kuvataan.

5 Hiilen lähteiksi soveltuvat glukoosi, tärkkelys, dekstriini sekä glyseriini. Sopivia typen lähteitä ovat soijajauho, lihauute, mallasuute, maissin liotusvesi, pep-toni ja kaseiini. Epäorgaanisiksi ravintosuoloiksi soveltuvat natriumkloridi, magnesiumsulfaatti tai kalsiumkar-10 bonaatti. Hivenaineina voidaan käyttää rautaa, magnesiumia, kuparia, sinkkiä sekä kobolttia.

Streptomyces purpurascens Y-11472:a voidaan viljellä 24-40°C:n lämpötilassa, pH 6,5 - 8,5:ssä. Etupäässä Streptomyces purpurascens Y-11472:n viljely tapahtuu aero-15 bisissa olosuhteissa, 30eC:ssa ja pH-arvossa 7,0. 72 tunnin kuluttua, jolloin saadaan suurin saanto, käyminen keskeytetään. Käyminen suoritetaan edullisesti pinnanalaisena.

Käymisen ja antrasykliini-yhdisteiden muodostumisen 20 edistymistä voidaan seurata viljelynesteen bakteerienvas-taisen toiminnan avulla bakteereja S. aureus 209 P sekä B. subtilis kohtaan samoin kuin uuttamalla koko viljely-neste (huovasto sekä viljelysuodos) orgaanisella liuottimena ja mittaamalla absorption voimakkuus 494 nm:ssä. 25 Orgaanisena liuottimena käytetään etupäässä etyyliasetaattia.

Viljelysuodoksen ja huovaston sisältämät antrasyk-liini-yhdisteet eristetään ko. keksinnön graafisessa kuviossa I esitetyn kaavion mukaisesti.

30 Huovaston sisältämät antrasykliini-yhdisteet uute taan jollain orgaanisella liuottimena, ensi sijassa vettä sisältävällä asetonilla, jonka pH-arvo on säädetty 3,5:een. Asetonin poistamisen jälkeen säädetään vesijakeen pH-arvo 7,5:een ja uutetaan sitten etyyliasetaatilla. Vil-35 jelyneste uutetaan pH-arvossa 7,5 jollain orgaanisella 7 80071 liuottimena, kuten etyyliasetaatilla tai kloroformilla, lähinnä etyyliasetaatilla. Huovastosta ja viljelysuodok-sesta saadut etyyliasetaattiuutteet yhdistetään tai niiden jatkokäsittely suoritetaan erillään, ne väkevöidään ja 5 otetaan johonkin orgaaniseen liuottimeen, kuten bentsee-niin tai tolueeniin. Ensi sijassa käytetään tolueenia. Tolueeniliuos uutetaan sitten asetaattipuskurilla, jonka pH-arvo on 3,5. Tässä vaiheessa jaetaan antrasykliini-johdannaisten seos kahteen jakeeseen. Tolueenijakeeseen jää-10 vää seosta merkitään jakeeksi A, vesijakeeseen jäävää gly-kosidiseosta merkitään jakeeksi B.

Jaetta A puhdistetaan edelleen, kuten ko. keksinnön graafisessa kuviossa 1 esitetään.

Jae B puhdistetaan edelleen ko. keksinnön graafisen 15 kuvion III mukaisesti.

Kuten graafisesta kuviosta II voidaan nähdä, ja-keesta A saadaan vähintään neljä komponenttia, joista sy-torodiini J-komponentti väkevöidään monivaiheisen kromato-grafian avulla ja eristetään puhtaassa muodossa.

20 Graafisessa kuviossa III kuvatulla tavalla saadaan jakeesta B sytorodiini A, B, C, D, E, F, seos G + I (1:1), H, K, L, M, seos M + 0, P, V ja W. Jakeissa "X" sekä "Y" on kysymys muiden antrasykliini-yhdisteiden seoksista, joita vielä tutkitaan. Niiden yleinen rakenne on kaavan I 25 kaltainen.

Streptomyces purpurascens Y-11472:n viljelyliuok-sesta eristetyt ja graafisen kuvion I mukaisesti puhdistetut yhdisteet ovat yleisen kaavan I mukaiset lukuunottamatta mahdollisesti substituentit OR3 ja OR4 .

30 8 80071

Graafinen kuvio I

Antibioottikompleksin eristäminen Streptomyces purpurascens Y-11472:sta 5 käymisen avulla saatu viljelyliuos

Huovasto Viljelysuodos I sekoitettu asetonin asetaattipusku- I pH säädet- kurin pH 3,5 kanssa 2 tunnin ajan ty 7,5:een 10 II väkevöity ja uutettu etyyli- rI uutettu asetaatilla pH 7,5 etyyliase- ________taa tiliä l J ϊ 15 vesijae etyyliasetaattijae vesijae

Haihdutettu kuivaksi V

raaka jäännös I liuotettu tolueeniin II uutettu asetaattipuskurilla (pH 3,5) l ί 25 Tolueenijae Vesijae

Jae A Jae B

9 80071

Graafinen kuvio II Jakeen A puhdistaminen

Raaka jae A : 5 g 5

Piihappogeelipatsas; 2,8 x 68 cm, 175 g eluoitu 2-%:isella metanolilla CHCl^ssa

\-'—“ I I

10 Jae A, Jae A~ Jae A-. Jae A.

1 2 i 4 preparatiivinen ohutlevykro-matografia piihappogeelillä, 4 % metanolia CHCl-.:ssa

15 J

sytorodiini J saanto 15 mg 10 80071

Graafinen kuvio III

Vesijakeen B jatkokäsittely I pH säädetty 7,5:een II uutettu etyyliasetaatilla r | etyyliasetaattijae vesijae (heitetty pois) 10 väkevöity glykosidin suhteen rikastetut jakeet (sytorodiinir-raakaseos) 15 I kromatografia pylväissä tai jakaminen tolueenin ja metanoli/veden 1:1 välillä II preparatiivinen ohutlevykromatografia _tai suurpainenestekromatojrafia (HPLC) osittain puhdistettu kompleksi I osittain puhdistettu komp- (heikommin polaarinen) leksill (voimakk. polaarinen)

HPLC HPLC

25 S y t o r o d i i n i ^ - Syto: :odj ini ^ F D E C P V G + I jae B H A M jae H y II My il / \ / \

30 KL N +0 W

lx 80071

Keksinnön mukaisesti valmistetut yhdisteet ovat

Yhdiste_R3_R4______

Sytorodiini F Roa-Rod-Acu Roa-Rod-Acu (kaava V) (kaava V) 5 " B Roa-dF-Cin A Roa-Rod-Rod (kaava VII) (kaava Vili) " A Roa-Rod-Rod Roa-Rod-Rod (kaava VIII) (kaava Vili) " P Roa-dF-Cin A Roa-Rod-Acu 10 (kaava VII) (kaava V) " V Roa-Rod-Acu Roa-Rod-Rod (kaava V) (kaava Vili) " N Roa-Rod-Rod Roa-dF-Rod (kaava VIII) (kaava X) 15 " W Roa-dF-Rod Roa-dF-Rod (kaava X) (kaava X)

Keksinnön läheisiä yhdisteitä ovat

Yhdiste_R3 ^_R4 __

Sytorodiini D Roa-dF=Cin B RoaRod-Acu 20 (kaava VI) (kaava V)

" C Roa-dF=Cin B Roa-dF=Cin B

(kaava VI) (kaava VI)

" G Roa-dF=Cin B Roa-dF-Cin A

(kaava VI) (kaava VII)

25 I Roa-dF-Cin A Roa-dF=Cin B

(kaava VII) (kaava VI) " 0 Roa-dF-Rod Roa-Rod-Rod (kaava X) (kaava Vili)

