HU195979B - Process for producing antracyclin derivatives and pharmaceutical compositions containing them - Google Patents

Process for producing antracyclin derivatives and pharmaceutical compositions containing them Download PDF

Info

Publication number
HU195979B
HU195979B HU842338A HU233884A HU195979B HU 195979 B HU195979 B HU 195979B HU 842338 A HU842338 A HU 842338A HU 233884 A HU233884 A HU 233884A HU 195979 B HU195979 B HU 195979B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
roa
rod
cin
formula
acu
Prior art date
Application number
HU842338A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT44803A (en
Inventor
Werner Aretz
Hans Berscheid
Hans-Wolfram Fehlhaber
Bimal N Ganguli
Gauknapalli Ch Reddy
Gerhard Huber
Hans P Kraemer
Hans-Harald Sedlacek
Ratan S Sood
Julia Gandhi
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of HUT44803A publication Critical patent/HUT44803A/hu
Publication of HU195979B publication Critical patent/HU195979B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás üj, antraciklin-tipusú antibiotikumok előállítására. Az eljárás során a DSM 2658 szám alatt letétbe helyezett (Y-ll 472 házijelű) Streptomyces purpurascens törzset vagy valamely, az új antibotikumok termelésére képes mutánsát vagy a variánsát fermentáljuk, majd az antibiotikumot elkülönítjük és tisztítjuk. Az új antraciklin-vegyületek néhány képviselője Gram-pozitiv baktériumok ellen hatékony, továbbá több fajta daganat ellen is hatásos. Az új vegyületek az (I) általános képletnek felelnek meg, amelyben
Rí jelentése hidrogénatom és
Rí jelentése -OR4 általános képletű csoport, ahol
R4 jelentése -Roa-Rod-Rod,
-Roa-Rod vagy -Roa-dF vagy
Rl jelentése -ORa általános képletű csoport és
Rz jelentése -OR’4 általános képletű csoport, ahol R3 és R4’ az alábbiak szerinti jelentéssel van egymáshoz rendelve
Ra R4’
- Roa-Rod-Acu - Roa-Rod-Acu
- Roa-dF=Cin B - Roa-Rod-Acu
- Roa-dF=Cin B - Roa-dF=Cin B
- Roa-dF-Cin A - Roa-Rod-Rod
- Roa-Rod-Rod - Roa-Rod-Rod
- Roa-dF=Cin B - Roa-dF-Cin A
- Roa-dF-Cin A - Roa-dF=Cin B
- Roa-dF-Cin A - Roa-Rod-Acu
- Roa-Rod-Acu - Roa-Rod-Rod
- Roa-Rod-Rod - Roa-dF-Rod
- Roa-dF-Rod - Roa-Rod-Rod
- Roa-dF-Rod - Roa-dF-Rod vagy.
Rl jelentése -O-Rod-Rod-Rod és R2 jelentése -COOCH3, ahol Roa: rodazamin, dF: dezoxifukóz, Rod: rodinöz, Acu: akulóz, Cin A: A-cinerulóz, Cin B: B-cinerulóz, és df=Cin B azt jelenti, hogy a két cukorcsoportot a szokásos glikozidkötés mellett járulékos éterkötés köti össze.
A Streptomyces törzset talajmintából és
6,5-8,5 pH-jú táptalaj felhasználásával izoláltuk. Előnyös a 6,5-7,0 pH-jú táptalaj alkalmazása. Az adott esetben adagolható antibiotikumként az alábbiak előnyösek: amoicillin, B-amfotericin. Az antibiotikumok a baktériumok és a gombák szaporodását akadályozzák. További lehetséges antibiotikumok a streptomicin, penicillin vagy nisztatin.
A tápkőzeg szén- és nitrogénforrást, valamint szervetlen sókat tartalmaz. Szénforrásként glükóz vagy fehérje, nitrogénforrásként pepton, élesztökivonat, húskivonat, malátnkivonat vagy kazein alkalmas. A táptalaj megszilárdítása érdekében agart használhatunk. Szervetlen tápsóként például nátrium-, kálium-, magnézium-, kalcium-, foszfor- vagy kénsók jöhetnek számításba.
Az Y-ll 472 sz. mikroorganizmus 1983. május 24-én a DSM 2658 szám alatt (Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen) a Német Mikroorganizmus Törzsgyűjteményben (D-3400 Cöttigen, Grisebachstr. 8) helyeztük letétbe.
Az Y-ll 472 jelű mikroorganizmus az Actinomycetales rendbe, a Streptomycetaceae családba és a Streptomyces fajhoz tartozik. Az irodalomban leírt Streptomyces-fajták némelyikéről ismert, hogy antraciklin-vegyületeket szintetizálnak. Az így nyert vegyületek közül a daunoraicint és az adriamicint a humángyógyászat már használja a rák gyógyításában.
Rodomicinon, izorodomicinon, valamint a rodomicinnel rokon antibiotikumok az irodalomból ismertek [Chem. Bér. 88, 1782-1818 (1955); Chem Bér. 101, 1341-1348 (1968); J. Med. Chem. 20, 957-960 (1977); Pharmacie 27, 732-789 (1972); Zeit. Alig. Microbiol., 14,
551-558 (1974); Tetrahed, Lett. No. 38, 3699-3702 (1973); Fólia Microbiol. 24, 293-295 (1979); J. Antibiotics 32,, 420 (1979)]. Az A-aklacinomicint a 3 988 315 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás [valamint Oki et al.: J. Antibiotics 28, 830 (1975) és 32, 791-812 (1979)1 ismerteti.
Az A- és B-cinerubin a 846 130 sz. brit és a 3 864 480 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásból, valamint a szakirodalomból [Keller-Schierlein et al.: Antimicrob:al Agents and Chemoterapy 1970, 68. old.; C. A. 54, 1466i (1960), J. Antibiotics 28, 830 (1974)] ismert.
Egyéb antraciklin-antibiotikumok az .Index of Antibiotics from antinomyces' [főkiadó: Hamao Umezawa, University Park
Press, State College, Pennsylvania, USA (1967)] az alábbi oldalakon tárgyal:
Antibiotikum oldalszám
A- és B-aklacinomycin 101-102 adriamicin, 122 karminomicin I 225 galirubinok S-D 405-408 rodomicin X és Y 879-880 β-rodomicin 881-885
-rodomicin 886-892 steffimicin 945.
További irodalom: A. DiMarco .Daunomycin and Related Antibiotics, .Antibiotics, Vol. I., Mechanisms of Action, kiadó: Dávid Gottlieb és Paul D. Shaw, Springer-Verlag New York, Inc., N.Y. 1967, 190-210. old.
.Information Bulletin', 10. szám. International Center of Antibiotics, A WHO együttműködésével, 1972. decemberben Belgiumban megjelent, az antraciklineket és származékaikat tárgyalja.
Az Y-ll 472 jelű Streptomyces törzs tulajdonságait a 2. táblázatban foglaltuk össze.
A találmány szerinti eljárással (I) általános képletű, antraciklin-típusü vegyületeket állítunk elő az Y-ll 472 jelű Streptomyces törzs fermentálásával. A fermentálást 6,5 és
8,5 közötti pH-értéke mellett, 24-40 °C hö-25 mérsékleten, aerób körülmények között végezzük szénforrést és nitrogénforrást, valamint szervetlen tapsokat és nyomelemeket tartalmazó tápközeg felhasználáséval. A hatóanyagokat ismert módon különítjük el a mi- 5 céliumból és a tenyészléből.
Szénforrásként glükózt, keményítőt, dextrint vagy glicerint, nitrogénforrásként szójalisztet, élesztókivonatot, húskivonatot, malátakivonatot, kukoricalekvárt, peptont 10 vagy kazeint használunk. Szervetlen tápsóként például nátrium-klorid, magnézium-szulfát vagy kalcium-karbonát, nyomelemként vas, magnézium, réz, cink, kobalt jöhet számításba. 15
Az Y-ll 472 sz. Streptomyces törzset 24-40 °C-on 6,5 és 8,5 közötti pH-érték mellett tenyésztjük. Előnyös, ha a fermentálást aerób körülmények mellett, 7,0 pH-η és 30 °C-os hőmérsékleten végezzük. A legna- 20 gyobb hozam elérésekor (72. órában) a fermentálást félbeszakítjuk. A fermentálást előnyösen süllyesztett fermentálásként valósítjuk meg.
A fermentáció előrehaladását és az ant- 25 raciklin-vegyületek képződését a tenyészlé S. aureus 209 P, illetve Bac. subtilis teszttörzsekkel szemben mutatott baktérium elleni hatása alapján, vagy pedig a teljes tenyészoidat (mlcélium és szürlet) szerves oldószer- 20 rel végzett extrahálása és a vörös vegyület 494 nm-nél mért abszorpciós intenzitása alapján ellenőrizhetjük. Serves oldószerként előnyösen etil-acetátot alkalmazunk.
A tenyészlé szűrletéből és a micéliumból 35 az antraciklín-vegyületeket az I. szemléltető táblában mutatott módon izoláljuk.
A micéliumból az antraciklin-vegyületeket szerves oldószerrel, előnyösen 3,5 pH-értékre beállított vizes acetonnal extraháljuk. 40 Az aceton eltávolítása után a vizes fázis pll-értékét 7,5-re állítjuk, és az oldatot etil-acetáttal extraháljuk.
A szűrletböl az antibiotikumot szintén szerves oldószerrel, így etil-acetáttal vagy 45 kloroformmal, előnyösen azonban etil-acetáttal
7,5 pH mellett végzett extrahálással nyerjük ki. A szűrletböl, illetve a micéliumból nyert etil-acetátos extraktumokat külőn-külön, de egyesítve is feldolgozhatjuk. Felfolgozásuk 53 során az extraktumot betÖményítjük, a maradékot szerves oldószerben, így benzolban vagy, előnyösen toluolban feloldjuk, és az oldatot 3,5 pH-jú acetát-pufferrel extraháljuk. A feldolgozásnak ezen a pontján az ant- 55 raciklin-vegyületek elegyét két részre osztjuk: a toluolos fázisban maradó anyagok az A frakciót alkotják, mig a vizes fázisban lévő glikozid-elegy a B-frakciót képezi.