Muita läheisiä yhdisteitä ovat seuraavat yleisen 30 kaavan III mukaiset sytorodiinit O OH OR^ J!SvJLv^L^ CH 2-ck 3 QQTXT011 <“>

OH 0 OH OR

i2 80071 jossa kaava Ritilä on seuraavat merkitykset:

Yhdiste p" 4

Sytorodiini E Roa-Rod-Rod (kaava VIII) " K Roa-dF-Rod ^ ' (kaava X) " L Roa-Rod (kaava XI)

" M Roa-dF

(kaava XII) 10

sekä seuraavan kaavan IV mukainen sytorodiini J

O OH COOCH3

^VVVVCI,2'Cil3 15 0H

OH O OH .OR

jossa kaavassa R^ merkitsee sokeriyhdistelmää Rod-Rod-Rod 20 (kaava IX). Edellä mainituilla sokeriyhdistelmillä on seuraavat rakennekaavat(v-XII): CK., CH- CH- j< _r< λ< 25 \ / °—( /- )rrO Roa-Rod-Acu N.(CH3) 2 (V) CH, CHr> 30 o-( P-(

-( / ° ~\ Vo Roa-dF=Cin B

n(ch3)2 ch3 35 (VI) 11 is 80071 'CU 3 CH3 CH3 ,° \ /O'-'C Roa-dF-Cin Λ

5 N(CH3)2 OH

(VII) ch3 ch3 ch3 0“\ ,°~K Roa-Rod-Rod

10 —V- o —/ \— O —7 \— OH

N(CH3)2 (VIII) 1C >CI13 xch3 /CH3 ~(3~ ° "Ö~ ° \3~m R°a'Roa'Koä (ix) y—O ( y—O ( y—OH Roa-dF-Rod

(CH,)7^0H

(X) 25 p-^CH3 C V“0 C y—OH Roa-Rod ^Ν(ΟΗ3) 2 (XI) 30 P^”3

\ / 0-\ / 0H Roa-dF

\n(ch3)7\oh (XII) l4 80071

Keksinnön mukaisesti valmistetuille antrasykliini-johdannaisille on ominaista voimakas vaikutus grampositii-visia bakteereita vastaan sekä selvä sytostaattinen vaikutus.

5 Sytotoksista aktiivisuutta koskeva selvitys

Kyseessä olevassa keksinnössä kuvattujen yhdisteiden tehokkuus määritettiin hiiren L1210 leukemiasoluilla. Yksityiskohtaisesti käytettiin seuraavia koejärjestelmiä: a) Solujen jakaantumismääritys 10 Tällä menetelmällä selvitetään in vitro koeyhdis- teen erilaisten konsentraatioiden kanssa suoritetun solujen inkuboinnin jälkeen, missä määrin solut voivat käyttää radioaktiivisia DNA-esiasteita (esim. C14:llä leimattua tymidiiniä). Käsittelemättömiä soluja käytetään samanlai-15 sissa koeolosuhteissa ja ne toimivat kontrolleina. Seuraa-vassa kuvataan menetelmää lyhyesti: L1210-soluja, jotka ovat eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa (5 x 103/ml RPMI 1640) inkuboidaan mikrotiitte-rilevyllä 72 tunnin ajan erilaisten konsentraatioiden 20 kanssa koeyhdistettä (37°C, 5 % C02 , 95 %:n suhteellinen ilmankosteus). Kontrollit koostuvat soluista, jotka inkuboidaan yksinomaan tuoreen elatusaineen kanssa. Kaikki määritykset suoritetaan nelinkertaisina määrityksinä.

65 tunnin kuluttua lisätään 50 μΐ C114 tymidiiniä (1,5 25 pCi/ml) solun DNA:n merkkaamiseksi radioaktiivisesta.

Seitsemän tunnin kuluttua solut poistetaan imemällä, DNA saostetaan 5-%:isella trikloorietikkahapolla ja pestään peräkkäin vedellä tai metanolilla.

50°C:ssa suoritetun kuivauksen jälkeen määritetään 30 DNA:hän muodostunut radioaktiivisuus, sen jälkeen kun on lisätty tuikenestettä.

Tulokset ilmoitetaan tuikeindeksin suhteena koeyh-disteen kanssa suoritetun inkuboinnin jälkeen, prosenttina käsittelemättömästä kontrollista. Näin saaduista mittaus-35 tuloksista saadaan annosvaikutuskäyrä ja graafisesti sei- il 15 80071 vitetään IC50, se on konsentraatio, joka koeolosuhteissa vähentää radioaktiivisen tymidiinin ottoa 50 % kontrolliin nähden. Taulukossa 2 esitetään yhteenvetona kyseessä olevassa hakemuksessa kuvattujen yhdisteiden IC50-arvot ad-5 riamysiiniin (ADM) verrattuna.

b) L1210 leukemiasolujen pesäkkeiden muodostus pehmeässä agarissa Tätä menetelmää käytetään osoittamaan koeyhdisteiden vaikutus solujen kasvuun useampien sukupolvien aikana 10 (solukierron pituuden ollessa noin 10-12 tuntia tarkkaillaan seitsemän päivän pituisen koeajan kuluessa noin 14 toisiaan seuraavaa sukupolvea).

Sytostaattisesti vaikuttavat aineet aikaansaavat tässä kokeessa tarkastellun pesäkeluvun vähenemisen käsit-15 telemättömään kontrolliin verrattuna. Yksityiskohtaisesti koe suoritetaan seuraavasti: 500 leukemiasolua levyä kohti inkuboidaan erilaisin konsentraatioin koeyhdistettä yhden tunnin ajan 37°C:ssa. Tämän jälkeen solut pestään kaksi kertaa McCoy5A-elatusai-20 neella ja valetaan lopuksi petrimaljoihin 0,3 % agarin lisäyksen jälkeen. Kontrollit inkuboidaan yksinomaan tuoreen agarin kanssa. Yksituntisen inkuboinnin sijaan monissa tapauksissa sekoitetaan ylempään agar-kerrokseen erilaisia konsentraatioita koeyhdistettä, jotta saavutetaan solujen 25 jatkuva ekspositio koko inkubointiajan. Agarin jähmettymisen jälkeen levyjä inkuboitiin seitsemän päivän ajan inkubaattorissa 37°C:ssa (5 % C02 , 95 % suhteellinen ilman kosteus). Tämän jälkeen lasketaan syntyneiden pesäkkeiden lukumäärä, joiden läpimitta on 60 μ. Tulokset esitetään 30 käsiteltyjen agarlevyjen pesäkeluvun prosenttina käsittelemättömien kontrollien suhteen. Näin saaduista annos-vai-kutus-käyristä määritetään IC5 0 aineen tehokkuuden mittana. Taulukossa 2 esitetään yhteenvetona kyseessä olevassa keksinnössä kuvatuille yhdisteille saadut tulokset adria-35 mysiiniin verrattuna.

80071 16

•H

4J CM

c n ro m n n n cm n I «-cm h · I * III II O II

q o o on o o o o o n «— o o XJ «— «-T-I «—«—«- «— «— | r~ r~

(1) 3 O O X

o X XXX«-XXX~,XX«- X X

M C ^ * r- in ui ή NrcMmX^cocM co oo X » r" σ\ in •H s ^ v v ·. v | *> ^ ΓΟ v ^

6 C '»«•rN NNN «— n T

3 •U X p tn ^ -p

O <H «- . -P

Ό g H

O \ -H ,x

P Cp -P -P

e 3 e p

C \ -H -P

dJ >- o

T3 12 -H

ir^ o ci tn n «j* m aj Φ 0J m ^ III III n ^ "J· «- «- n -X O C O o o n o r> I I I O i | I — 2* h h ^ ^ ^ ° ° OOOI o o o * tttj I «— <— t— o i— i— «—

S " X X X ° X X X X X X X χ X

* g, cirro mi-co - cm t>. * «- vo m r- cMcnn «— n cm ,- n cm cm «- cm rH en n m -‘T vr ^ n cm m m 7 «- e IIIIIII 7 7 7 O 7 \ o o o o o o o 'o oo ° T- on 0, g1 ° ° - I °7 3 ws X X X X X X X χ χ χ * ° χ ° •q r* ς _ ocoi-comtovvin^oi - χ co x min '‘•-*'*·ν,“ν*--η - VDCMT-CMinCMCMVTCMCMCM nCMin

« H

H o + +

f «N

0 c

* -H

M -H

J-J Ό rH p " - i Ξ E ε

3 «S

(ö D S

E-ι ti, >s oo il i7 80 0 71

Ko. keksintöä valaistaan lähemmin seuraavin esimerkein:

Esimerkki 1

Streptomyces purpurascens Y-11472:n eristäminen 5 maasta a) Eristyselatusaineen valmistus Elatusaine 1: Glukoosi 1,0 g

Glyseriini 1,0 g L-arginiini 0,3 g 10 K2HP04 0 , 3 g

MgS04 . 7H2 0 0,2 g

NaCl 0,3 g

Hiivauute 2,0 g

Fe2 (S04 )3 10 mg 15 CuS04 . 5H2 0 1 mg

ZnS04 . 7H2 0 1 mg

MnS04 . 7H2 0 1 mg

Agar 15 g

Tislattua vettä 1 1 20 pH 6,5

Elatusaine 2: Glukoosi 2,0 g L-asparagiini 1,0 g K2HP04 0 , 5 g 25 MgS04 . 7H2 0 0, 5 g

Maauute 200 ml

Agar 15 g

Tislattua vettä 800 ml pH 8,0 30

Elatusaine 3: Tärkkelys 10,0 g

Kaseiini 0,3 g KN03 2,0 g

NaCl 2,0 g 35 K2HP04 2,0 g is 80071

MgS04 0,05 g

CaC03 0,02 g

FeS04 0,01 g

Agar 15 g 5 Tislattua vettä 1 l pH 7,2 - 7,5

Elatusaineita steriloidaan puoli tuntia 121°C:ssa. b) Maanäytesuspension valmistus 1 g maanäytettä kuivattiin ilmassa, jauhettiin huh-10 maressa hienoksi ja kuumennettiin tunnin ajan 120°C:ssa. Näin käsitelty maanäyte lietettiin tislattuun veteen ja sitä ravisteltiin perusteellisesti. Maan annettiin laskeutua ja yläpuolella sijaitseva neste käytettiin siirroksena edellä esitettyä eristyselatusainetta varten.

15 c) Eristyselatusaineen siirrostus 1 ml maanäytesuspensiota siirrostettiin petrimal-joille, joilla oli kullakin 50 ml edellä esitettyä eristyselatusainetta .

d) Streptomyces purpurascens Y-11472;n eristäminen 20 Siirrostettuja petrimaljoja inkuboitiin kahden vii kon ajan 37°C:ssa ja Streptomyces purpurascens Y-11472 eristettiin kasvavista mikro-organismeista tunnetulla tavalla.

Esimerkki 2 25 Streptomyces purpurascens Y-11472:n viljely anti- bioottikompleksin fermentatiiviseksi tuottamiseksi

Streptomyces purpurascens Y-11472 siirrostettiin hiiva-mallasagarille, jolla oli seuraava koostumus: Mallasuute 10,0 g 30 Hiivauute 4,0 g

Glukoosi 4,0 g

Agar 15,0 g

Tislattua vettä 1 1 pH 7,0 35 Elatusaine jaettiin koeputkiin ja steriloitiin 30 i9 80071 minuutin ajan 121°C:ssa, sitten putket jäähdytettiin vino-asennossa vinopintojen valmistamiseksi, siirrostettiin siirroksella ja inkuboitiin 10-15 päivän ajan 28°C:ssa.

Tämän ajan kuluttua voitiin todeta hyvä kasvu sekä 5 hyvä itiöiden muodostuminen. Tislattuun veteen vinopinnal-ta saatua itiösuspensiota käytettiin siirroksena 5 erlen-meyer-kolvia varten, joissa kussakin oli 100 ml siirros-tusainetta tai yhtä 5 litran vetoista imupulloa varten, jossa oli 1 litra kantaviljelmäelatusainetta.

10 Siirroselatusaineen koostumus

Glukoosi 15,0 g

Soijajauho 15,0 g

Maissin liotusvettä 5,0 g

CaC03 2,0 g 15 NaCl 5,0 g

Tislattua vettä 1 1 pH 7,0

Edellä esitetty elatusaine jaettiin 100 ml:n erinä 500 ml:n vetoisiin pulloihin tai 1 litra elatusainetta 20 otettiin 5 litran vetoiseen imupulloon ja elatusainetta steriloitiin 30 minuutin ajan l21°C:ssa. Kolvit ja pullot jäähdytettiin, siirrostettiin itiösuspensiolla sekä ravisteltiin 240 kierrosta minuutissa, 72 tunnin ajan 30eC:ssa pyöröravistelulaitteessa, jonka heilahdussäde oli 3,75 cm. 25 Kasvanut viljelmä käytettiin siirroksena 15 litran vetoisessa lasisessa käymisastiassa, jossa oli 5 tilavuus-%:ista kantaviljelmäelatusainetta, siirrosviljelmän valmistamiseksi toista vaihetta varten. Käyminen suoritettiin 26°C:ssa (± leC) samalla sekoittaen 160-180 kierrosta mi-30 nuutissa ilmastusnopeuden ollessa 6-7 1/min. Tällöin saatu hyvin kasvanut siirrosviljelmä käytettiin tuotantoelatus-aineen siirroksena.

Tuotantoelatusaineen koostumus Glukoosi 20,0 g 35 Mallasuute 10,0 g 20 8 0 0 71

Hiivauute 4,0 g

Tislattu vesi 1 1 pH 6,8

Fermenttorin sisältöön lisättiin 0,025 % Desmo-5 pher©: iä vaahdonestoaineeksi.

260 1 edellä esitettyä elatusainetta pantiin 390 litran vetoiseen käymisastiaan. Elatusainetta steriloitiin sekä epäsuorasti että suoraan höyryn avulla 28 minuutin ajan 121°C:ssa. Käymisastia jäähdytettiin ja siirrostet-10 tiin kakkosvaiheen siirrosviljelmällä (5 tilavuus-%). Käyminen suoritettiin 68-72 tunnin ajan 26°C:ssa (± 1°C) samalla sekoittaen 100-200 kierroksella minuutissa käyttäen 1:0,6 (9-10 m3/h) ilmastusnopeutta. Käymisen päätyttyä 68-72 tunnin kuluttua antibiootin konsentraatio nousi 100-150 15 μΐ/mlraan ja viljelynesteen pH nousi 5,5 - 6,Oraan. Jään-nössokerin pitoisuus viljelyliuoksessa oli 0,03 - 0,5 % ja huovaston märkäpaino nousi 3-4 g/tilavuus-%.