Az A-frakciöt a II. szemléltető táblán feltüntetett módon tisztítjuk tovább. A B-frakció tisztítását a III. szemléltető táblán mutatjuk be.
Ahogy a II. szemléltető tábla mutatja, az A-frakció legalább 4 komponenst ad; ezek θ5 közül a J-citrodin komponens többlépcsős kromatográfiával feldúsul, végül tiszta anyagként nyerjük ki.
A III. szemléltető tábla a B-frakció feldolgozását mutatja. A B-frakcióból az Α-, B-, C—, D-, E- és F-citorodint, a G- é6 I-citorodin 1:1 arányú elegyét, a H-, L- és M-komponenst az N- és 0-citorodin elegyét, valamint a Ρ-, V- és W-citorodint nyerjük ki. Az X- és Y-jelű frakció más antraciklin-vegyületekből tevődik össze; szerkezetüknek szintén az (I) általános képlet felel meg, megvizsgálásuk folyamatban van.
Az Y-ll 472 sz. Streptomyces törzs tenyészléböl elkülönített, az I. szemléltető tábla szerint tisztított vegyületek az (I) általános képletnek felelnek meg.
I. Szemléltető tábla: az antibiotikum-komplex elkülönítése a Streptomyces Y-ll 472 fermentált tenyészetéből
Fermentált tenyészlé
Micélium
I acetonnal és acetátpufferrel (pH 3,5) 2 órán át keverni
II besűríteni, majd pH 7,5 mellett etil-acetáttal extrahálni
I pH 7,5-re szűrlet beállítása
II etil-acetáttal extrahálni vizes fázis etil-acetátos fázis szárazra párolva nyers maradék vizes fázis
I toluolban oldva,
II acetátpufferrel (pH 3,5) extrahálva toluolos fázis A) frakció vizes fázis B) frakció
II. Szemléltető tábla: az A) frakció tisztítása
Nyers A) frakció (5 g)
Kieselgél-oszlop 2.8x68 cm (175 g)
2% CHaOH-t tartalmazó CHCb '1 I-1-1-[
Ai frak- Az frak- A3 frak- Ai frakció ció ció ció
III. szemléltető tábla:
preparatív vékonyrétegkromatográfia Kieselgélen, 4% metanolt tartalmazó kloroform citorodin-J
Az (1) általános képletű vegyületek egy szükebb csoportját képező vegyületek a (II) általános képletnek felelnek meg (Ri=-ORa, R.'=-0R’4)> ahol R3 és R’< a fent megadott.
Az (I) általános képletű vegyületek egy másik szőkébb csoportját képező vegyületek a (III) általános képletnek felelnek meg (Fi=H, R2=-0Ri), ahol R4 jelentése a fenti.
A találmány szerint előállított vegyülete10 két - képletszámmal, rövidített megjelöléssel és a szubsztituensek jelentésével együtt az alábbi táblázatban foglaljuk össze.
A vizes B) fázis felfolgozása
15 Vegyület R3 R’4 (II) ált.
I. pH beállítása rövid jele képletűek
7,5-re F- citorodin -Rod-Rod-Acu -Rod-Rod-Acu
Π. etil-acetáttal (V. képlet) (V. képlet)
végzett extrahá- 20 D-citorodin -Roa-dF=Cin B -Roa-Rod-Acu
lás C-citorodin (VI. képlet) -Roa-dF=Cin B (VI. képlet) (V. képlet) -Roa-dF=Cin B (VI. képlet)
|
etil-acetátos fázis vizes fázis B-citorodin -Roa-dF-Cin A -Roa-Rod-Rod
(kiönteni) 25 (VII. képlet) (VIII. képlet)
A-citorodin -Roa-Rod-Rod -Roa-Rod-Rod
(VIII. képlet) (VIII. képlet)
koncentrálni G-citrorodin -Roa-dF=Cin B -Roa-dF-Cin A
(VI. képlet) (VII. képlet)
30 I-citrorodin -Roa-dF-Cin A -Roa-dF=Cin B
glikozidokban feldúsított (VII. képlet) (VI. képlet)
frakció ( nyers citorodinok) P-citorodin -Roa-dF-Cin A -Roa-Rod-Acu
(VII. képlet) (V. képlet)
V-?itorodin -Roa-Rod-Acu -Roa-Rod-Rod
I. oszlopkromatográfia vagy toluol és vizes metanol 1:1 35 (V. képlet) (VIII. képlet)
arányú elegyével Vegyület R3 R’4 (II)
végzett elosztás II. preparatív vé- 40 rövid jele képletűek
N-cito- -Roa-Rod-Rod -Roa-dF-Rod
konyrétegkromatog-
ráfia vagy nagynyo- rodin (VIII. képlet) (X. képlet)
mású folyadékkroma- 0-oito- -Roa-dF-Rod -Roa-Rod-Rod
tográfia (HPLC) rodin (X. képlet) (VIII. képlet)
45 W-cito- -Roa-dF-Rod -Roa-dF-Rod
-. rodin (X. képlet) (X. képlet)
részen tisztított részben tisztított R4 (III) ált
I-es komplex (kevésbé poláros) Il-es komplex (erősebben 50 képletűek
poláros) E-cito- -Roa-Rod-Rod
rodin (VIII. képlet)
L-cito- -Roa-Rod
HPLC HPLC 55 rodin (XI. képlet)
M-cito- -Roa-dF
citorodinok citorodinok rodin (XII. képlet)
Rl R2 (I) ált.
I 1 F D E ” 1' 1 1——j | C P V G+I X 1 1 1 1 1 Β Η A Μ Y képletű
/ /\ 60
/
L N+O W J-cito- -O-Rod-Rod- -COOCH3
rodin -Rod
A vegyületek izolálásához alkalmazott kromatográfiai módszerek kapcsán az alábbi irodalomra utalunk:
fordított fázisú kromatográfia (reversed phase):
(1) Laborbücher Chemie, Praxis dér Hochleistungschromatographie (Veronika Mexer), 1. kiadás 1979, 117. oldaltól. Kiadó: Moritz Diesterweg Frankfurt am Main - Berlin - München (2) Heinz Engelhard, HochdruckflüssigkeitsChromatographie Springer-Verlag Berlin, 1. kiadás, 1975, 96. o.
(3) Sebastian, E. 0., Halász, Cbromatographia
7, 371 (1974) cseppentéses ellenáramú kromatográfia (DCCC) (1) K. Hostettmann, Planta medica 39, 1 (1980) (2) T. Tanimura, J. J. Pisano, Y. Ito, A. L. Bowman
Science 169, (1970)
A találmányt az alábbi példákkal közelebbről ismertetjük.
1. példa
Az Y-ll 472 sz. Streptomyces törzs elkülönítése során 3 különböző tápkőzeget használhatunk. A 2. tápközeg összetételében említett talajkivonat úgy készül, hogy tetszőleges talajmintát vízzel kiforralunk, utána szűrjük. A szűrlet tápanyagokat, ásványi anyagokat és kelátképzöket tartalmaz.
Az Y-ll 472 sz, Streptomyces törzs elkülönítése
a) a tápkőzegek előállítása
1. tápközeg:
glükóz 1.0 g
glicerin 1.0 g
L-arginin 0.3 g
K2HPO4 0.3 g
MgSO4.7H2O 0.2 g
NaCl 0.3 g
élesztőkivonat 2.0 g
Fe2(SO4)s 10 mg
CuSO4.5H2O 1 mg
ZnSO4.7H2Ö 1 mg
MnSO4.7H2O 1 mg
agar 15 g
deszt. víz 1 liter
pH 6.5
2. tápközeg: keményítő 2.0 g
L-aszparagin 1.0 g
K2HPO4 0.5 g
MgSŰ4.7H2O 0.5 g
talaj kivonat 200 ml
agar 15 g
deszt. víz 800 ml
PH 8.0
3. tápközeg: keményítő 10.0 g
kazein 0.3 g
KNOa 2.0 g
NaCl 2.0 g
K2HPO4 2.0 g
MgS04 0.05 g
CaCoa 0.02 g
FeS04 0.01 g agar 15 g deszt víz 1 liter pH 7.2-7.5
A tápközegeket 121 °C-on 30 percen át sterilizáljuk.
b) talajminta-szuszpenzió előállítása g tömegű talajmintát levegőn szárítunk, mozsárban szétdörzsölünk, majd egy órán át 121 °C-on tartjuk. Az igy kapott mintát desztillált vízben szuszpendáljuk és a s2uszpenziót alaposan felrázzuk. Utána a földet hagyjuk leülepedni, és a felülúszó részszel a fenti tápközegeket inokuláljuk.
c) az inokulálás
50-50 ml 1. tápkőzeget Petri-csészébe töltünk, és 1 ml talaj-szuszpenzióval inokulálunk.
d) Az Y-ll 472 törzs elkülönítése
Az inokulált Petri-csészéket 37 °C-on 2 héten át inkubáljuk, a növekvő mikroorganizmusok közül az Y-ll 472 számú törzset ismert módon izoláljuk.
2. példa
Az antibiotikum-komplex fermentációs előállításéhoz szükséges oltóanyag előállítása
Az Y-ll 472 jelű Streptomyces törzset az alábbi összetételű élesztős agarra adjuk: malótakivonat 10.0 g élesztökivonat 4.0 g glükóz 4.0 g agar 15.0 g deszt. viz 1 liter pH 7.0
A táptalajt kémcsövekbe töltjük és 121 °C-on 30 percen át sterilizáljuk. A csöveket ferdén felfektetve hagyjuk kihűlni, hogy a ferde táptalaj felület létrejöjjön. A törzzsel inkubált kémcsöveket 10-15 napon át 28 °C-on inkubáljuk, ezen időszak végén mér jó növekedés és spóraképződés tapasztalható. Egy-egy ferde agárról desztillált vízzel lemosott spóraszuszpenziót 100-100 ml oltóközeget tartalmazó 5 db Erlenmeyer lombik, vagy egy 5 literes, 1 liter oltóközeget tartalmazó palack inokulálására használunk fel. Az oltóközeg összetétele:
Glükóz 15.0 g
szójaliszt 15.0 g
kukoricalekvór 5.0 g
CaCOa 2.0 g
NaCl 5.0 g
desztillált víz 1 liter
PH 7.0
-511
500 ml-es Erlenmeyer-lombikba 100-100 ml fenti tápközeget, illetve 5 literes palackba 1 liter tápközeget adunk és 121 °C-on 30 percen át sterilizáljuk. A lombikokat, illetve a palackot lehűtjük, a spóraszuszpenzióval beoltjuk, majd 3,75 cm amplitúdójú, 240 perc'1 frekvenciájú rotációs rázógépben 30 °C-on 72 órán át rázzuk. A kapott kultúrát 15 literes üvegfermentor beoltására használjuk fel; az üvegfermentorban 10 liter 5 tF%-os, fenti összetételű közegen a 2. lépcső oltóanyagát állítjuk elő. A fermentálást 26 °C-on (±1 °C), keverés közben 160-180 perc-1 frekbencia és 6-7 liter/perc levegőztetés mellett végezzük. A kapott tenyészetet a termelő közeg beoltásához használjuk fel.
A termelő közeg összetétele glükóz 20.0 g malátakivonat 10.0 g élesztökivonat 4.0 g deszt. víz 1 liter pH 6.8
Habzásgátlóként minden fermentorba 0,025% Desmophen-t adtunk.
A fenti tápközeg 260 1—jét 390 liter térfogatú fermentorba töltjük. A közeget indirekt fűtéssel és vízgőz direkt bevezetésével 121 °C-on 28 percen át sterilizáljuk, majd a
3. lépcsőben készített oltókultúrával (5+f%) beoltjuk. A fermentálást 26 °C-on (±1 °C), keverés közben 100-200 perc-1 frekvencia és 9-10 m3/°ra levegőztetés mellett 68-72 órán át végezzük. A fermentálás végén a tenyészlé 100-150 p/ml koncentrációban tartalmazza az antibiotikumot, a pH-érték 5,5-6,0. A tenyészlé maradók cukortartalma 0,03-0,5%, a micélium nedvességtömege 3-4 g/tf%.
3. példa
Az antibiotikum-komplex fermentációs előállításához szükséges Y-ll 472 jelű Streptomyces purpurascens törzs előtenyésztése
a) (1) Az elókultúra közeg összetétele
Grara-oltöpor 10.0 g
dextróz 10.0 g
NaCl 5.0 g
CaCO3 3.0 g
deszt. viz 1 li tér
pH 7.0
72 óra 30 °C-on
rmelő közeg összetétele
keményítő 10.0 g
glükóz 10.0 g
malátakivonat 7.5 g
pepton 7.5 g
NaCl 3.0 g
MgS04 1.0 g
KH2PO4 2.0 g
CuSO4.5H2O 0.007 g
FeSCn.7H2O 0.001 g
MnSO4.4H2O 0.008 g
ZnSOi.THzO 0.002 g deszt. víz 1 liter pH 7.0
A fermentálás időtartama: 88-96 óra módja: 2. példa szerint
b) (1, az elókultúra közeg összetétele malátakivonat 10.0 g élesztökivonat 4.0 g glükóz 4.0 g deszt. víz 1 liter pH 7.0
Fermentálás: 72 órán át 30 °C-on.
(2) a termelő közeg összetétele
keményítő 10.0 g
glükóz 10.0 g
szójaliszt 15.0 g
K2HPO4 1.0 g
MgSO4 1.0 g
NaCl 3.0 g
CUSO4.5H2O 0.007 g
FeSO4.7H2O 0.001 g
MnCl2.4H2O 0.008 g
ZnSO4.7H2O 0.002 g
deszt. víz 1 liter
pH 7.0
Fermentáció befejezése: 88-96 óra elteltével.
4· példa
Az antraciklin-vegyületek keverékének elkülönítése
300 literes fermentorból kiveszünk mintegy 250 1 tenyészoldatot. Az oldatot centrifugáljuk.
a) 200 1 szűrlet pH-értékét nétrium-hidroxid-oldattal 7,5-re állítjuk. Az oldatot 50-50 1 etil-acetáttal kétszer extraháljuk, utána a szerves fázist vákuumban betőményitjük. Az ennek során kiváló vizes fázist elkülönítjük és etil-acetáttal utóextraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot 650 ml toluolban feloldjuk, az oldatot 300-300 ml 3,5 pH-jú nstrium-acetát-pufferrel 5x extraháljuk, és a toluolos fázist vákuumban bepároljuk (vörös olajos maradék, A-frakció). Az egyesített vizes fázis pH-értékét 2 n nátrium-hidroxid-oldattal 7,5-re állítjuk, és a vizes oldatot 400 ml etil-acetáttal 4x extraháljuk. Az elválasztott etil-acetátos fázisokat vákuumban szá.-azra pároljuk (0,7 g mélyvörös, szilárd hali íazállapotú maradék, B-frakció).
b) 9,5 kg micéliumot aceton és 3,5 pH-jú acetátpuffer 10:1 arányú elegyének 50-50 literjével kétszer extrahálunk, az egyesitett extraktumokat 12 liter térfogatra betöroényítjük, a koncentrátumot 3x4 liter toluollal mossuk, a toluolos fázisokat egyesítjük és vákuumban mélyvörös olajos maradékká tömé-613 nyitjuk (A-frakció). A vizes fázist tömény nátrium-hidroxid-oldattal pH 7,5-re állítjuk, 4-4 liter etil-acetáttal 3x extraháljuk, és az egyesített etil-acetátos fázisokat vákuumban bepároljuk. Mélyvörös szilárd maradékot (B-frakció) kapunk 1,98 g mennyiségben.
c) Az elkülönítés további menete az I-III. szemléltető táblából lótható. A J-citorodint, például az oszlopkromatográfiával kapott, félig tiszta A3-frakcióból nyerjük preparativ vékonyrétegkromatográfiával.
Az A-, B-, C-, D-, E-, P-citorodint, valamint a G- és I-citorodin 1:1 arányú elegyét a glikozidokban feldúsult frakcióból nyerjük (III. szemléltető tábla), például ismételt kromatográfiával Kieselgélen vagy Sephedexen (LH 20) vagy fordított fázisú (reversed phase) adszorbenseken vagy DCCC-n (droplet counter current chromatography), vagy pedig toluol és vizes metanol 1:1 arányú elegyével végzett elosztással. A tisztítás utolsó lépcsőjében preparatív vékonyrétegkromatográfiát és nagynyomású folyadékkromatogréfiét alkalmazunk. Az utóbbihoz Micropoiasil” (Waters) vagy LinchrosorbR S: 60 (Merck) oszlopot használunk, a mozgó fázis összetétele: klorof orm: metanol: ecetsav: víz: trielil-amin=68:20:i0:2:0,01. Az átfolyási sebesség 0,5-1,5 ml/perc értéken tartjuk, a kimutatás UV-abszorpcióval étfolyási fotométerben történik, 254, 260 és 490 nm hullámhosszon.
5. példa
A J-citorodin (1. képletű vegyület, ahol
Ri=Rod-Rod-Rod és R2=COOCH3) azonosítása A II. szemléltető tábla szerinti módszerrel 15 mg J-citorodint izolálunk, amely 128-130 °C-on olvad.
UV-színkép (metanol): 242, 284, 492, 510,
522 és 558 nm.
NMR (CDCb): (ppm): 1,1-1,22 (12H, m, 4
CHs), 1,75-2,25 (14H, m 7 -CH2-), 2,36 (2H, m, -CHz-), 3,51-3,6 (3H, m, 4’, 4”,
4”’-H), 3,7 (311, s, -COOCH3), 3,94-4,12 (311, m, 5’, 5”,
5”’-H). 4,3 (IH, s,
C 10-H), 4,83-4,86 (2H, m, 1”, l’”-H), 5,28 (111, sz., C7-H), 5,45 (IH, sz., C l’-H), 7,34 (IH, d, J=8 Hz, C1H).
-elegy (B) frakció 1,0 g-ját 100 g 31 μ Kieselgélen (Grace) kloroform, 96%-os metanol, ecetsav, víz és trietil-amin 80:5:5:1:0,01 arányú elegyével 3 cm átmérőjű, 43 cm hosszúságú üvegoszlopban kromatografáljuk. A mintát 7 ml futtató elegyben feloldjuk, az eluenssel átitatott oszlopra visszük és eluálás közben 23 ml-es frakciókat fogunk. Az antibiotikum-tartalmat vékonykromatográfiával, DC Kieselgel 60 F 254 (Merck) lemezen, kloroform, metanol, 96%-os ecetsav, víz és trietil-amin 80:10:10:2:0.01 arányú elegyével (B-rendszer) állapítjuk meg.
1-139 frakció: 238 mg a C, D, E, F, G+I vegyületek elegye
140-220 frakció: 189 mg az A, Β, Η, M vegyületek elegye,
221-228 frakció: 138 mg poláros termékek elegye (Y-frakció).
Hasonló módon további nyers terméket dolgozunk fel oszlopkromatográfiával, és az azonos összetételű keverék-frakciókat acéloszlopban nagynyomású folyadéklcromatográfiával (HPLC) tovább bontjuk.
7. példa
Az A, B és H komponensek elkülönítése HPLC módszerrel
52,5 mg keverékfrakciót (A, B és H komponens) 2 ml B-rendszerben (összetétele lásd 6. példa) feloldunk, és az oldatot 2,lx x25 cm méretű acéloszlopra adjuk, amelyet nyomás alatt 40 g Lichrosorb* Sí 60 7 μ Merck adszorbenssel töltöttünk és a fenti mozgó fázissal kiegyensúlyoztunk. Az eluálás 5 ml/perc sebességgel történik, átfolyási szinképfotométerrel 490 nm hullámhosszon követjük, 4 ml-es frakciókat fogunk fel, és ezeket HPLC módszerrel végzett vizsgálat alapján az alábbiak szerint csoportosítjuk:
frak- ció vegyü- letek A-rendszerben* mért Rf
19-22 6 mg B-cito- rodin 0.33
23-27 7 mg B+H+A ci- torodin keveréke 0.3
28-37 15 mg A-cito- rodin 0.27
6. példa
A-, B- és H-citorodin elkülönítése nyers elegy alakjában
A tenyészléból extrahálással (lásd. I. szemléltető tábla) nyert nyers citorodin*A-rendszer: kloroform-metanol-jégecet-vlz
80:10:10:2 arányú elegye
A H-citorodin kinyerése céljából több keverékfrakciót egyesítünk és újból kromatograf álunk.