Esimerkki 3

Streptomyces purpurascens Y-11472:n kasvatus anti-20 bioottikompleksin valmistamiseksi käymistietä a) (1) Esiviljelyelatusaineen koostumus

Gramimpf-jauhe 10,0 g

Dekstroosi 10,0 g

NaCl 5,0 g 25 CaC03 3,0 g

Tislattu vesi 1 1 PH 7,0 72 tuntia 30°C:ssa (2) Tuotantoelatusaineen koostumus 30 Tärkkelys 10,0 g

Glukoosi 10,0 g

Mallasuute 7,5 g

Peptoni 7,5 g

NaCl 3,0 g 35 MgS04 1,0 g 2i 80071 ΚΗ2Ρ04 2,0 g

CuS04 . 5H2 0 0,007 g

FeS04 . 7H2 0 0,001 g

MnS04 .4H2 0 0,008 g 5 ZnS04 . 7H2 0 0,002 g

Tislattu vesi 1 1 pH 7,0 Käymisaika: 88-96 tuntia b) (1) Esiviljelyelatusaineen koostumus 10 Mallasuute 10,0 g

Hiivauute 4,0 g

Glukoosi 4,0 g

Tislattu vesi 1 1 pH 7,0 15 72 tuntia 30°C:ssa (2) Tuotantoelatusalneen koostumus Tärkkelys 10,0 g

Glukoosi 10,0 g

Soijajauho 15,0 g 20 K2HP04 1,0 g

MgS04 1,0 g

NaCl 3,0 g

CuS04 . 5H2 0 0,007 g

FeS04.7H20 0,001 g 25 MnCl2.4H20 0,008 g

ZnS04 . 7H2 0 0,002 g

Tislattu vesi 1 1 pH 7,0

Talteenotto 88-96 tunnin kuluttua 30 Esimerkki 4

Antrasykliini-yhdisteiden raakaseoksen eristäminen Sentrifugoitiin noin 250 1 viljelyliuosta yhdestä 300 litran vetoisesta käymisastiasta.

a) 200 litran erä suodatuselatusainetta säädettiin 35 pH 7,5:een NaOH:n avulla sekä uutettiin kaksi kertaa 50 22 80 071 litralla etikkahappoetyyliesteriä, sitten orgaaninen jae väkevöitiin tyhjössä. Tällöin erkautuva vesijae erotettiin ja uutettiin kolme kertaa etikkaesterillä. Yhdistetyt orgaaniset jakeet väkevöitiin kuiviksi tyhjössä ja jäännös 5 liuotettiin 650 ml:aan tolueenia, liuos uutettiin viisi kertaa, kulloinkin 300 ml:n erällä natriumasetaattipusku-ria pH 3,5, tolueenijae väkevöitiin tyhjössä (punainen öljymäinen jäännös, jae A). Yhdistettyjen vesijakeiden pH säädettiin 7,5:ksi 2 normaalisella NaOH:lla sekä uutettiin 10 neljä kertaa 400 ml:11a etikkaesteriä. Erottuneet esteri-jakeet väkevöitiin tyhjössä kuiviksi (0,7 g syvänpunaista kiinteää jäännöstä: jae B).

b) 0,5 kg kiinteää huovastoa uutettiin kaksi kertaa, kulloinkin 50 litralla asetoni-asetaattipuskuria pH

15 3,5 (10:1), yhdistetyt uutteet väkevöitiin tyhjössä 12 litraksi (pH 3,5), väkevöite pestiin kolme kertaa neljän litran erällä tolueenia, tolueenijakeet yhdistettiin ja väkevöitiin tyhjössä öljymäiseksi, syvänpunaiseksi jäännökseksi. Vesijakeen pH säädettiin väkevöidyllä NaOHilla 20 pH 7,5:een, uutettiin kolme kertaa, kulloinkin 4 litran erällä etikkaesteriä ja yhdistetyt esterijakeet väkevöitiin tyhjössä. Jäljelle jäi 1,98 g syvänpunaista, kiinteää jäännöstä (jae B).

c) Eristyksen jatkomenetelmä käy ilmi kaavioku-25 vioista I-III. Esimerkiksi yhdiste sytorodiini J saatiin pylväskromatografian avulla saadun puolittain puhtaan ja-keen Aa preparatiivisen ohutlevykromatografiän avulla (kaaviokuvio II).

Sytorodiini A, B, C, E, F ja H sekä l:l-seos 30 G + I eristettiin glykosidin suhteen rikastettujen jakei-den toistetun kromatografian avulla (kaaviokuvio lii), esim.piihappogeelillä tai Sephadex LH 20:llä tai käänteis-faasi, "reversed phase" -adsorption tai DCCC:n (pisara-vastavirta-kromatografian) avulla tai jakamalla tolueenin 35 ja metanoli/veden (1:1) välillä. Viimeinen puhdistusvaihe 11 23 80071 suoritettiin ohutlevy- tai suurpainenestekromatografialla (HPLC). HPLC tapahtui käyttämällä pylvästä, jossa oli Microporasil®: a (Waters) tai Lichrosorb^! Si 60:a (Merck) sekä liikkuvaa faasia, jolla oli seuraava koostumus: klo-5 roformi:metanoli:etikkahappo:vesi: trietyyliamiini suhteessa 68:20:10:2:0,01. Virtaus säädettiin 0,5 - 1,5 ml:ksi minuutissa ja kvalitatiivinen analyysi suoritettiin UV-ab-sorption avulla 254, 260 tai 490 nm:ssä läpivirtausfoto-metrillä.

10 Esimerkki 5

Yhdisteiden sytorodiini A:n, B:n sekä H:n eristäminen raakaseoksena 1,0 g raakaa sytorodiiniseosta, joka oli saatu uuttamalla viljelyliuoksesta kaaviokuviossa I kuvatulla ta-15 valla, kromatografoitiin piihappogeelillä 31 μ (Grace) lasipylväässä, jonka koko oli 3 x 43 cm, käyttämällä CHClj/metanoli/95 %:nen etikkahappo/vesi/trietyyliamiini-seosta suhteessa 80:5:5:1:0,01. Näyte liuotettiin 7 ml:aan liikkuvaa jaetta, pantiin eluentilla tasapainotettuun pyl-20 vääseen, koottiin 23 ml:n suuruisiin jakeisiin ja arvioitiin ohutlevykromatografian avulla, joka suoritettiin DC-valmislevyillä piihappogeelillä 60 F 254 (Merck) käyttäen eluenttina CHC13/metanoli/96-%:inen etikkahappo/vesi/tri-etyyliamiini-seosta suhteessa 80:10:10:2:0,01 (järjestelmä 25 B): 1-139 239 mg yhdisteiden C, D, E, F, G + I seos 140-220 189 mg yhdisteiden A, B, H, M seos 221-288 139 mg polaaristen tuotteiden seos (jae "Y")

Analogisella tavalla suoritettiin raakatuotteen 30 sytorodiiniseoksen pylväskromatografia. Samalla tavalla kootut seosjakeet erotettiin edelleen HPLC:n avulla teräs-pylväissä.

Esimerkki 6

Yksittäiskomponenttien sytorodiini A: n, B:n sekä 35 H:n erottaminen suurpainenestekromatografian (HPLC) avulla 24 8 0 0 71 52,5 mg sytorodiinin A, B sekä H seosjaetta liuotettiin 2 ml:aan seosta, jossa oli CHC13/MeOH/96-%:inen etikkahappo/vesi/trietyyliamiini suhteessa 80:10:10:2:0,01 sekä pantiin teräspylvääseen (2,1 x 25 cm), joka paineen 5 alla oli täytetty 40 g:lla LichrosorliR Si60 7 p:lla (Merck) ja joka oli tasapainotettu liikkuvalla faasilla. Eluointi suoritettiin virtausnopeudella 5 ml/min ja sitä seurattiin läpivirtausspektrofotometrillä aallonpituudella 490 nm, jolloin koottiin 4 ml:n jakeet, jotka yhdistettiin 10 seuraavasti analyyttisen HPLC-testin jälkeen:

Jae Yhdisteet Rf-järjestelmä A

19-22 5 mg Sytorodiini B 0,33 23-27 7 mg Seosjae sytorodiini B + H + A 0,3 28-37 15 mg Sytorodiini A 0,27 15 Sytorodiini H -yhdisteen eristämiseksi kromatogra- foitiin samalla tavalla uudelleen seosjakeet, jotka oli saatu useammista ajoista.

Useammista kromatografisista ajoista saadut yksit-täiskomponentit yhdistettiin ja puhdistettiin seuraavan 20 menetelmän avulla toistamiseen.