-715
A több ismétléssel végzett kromatográfia útján kapott tiszta komponenseket az alábbiak szerint tovább tisztítjuk.
A leírt módon többszörös oszlopkromatográfiával elkülönített A-citorodin 120 mg-ját 30 ml 3,5 pH-jú nátrium-acetét-pufferben feloldjuk, az oldatot 2 n nátrium-hidroxid-oldattal pH 7,8-ra állítjuk és 15-15 ml etil-acetáttal 4x extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat EDTA 0,001 mólos, 7,5 pH-jú oldatának 1 ml-jével, majd 2-2 ml vizzel kétszer mossuk, nátrium-szulfáttal szárítjuk, szűrjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot kevés kloroformban feloldjuk, üvegszűrón át Ieszívatjuk, heptánt adunk hozzá megzavarosodásig, végül vákuumban bepároljuk.
A-komponens
^-NMR színkép: lásd 1. ábra
abszorpciós színkép:
a) 235 (4.62) 253 (váll.) 295 (3.87)
4.95 (4.11)
b) 235 (4.62) 255 (váll.) 29G (3.92)
4.97 (4.17)
c) 243 (4.63) - 280 (3.95),
305 (3.91).
575 u. 610
(4.15)
CmHssN2O20 számított móltömeg: 1156
(FAB-MS által igazolva) ra visszük. A fenti oldószerelegyet nyomás alatt 6 ml/perc áramlási sebességgel áramoltatjuk az oszlopon át. 100 ml eluátumot elengedünk, utána frakciókat fogunk fel az átfolyási detektorral 260 nm hullámhosszon végzett vizsgálat, valamint analitikai HPLC módszerrel végzett ellenőrzés alapján az alábbiak szerint csoportosítjuk:
frakció vegyületek A-rendszerben mért Rf
43-48 F-citorodin 0.63
49-51 D+E-citorodin 0.53
52-62 E-citorodin 0.53
110-135 C-citorodin 0.44
A fenti eljárást hatszor megismételjük, és a nyert azonos összetételű frakciókat analitikai HPLC módszerrel végzett vizsgálat után egyesítjük. Mindegyik frakciót 20 ml 3,5 pH-jú vizes nátrium-acetát-pufferben feloldunk, és az oldathoz etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA) 0,001 mólos, nátrium-hidroxid-oldattal pH 3,5-re állított oldatának 1 ml-jét, valamint 5 ml toluolt adunk. Az elegyet felrázzuk és a toluolt leöntjük. A vizes fázist 2n nátrium-hidroxid-oldattal pH 7,5-re állítjuk, majd 20 ml kloroformmal extraháljuk és nátrium-szulfáttal szárítjuk. Az oldatot vákuumban bepároljuk. Az alábbi frakciókat nyerjük:
B-komponens
Hl-NMR színkép: lásd 2. ábra adszorpciós színkép:
a) 235 (4.52) 252 (váll.) 297 (3.83)
4.95 (3.94)
b) 236 (4.52) 253 (váll.) 295 (3.89)
4.95 (4.03)
c) 242 (4.40) - 280 (3.89), 305 (3.69)
610 (3.83)
CeoH [86N2O2 a számított móltömeg: 1170
Vegyületek A-rend- szerben mért Rf
F-citorodin 8 mg 0.63
D+E citorodin 10 mg 0.53
E-citorodin 21 mg 0.53
C-citorodin 21 mg 0.44
(FAB-MS által igazolva)
H-komponens 1H-NMR színkép: lásd 3. ábra Móltőmeg: M 1150-1300 (FAB-MS)
8. példa
E-citorodin elkülönítése preparatív nagynyomású folyadékkromatográfia útján mg nyers citorodint kloroform, metanol, 96%-os ecetsav, viz és trietil-amin 400:25:50:5:0.05 arányú elegyének 0,5 ml-jében feloldunk, és az oldatot 2,5x30 cm méretű, mintegy 40 g Kieselgél Lichrosorb 60 (Merck) 7 μ adszorbenssel töltött acéloszlopAz analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiát a fenti mozgó fázissal, 4x125 mm méretű Lichrosorb Si 60 7 μ adszorbenssel töltött oszlopon végeztük. A detektálás 260 nm-nél szinképfotométer segítségével történt.
E-komponens ’H-NMR: lásd 4. ábra adszorpciós színkép (nm)
235 (4.57) 253 (váll.) 295 (3.85)
495 (4.1)
236 (4.58) 256 (váll.) 296 (3.9)
498 (4.15)
-817
c) 243 (4.6) - 305 (3.88)
610 (4.1)
C«H53NOi3 számított mólsúly: 755 (FAB-MS által igazolt)
9. példa
F-, D-, C-, (G+I)-citorodin elkülönítése g nyers citorodint kloroform, metanol, jégecet és víz 80:10:10:2 arányú elegyének (A-rendszer) 50 ml-jében feloldunk, és az oldatot 2,75x42 cm méretű, Merck-Kieselgéllel (60, 15-40 pm) töltött oszlopra visszük. Az oszlop A-rendszer oldószerrel van átitatva, és ugyanezt az oldószerelegyet eluensként is alkalmazzuk, de 0,01% nátrium-heptán-szulfonét adalékkal. 1,1 litert hagyunk elfolyni, utána 25 ral-es frakciókat szedünk és vékonyrétegkromatografiásan vizsgálunk (Kieselgel 60 R254 Merck, A-rendszer). Az aktív komponenseket az alábbi frakciókban találjuk:
frakció citorodin A-rendszerben mért Rf
40-44 F 20 mg 0.63
45-49 F+D 60 mg
50-76 D 263 mg 0.53
77-93 D+C 145
94-126 C 260 0.44
127-153 C,P+V,G+I 135 mg
154-192 G+I 175 0.34
Az oszlopot metanollal mosva a .X frakciót nyerjük.
Az egyesített frakciókhoz addig adunk telitett vizes dinátrium-hidrogén-foszfát-oldatot, mig a kloroformos fázis kiválik. A kloroformos fázist azonos térfogatú 5%-os dinátrium-hidrogén-foszfát-oldattal, majd azonos térfogatú vizzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, vákuumban betőményitjük, majd a terméket petroléterrel vagy hexánnal kicsapjuk.
F-komponens 1H-NMR-szinkép: lásd 5. ábra abszorpciós színkép:
a) 235 (4.55) 254 (váll.) 295 (3.79)
495 (4.04)
b) 235 (4.55) 255 (váll.) 295 (3.79)
495 (4.04)
c) 243 (4.49) 280 (váll.
382) 580,
610 (3.95)
CboHsoNzO», számított móltömeg: 1148
D-komponens
Ή-NMR színkép: lásd 6. ábra adszorpciós színkép:
a) 235 (4.62) 495 (3.17) 255 (váll.) 295 (3.82)
b) 236 (4.75) 253 (váll.) 293 (4.0)
495 (3.30)
c) 242 (4.64) - 298 (3.88)
555 (3.09)
C60HS0N2OZ1, számított mólsúly 1164 ( : FAB-MS
által igazolt)
C-komponens ’H-NMR színkép: lásd 7. ábra abszorpciós színkép:
a) 234 (4.68) 495 (4.11) 253 (váll.) 295 (3.85)
b) 234 (4.68) 495 (4.18) 253 (váll.) 295 (3.92)
c) 244 (4.69) - 290 (váll.,
3.85) 580,
610 (4.18)
CeollsoN2022, szí ámított mólsúly: 1180 (FAB-MS
által igazolt)
G+I komponensek
’H-NMR színkép: lásd 8. ábra
adszorpciós színkép:
a) 237 (4.61) 495 (4.13) 256 (váll.) 300 (3.9)
b) 236 (4.61) 495 (4.13) 255 (váll.) 295 (3.9)
c) 242 (4.6) 570 (4.1) 300 (3.9)
C6oHa2N2022, számított mólsúly: 1182 (FAB-MS
által igazolt)
Az elkülünített termék a G és I szerkezet-izomer formák mintegy 1:1 arányú keveréke. Ez a tény az ’H-NMR színképből, lebontási kísérletekből (hidrogenollzis) és az egyes cukormolekulák totálhidrolízis után végzett meghatározásából következik.
10. példa
A citorodin nyerskeverék frakcionálása toluol és vizes metanol között végzett elosztással
A citorodin nyerskeveréket igen gyors és egyszerű módon toluol és vi2es metanol közötti elosztással felbonthatjuk kevésbé poláros résszé (I. komplex) és erősebben poláros résszé (II. komplex). 83 g nyers citoro10
-919 din-keveréket (a micélium extrahálásával nyert) metanol és viz 1:1 arányú elegyének 500 ml-jében feloldunk, és az oldatot 500-500 ml toluollal ötször extraháljuk. Az egyesített toluolos fázisokat vákuumban bepároljuk, a maradék: 32 g citorodin-keverék, amely főleg kevésbé poláros komponensekből áll {az un. I. komplex főleg F, D, C, P, X és V citorodint tartalmaz). A vizes-metanolos fázistól 47 g olyan citorodin-keveréket izoláltunk (II. komplex), amely inkább poláros komponensekből áll (főleg Β-, Η-, A-, M-citorodin és az Y-frakciő, amely egyebek között az M-, S-, (N+0)- és W-citorodint tartalmazza.
Az igy kapott termékek kedvező kiindulási anyagok a citorodinok további tisztítása szempontjából, feldolgozhatjuk oszlopkromatográfiás módszerrel vagy DCC-kromatográfiásan (droplet counter current chromatography) vagy a két módszer kombinálásával.
11. példa
Az A-citorodin és a (N+0)-citorodin feldúsitása módosított Kieselgélen végzett oszlopkromatográfia útján
A 10. példa szerint előállított, nyers poláros citorodin-elegy (II. komplex) 10 g-ját kloroform, viz és metanol 130:40:40 arányú elegy (alsó fázis) 30 ml-jében feloldunk. Az oldatot 5,5x95 cm, méretű, mintegy 870 g módosított Kieselgél 31 μ (Grace) adszorbenssel töltött üvegoszlopra visszük. A fenti oldószereleggyel eluálunk.