120 mg yhdistettyjä valmistuseriä, jotka oli saatu toistetun pylväskromatografian avulla, kuten on kuvattu eristetyn sytorodiini A:n suhteen, liuotettiin 30 ml:aan natriumasetaattipuskuria pH 3,5, liuoksen pH säädettiin 25 7,8:ksi 2 normaalisella NaOH:lla ja sitä uutettiin neljä kertaa, kulloinkin 15 ml:n erällä etikkahappoetyylieste-riä, yhdistetyt orgaaniset jakeet pestiin kerran 1 ml:11a 0,001 molaarista EDTA:n liuosta (pH 7,5) ja tämän jälkeen kaksi kertaa 2 ml:n erällä vettä, kuivattiin NaS04:n pääl-30 lä, suodatettiin sekä haihdutettiin tyhjössä. Jäännös liuotettiin pieneen erään CHC13:a, liuos imettiin lasi-sintterin läpi sekä heptaanin lisäyksen jälkeen haihdutettiin tyhjössä samentumiseen saakka.

35 li 25 80071 A: 1HNMR Kuvio 1

Absorptiospektri a) 235 (4,62) 253 (kaa- 295 (3,87) 4,95 (4,11) 5 b) 235 (4,62) 255 vio) 296 (3,92) 4,97 (4,17) c) 243 (4,63) - 280 (3,95) 305 (3,91) 575 ja 610 (4,15) ^60H88N2^20’ ^ lask: 1156 (FAB-MS:llä varmistettu) B: 1HNMR Kuvio 2

Absorptiospektri a) 235 (4,52) 252 (kaa- 297 (3,83) 4,95 (3,04) b) 236 (4,52) 253 vio) 295 (3,89) 4,95 (4,03) c) 242 (4,40) - 280 (3,89) 305 (3,69) 610 (3,83) ^60^88^2^21’ M lask: 1170 (FAB-MS:llä varmistettu) 15 H: *H-NMR Kuvio 3 moolimassa M 1150 - 1300 (FAB-MS)

Esimerkki 7

Sytorodiini E:n eristäminen preparatiivisella suur-painenestekromatografiällä (HPLC) 30 mg raakaa sytorodiinia liuotettiin 0,5 ml:aan 20 seosta, jossa oli CHC13/metanoli/96 % etikkahappo/vesi-trietyyliamiini suhteessa 400:25:5:0,05 ja se pantiin terä spylvääseen, jonka koko oli 2,5 x 30 cm ja joka oli pakattu noin 40 6:11a piihappogeeliä Lichrosorl^) 60 (Merck) 7 μ ja se kromatografoltiin paineen alla edellä esitetyllä 25 seoksella, virtausnopeudella 6 ml/min. 100 ml:n suuruisen esijakeen jälkeen yhdistettiin analyyttisen HPLC-tutkimuk-sen jälkeen läpivirtausdetektori11a, aallonpituudella 260 nm havaittavissa olevat jakeet.

30 Jakeet_ Yhdisteet_t Rf -järjestelmä A

43 - 48 Sytorodiini F j 0,63 49-51 " D + E 0,53 52 - 62 " E 0,53 110 - 135 " C 0,44 35 ί 26 80071

Kuudesta samalla tavalla suoritetusta preparatiivi-sesta HPLC-ajosta saadut jakeet, joilla oli samanlainen koostumus, yhdistettiin analyyttisen HPLC-testin jälkeen, liuotettiin sitten 20 ml:aan vettä sisältävää Na-asetaat-5 tipuskuria pH 3,5, sekoitettiin 1 ml:n kanssa 0,001 molaa-rista, vettä sisältävää etyleenidiamiinitetraetikkahappo-liuosta (EDTA; jonka pH oli NaOH:lla säädetty 3,5:ksi) sekä ravisteltiin 5 ml:n kanssa tolueenia. Tolueenijae heitettiin pois, vesijakeen pH säädettiin 7,5:ksi 2 nor-10 maalisella NaOH:lla sekä uutettiin 20 ml:11a CHC13. Nat-riumsulfaatin päällä suoritetun kuivauksen jälkeen se suodatettiin ja väkevöitiin tyhjössä. Saatiin:

Yhdisteet Rf-järjestelmä A

15 Sytorodiini F 8 mg 0,63 " D + E 10 mg 0,53 " E 21 mg 0,53 " C 21 mg 0,44

Analyyttinen HPLC suoritettiin edellä sanotulla 20 liikkuvalla jakeella valmiissa pylväässä Lichrosorb^ Si60 7 μ, 4 x 125 mm (Merck). Detektio suoritettiin 260 nm:ssä spektrofotometrin avulla läpivirtauskyvettiä käyttäen.

E: 1H-NMR Kuvio 4 25 Absorptiospektri (nm): a) 235 (4,57) 253 (kaavio) 295 (3,85) 495 (4,1) b) 236 (4,58) 256 (kaavio) 296 (3,9) 498 (4,15) c) 243 (4,6) - 305 (3,88) 610 (4,1) C4 0 H5 3 Nx 0X 3, M laskettu 755 (FAB-MS:11a varmistettu) 30 Esimerkki 8

Sytorodiini F:n, D:n, C:n ja G + I:n eristäminen 2 g raakaa sytorodiinia liuotettiin 50 ml:aan seosta, jossa oli kloroformi/metanoli/jääetikka/vesi suhteessa 80:10:10:2 (järjestelmä A) sekä järjestelmään A lietettynä 35 pantiin pylvääseen, jossa oli piihappogeeli 60 "Merck", 27 80071 15-40 μ, 2,75 x 42 cm. Eluutiojärjestelmänä käytettiin järjestelmää A, joka sisältää 0,01 % Na-heptaanisulfonaat-tia. 1,1 litran suuruisen esijakeen jälkeen koottiin 25 ml:n suuruiset jakeet sekä tutkittiin ohutlevykromatogra-5 fiän avulla (Kieselgel 60 F254 (Merck), järjestelmä A).

Aktiiviset komponentit eluoituivat seuraavissa jakeissa:

Jae_Sytorodllnl_RF-järjestelmä A

40-44 F 20 mg 0,63 10 45 - 49 F + D 60 mg 50-76 D 263 mg 0,53 77-93 D + C 145 mg 94 - 126 C 260 mg 0,44 127 - 153 C, P+V, G+I 135 mg 15 154 - 192 G+I 175 mg 0,34 Jälkijae "X" (saatu pesemällä pylväs metanolilla) Yhdistetyt jakeet sekoitetaan Na2HP04:n kyllästetyn vesiliuoksen kanssa, kunnes kloroformijae erottuu, kukin kloroformi pestään yhdellä tilavuudella 5-%:ista Na2HP04-20 liuosta sekä sitten vedellä, kuivataan vedettömän natrium-sulfaatin päällä, väkevöidään tyhjössä sekä seostetaan petrolieetterillä tai heksaanilla.

F: 1H-NMR: Kuvio 5 25 Absorptiospektri a) 235 (4,55) 254 (kaavio) 295 (3,79) 495 (4;04) b) 235 (4,55) 255 295 (3,79) 495 (4,04) c) 243 (4,49) - 280 (kaavio 382) 580, 610 (3,95) C60H80N2°20' M· laSk* 1148 30 D; 1H-NMR: Kuvio 6

Absorptiospektri a) 235 (4;62) 255 (kaavio) 295 (3,82) 495 (3,17) b) 236 (4;75) 253 293 (4,0) 495 (3,30) 35 c) 242 (4;64) 298 (3,88) 555 (3,09) 28 80071 C60H80N2O21, M lask. 1164 (FAB-MS:llä varmistettu)

Ct 1H-NMR: Kuvio 7

Absortiospektri 5 a) 234 (4,68) 253 (kaa- 295 (3,85) 495 (4,11) b) 234 (4,68) 253 vio) 295 (3,92) 495 (4,18) C) 244 (4,69) - 290 (Sch, 3,85) 580, 610 (4,18) C6oH8oN2®22' m lask· 1180 (FAB-MS:llä varmistettu) 10 G + I: 1H-NMR: Kuvio 8

Absorptiospektri a) 237 (4,61) 256 (kaa- 300 (3,9) 495 (4,13) b) 236 (4,61) 255 vio) 295 (3,9) 495 (4,13) c) 242 (4,6) - 300 (3,9) 570 (4,1) 15 C60H82N2 02 2 , M lask 1182 (FAB-MS:llä varmistettu)

Eristetty tuote on molempien rakenneisomeerikompo-nenttien G sekä I seos suhteessa 1:1. Tämä ilmenee 1H-NMR-spektristä, hajotuskokeista (hydrogenolyysi) sekä yksi-20 tyisten sokerirakenneosien määrittämisestä kokonaishydro-lyysin jälkeen.

Esimerkki 9

Sytorodiinl-raakaseoksen fraktiointi tolueenin ja metanoli-vesi-seoksen välillä suoritetun jakamisen jälkeen 25 Sytorodiinl-raakaseoksen yksinkertainen, nopea erottaminen vähemmän polaariseksi osaksi (kompleksi I) sekä voimakkaammin polaariseksi osaksi saavutettiin tolueenin ja metanoli/vesi-järjestelmän välillä tapahtuvan jakaantumisen avulla. 83 g raakaa sytorodiiniseosta, joka 30 on saatu huovastoa uuttamalla, liuotetaan 500 ml:aan meta-noli-vettä (1:1) ja uutetaan viisi kertaa kulloinkin 500 ml:11a tolueenia. Yhdistetyissä tolueenijakeissa ilmenee tyhjössä suoritetun väkevöinnin jälkeen 32 g sytorodiiniseosta (kompleksi I), jossa on pääasiallisesti heikommin 35 polaarisia komponentteja (ennen kaikkea sytorodiini F:a, 29 8 0 0 71 D:ä, C:ä, P:ä, V:ä, X:ä), metanoli-vesi-jae sitä vastoin antaa 47 g sytorodiiniseosta (kompleksi II), jossa etupäässä voimakkaammin polaarisia komponentteja (ennen kaikkea sytorodiini B:ä, H:a, A:a, M:a sekä jakeen Y, jolloin 5 jae Y sisältää mm. sytorodiini M, S, N + 0 sekä W).

Näin saadut tuotteet osoittautuvat soveliaiksi lähtöaineiksi sytorodiinin lisäerottamista sekä eristämistä varten, joka suoritetaan pylväskromatografian tai DCC-kro-matografian (pisara-vastavirtakromatografian) avulla tai 10 molempien menetelmien yhdistelmällä.

Esimerkki 10

Sytorodiini A sekä N + 0 -yhdisteiden rikastaminen muunnetulla piihappogeelillä suoritetun pylväskromatografian avulla 15 10 g raakaa polaarista sytorodiiniseosta (kompleksi II), joka oli saatu tolueeni-metanoli-veden välillä suoritetun jakamisen avulla, liuotettiin 300 ml:aan seosta, jossa oli (liikkuva jae) CHC13/H20/MeOH 130:40:40 (alajae) sekä pantiin lasipylvääseen, jonka koko oli 5,5 x 95 cm 20 ja jossa oli noin 870 g muunnettua Kieselgel 31 μ (Grace) ja se kromatografoitiin yllä mainitulla liuotinseoksella.

Käytetty piihappogeeli oli pesty 2 N HCl:llä metal-littomaksi ja hapon pesemällä suoritetun poistamisen jälkeen geeliä käsiteltiin veteen lietettynä 5 N NaOH:lla, 25 kunnes pH-arvoksi tuli 7,6. Dekantoinnin jälkeen muunnettu piihappogeeli kuivattiin lämpökaapissa 130°C:ssa, siivilöitiin sekä lietettiin liikkuvan faasin kanssa pylvääseen. Kromatografia suoritettiin virtausnopeudella noin 100 ml/tunti, aluksi 5,5 litralla yllä mainittua, liikku-30 vaa jaetta, sitten 5,3 litralla seosta, jossa oli CHC13/H20/MeOH suhteessa 130:40:50, jakeiden koon ollessa noin 15 ml. DC:llä suoritetun määrityksen jälkeen koottiin eluoidut jakeet sopivalla tavalla ryhmiksi sekä väkevöi-tiin tyhjössä: Täten saatiin noin 2 litran suuruisen esi-35 jakeen jälkeen: 30 80071

Jae 1 g Yhdisteet 1-52 0,750 0,63 Ei-polaaristen yhdisteiden seos (nun. C ja D) 53-343 4,1 2,64 Keskimääräisen polaarisuuden sisäl- 5 tävien yhdisteiden seos (mm, V, G + I:stä B:hen saakka) 344-400 0,9 1,7 Suurehkon polaarisuuden sisältävien yhdisteiden seos (mm. B, A) 401-430 0,3 0,56 Noin 40 % A, noin 35 % N + 0 10 431-560 1,1 1,3 Erittäin polaaristen yhdisteiden seos (mm. A, N + 0, W) 1 litralla MeOH:a pestiin pylväästä seos, joka sisälsi polaarisista ryhmistä hyvin polaarisiin ryhmiin saakka.

15 Esimerkki 11

Rikastetun, polaarisen sytorodiiniseoksen frakti-ointi pisara-vastavirtakromatografiän (DCCC) avulla 5 g tolueenin ja metanoli/veden välillä jakamalla saatua, voimakkaammin polaaristen komponenttien suhteen 20 rikastettua sytorodiiniseosta erotettiin DCCC:n avulla käyttämällä DCC-kromatografia 670 (Btichi). Näyte lisättiin siihen 20 ml:ssa heterogeenisen tasapainotetun liuotin-seoksen CHC13/vesi/metanoli/n-propanoli 45:90:120:5 ala-jakeeseen (tasapainottamisen jälkeen sekoitettuna 1 %:n 25 kanssa 96-%:ista etikkahappoa) liuotettuna ja pumpattiin sisään. Virtausnopeudella noin 40 ml/tunti sekä 500 -1 000 kPa:n suuruisella paineella pumpattiin 200 ml:n suuruisen alkujakeen jälkeen noin 3 1 alajaetta kolmen päivän kuluessa stationäärisellä faasilla (edellä esitetyn seok-30 sen yläjaetta, joka oli sekoitettu 1 %:n kanssa 96-%:ista yläjaetta) täytetyn lasipylvään (sisäläpimitta 2,77 mm) läpi ("descending mode"). Juoksutettu liikkuva jae koottiin 10 ml:n suuruisiin jakeisiin. DC:n sekä analyyttisen HPLC:n avulla suoritetun määrityksen jälkeen koottiin yh-35 teenkuuluvat jakeet ja väkevöitiin tyhjössä haihduttamal- 3i 80 0 71 la. Saatiin:

Jae mg Komponentit

Esijae 800 (öljymäinen) Tuskin muuttunut lähtöaineseos, ei-polaarisia komponentteja 5 1-21 660 V:n, L:n, B:n seos 22-27 450 B, jossa on vähäisiä määriä vä hemmän polaarisia komponentteja (V, L) 28-33 500 B (vähemmän polaarisin epäpuh 10 tauksin)

34-55 230 A, M sekä L

56-63 200 A, M

64-75 420 A, M, voimakkaammin polaarisia komponentteja 15 76-100 1 300 Jae Y (sisältäen N + 0:n, W:n)