A Kieselgél előkészítése: a Kieselgélt 2n sósav-oldattal fémmentessé mossuk, a savat kimossuk és a Kieselgél vizes szuszpenzióját 5n nátrium-hidroxid-oldattal kezeljük 7,6 pH beálltáig. Dekantálás után a módosított Kieselgélt szárítószekrényben 130 °C-on szárítjuk, szitáljuk, majd a mozgó fázissal beiszapoljuk az oszlopba.
A kromatografálást mintegy 100 ml/óra átfolyási sebesség mellett először 5,5 liter fent említett oldöszereleggyel utána kloroform, víz és metanol 130:40:50 arányú elegyének 5,3 literjével végezzük, mintegy 15 ml-es frakciókat felfogva. Vékonyrétegkromatográfiai elbirálás alapján a frakciókat az alábbiak szerint csoportosítottuk (2 literes elófrakció elfolyatva):
frakció 1 g vegyületek
1-52 0.750 0.63 nem poláros vegyületek (egyebek között C és D) elegye
53-343 4.1 2.64 közepesen poláros vegyületek [V, (G+I) ós B] elegye
344-400 0.9 1.7 erősebben poláros vegyületek (B és A) elegye
401-430 0.3 0.56 kb. 40% A, kb. 35% (N+0)
431-550 1.1 1.3 erősen poláros
vegyületek [egyebek között A, (N+0), W] elegye
Egy liter metanollal a poláros és erős poláros komponensek elegyét mossuk az oszlopról.
,2. példa
Feldúsított poláros citorodin-elegy frakcionálísa cseppellenáramos kromatográfiával (DCCC módszerrel)
A toluol és metanol közötti elosztás során nyert, erősebben poláris komponensekben dús citorodin-elegyből 5 g-ot a DCCC módszerrel, DCC-Chromatograph 670 (Büchi) típusú készüléket használva frakcionálunk. A mintát a kloroform, viz metanol és n-propanol 45:90:120:5 arányú elegyéből álló, kiegyenlítés utón 1% 96%-os ecetsavval adagolt heterogén oldószerelegy alsó fázisának 20 ml-jében feloldjuk és beszivattyuzzuk. Mintegy 40 ml/óra átfolyási sebesség és 5-10 bar nyomás mellett, 200 ml elófrakció után 3 nap alatt mintegy 3 liter alsó fázist szivatytyúzurik az álló fázissal (azzal a fenti elegy 1% 96%-os ecetsavval kiegészített felső fázisával) töltött üvegcsöveken át (ID, 2,7 mm, .descending mode). A kilépő mozgó fázist 10-10 ml-es frakciókban felfogjuk. Vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat után a frakciókat
az alábbiak szerint csoportosítjuk:
frakció mg komponensek
elófrakció 800 (olajos) alig konvertált kiindulási elegy, nempoláros részek
1-21 660 V. L és B elegye
22-27 450 B, összekeverve kisebb mennyiségű poláros (V. L) komponenssel
28-33 500 B (kevésbé poláros szennyeződésekkel
34-55 230 A, M és L
56-63 200 A, M
64-75 420 A, M, erősebben poláros kompo-
-1021 nensekkel
76-100 1300 Y-frakció (N+O és W-komponenssel)
13. példa
Az A és (N+O) citorodin elkülönítése erősen feldúsított elegyből, fordított fázisú nagynyomású folyadékkroniatográfia (reversed phase HPLC) segítségével.
Mintegy 40% A-citorodint és mintegy 35% (N+0)-citorodint tartalmazó keverékfrakciö 50 mg-ját a mozgó fázis kloroform, metanol és 10%-os vizes ammónium-acetát-oldat 150: :1050:375 arányú elegye) 1,5 ml-jében feloldunk és 1,6x25 cm méretű acéloszlopon 30 g Lichrosorb RP-18, 10 μ (Merck) adszorbensen 2 ml/perc áramlási sebesség mellett kromatografálunk. Átáramlási fotométer segítségével 490 nm hullámhossz mellett követjük az eluálást. A 4 ml-es frakciókat analitikai nagynyomású folyadékkromat.ográfia (szintén acéloszlopban, azonos adszorbenssel végezve) alapján egyesítjük és feldolgozzuk. Az összesített frakciókat fele annyi vízzel hígítjuk, kloroformot adunk hozzá a fázisok szétválásáig, majd az elválasztott kloroformos fázist vízzel mossuk, nátrium-szulfáttal szárítjuk és vákuumban bepároljuk.
frakció C-rendszerben mért Rp-érték
15-17 kb. 5 mg dúsított M-citorodin
26-30 22.5 mg (N+O) citorodin 0.30
35-40 10.4 mg A-citorodin 0.41
C-rendszer: kloroform, metanol, 99%-os ecetsav és viz 75:15:10:2 arányú elegye (N+0)-citorodin ’H-NMR-színkép: 9. ábra abszorpciós színkép:
a) 235 (4.56) 25 (váll) 293 (3.67)
495 (4.04)
b) 234 (4.59) 25 (váll) 293 (3.68)
495 (4.15)
c) 240 (4.51) 283 (3.81) 575 (4.0)
615 (3.98)
C60HMN2O21, számított moltömeg: 1172 (FAB-Ma által igazolt)
Az elkülönített elegy a szerkezetileg izomer N- és O-komponensek 1:1 arányú keveréke. Ezt a tényt a NMR-színkép, lebontási kísérletek (hidrogenolizis), valamint a cukrok hidrogenolizis és teljes hidrolízis után végzett meghatározása igazolja. Az O-citorodin az irodalomból ismert [H. Brockmann, H. Greve, Tetrahedron Letters 1975 (831-834)].
14. példa
A P-citorodin elkülönítése közepes nyomású kromatográfia és preparatív vékonyrétegkromatográfia segítségével
Az I. tábla szerinti eljárással tenyészléböl nyert nyers citorodin-elegy 6 g-ját 620 g Kieselgél 31 μ (Grace) adszorbensen radiális irányban nyomás alatt helyezett két darab Silica-patronban (Waters, PrepLC/System 500) kloroform, metanol, 96%-os esetsav és viz 80:10:10:1 arányú elegyével kromatografáljuk. A mintát a futtató elegy 50 ml-jében feladjuk a kiegyensúlyozott oszlopra és 35 ml/perc átfolyási sebesség mellett 23 mles frakciókra bontjuk. A frakciókat vékonyrétegkromatográfiailag, valamint az analitikai HPLC segítségével minősítjük. A 41-56. frakcióban 220 mg P-citorodint találjuk; tisztasága: 88%, A-rendszerben mért Rr. 0,42. A termék 40 mg-ját preparatív vékonyrétegkromatográfia (Merck, DC-Kieselgél lemez) segítségével az A-rendszer szerinti oldószereleggyel tovább tisztítjuk. A Kieselgél sávot kloroform és metanol 1:1 arányú elegyével eluáljuk. Az eluátumot vizes dinátrium-hidrogén-foszfátoldattal semlegesítjük és vízzel hígítjuk a fázisok szétválásáig. A kloroformos fázist elválasztjuk, kevés vízzel kloroformban oldjuk és tízszeres térfogatú petroléterrel kicsapjuk. A szárított csapadék: 15 mg tiszta P-citorodin.
P-citorodin 'H-NMR-szinkép: 10. ábra abszorpciós színkép (nm)
a) 235 (4.63) 494 (4.13) 254 (váll, 4.33) 293 (3.90
b) 235 (4.60) 494 (4.12) 254 (váll, 4.31) 293 (3.85)
c) 244 (4.33) - 570
(3.59) (3.71) 620
C60H82N2O21, számított moltömeg 1166 (FAB
MS által igazolt)
15. példa
A V-komponens elkülönítése nyomáskroir.atográfia és preparatív vékonyrétegkromatográfia segítségével
Az I. tábla szerinti eljárással tenyészléből nyers citorodin-elegy 7 g-ját 620 g Kieselgél 31 μ (Grace) adszorbensen radiális irányban nyomás alatt helyezett 2 darab Sili-1123 ca-patronban (Waters, PrepLC/System 500) kloroform, metanol, 96%-os ecetsav és viz 80: :10:10:2 arányú elegyével kromatografáljuk. A mintát a futtató elegy 65 ml-jében feladjuk a kiegyensúlyozott oszlopra és 25 ml/perc átfolyási sebesség mellett 23 ml-es frakciókra bontjuk. A frakciókat vékonyrétegkromatográfiásan, valamint analitikai HPLC segítségével minősítjük. A 29-34. frakcióban 195 mg V-citorodint találunk; tisztasága 80%, A-rendszerben mért Rn 0,38).
A termék 60 g-ját preperatív vékonyrétegkromatográfiai (Merck DC-Kieselgél lemez) segítségével az A-rendszer szerinti oldószer-eleggyel tovább tisztítjuk. A Kieselgél sáv eluálását és a további feldolgozást 14. példában leírtak szerint végezzük. 16 mg tiszta V-citorodint kapunk.
V-citorodin ’H-NMR-színkép: 11. ábra abszorpciós színkép (nm)
a) 235 (4.72) 254 (váll, 4.48) 290 (4.04)
495 (4.20)
b) 235 (4.73) 254 (váll, 4.48) 290 (4.06)
494 (4.24)
c) 244 (4.61) 268 (4.63) - 570
(4.2 2)
601 (4.19)
-C60H8SN2O20, számított moltömeg: 1152 (FABMS által igazolt).