Esimerkki 12

Sytorodiini A:n ja N + 0:n eristäminen voimakkaasti rikastetusta seoksesta käänteisfaasi-HPLC:n avulla 50 mg seosjaetta, jossa oli noin 40 % sytorodiini 20 A ja noin 35 % sytorodiini N + 0, liuotettiin noin 1,5 mlraan liikkuvaa jaetta, jossa oli CHC13/MeOH/10-%:inen ammoniumasetaatti H20:ssa, suhteessa 150:1050:375, ja kro-matografoitiin teräspylväässä, jonka koko oli 1,6 x 25 cm, 30 g:lla Lichrosorli) RP-18, 10 μ (Merck) virtausnopeudella 25 2 ml/min. Eluution kulkua seurattiin läpivirtausfotomet- rillä aallonpituudella 490 nm. Jakeet, joiden koko oli 4 ml, kerättiin analyyttisellä HPLC:llä suoritetun määrityksen jälkeen (samoin teräspylväässä, joka oli täytetty 10 μ Lichsorli*) RP-18:11a (Merck)) sekä koottiin. Tämän 30 jälkeen laimennettiin puolella tilavuudella vettä ja lisättiin CHC13 jakeiden erottumiseen saakka ja erotettu CHCI3-jae pestiin H20:lla, kuivattiin Na2S04:n päällä ja väkevöitiin tyhjössä haihduttamalla. Saatiin seuraavasti: 35 00 80071 32

Jae Rf-järjestelmä C

15-17 noin 5 mg rikastettu sytoro-

diini M

26-30 22,5 mg sytorodiini N + 0 0,30 5 35-40 10,4 mg sytorodiini A 0,41 Järjestelmä C: CHC13/metanoli/99 % etikkahappo/vesi 75:15:10:2.

Sytorodiini N+0: 1H-NMR Kuvio 9 10 Absorptiospektri a) 235 (4,56) 25 (kaavio) 293 (3,67) 495 (4,04) b) 234 (4,59) 25 293 (3,68) 495 (4,15) C) 240 (4,51) 283 (3,81) 575 (4,0) 615 (3,98) 15 C6oH88N2°2i' m lask.1172 (FAB-MA: llä varmistettu)

Eristetty tuote on molempien rakenneisomeeristen komponenttien N:n ja 0:n l:l-seos. Tämä käy ilmi 1H-NMR-spektristä, hajotuskokeista (hydrogenolyysi) sekä hydroge-20 nolyysin ja kokonaishydrolyysin jälkeen suoritetusta yksittäisten sokerirakenneosien määrityksestä. Komponentti sytorodiini 0 on tunnettu kirjallisuuden perusteella (H. Brockmann, H. Greve, Tetrahedron Letters 1975 (831-834)). Esimerkki 13 25 Yksittäiskomponentin sytorodiini P:n eristäminen (keski)painekromatografiän sekä preparatiivisen ohutlevy-kromatografian avulla 6 g raakaa sytorodiiniseosta, joka oli saatu uuttamalla elatusaineliuosta kaaviossa I kuvatulla tavalla, 30 kromatografoltiin 620 g:11a Kieselgel 31 μ (Grace) kahdes sa säteittäin kokoon puristetussa piihappopatruunassa (Waters, PrepLC/System 500R) ajoaineseoksella CHC13/meta-noli/96-%:inen etikkahappo/vesi (80:10:10:2). Näyte pantiin tasapainotettuun pylvääseen 50 ml:ssa liikkuvaa faasia 35 ja erotettiin virtausnopeudella 35 ml/min 23 ml:n jakeik- 33 80071 si. Määritys suoritettiin ohutlevykromatografian sekä analyyttisen HPLC:n avulla.

Jakeisiin 41-56 tuli 220 mg sytorhodiini P, joka oli 88-%:isesti puhdasta (Rf 0,52 järjestelmässä A).

5 40 mg tätä näytettä puhdistettiin edelleen prepara- tiivisen ohutlevykromatografian avulla (Merck, DC-valmis-levyt Kieselgel 60) käyttäen järjestelmää A.

Piihappogeelivyöhykkeiden eluutio suoritettiin käyttämällä CHC13/metanolia 1:1. Eluutioliuos neutraloi-10 tiin vettä sisältävällä dinatriumvetyfosfaattiliuoksella ja laimennettiin vedellä CHCl3-jakeen erottumiseen asti. Kloroformijae erotettiin, pestiin kerran vähäisellä määrällä vettä, kuivattiin Na2S04:n päällä ja haihdutettiin. Sen jälkeen kun jäännös oli otettu vähäiseen määrään 15 CHC13, saostuma käsitelty 10-kertaisella määrällä petroli-eetteriä ja saostuma kuivattu, saatiin 15 mg puhdasta P.

Pj^ 1H-NMR Kuvio 10

Absorptiospektri (nm): 20 a) 235 (4,63) 254 (kaa- 4,33) 293 (3,90) 494 (4,13) b) 235 (4,60) 254 vio) 4,31) 293 (3,85) 494 (4,12) c) 244 (4,33) - 570 (3,59) 620 (3,71) C60He2N2 02 1 , M lask. 1166 (FAB-MS:llä varmistettu) 25

Esimerkki 14

Sytorodilni V:n yksittäiskomponenttien eristäminen painekromatografian ja preparatiivisen ohutlevykromatografian avulla 30 7 g sytorodiiniseosta, joka oli saatu uuttamalla viljelyliuoksesta kaaviokuviossa I kuvatulla tavalla, kro-matografoltiin 620 g:11a Kieselgel 31 μ (Crace) kahdessa säteittäin kokoon puristetussa piihappopatruunassa (Waters, PrepLC/System 500R ) käyttäen ajoaineseosta CHC13/me-35 tanoli/96-%:inen etikkahappo/vesi (80:10:10:2). Näyte pan- 34 80071 tiin 65 ml:ssa tasapainotettuun pylvääseen ja erotettiin virtausnopeudella 25 ml/min. 23 ml:n vetoisiin jakeisiin. Määritys suoritettiin ohutlevykromatografian sekä analyyttisen HPLC:n avulla.

5 Jakeisiin 29-34 tuli 195 mg sytorodiini V, jonka puhtaus oli 80-%:inen (Rf 0,38 järjestelmässä A).

60 mg tätä näytettä puhdistettiin edelleen prepara-tiivisen ohutlevykromatografian avulla (Merck, DC-valmis-le vyt Kieselgel 60) käyttämällä järjestelmää A.

10 Piihappogeelivyöhykkeiden eluutio sekä puhtaan sy torodiini V:n valmistus tapahtui esimerkissä 13 kuvatulla ta valla. Saatiin 16 mg puhdasta V.

Vj_ 1H-NMR Kuvio 11 15 Absorptiospektri (nm): a) 235 (4,72) 254 (kaa- 4,48) 290 (4,04) 495 (4,20) b) 235 (4,73) 254 (vio) 4,48) 290 (4,06) 494 (4,24) c) 244 (4,61) 268 (4,63) 570 (4,22) 601 (4,19) 20 C6oH88N2O20, m lask. 1152 (FAB-MS:llä varmistettu)

Esimerkki 15

Sytorodiini M:n eristäminen preparatiivisella kään-teisfaasi "reversed phase" suurpainenestekromatografian 25 (HPLC) avulla 50 mg sytorodiini A, joka oli saatu Si02:11a suoritetusta preparatiivisesta HPLC:sta ja joka analyyttisessä HPLC:ssä osoitti voimakasta hännänmuodostusta, liuotettiin 2 ml:aan seosta, jossa oli CHC13/metanoli/10-%:inen ammo-30 niumasetaatin vesiliuos (150:1050:375) ja pantiin teräs-pylvääseen, jonka koko oli 1,6 x 25 cm ja joka oli pakattu noin 35 G:lla Lichrosorki?) RP-18 μ (Merck) ja kromatogra-foitiin paineen alla edellä esitetyllä liuoksella, vir-tausno peudella 2 ml/min. Eluutiota seurattiin läpivir-35 tausspektro fotometrillä, aallonpituudella 490 nm, jolloin 35 80071 koottiin 4 ml:n suuruiset jakeet ja yhdistettiin ne analyyttisellä HPLC:llä (valmispylväs 4,6 x 250 nm täytettynä LiChrosorb8' RP-18:lla, 10 μ (Merck) suoritetun tutkimuksen jälkeen:

5 Jae Yhdisteet Rf-järjestelmä A, C

18-20 10 mg sytorodiini M 0,27 0,37 25 mg sytorodiini A 0,27 0,41

Sytorodiini M ei ollut erotettavissa sytorodiini A:sta piihappogeelillä suoritettavan analyyttisen HPLC:n 10 eikä DC:n avulla liikkuvaa faasijärjestelmää A käyttämällä (ks. esimerkki 8).