16. példa
Az L-citorodin elkülönítése oszlop- és preparatív rétegkromatográfia segítségével
Az I. tábla szerinti eljárással a tenyészléből nyert nyers citorodin-elegy 6 g-ját 800 g 15-40 μ szecseméretű Kieselgél (Merck) adszorbens kromatografáljuk. Eluáláshoz kloroform, metanol, 96%-os ecetsav és víz komponensekből álló gradienst alkalmazunk. Először 1,65 liter 80:10:10:2 arányú eleggyel (A-rendszer), majd ugyanezen rendszer 0,01% heptán-szulfonsav hozzáadásával készített módosított változatának 4 literjével, ezt követően 3,6 liter 70:20:10:2 arányú eleggyel és végül 2,8 liter 50:50:5:2 arányú eleggyel eluálunk. A mintát 50 ml A-rendszerben feloldva adjuk az oszlopra, és 1,65 liter előfrakció elengedése után 25 ml-es frakciókat szedünk. A frakciókat vékonyrétegkromatográfiásan, valamint analitikai HPLC segítségével minősítjük. A 161-225. frakcióban 1,1 g citorodin-elegyet találunk, amelynek L-citorodin-tartalma 24%.
A kapott terméket a (teljes mennyiséget) 160 g 15-40 u szemcseméretű Kieselgél (Merck) adszorbensben kloroform, metanol, 96%-os ecetsav és viz 80:10:10:2 arányú elegyével kromatografáljuk. A mintát a fenti oldószer-elegyben feloldva adjuk a kiegyensúlyozott oszlopra, és 700 ml előfrakció elengedése után 10 ml-es frakciókat szedünk. A 91-102. frakció egyesítésével 31 mg terméket kapunk 64% L-citorodin-tartalommal, a 103-118. frakcióból 44 mg 68%-os L-citorodint különítünk el (meghatározás analitikai HPLC segítségével).
Az egyesített termék 50 rag-ját preparat'v vékonyrétegkromatográfia segítségével (Merck DC lemez Kieselgél 60; futtató elegy: A-rendszer) tovább tisztítjuk. A Kieselgél sáv eluálását és a további feldolgozást a 14. példában leírtak szerint végezzük. 18 mg L-citorodint kapunk, amelynek analitikai HPLC módszerrel meghatározott tisztasága 74%. A kapott mennyiséget azonos feltételek mellett újból kromatografálva 14 mg tiszta L-citorodint kapunk.
L-citorodin
Hi-NMR: 12. ábra
a) 235 (4.59) 495 (4.1) 253 (váll) 295 (3.86)
b) 235 (4.6) 255 (váll) 295 (3.91)
495 (4.13)
c) 244 (4.61) - 303 (3.87)
570 (4.1) 610 (4.15)
17. példa
M-citorodin elkülönítése preparatív fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfia (reversed phase HPLC) segítségével
Szilíciumoxidon végzett preparatív HPLC segítségével nyert A-citorodin (erős tailing-et mutatott) 50 mg-ját kloroform, metanol és 10%-os vizes ammónium-acetát-oldat 150:1050: :?75 arányú elegyének 2 ml-jében feloldjuk, l;6x25 cm méretű, 35 g Lichrosorb RP-18, 10 ju (Merck) adszorbenssel töltött acéloszlopra adjuk, és nyomás alatt a fenti összetételű oldószer-eleggyel 2 ml/perc átfolyási sebesség mellett kromatografáljuk. Átfolyási fotométer segítségével 490 nm hullámhossz mellett figyeljük az eluálást, 4 ml-es frakciókat szedünk. Analitikai HPLC (4,4x250 mm) méretű, alkalmazásra kész oszlop, Linchrosorb RP-18, 10 μ, (Merck) alapján az alábbi frakciókat egyesítjük:
-1225
195579
frakció vegyület A-, ill. C- -rendszerben mért Rf
18-20 10 mg M-citorodin 0.27 0.37
25 mg A-citorodin 0.27 0.41
Az M-citorodin és az A-citorodin között sem Kieselgélen végzett analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiával, sem az A-rendszerrel végzett vékonyrétegkromatográfiával nem lehetett különbséget tenni. Szétválasztásukhoz alkalmasnak a C-rendszer (kloroform, metanol, 99%-os ecetsav és víz 75:15:10:2 arányú elegyet) bizonyult Kieselgél lemezeken: a C-rendszerben mért R^értékek: A-citorodin 0,41; M-citorodin 0,37.
M-citorodin ’H-NMR: 13. ábra abszorpciós színkép:
a) 235 (4.56) 495 (4.1) 253 (váll) 295 (3.83)
b) 235 (4.58) 256 (váll) 296 (3.89)
496 (4.15)
c) 244 (4.59) - 305 (3.87)
610 (4.1)
C34H43NO12, számított mólsúly: 657 ( :fab-ms
által igazolt).
18. példa
W-citorodín elkülönítése preparativ
HPLC segítségével
A poláros Y-frakció 80 mg-ját kloroform, metanol 96%-os ecetsav és trietilamin 80:10: :10:0,01 arányú, vízzel telített elegyének 2 ml-jében feloldjuk, 3,2x25 cm méretű, 110 g 7 μ szemcseméretű Lichrosorb Si 60 Merck adszorbenssel töltött acéloszlopra adjuk és nyomás alatt, 8 ml/perc átfolyási sebesség mellett kromatografáljuk. 4 ml-es frakciókat szedünk, amelyeket analitikai HPLC segítségével minősítünk, majd az azonos tartalmú frakciókat egyesítjük és a szokásos módon feldolgozzuk. Nem azonosítható komponensek mellett 1,5 mg W-citorodint nyerünk. A vegyület DC Kieselgél 60 (Merck) lemezeket C-rendszerben mért Rf-értéke: 0,23.
W-citorodin abszorpciós színkép:
a) 235 (4.53) 253 (váll) 293 (3.64)
495 (4.01)
b) 235 (4.57) 253 (váll) 293 (3.65)
495 (4.13)
c) 241 (4.49) - 282 (3.78)
575 (3.81)
610 (3.96)
C60H8SN2O22, számított mólsúly: 1184.
A komponenseknek a példákban leírt azonosítása az alábbi mérési körülmények között történt.
A proton-rezonancia-szinképeket (1H— -NMR-szinképeket) BRUKER HX-270 típusú fourier-transform magrezonancia spektrométerrel vettük fel 270 MHz frekvencia mellett. A koncentrációk 2-4 mg/0,5 ml 99,8%-os CDCb közötti értékek voltak; az oldatokat - mindjárt előkészítésük után - nátrium-karbonát 99,5%-os Ü20-val készített 5%-os oldatának 0,1 ml-jével összerázzuk.
Az ábrákon csillaggal jelölt csúcsuk ezrelékes mennyiségű kis molekulatömegű szennyeződésekre, valamint oldószermaradványokra vezethetők vissza.
A tömegspektrumokat MS-902 S, AEI típusú tőmegspektrométerrel, FAB (fást atom bombardment) ionforrás alkalmazásával, egyes esetekben ammónium-klorid adagolása mellett.
Az abszorpciós színképeket 200-700 nm hullámhossz-tartományban mértük az alábbi rendszerekben:
a) viz és metanol 1:9 arányú elegye
b) 10% In HC1 metanolban
c) 10% In NaOH metanolban
Az anyagok koncentrációja 10-30 mg/1 volt. A példákban az abszorpciós maximumokat nanométerben, valamint zárójelben a moláris extinkciós együtthatót (lóg £) adtuk meg.
A citotixikus aktivitás meghatározása
A citostatikus hatékonyság meghatározása az egér L1210 jelű leukémiasejtjein történt, az alábbi teszt-rendszerben:
a) proliferációs assay
A módszerre jellemző, hogy a sejteket in vitro a kísérleti anyagok különböző koncentrációval inkubáljuk, majd meghatározzuk, hogy a sejtek milyen mértékben képesek rádióaktlv DNA-prekurzorok (például C14-el jelzett timidin) beépítésére. Kezeletlen L12210-se jteket azonos kísérleti körülményeknek vetünk alá, ezek a kontrollt szolgáltatják. Az alábbiakban a módszert röviden leírjuk.
A növekedés exponenciális fázisában (5xl03/ml RPMI-kőzeg) lévő L1210-sejteket mikrotiter lemezen 72 órán át a kísérleti anyag különböző koncentrációjával inkubálunk (37 °C, 5% CO2, 95% relatív páratartalma). A kontrollt képező sejteket csupán friss közeggel inkubáljuk. Minden meghatározás 4 ismétlésben, készül. 65 óra elteltével 50 μ C14-timidint (1,5 pCi/ml) adunk a tenyészethez, a sejtben lévő DNA rádióaktív jelölése céljából. 7 óra inkubálás után a sejteket leszívatjuk, a DNA-t 5%-os triklórecetsavval kicsapjuk és először vizzel, majd metanollal mossuk.
°C-on végzett szárítás után a DNA-ba beépített rádióaktivitást 5 ml szcintilláci14
-1327 ós folyadék hozzáadása után meghatározzuk.
Az eredményt a tesztanyaggal végzett inkubálás után mért szcintillációs indexként adjuk meg a kontroll százalékában (indexjnjs.100). 5 indeXkontr
Az így kapott értékekből a dózis-hatás-görbét vesszük fel, és grafikusan meghatározzuk az ICso-értéket, azaz azt a koncentrációt, amely a kísérleti körülmények között a jű rádióaktiv timidin beépítését a kontrolihoz viszonyítva 50%-kal csökkenti. A találmány szerint elkülönített vegyületek ICsa-értékeit az 1. táblázatban adjuk meg (referencia: ADM=adriamicin). 15
b) L1210 leukémiasejtek telepeinek képződése légy agaron
A módszerrel kimutatható, hogy van-e a tesztanyagoknak befolyása a sejtek több generáción keresztül figyelt növekedési visel- 20 kedésére (10-12 órás sejtciklusidő mellett a 7 napig tartó kísérlet során mintegy 14 egymást követő generáció figyelhető meg,)
Citosztatikusan hatékony anyagok a fenti tesztben a telepek számának csökkenté- 25 sét eredményezik, a kezeletlen kontrolihoz hasonlítva. A tesztet az alábbiak szerint hajtjuk végre:
Lemezenként 500 leukémiasejtet a megvizsgálandó anyag különböző koncentrációban 37 °C-on 1 órán át inkubálunk. Ezt követően a sejteket McCoy5A-közeggel kétszer mossuk, majd 0,3%-os agar hozzáadása után Petri-csészébe öntjük. A kontrollt csupán friss közeggel inkubáljuk. Az egyórás inkubáció helyett egyes esetekben a felső agarréteghez különböző koncentrációjú kísérleti hatóanyagot keverünk, hogy a teljes inkubációs időn ál a sejtek folyamatos exponálását érjük el. Miután az agar megdermedt, a lemezeket keltető szekrényben 37 °C-on 7 napon keresztül (5% CO2, 95% relatív páratartalom mellett) inkubáljuk. Utána megállapítjuk a kinőtt, 60 ju-nél nagyobb átmérőjű telepek számát és a kezeletlen kontroll százalékában adjuk meg. Az így kapott dózis-hatás-görbe alapján meghatározzuk az anyag hatékonyságéra jellemző IC50 értékét. A találmány szerint előállítható vegyületek eredményeit az 1. táblázatban adjuk meg, referenciaként adriamicint használva.