Liuotinjärjestelmä CHC13/MeOH/etikkahappo 99 %/H20 suhteessa 75:15:10:2 piihappolevyillä (Merck) käytettynä osoittautui soveltuvan erottamiseen.

15 (Järjestelmä C): Rf 0,41 (A) ja Rf 0,37 (M) M£. 1H-NMR Kuvio 13

Absorptiospektri a) 235 (4,56) 253 (kaa- 295 (3,83) 495 (4,1) 20 b) 235 (4,58) 256 vio) 296 (3,89) 496 (4,15) c) 244 (4,59) 305 (3,87) 610 (4,1) c3 4 H4 3 Nj Oj 2, M lask.657 (FAB-MS:llä varmistettu)

Esimerkki 16 25 Sytorodiini W:n eristäminen preparatiivisen suur- painenestekromatografian (HPLC) avulla 80 mg polaarista jaetta Y liuotettiin 2 ml:aan 1-iikkuvaa jaetta CHC13/metanoli/96-%:inen etikkahappo/tri-etyyliamiini (80:10:10:0,01, vedellä kyllästetty) ja pan-30 tiin teräspylvääseen, jonka koko oli 3,2 x 25 cm ja joka oli pakattu 110 mg:11a 7 μ LiChrosorb" Si60 (Merck) sekä kromatografoitiin paineen alaisena virtausnopeudella 7 ml/min. Koottiin 4 ml:n suuruiset jakeet ja määritettiin analyyttisellä HPLC:llä, yhdistettiin sekä käsiteltiin 35 edelleen tavanomaisella tavalla. Muiden identifioimatto- 36 80071 mien komponenttien rinnalla eristettiin 1,5 mg sytorodiini W-yhdistettä, joka tavanomaisilla DC-valmislevyillä Kie-selgel 60 (Merck) antoi Rf-arvoksi 0,23.

Wi 5 Absorptiospektri a) 235 (4,53) 253 (kaa- 293 (3,64) 495 (4,01) b) 235 (4,57) 253 vio) 293 (3,65) 495 (4,13) c) 241 (4:49) - 282 (3,78) 575 (3,81) 610 (3,96) 10 C60H88N2 02 2 , M lask.1184

Edellä esitetyissä esimerkeissä suoritettu komponenttien identifiointi suoritettiin seuraavassa kuvatuissa mittausolosuhteissa: 15 Protonien resonanssispektrit (1 H-NMR-spektrit) mi tattiin HX-270 BRUKER Fourier’n muunnos-ydinresonanssi-spektrometrillä 270 MHz:ssä. Konsentraatiot olivat 2-4 mg/0,5 ml 99,8-%:ista CDC13; heti valmistumisen jälkeen liuoksia ravisteltiin 0,1 ml:n kanssa 5-%:ista Na2C03, 20 joka oli 99,5-%:isessa D20:ssa.

Kuvioissa tähdellä varustetut signaalit johtuvat pienimolekyylisistä epäpuhtauksista 0 %:n alueella sekä liuotintähteistä.

Massaspektrit mitattiin massaspektrometrillä MS902 25 S, AEI, käyttämällä FAB-( fastatombombardment)ionilähdettä. Aineet vietiin tioglyseriinimatriisissa ionilähteeseen, osittain lisäämällä ammoniumkloridia. Absorptiospektrit mitattiin alueella 200-700 nm: a) vesi-metanoli 1:9 30 b) 10 % IN HC1 metanolissa c) 10 % IN NaOH metanolissa

Ainekonsentraatio oli 10-30 mg/1; absorptiomaksimit esitetään nm:nä sekä ilmoitetaan molaariset ekstinktioker-toimet (log ).

35

Claims

37 80071

1. Menetelmä sytostaattisesti vaikuttavien antra-sykliinijohdannaisten valmistamiseksi, joilla on kaava 1 5 o OH OR . Il 4 CH2-CH3 \ ^ I ^ oh 1 OH O OH OR3 jossa, silloin kun R4 merkitsee sokeriyhdistelmää Roa-Rod-15 Rod, R3 on Roa-Rod-Rod, Roa-dF-Cin A tai Roa-Rod-Acu, tai silloin kun R4 merkitsee sokeriyhdistelmää Roa-Rod-Acu, R3 on Roa-Rod-Acu tai Roa-dF-Cin A, tai silloin kun R4 merkitsee sokeriyhdistelmää Roa-dF-Rod, R3 on Roa-Rod-Rod tai Roa-dF-Rod, jolloin 20 Roa = rodosamiini dF = deoksifukoosi Rod = rodinoosi Acu = asuloosi ja Cin A * sineruloosi A 25 sekä niiden fysiologisesti hyväksyttävien happoadditiosuo-lojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että mikro-organismia Streptomyces purpurascens Y-11472 (DSM 2658) fermentoidaan tavanomaisella tavalla aerobisissa olosuhteissa elatusaineen läsnäollessa ja muodostuneet yhdisteet 30 eristetään viljelynesteestä sekä huovastosta tavanomaisella tavalla uuttamalla orgaanisilla liuottimilla sekä sitä seuraavan suoritettavan kromatografian tai jakautumisen avulla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että mikro-organismia Streptomyces purpurascens Y11472 (DSM 2658) fermentoidaan hiili- ja typpilähteitä sekä epäorgaanisia ravintosuoloja ja hiven- 38 80071 aineita sisältävässä elatusaineessa 24 - 40°C:n lämpötilassa sekä pH:ssa 6,5 - 8,5, muodostuneet yhdisteet uutetaan sitten viljelynesteestä etyyliasetaatilla tai kloroformilla ja huovastosta ensin vettä sisältävän asetonin 5 avulla, sitten erotetusta vesijakeesta etyyliasetaatin avulla, yhdistetyt etyyliasetaattiuutteet väkevöidään ja otetaan bentseeniin tai tolueeniin, saatu liuos uutetaan asetaattipuskurilla pH-arvossa 3,5 ja saadusta liuoksesta eristetään kaavan I mukainen yhdiste kromatografian tai 10 jakautumisen avulla.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan I mukaisten yhdisteiden kromatografinen eristäminen tapahtuu piihappogeelipylväi-den, käänteisfaasi-adsorbenssien, pisara-vastavirtakroma- 15 tografian tai jakautumisen avulla sekä sitä seuraavan ohutlevy- tai korkeapainenestekromatografiän avulla.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R3 on sokeriyhdistelmä Roa-dF-Cin A ja R, on sokeriyhdistelmä Roa-Rod-Rod.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R3 ja R4 merkitsevät sokeri-yhdistelmää Roa-Rod-Rod.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R3 on sokeriyhdistelmä Roa-

25 Rod-Acu ja R4 on sokeriyhdistelmä Roa-Rod-Rod.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R3 ja R4 merkitsevät sokeri-yhdistelmää Roa-Rod-Acu.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että R3 on sokeriyhdistelmä Roa-dF-Cin A ja R( on sokeriyhdistelmä Roa-Rod-Acu.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R3 on sokeriyhdistelmä Roa-Rod-Rod ja R4 on sokeriyhdistelmä Roa-dF-Rod.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R3 ja R4 merkitsevät sokeri-yhdistelmää Roa-dF-Rod. Il 39 80071