1. táblázat
Hatóanyag proliferációs teszt IC50 (pg/ml) telep növekedés
7 nap 1 óra inkubáció IC50 (jug/ml)
adriamicin 6.OXIO-3 2.2x10-2 4.4x10-2
citorodin B 2.8x10-3 3.4x10-3 1.2x10-3
- i I - A 1.1x10-3 3.0x10-3 1.3x10-3
_ | · _ G+I 2.8xl0-> IC'4 2 xl0-3
- I : - C 5.5xl04 1.5xl0’4 3.4x10-3
- Π - D 2.8xl04 3.7x10-3 2.8x10-3
- ;' - F 2.4x10-3 2.8x10 2 4.2x10-2
_ : _ J 4.4 - -*)
E 2.5xl0-2 1.4x10 3 2.8x10-2
P 2.6x10-3 3.2xlO’4 2.8x10-3
— j j — V 2.9x10-3 2.7xl0‘4 2 xlO'3
«. | ] — K 3.7x10-3 3 xlO-3 3.1x10-2
- I i- L 3 xlO-1 2.1x1ο1 1.75
- I 1- M 2.8X10-1 1.6X10-1 3.9X10-1
- i N+O 5 xlO'3 2.5xl0-3 4.5x10-2
*)nem vizsgált
-1429
2. táblázat
A Streptomyces purpurascens Y-ll 472 jelű törzs jellemzése
a) morfológia: Spirales osztály. Közepesen hosszú, érett spóraláncok, lánconként legal&b 10-50 spórával. Ez a morfológia éleszto-maláta-agar, zabliszt-agar, sós keményítö-agar és glicerin-aszparagin-agar esetén mutatkozik.
b) kultúra jellemzők különböző táptalajon:
Közeg növekedés alsó oldal levegő micélium oldható pigment
1. élesztő-maláta- agar jó, ráncos, száraz v örös-vioiaszinu jó; gyapotszerűen bársonyos, sárga- barna-rózsa- szín
2. zabliszt-agar jó, lapos, száraz se padt- rózsaszínű jó, poros, sárga-rózsaszínű sépadt-rózsa- szinű
3. glicerín-aszparagín-agar közepes, ráncos száraz vcrős-ibolya- színü közepes, poros, szürke-rózsaszínű halvány vórős-viola- szinü
4. ásv&nyisó-keményítö-agar közepes, lapos, száraz vörös-ibolyasz’nű, vagy 'sz ntelen jó, gyapotszerűen halványbársonyos, könnyű sárga-ró- zsaszínű
5. burgonya-giúkózagar jó, kidomborodó, száraz barna jó, bársonyos, sárga-fehér violaszinű
6. pepton-élesztó-vas-agar jó, kidomborodó, száraz színtelen v. halvány sárga nem volt vöröses- -barna
7. tirozín-agar jó, domborodó, száraz barna jó, gyapotszerűen bársonyos, könnyű, szürke- -rózsaszínű vöröses- -barna
8. Czapek-féle agar jó, ráncos, száraz bíborvörös közepes, gyapotszerűen bársonyos halvány sárga-rózsaszinű enyhén bi:, borvörös
c) fiziológiai tulajdonságok
1. A növekedési hőmérséklet-tartomány: élesztő-maláta-agaron 24-40 °C-on növekszik, optimum: 30 °C
2. nitrát redukálás
3. melanin hasznosítás
4. zselatin hasznosítás
5. keményítő hidrolízis
7. NaCl-tűrőképesség
8. zselatin folyósító
9. kazein hidrolízis
10. ureáz-szintézis
13. streptomyces gátlás
12. pH-érzékenység:
pozitív pozitív pozitív pozitív >7.0%, de <10.0% pozitív pozitív pozitív
12.5 ug/ml konc.-ná) gátlás
A szubsztrátumban növekvő micélium és a diffúzióra képes pigment pH-érzéJ kény: lúgos körülmények között violaszinű (bíborszinü), savas körülmények között vörös (rózsaszínű).
d) szén források hasznosítása rr A szaporodás során D-glűkózt, L-arabinózt, szacharózt, D-xilózt, I-ínozitot, D-mannitot, D-fruktózt, ramnózt, raffinózt, galaktózt, szaiicint, maltózt, cellobiózt, ribózt, Náci utániétól. és szorbitot hasznosít, a cellulóz
Ρθ hasznosítása nem egyértelmű.

Claims (7)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás (I) képletű antraciklin-tlpusú antibiotikumok előállítására - az (I) általános képletben
    Rí jelentése hidrogénatom és R2 jelentése - OR4 általános képletű csoport, ahol R4 jelentése -Roa-Rod-Rod vagy
    Rl jelentése -OR3 általános képletű csoport és
    R2 jelentése -OR’4 általános képletű csoport, ahol Ra és R4' az alábbiak szerinti jelentéssel van egymáshoz rendelve
    Ra R4’
    -Roa-Rod-Acu -Roa-Rod-Acu
    -Roa-dF=Cin -Roa-Rod-Acu
    -Roa-dF=Cin B -Roa-dF=Cin B
    -Roa-dF-Cin A -Roa-Rod-Rod
    -Roa-Rod-Rod -Roa-Rod-Rod
    -Roa-dF=Cin B -Roa-dF-Cin A
    -Roa-dF-Cin A -Roa-dF=Cin B vagy
    Rl jelentése -O-Rod-Rod-Rod és R2 jelentése -COOCH3, ahol Roa: rodozamin, dF: dezoxifukóz, Rod: rodinózt, Acu: akulóz, Cin A: A-cinerulóz, Cin B: B-cinerulóz, és dF=Cin B azt jelenti, hogy a két cukorcsoportot a szokásos glikozidkötés mellett járulékos éterkötés köti össze azzal jellemezve, hogy a DSM 2658 szám alatt letétbe helyezett Streptomyces purpuruscens törzset (Y-ll 472) vagy valamely, a fenti antibiotikumok termelésére képes mutánsét vagy variánsát aerob körülmények között szénforrást, nitrogénforrést és ásványi anyagokat tartalmazó tépközegben fermentáljuk, és a képződött antibiotikumokat egy vagy több szerves oldószerrel a micéliumból és a tenyészléből extraháljuk, majd kromatográfiai úton vagy megosztással elkülönítjük. (1983. 06. 25)
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termelő törzset 24-40 °C-on, 6,5 és 8,5 közötti pH-érték mellett fermentáljuk, a tenyészlét etil-acetáttal vagy kloroformmal, a micéliumot pedig vizes acetonnal, majd az elválasztott vizes fázist újból etil-acetáttal, illetve kloroformmal extraháljuk, az egyesített etil-acetátos, illetve kloroformos fázisokat betÖményítjük, a maradékot benzolban vagy toluolban feloldjuk, a kapott oldatot 3,5 pH mellett acetát-pufferrel extraháljuk és a kapott extraktumból az (I) általános képletű vegyületeket kromatográfiai úton vagy megosztással izoláljuk. (1983. 06. 25.)
  3. 3. Eljárás (I) általános képletű antraciklin-tipusú antibiotikumokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 1. vagy 2. igénypont szerint előállított (I) általános képletű antibiotikumot - az (I) általános képletben Rí és R2 jelentése az 1. igénypontban megadott - a gyógyászatban használatos hordozó- és egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítunk. (1983. 06. 25)
  4. 4. Eljárás (I) általános képletű antraciklin-típusú antibiotikumok előállítására - az (I) általános képletben
    Rj jelentése hidrogénatom és
    Rí jelentése -OR4 általános képletű csoport, ahol
    R4 jelentése -Roa-Rod-Rod,
    -Roa-Rod vagy -Roa-dF vagy
    Rí jelentése -OR3 általános képletű csoport és
    R; jelentése -OR’4 általános képletű csoport, ahol Ra és R4’ az alábbiak szerinti jelentéssel van egymáshoz rendelve
    Ra R4’ -Roa-Rod-Acu -Roa-Rod-Acu -Roa-dF=Cin B -Roa-Rod-Acu -Roa-dF=Cin B -Roa-dF=Cin B -Roa-dF-Cin A -Roa-Rod-Rod -Roa-Rod-Rod -Roa-Rod-Rod -Roa-dF=Cin B -Roa-dF-Cin A -Roa-dF-Cin A -Roa-dF=Cin B -Roa-dF-Cin A -Roa-Rod-Acu -Roa-Rod-Acu -Roa-Rod-Rod -Roa-Rod-Rod -Roa-dF-Rod -Roa-dF-Rod -Roa-Rod-Rod -Roa-dF-Rod -Roa-dF-Rod vagy
    Rí jelentése -O-Rod-Rod-Rod és R2 jelentése -COOCH3, ahol Roa: rodozamin, dF: dezoxifukcz, Rod: rodinóz, Acu: akulóz, Cin A: A-cinerulóz, Cin B: B-cinerulóz, és dF=Cin B azt jelenti, hogy a két cukorcsoportot a szokásos glikozidkötés mellett járulékos éterkőtés ke ti össze - azzal jellemezve, hogy a DMS 2658 szám alatt letétbe helyezett Streptomyces purpurascens törzset (Y-ll 472) vagy valamely, a fenti antibiotikumok termelésére képes mutánsát vagy variánsát aerób körülmények között szénforrást, nitrogénforrást és ásványi anyagokat tartalmazó tápközegben fermentáljuk és a képződött antibiotikumokat egy vagy több szerves oldószerrel a micéliuriból és a tenyészléből extraháljuk, majd kromatográfiai úton vagy megosztással elkülönítjük. (1984. 06. 18.)
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termelő törzset 24-40 °C-on 6,5 és 8,5 közötti pH érték mellett fermentáljuk, a tenyészlét etil-acetáttal vagy kloroformmal, a micéliumot pedig vizes acetonnal, majd az elválasztott vizes fázist újból etil-acetátal, illetve kloroformmal extraháljuk, az egyesített etil-acetátos, illetve kloroformos fázisokat betÖményítjük, a maradékot benzolban vagy toluolban feloldjuk, a kapott oldatot 3,5 pH mellett acetát-pufferrel extraháljuk és a kapott extraktumból az (I) általános
    -1633 képletű vegyületeket kromatográfiai úton vagy megosztással izoláljuk. (1984. 06. 18.)
  6. 6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (1) általános képletű vegyületeket Kieselgél-oszlopon, fordított fázisú !> kromatográfiával vagy cseppentett ellenáramú kromatográfiával kromatografáljuk vagy megosztással és ezt követő vékonyréteg- vagy nagynyomású folyadék-kromatográfiás módszerrel izoláljuk. (1984. 06. 18.) 13
  7. 7. Eljárás (I) általános képletű antraciklin-tipusú antibiotikumokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 4-6. igénypontok bármelyike szerint előállított (I) általános képletű antibiotikumot - az (1) általános képletben Rí és R2 jelentése a 4. igénypontban megadott - a gyógyászatban használatos hordozó és egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítunk. (1984. 06. 18.)
HU842338A 1983-06-25 1984-06-18 Process for producing antracyclin derivatives and pharmaceutical compositions containing them HU195979B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3323025A DE3323025A1 (de) 1983-06-25 1983-06-25 Anthracyclin-derivate, ein mikrobiologisches verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als cytostatika

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT44803A HUT44803A (en) 1988-04-28
HU195979B true HU195979B (en) 1988-08-29

Family

ID=6202458

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU842338A HU195979B (en) 1983-06-25 1984-06-18 Process for producing antracyclin derivatives and pharmaceutical compositions containing them

Country Status (20)

Country Link
US (1) US4713371A (hu)
EP (1) EP0131181B1 (hu)
JP (1) JPS6036437A (hu)
KR (1) KR850000529A (hu)
AT (1) ATE50776T1 (hu)
AU (1) AU578615B2 (hu)
CA (1) CA1244364A (hu)
DE (2) DE3323025A1 (hu)
DK (1) DK306584A (hu)
ES (1) ES8601230A1 (hu)
FI (1) FI80071C (hu)
GR (1) GR81630B (hu)
HU (1) HU195979B (hu)
IL (1) IL72214A0 (hu)
MX (1) MX7303E (hu)
NO (1) NO160011C (hu)
NZ (1) NZ208622A (hu)
PH (1) PH22276A (hu)
PT (1) PT78784B (hu)
ZA (1) ZA844742B (hu)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3325957A1 (de) * 1983-07-19 1985-02-07 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Anthracyclin-derivate, ein verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als cytostatika
JPS6117597A (ja) * 1984-07-03 1986-01-25 Microbial Chem Res Found アントラサイクリン化合物
DE3524117A1 (de) * 1985-07-05 1987-02-05 Hoechst Ag Neue anthracyclin-tetrasaccharide, ein verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als cytostatik
DE3706175A1 (de) * 1987-02-26 1988-09-08 Behringwerke Ag Verwendung von lipophilen anthracyclinen zur behandlung "sekundaer" anthracyclin-resistenter tumoren, mittel enthaltend ein lipophiles anthracyclin und verfahren zu seiner herstellung
DE3712350A1 (de) * 1987-04-11 1988-10-20 Behringwerke Ag Semisynthetische rhodomycine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als zytostatika
US4918172A (en) * 1987-10-06 1990-04-17 Sanraku Incorporated Anthracycline antibiotics
DE3842836A1 (de) * 1988-12-20 1990-06-21 Behringwerke Ag Rhodomycine mit einer modifizierten kohlenhydrat-einheit
DE3920062A1 (de) * 1989-06-20 1991-01-10 Hoechst Ag Neue anthracyclin-derivate, ein verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als arzneimittel
FI93860C (fi) * 1991-03-25 1995-06-12 Leiras Oy Menetelmä antibioottien tuottamiseksi, siinä käyttökelpoisia DNA-jaksoja, yhdistelmä-DNA-konstruktioita ja näitä sisältäviä mikrobikantoja
DE10029433A1 (de) * 2000-06-15 2001-12-20 Bioleads Gmbh Rhodomycinon-Derivate
US8313760B2 (en) 2002-05-24 2012-11-20 Angiotech International Ag Compositions and methods for coating medical implants
ATE515277T1 (de) 2002-05-24 2011-07-15 Angiotech Int Ag Zusammensetzungen und verfahren zum beschichten von medizinischen implantaten
US20050059156A1 (en) * 2003-08-06 2005-03-17 Pharmacia Italia S.P.A. Method for detecting contaminants in pharmaceutical products
WO2005051451A2 (en) * 2003-11-20 2005-06-09 Angiotech International Ag Electrical devices and anti-scarring agents

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5323961A (en) * 1976-08-16 1978-03-06 Microbial Chem Res Found Antitumors
JPS55120786A (en) * 1979-03-14 1980-09-17 Sanraku Inc Variant capable of producing anthracycline glycoside
JPS6023679B2 (ja) * 1979-07-13 1985-06-08 メルシャン株式会社 ロドマイシン群抗生物質とその製造法
CH648327A5 (de) * 1980-10-16 1985-03-15 Hoffmann La Roche Anthracycline.
JPS57114547A (en) * 1981-01-07 1982-07-16 Sanraku Inc Anthracycline antibiotic substance and its preparation
JPS57176995A (en) * 1981-04-23 1982-10-30 Sanraku Inc Novel anthracyclinone glycoside and its preparation
JPS5826895A (ja) * 1981-08-11 1983-02-17 Sanraku Inc ２‐ヒドロキシアクラシノマイシンｂ
JPS5874694A (ja) * 1981-10-29 1983-05-06 Sanraku Inc アントラサイクリン誘導体
JPS5982395A (ja) * 1982-11-02 1984-05-12 Microbial Chem Res Found アントラサイクリン化合物、その製造法およびその用途
JPS59231023A (ja) * 1983-11-11 1984-12-25 Ajinomoto Co Inc 抗腫瘍剤

Also Published As

Publication number Publication date
DE3323025A1 (de) 1985-01-10
PH22276A (en) 1988-07-14
NO160011C (no) 1989-03-01
KR850000529A (ko) 1985-02-27
NO842546L (no) 1984-12-27
PT78784B (de) 1986-07-22
ES533631A0 (es) 1985-10-16
FI842523A0 (fi) 1984-06-21
AU2981284A (en) 1985-01-03
EP0131181A3 (en) 1985-05-22
FI80071C (fi) 1990-04-10
DK306584A (da) 1984-12-26
MX7303E (es) 1988-04-29
PT78784A (de) 1984-07-01
DE3481515D1 (de) 1990-04-12
NO160011B (no) 1988-11-21
ES8601230A1 (es) 1985-10-16
GR81630B (hu) 1984-12-11
CA1244364A (en) 1988-11-08
AU578615B2 (en) 1988-11-03
ATE50776T1 (de) 1990-03-15
HUT44803A (en) 1988-04-28
FI80071B (fi) 1989-12-29
IL72214A0 (en) 1984-10-31
ZA844742B (en) 1985-02-27
US4713371A (en) 1987-12-15
DK306584D0 (da) 1984-06-22
EP0131181A2 (de) 1985-01-16
NZ208622A (en) 1988-02-29
JPS6036437A (ja) 1985-02-25
FI842523A (fi) 1984-12-26
EP0131181B1 (de) 1990-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4316011A (en) Rhodomycin antibiotics
US3686163A (en) Dihydrodaunomycin antibiotic and derivatives thereof
HU195979B (en) Process for producing antracyclin derivatives and pharmaceutical compositions containing them
CA1100895A (en) Antitumor anthracylcine antibiotics
Oki et al. ANTITUMOR ANTHRACYCLINE ANTIBIOTICS, ACLACINOMYCIN A AND ANALOGUES I. TAXONOMY, PRODUCTION, ISOLATION AND PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES
Furumai et al. TPU-0037-A, B, C and D, novel lydicamycin congeners with anti-MRSA activity from Streptomyces platensis TP-A0598
YOSHIMOTO et al. Intensely potent anthracycline antibiotic oxaunomycin produced by a blocked mutant of the daunorubicin-producing microorganism
Yoshimoto et al. Microbial conversion of ε-pyrromycinone and ε-isorhodomycinone to 1-hydroxy-13-dihydrodaunomycin and N-formyl-1-hydroxy-13-dihydrodaunomycin and their bioactivities
US4329339A (en) Anthracyclinones and derivatives thereof
GB1561619A (en) Anthracyclineglycoside antitumor antibiotics
EP0187049B1 (en) Micromonospora microorganisms and macrolide antibiotic production therewith
CA1115224A (en) Process for producing aminoglycoside antibiotics
US4474945A (en) Anthracycline antibiotics
US4942155A (en) Biosynthetic anthracyclines related to daunorubicin
US4336333A (en) Process for preparing tunicamycin
FI81608C (fi) Foerfarande foer framstaellning av 1-hydroxi-cytorodiner.
US4401812A (en) Anthracycline antibiotics
JPH0576958B2 (hu)
US4977084A (en) Production, isolation, and identification of novel antifungal compounds
JP3148331B2 (ja) 抗生物質レスピノマイシン、その製造法並びに抗腫瘍剤及び抗ウイルス剤
US4468386A (en) 1-Deamino-1-hydroxy-aminoglycoside compounds, antibacterial compositions and method of use
KR840000127B1 (ko) 이스타마이신의 제조방법
JPH07278188A (ja) Ｇｅ３化合物
GB2036021A (en) Antitumor antibiotics
JPH04120088A (ja) Ｒｋ―４８３ａ、その製造法並びに抗腫瘍剤及び抗菌剤

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee