NO160011B - Mikrobiologisk fremgangsmaate for fremstilling av antracyklin-derivater. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder en fremgangsmåte for

fremstilling av nye antracyklin-forbindelser ved fermentering av den nye mikroorganismestammen Streptomyces Y-11472, DMS. 2N658/med etterfølgende isolering og rensing. Noen av disse nye antracyklin-forbindelsene utmerker seg ved en anti-

bakteriell virkning mot grampositive bakterier og er dess-

uten virksomme mot forskjellige arter av tumorer. De nye forbindelsene har den generelle struktur som fremgår av formel I,

hvori betyr resten -OR^, R2 betyr resten -OR^, og R^ og R^ er like eller forskjellige og betyr sukkerkombina-

sjoner med følgende sammensetning:

Roa-dF-Rod, Roa-dF-Cin A, Roa-dF- = Cin B, Roa-Rod-Rod, Roa-Rod-Cin A, Roa-Rod-Acu, Rod-Rod-Rod, Roa-dF-Acu,

Roa-Rod eller Roa-dF, hvorved

Roa betyr rhodesamin,

dF betyr desoksyfucose,

Rod betyr rhodinose,

Acu betyr aculose,

Con A betyr cinerulose A,

Cin B betyr cinerulose B,

dF = Cin B betyr at begge sukkerbyggestenene er sammen-

knyttet med en ytterligere eterbro ved siden av den vanlige flukosidiske bindingen, såvel som deres fysiologisk godtag-

bare syreaddisjonssalter.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er karakterisert ved

at mikroorganismen Streptomyces purpurascens Y-11472,

DSM 2658, fermenteres aerobt i et næringsmedium som inneholder karbon- og nitrogenkilder samt uorganiske næringssalter og sporelementer, ved temperaturer på 24-40°C og en pH på 6,5-8,5, de dannede forbindelser ekstraheres fra kulturvæsken og mycelet ved behandling med organiske oppløsnings-midler og fra ekstraheringsoppløsningen isoleres de ønskede forbindelser ved anvendelse av kieselgelsøylekromatografi, "reversed phase"-adsorbsjon, motstrømskromatografi og etterfølgende tynnsjikts- eller høytrykksvæskekromatografi.

Streptomyces Y-11472 ble isolert på kjent måte fra en jord-prøve under anvendelse av et næringsmedium ved et pH fra 6,5 til 8,5 med eller uten tilsetning av antibiotika. Fortrinnsvis isoleres Streptomyces Y-11472 fra en jordprøve under anvendelse av et næringsmedium ved pH fra 6,5 - 7,0. Som antibiotika som eventuelt tilsettes til næringsmediet, anvendes fortrinnsvis "Ampicillin" eller "Amphotericin B". De tilsatte antibiotika forhindrer bakterie- og soppvekst. Videre kan det som antitiobika anvendes "Streptomycin", "Penicillin" eller "Nystatin".

Næringsmediet består av karbon- og nitrogen-kilder såvel

som uorganiske næringssalter. Som karbonkilder egner glukose eller stivelse seg. Som nitrogenkilder, kan det anvendes pepton, gjærekstrakt, kjøttekstrakt, maltekstrakt eller kasein. Til fastgjøring kan det anvendes agar. Som uorganiske næringssalter, egner seg eksempelvis natrium-, kalium-, magnesium-, kalsium-, fosfor- eller svovelsalter.

Den således oppnådde mikroorganisme Streptomyces Y-11472

ble deponert 24.5.1983 under innleveringsnr. DSM 2658 hos DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) i D-34 00 Gøttingen (Grisebachstr. 8).

Mikroorganismen Streptomyces Y-11472 tilhører ordenen actino-mycetales, familien Streptomycetaceae og slekten Streptomyces. Fra forskjellige Streptomyces-arter som er beskrevet i litteraturen, er det kjent, at de fremstiller antracyklin-forbindelser. Av disse arter anvendes allerede daunomycin og adriamycin i klinikken på mennesker for kreftbekjemp-else.

Rhodomycinoner, iso-rhodomycinon såvel som rhodomycin-beslektede antitibiotika er beskrevet i Chem. Ber. 88, 1782-1818 (1955), Chem. Ber. 101, 1341-1348 (1968), J.Med. Chem. 20, 957-960 (1977), Pharmacie 27, 782-789 (1972), Zeit. Allg. Mikrobiol., 14, 551-558 (1974), Tetrahed. Lett. Nr. 38, 3699-3702 (1973), Folia Microbiol., 24, 293-295

(11979) og J. Antibiotics, 32, (1979).

Aclacinomycin A er beskrevet i US patent nr. 3.988.315 såvel som av Oki et al., i J. Antibiotics, 28, 830 (1975) og 32, 791-812 (1969).

Cinerubinene A og B er beskrevet i GB patent nr. 846 130,

i US-PS 3.864.480, i "Antimicrobial Agents and Chemothera-py", s. 68 (1970) av Keller-Schierlein et al., i Chemical Abstracts 54, 14661 (1960) og i J.Antibiotics 28, 839

(1975).

Ytterligere antracyklinantibiotika er beskrevet detaljert eller som sammenfatning i "Index of Antibiotics from Actino-mycetes", hovedutgiver Hamao Umezawa, University Park Press, State College, Pennsylvania, USA (1967) som følger:

I "Antibiotics", col. I, Mechanisms of Action, utgiver David Gottlieb og Paul D. Shaw, Springer-Verlag, New York, Inc., N.Y. (1967) inneholdes på sidene 190-210 en avhandling av A.DiMacro med tittelen "Daunomycin and Related Antibiotics".

"Information Bulletin" nr. 10, International Center of Antibiotics, i samarbeide med WHO, desember 1972, Belgia, omta-ler antracykliner og deres derivater.

Egenskapene til Streptomyces Y-11472 beskrives i tabell

2 i denne beskrivelse.

Foreliggende oppfinnelse gjelder en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser av antracyklin-klassen med den generelle formel I, ved dyrking av Streptomyces Y-11472 ved fermentering ved en pH-verdi fra 6,5 - 8,5 og en temperatur fra 24 - 40°C under aerobe betingelser i et næringsmedium som inneholder karbon- og nitrogen-kilder såvel som uorganiske næringssalter, såvel som sporelementer, og isolering av forbindelsene fra dyrkningsvæsken og mycelet på kjent måte som beskrevet nedenfor.

Som karbonkilder egner seg glukose, stivelse, dekstrin og glycerol. Egnede nitrogenkilder er soyamel, gjærekstrakt, kjøttekstrakt, maltekstrakt, maissvellevann, pepton eller kasein. Som uorganiske næringssalter egner seg f.eks. natriumklorid, magnesiumsulfat eller kalsiumkarbonat. Som sporelementer, kan det anvendes jern, magnesium, kobber, sink og kobolt.

Streptomyces Y-11472 kan dyrkes ved temperaturer på 24 - 40°C ved et pH på 6,5 - 8,5. Fortrinnsvis foregår dyrkingen av Streptomyces Y-11472 under aerobe betingelser ved 30°C

og ved en pH-verdi på 7,0. Etter 72 timer, når det høyeste utbyttet er nådd, avbrytes fermenteringen. Fortrinnsvis kan det ved fermenteringen handle om en submers-fermentering.

Fermenteringen og dannelsen av antracyklinforbindelsene

kan gjennomføres takket være den antibakterielle virkningen av dyrkningsvæsken overfor S. aureus 209 P og Bae. subtilis såvel som ved ekstraktsjon av den totale dyrkningsløsningen (mycel og dyrkningsfiltrat) med et organiske løsningsmiddel og måling av absorbsjonsintensiteten av den røde forbindel-

sen ved 494 nm. Som organisk løsningsmiddel anvendes fortrinnsvis etylacetat.

Antracyklin-forbindelsene i dyrkningsfiltratet og i mycelet isoleres ifølge flytskjema I i foreliggende oppfinnelse.

Antracyklin-forbindelsene i mycelet ekstraheres med et organisk løsningsmiddel, fortrinnsvis med vandig aceton, som ble innstilt på en pH-verdi på 3,5. Etter fjerning av ace-tonet, innstilles pH-verdien i den vandige fasen på 7,5

og ekstraheres så med etylacetat. Dyrkningsvæsken ekstraheres ved en pH-verdi på 7,5 med et organisk løsningsmiddel som etylacetat eller kloroform, fortrinnsvis med etylacetat. Etylacetatekstraktene fra mycelet og dyrkningsfiltratet forenes eller opparbeides separat, konsentreres og opptas 1 et organisk løsningsmiddel, som benzen eller toluen. Fortrinnsvis anvendes toluen. Toluen-løsningen ekstraheres så med en acetat-buffer med en pH-verdi på 3,5. På dette trinnet oppdeles blandingen av antracyklin-derivatene i 2 fraksjoner. Den blanding som forblir i toluenfasen betegnes som fraksjon A, den glykocid-blandingen som blir igjen i den vandige fasen, betegnes som fraksjon B. Fraksjon A renses videre, som vist i flytskjema II i foreliggende oppfinnelse.

Fraksjon B renses videre ifølge flytskjema III i foreliggende oppfinnelse.

Som det fremgår av flytskjema II, gir fraksjon A minst 4 bestanddeler, av hvilke bestanddelen cytorodin J anrikes ved flertrinnskromatografi og endelig isoleres i ren form.

Som det vises i flytskjema III, oppnås fra fraksjon B cytorhodinene A, B, C, D, E, F, blandingen G ? + I (1:1), H,

K, L, M, blanidngen N + 0, P, V og W. Ved fraksjonene "X" og "Y" handler det om blandinger av andre antracyklin-forbindelser, som skal undersøkes. Deres generelle struktur tilsvarer formel I.

De forbindelser som er isolert fra dyrkningsløsningen av Streptomyces Y-11472 og som er renset ifølge flytskjema

I, har den generelle formel I.

Noen av forbindelsene ifølge oppfinnelsen har den struktur som er angitt i formel II

hvorved R, og R4 har den ovennevnte betydning.

Flytskjema I

Isolering av det antibiotiske komplekset fra Streptomyces Y- 11472.

Flytskjema II

Rensing av fraksjon A

Flytskjema III Opparbeiding av den vandige fase B

Andre forbindelser ifølge oppfinnelsen har den struktur som er angitt i formel III hvor R. har den ovenfor angitte betydning, såvel som den struktur som er angitt i formel IV hvorved R. og R,, har den ovenfor angitte betydning. Særlig foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen er slike som har formelen II hvor R^ og R^ har de betydninger som er angitt i det følg-ende : Andre særlig foretrukne forbindelser er cytorhodinene med den generelle formel III hvor R4 har følgende betydninger: såvel cytorhodin J med den generelle formel IV hvor R- betyr metyl og R^ sukkerkombinasjonen Rod-Rod-Rod (formel IX). De foran nevnte sukkerkombinasjoner har følg-ende strukturformler (til IX):

Antracyklinforbindelsene ifølge oppfinnelsen utmerker seg med en sterk virkning mot grampositive bakterier såvel som en utpreget cytostatisk virkning.

Foreliggende oppfinnelse forklares ytterligere ved hjelp av etterfølgende eksempler:

Eksempel 1.

Isolering av streptomyces Y- 11472 fra jord.

a) Fremstilling av isoleringsnæringsmedier.

Mediene ble sterilisert i % time ved 121°C.

b) Fremstillling av en jordprøve- suspensjon.

1 g jordprøve ble tørket i luft, malt i en morter og opp-varmet i 1 time ved 120°C. Den således behandlede jord-prøven ble suspendert i destillert vann og rystet grundig. Så fikk jorden avsette seg, og den overstående væsken ble benyttet som inokkulum for de ovenstående isoleringsmediene.

c) Poding av isoleringsmediene.

1 ml jordprøve-suspensjon ble podet i petriskåler ved hver

50 ml av de ovenstående isoleringsmediene.

d) Isolering av streptomyces Y- 11472.

De podede petriskålene ble inkubert i 2 uker ved 37°C og

Streptomyces Y-11472 ble isolert på kjent måte fra de vok-sende mikroorganismene.

Eksempel 2.

Dyrkning av Streptomyces Y- 11472 for fermentativ produksjon av det antibiotiske komplekset.

Streptomyces Y-11472 ble tilsatt til gjær-malt-agar med følgende sammensetning:

Mediet ble fordelt i reagensglass og sterilisert i 30 minutter ved 121°C, så ble glassene avkjølt i skråstilling for fremstilling av skråkulturer, podet med kulturen og inkubert i 10-15 dager ved 28°C. Derpå kunne det fastslås en god vekst og en god sporedannelse. En sporesuspensjon i destillert vann fra et skråglass ble anvendt som inokkulum for 5 Erlenmeyerkolber med hver 100 ml podetkulturmedium eller for en 5-liters sugeflaske med 1 liter av det samme stammekulturmedium.

Sammensetning av podekulturmediet.

Hver 100 ml av det ovenstående medium ble fordelt på 500

ml Erlenmeyerkolber eller 1 liter av mediet ble tilsatt til en 5 liters sugeflaske og mediet ble sterilisert i 30 minutter ved 121°C. Kolbene hhv. flaskene ble avkjølt, podet med sporesuspensjonen og rystet med 240 omdr./min.

i 72 timer ved 30°C i en rotasjonsrystemaskin med en ampli-tyde på 3,75 cm. Den utvokste kulturen ble anvendt som inokkulum for et 15 liters glassfermenteringskar med 10 liter av et 5 volum-%-ig stammekulturmedium for fremstilling av en podekultur for det andre trinnet. Fermenteringen foregikk ved 26°C (+ 1°C) under omrøring ved 160-180 omdr./

min. med en luftningsgrad på 6-7 l/min. Det derved oppnådde godt utvokste podekulturen ble anvendt som inokkulum for produksjonsmediet.

Sammensetning av produksjonsmediet.

Tilsetningene til fermenteringskaret ble tilsatt 0,025% Desmophen R som antiskum-middel.

260 1 av det ovenstående medium ble tilsatt til et fermenteringskar på 390 1 mediet ble sterilisert med indirekte såvel som med direkte damp i 28 minutter ved 121°C. Fermenteringskaret ble avkjølt og podet med podekulturen fra det andre trinnet (5 vol.-%). Fermenteringen foregikk i 68-72 timer ved temperatur 26°C (+ 1°C) under omrøring ved 100-200 omdr./min. ved en luftingsgrad på 1:0,6 VVM (9-10 m<3>/time). Ved slutten av fermenteringen etter 68 - 72 timer oppgikk konsentrasjonen av antibiotikumet til 100-150 \ iq pr. ml og pH i dyrkningsvæsken 5,5-6,0. Restsukkerinnholdet i dyrkningsløsningen oppgikk til 0,03 - 0,5% og mycelets våtvekt oppgikk til 3-4 g/vol-%.

Eksempel 3.

Dyrking av Streptomyces Y- 11472 for fermentativ fremstilling av det antibiotiske komplekset.

1) Sammensetning av forkulturmediet:

72 timer ved 30°C.

2) Sammensetning av produksjonsmediet: Fermenteringsvarighet: 88 - 96 timer, b) 1) Sammensetning av forkulturmediet. 2) Sammensetning av produksjonsmediet;

Innhøsting etter 88 - 96 timer.

Eksempel 4.

Isolering av råblandingen av antracyklinforbindelsene.

Ca. 250 1 kulturløsning fra et 300 liters fermenteringskar ble sentrifugert.

a) 200 1 kulturfiltrat ble innstilt på pH 7,5 med NaOH

og ekstrahert 2 ganger med hver gang 50 liter etylacetat,

hvoretter den organiske fasen ble inndampet i vakuum. Den vandige fasen som derved skilte seg ut, ble fraskilt og etterekstrahert 3 ganger med etylacetat. De forenede organiske fasene ble inndampet til tørrhet i vakuum og resten oppløst i 650 ml toluen, løsningen ekstrahert 5 ganger med hver gang 300 ml natriumacetat-buffer, pH 3,5, toluenfasen inndampet i vakuum (rød, oljeaktig rest, fraksjon A). De forenede, vandige fasene ble bragt på pH 7,5 med 2 n NaOH og ekstrahert 4 ganger med 400 ml etylacetat. De fraskilte etylacetatfaser ble inndampet til tørrhet i vakuum (0,7

g dyprød, fast rest: fraksjon B).

b) 9,5 g fast mycel ble ekstrahert 2 ganger med hver 50 liter aceton-acetatbuffer pH 3,5 (10:1), de forenede eks-traktene inndampet til 12 liter i vakuum (pH 3,5), konsentratet vasket 3 ganger med 4 liter toluen, toluenfasene forenet og inndampet i vakuum til en oljeaktaig, dyprød rest. Den vandige fasen ble innstilt på pH 7,5 med konsen-trert NaOH, ekstrahert 3 ganger med hver 4 liter etylacetat og de forenede etylacetatfåsene inndampet i vakuum. Det ble tilbake 1,98 g av en dyprød, fast rest (fraksjon B). c) Den videre isoleringsfremgangsmåten fremgår fra flyt-skjemaene I til III. Eksempelvis ble forbindelsen cytorhodin J oppnådd ved preparativ tynnsjiktskromatografi av den halvrene fraksjon A^ som ble oppnådd søylekromatigrafisk (flytskjema II).

Cytorhodinene A, B, C, D, E, F og H og 1:1-blandingen G

+ I ble isolert ved gjentatt kromatografi av de fraksjoner som er anriket på glykosid (flytskjema III) f.eks. ved hjelp av silikagel eller "Sephadex" LH 20 eller på "reversed phase" adsorbsjonsmidler eller DCCC (droplet counter current chromatography), eller ved fordeling mellom toluen og etanol/ vann (1:1). Det siste rensetrinnet foregår ved hjelp av preparativ tynnsjikts- og høytrykksvæskekromatografi (HPLC). HPLC foregikk under anvendelse av en søyle med Micropora-sil Rog en mobil fase med følgende sammensetning: kloroform: metanol: eddiksyre: vann: trietylamin i forholdet 68 : 20 : 10 : 2 : 0,01. Strømningen ble innstilt på 0,5 - 1,5 ml pr. minutt og påvisningen foregikk ved hjelp av UV-absorbsjon ved 254, 260 hhv. 490 nm i et gjennomstrøm-ningsfotometer.

Eksempel 5.

Identifisering av cytorhodin J (formel IV med = Rod-Rod-Rod og R5 = CH3).

Som angitt i flytskjema II ble 15 mg isolert.

Smp.: 128 - 130°C.

UV-spektrum (metanol): 242, 284, 492, 510, 522 og 558 nm. NMR i CDC13:

-verdier'(ppm): 1,1 - 1,22 (12H, m, 4 x CH3)

1,75 - 2,25 (14H, m, 7 X -CH2~)

2,36 (2H, m, -CH2~

3,51 til 3,6 (3H, m, 4', 4", 4"'-H)

3,7 (3H, s, -COOCH3)

3,94 - 4,12 (3H, m, 5', 5", 5"'-H)

4.3 (1H, s, C 10-H)

4,83 - 4,86 (2H, m, 1", 1"'-H)

5,28 (1H, br, C7-H)

5.4 5 (1H, br, C l'-H)

7,34 (1H, d, J = 8 Hz, C1H)

Eksempel 6:

Isolering av forbindelsene cytorhodin A, B og H som råblanding. 1,0 g rå cytorhodinblanding, oppnådd ved ekstraksjon fra kulturløsningen som beskrevet i skjema I, ble kromatografert på 100 g silikagel 31 u (Grace) med blandingen CHC13/ metanol/96%-ig eddiksyre/vann/trietylamin 80:5:5:1:0,01 i en glassøyle 3 x 43 cm. Prøven ble oppløst i 7 ml av den mobile fase, tilsatt til søylen som er ekvilibrert med elueringsmidlene og oppfanget i fraksjoner på 23 ml og be-dømt med tynnsjiktskromatografi på CD-Fertigplatten Kieselgel 60 F 254 (Merck) med systemet CHCl3/metanol/96%-ig eddiksyre/vann/trietylamin 80:10:10:2:0,01 (system B):

På analog måte ble det gjennomført ytterligere søylekroma-tograferinger med den råe cytorhodin-blandingen. Likeartet sammensatte blandingsfraksjoner ble ytterligere oppdelt ved hjelp av HPLC i stålsøyler.

Eksempel 7.

Isolering av enkeltbestanddelene cytorhodon A, B og H ved høytrykksvæskekromatografi ( HPLC).

52,5 mg av en blandingsfraksjon med cytorhodin A, B og H ble oppløst i 2 ml av blandingen CHCl3/MeOH/96%-ig eddiksyre/vann/trietylamin 80:10:10:2:0,01 og tilsatt til en stålsøyle (2,1 x 25 cm), som under trykk var blitt fylt

med 40 g LiChrosorb Si60 7 \ i Merck, og var blitt ekvilibrert med den ovenstående mobile fase. Elueringen foregikk med en strømning på 5 ml/minutt og ble fulgt med et gjennom-strømnings-spektralfotometer ved en bølgelengde på 490 nm, hvorved fraksjoner på 4 ml ble oppfanget og samlet etter prøvning med analytisk HPLC:

For isolering av forbindelsen cytorhodin H ble blandings-fraksjonene fra flere forløp rekromatografert på samme måte.

De rene enkeltbestanddelene fra flere kromatografiske for-løp ble forenet og igjen renset ved hjelp av følgende fremgangsmåte .

120 mg forente satser av cytorhodin A som er isolert som beskrevet ved hjelp av flere gangers søylekromatografi,

ble oppløst i 30 ml natrium-acetatbuffer pH 3,5, løsningen innstilt på pH 7,8 med 2 n NaOH og ekstrahert 4 ganger med hver gang 15 ml etylacetat, de forenede organiske fasene ble vasket en gang med 1 ml av en 0,001 molar løsning av EDTA (pH 7,5) og deretter 2 ganger med hver 2 ml vann, tørket over NaSO^, filtrert og inndampet i vakuum. Resten ble oppløst i litt CHCl^, løsningen avsuget gjennom et glass-filter og inndampet i vakuum etter tilsetning av heptan til den ble uklar.

A: <1>H-NMR Fig. 1

Absorb- a) 235 (4,62) 253 (Sch) 295 (3,87) 4,95 (4,11) sjons- b) 235 (4,62) 255 (Sch) 296 (3,92) 4,97 (4,17) spektrum c) 243 (4,63) - 280 (3,95), 305 (3,91),

575 u. 610 (4,15) <C>60H88<N>2°20' M-ber-: 1156 (FAB-MS bekreftet).

B: <1>H-NMR Fig.2

Absorb- a) 235 (4,52) 252 (Sch) 297 (3,83) 4,95 (3,94) sjons- b) 236 (4,52) 253 (Sch) 295 (3,89) 4,95 (4,03) spektrum c) 242 (4,40) - 280 (3,89), 305 (3,690),

610 (3,83).

C60Hg6N2O21, M ber.: 1170 (FAB-MS bekreftet)

H """H-NMR Fig. 3

molmasse M 1150 - 1300 (FAB-MS)

Eksempel 8.

Isolering av cytorhodin E ved preparativ høytrykksvæske-kromatografi ( HPLC). 30 mg rått cytorhodir> ble oppløst, i 0,5 ml av en blanding av CHCl3/metanol/96%-ig eddiksyre/vann-trietylamin 400:25: 50:5:0,05 og tilført til en stålsøyle 2,5 x 30 cm, som er pakket med ca. 40 g silikagel Lichrosorb R 60 (merck) 7 n og kromatografert under trykk med den ovenstående blanding ved en strømning på 6 ml/minutt. Etter et forløp på 100 ml, ble de fraksjoner som var kjennbare ved bølgelengden 260 nm med en gjennomstrømningsdetektor, forent etter over-prøvning med analytisk HPLC.

Fraksjoner med samme sammensetning som ble oppnådd fra 6

på samme måte gjennomførte preparative HPLC-forløp, ble forenet etter prøving med analytisk HPLC, hver oppløst i 20 ml vandig natriumacetatbuffer, pH 3,5, tilsatt 1 ml molar vandig etylendiamin tetraeddiksyreløsning (EDTA; innstilt på pH 3,5 med NaOH og rystet med 5 ml toluen. Toluenfasen ble kastet, den vandige fasen innstilt på pH 7,5 med 2n NaOH og ekstrahert med 20 ml CHC13. Etter tørking over natriumsulfat, ble det filtrert og inndampet i vakuum.

Det ble oppnådd:

Den analytiske HPLC ble gjennomført med den ovenstående mobile fase på o en ferdigsøyle Lichrosorb R Si 60 l[i, 4 x 125 nm (Merck). Deteksjonen fulgte ved 260 nm ved hjelp av et spektralfotometer med gjennomstrømningscelle.

E: <1>H-NMR Abb. 4

Absorbsjonsspektrum (nm):

a) 235 (4,57) 253 (Sch) 295 (3,85) 495 (4,1) b) 236 (4,58) 256 (Sch) 296 (3,9) 498 (4,15) c) 243 (4,6) - 305 (3,88) 610 (4,1)

C40<H>53<N>1°13' M ber"755 (FAB_MS bekreftet).

Eksempel 9.

Isolering av cytorhodin F, D, C og G + I.

2 g rått cytorhodin ble oppløst i 50 ml av en blanding av kloroform/metanol/iseddik/vann 80:10:10:2 (system A) og påført på en søyle med Kieselgel 60 "Merck", 15 - 40 \ i, 2,75 x 42 cm, oppslemmet i system A. Som elueringsmiddel ble det benyttet system A som inneholdt 0,01% natrium-heptan sulfonat. Etter et forløp på 1,1 liter, ble det oppfanget fraksjoner på hver 25 ml som ble undersøkt tynnsjiktskroma-tografisk (Kieselgel 60 F254 (Merc^) > System A). De aktive bestanddelene ble eluert i følgende fraksjoner:

127 - 153 C, P+V, P+V, G+I 125 mg

154 - 192 G+I 175 mg 0,34

Etter løp "x" (ved vasking av søylen med metanol)..

De forenede fraksjonene tilsettes mettet, vandig løsning av Na„2 HPO4„ til utskillelse av kloroformfasen, kloroformfasen vaskes med et volum 5%-ig Na2HP04~løsning og så med vann, tørkes over vannfritt natriumsulfat, inndampes i vakuum og felles med petroleter eller heksan.

F: <1>H-NMR: Fig. 5

Absorbsjonsspektrum:

a) 235 (4,55) 254 (Sch) 295 (3,79) 495 (4,04) b) 235 (4,55) 2,55 (Sch) 295 (3,79) 495 (4,04) c) 243 (4,49) - 280 (Sch, 382) 580, 610 (3,95)

<C>60<H>80N2°20' M- ber- 1148-

D: "'"H-NMR: Fig. 6

Absorbsjonsspektrum;

a) 235 (4,62) 255 (Sch) 295 (3,82) 495 (3,17) b) 236 (4,75) 253 (Sch) 293 (4,0) 495 (3,30) c) 242 (4,64) - 298 (3,88) 555 (3,09)

<C>60<H>80N2°21' <M*> ber"1164 (FAB-MS bekreftet).

C: <1>H-NMR: Fig. 7

a) 234 (4,69) 253 (Sch) 295 (3,85) 495 (4,11) b) 234 (4,68) 253 (Sch) 295 (3,92) 495 (4,18) c) 244 (4,69) - 290 (Sch; 3,85) 580, 610 (4,18)

<C>60<H>80N2°22' M ber' 1180 (FAB-MS bekreftet).

G+ I: <1>H-NMR: Fig. 8

Absorbsjonsspektrum:

a) 237 (4,61) 256 (Sch) 300 (3,9) 495 (4,13) b) 236 (4,61) 255 (Sch) 295 (3,9) 495 (4,13) c) 242 (4,6) - 300 (3,9) 570 (4,1)

<C>60<H>82<N>2°22 M ber- 1182 (FAB-MS bekreftet).

Det isolerte produktet er en ca. 1:1-blanding av de to strukturisomere bestanddelene G og I. Dette fremgår fra "'"H-NMR-spektrum, nedbrytningsforsøk (hydrogenolyse) og bestemmelse av de enkelte sukkerbyggstenene etter totalhydrolyse.

Eksempel 10.

Fraksjonering av cytorhodin-råblandingen med fordeling mellom toluen og metanol-vann.

En enkel, rast oppdeling av cytorhodin-råblandingen i en mindre polar andel (kompleks I) og en sterkere polar andel (kompleks II) ble oppnådd ved fordeling mellom toluen og metanol/vann. 83 g rå cytorhodin-blanding, oppnådd ved ekstraksjon fra mycel, oppløses i 500 ml metanol-vann (1:1) og ekstraheres 5 ganger med hver 500 ml toluen. De forenede toluenfasene ga etter inndamping i vakuum 32 g av en cytorhodin-blanding (kompleks I) med overveldende svakere polare bestanddeler (fremfor alt cytorhodinene F, D, C, P, C, X), metanol-vann-fasen derimot 47 g av en cytorhodin-blanding (kompleks II) med overveiende sterkere polare bestanddeler (fremfor alt cytorhodinene B, H, A, M og fraksjon Y, hvorved fraksjonen Y bl.a. inneholder cytorhodinene M, S, N + O

og W) .

De således oppnådde produktene viste seg som gunstige ut-gangsprodukter for den videre oppdeling og isolering av cytorhodinene ved søylekromatografi eller DCC-kromatografi (droplet counter current chromatography) eller ved kombina-sjon av begge fremgangsmåter.

Eksempel 11.

Anrikning av forbindelsene cytorhodin A og N + O ved søyle-kromatograf i på modifisert silikagel.

10 g rå, polar cytorhodinblanding (kompleks II), oppnådd ved fordeling mellom toluen-metanol-vann ble oppløst i 30 ml av blandingen (mobil fase) CHCl3/H20/MeOH 130:40:40 (under-fase) og påført på englasssøyle 5,5 x 95 cm med ca. 870 g modifisert silikagel 31 n (Grace) og kromatografert med ovenstående løsningsmiddelblanding.

Det anvendte silikagel var vasket metallfritt med 2 N HC1

og etter utvasking av syren i vandig suspensjon blitt be-handlet med 5 N NaOH til det hadde innstilt seg et pH på 7,6. Etter dekantering ble det modifiserte silikagel tørket i tørkeskap ved 130°C, siktet og innslemmet med den mobile fasen i søylen. Kromatografien foregikk med en strømning på ca. 100 ml/time først med 5,5 liter av den ovenfor angitte mobile fase, så med 5,3 liter av blandingen CHCl^/ H20/MeOH 130:40:50 med fraksjoner på ca. 15 ml. Etter bedømmelse ved DC ble de eluerte fraksjonene samlet på egnet måte til grupper og inndampet i vakuum. Etter et forløp på ca. 2 liter ble det så oppnådd:

Med 1 liter MeOH ble det vasket ut av søylen en blanding av polare til meget polare grupper.

Eksempel 12.

Fraksjonering av en anriket polar cytorhodin-blanding ved dråpe motstrøms-kromatografi (DCCC).

5 g av en cytorhodin-blanding som er anriket på sterkt polare bestanddeler og oppnådd ved fordeling mellom toluen og metanol/vann, ble oppdelt ved DCCC med DCC-kromatografen 670 (Biichi). Prøven ble i denne hensikt oppløst i 20 ml av underfasen fra den heterogent ekvilibrerte løsningsmiddel-blandingen (CHCl^/vann/metanol/n-propanol 45:90:120:5

(etter ekvlibrering tilsatt 1% 95%-ig eddiksyre) og inn-pumpet. Ved en strømning på ca. 4 0 ml/time og et trykk på 5-10 bar, ble etter et forløp på ca. 200 ml ca. 3 liter av underfasen i løpet av 3 dager pumpet gjennom glassrørene (ID 2,7 mm) som var fylt med den stasjonære fasen (overfasen fra den ovenstående blandingen som var tilsatt 1% 95%-ig eddiksyre) ("descending mode"). Den påførte mobile fasen ble oppfanget i fraksjoner på 10 ml. Etter bedømmelse ved hjelp av DC og analytisk HPLC ble de sammenhørende fraksjonene samlet og inndampet i vakuum. Det ble oppnådd:

Eksempel 13.

Isolering av cytorhodinene A og N+O fra en sterkt anriket blanding ved "reversed phase" HPLC.

50 mg av en blandingsfraksjon med ca. 40% cytorhodin A og ca. 35% cytorhodin N+0 ble oppløst i 1,5 ml av den mobile

fasen CHCl3/MeOH/10% ammoniumacetat i H20 150:1050:375

og kromatografert i en stålsøyle 1,6 x 25 cm på 30 g LiChrosorb R RP-18, 10 [ i (Merck) ved en strømning på 2 ml/min.• ' Med et gjennomstrømningsfotometer ved forløpet av elueringen fulgt ved bølgelengden 490 nm. Fraksjonene på 4 ml ble samlet etter bedømmelse ved analytisk HPLC (likeledes på en ståo lsøyle fylt med 10 y. LiChrosorb R RP-18 (Merck) og opparbeidet. I denne hensikt ble det fortynnet med halv-parten av volumet av vann og CHCl^ ble tilsatt til fase-adskillelse og den avskilte CHCl^-fase vasket med H20, tørket over Na2C04 og inndampet i vakuum. Det ble oppnådd :

System C: CHCl3/metanol/99% eddiksyre/vann 75:15:10:2.

Cytorhodin N+O: 1H-NMR Fig. 9

Absorbsjons- a) 235 (4,56) 25 (Sch) 293 (3,67) 495 (4,04) spektrum - b) 234 (4,59) 25 (Sch) 293 (3,68) 495 (4,15)

c) 240 (4,51) 283 (3,81) 575 (4,0) 615 (3,98)

<C>60<HggN>2<O>21, M ber. 1172 (FAB-MA bekreftet).

Det isolerte produktet er en l:l-blanding av de to strukturisomere bestanddelene N og O. Dette fremgår av 1H-NMR-spektrum, nedbrytningsforsøkene (hydrdgenolyse) og bestemmelse av de enkelte sukkerbyggstenene etter hydrogenolyse og totalhydrolyse. Bestanddelen cytorhodin O er kjent fra litteraturen (H. Brockmann, H. Greve, Tetrahedron Letters 1975 (831 - 834) ) .

Eksempel 14.

Isolering av enkeltbestanddelen cytorhodin P ved (middel)-trykk-kromatografi og preparativ tynnsjiktskromatografi. 6 g rå cytorhodinblanding, oppnådd ved ekstraksjon fra kul-turløsningen som beskrevet i skjema I, ble kromatografert på 620 g silikagel (Grace) i to radialt komprimerte silika-patroner (Waters, PrepLC/system 500 R ) med elueringsmiddelblandingen CHCl3/metanol/96%-ig eddiksyre/vann = 80/10/10/2. Prøven ble i 50 ml av den mobile fasen paiørt på den ekvilibrerte søylen og oppdelt i fraksjoner på 23 ml ved en strøm-ning på 35 ml/minutt. Bedømmelsen foregikk tynnsjikts-kromatografisk og ved hjelp av den analytiske HPLC.

I fraksjonene 41 - 56 utfalt 22 mg cytorhodin P i en renhet på 88% (Rf 0,42 i system A). 40 mg av denne prøven ble ytterligere renset ved preparativ tynnsjiktskromatografi (Merck, CD-ferdigplater kieselgel

60) med system A.

Elueringen av silikagel-båndet foregikk med CHCl^/metanol 1/1. Elueringsløsningen ble nøytralisert med vandig di-natriumhydrogenfosfat-løsning og tilsatt vann til fraskil-lelse av CHCl^-fasen. Kloroformfasen ble separert, vasket 1 gang med litt vann, tørket over Na2S04 og inndampet. Etter opptagelse i litt CHCl^, utfelling med 10 ganger volum-mengden petroleter og tørking av bunnfallet, ble det oppnådd 15 mg rent P.

P; <1>H-NMR Fig. 10

Absorbsjonsspektrum (nm):

a) 235 (4,63) 254 (Sch 4,33) 293 (3,90) 494 (4,13) b) 235 (4,60) 254 (Sch 4,31) 293 (3,85) 494 (4,12) c) 244 (4,33) - 570 (3,59)

620 (3,71)

C,„HQNo0o,, M ber. 1166 (FAB-MS bekreftet),

bu ts z. zx

Eksempel 15.

Isolering av enkeltbestanddelen cytorhodin V ved trykk-kromatografi og preparativ tynnsjiktskromatografi.

7 g rå cytorhodin-blanding, oppnådd ved ekstraksjon fra kulturløsningen som beskrevet i skjema I, ble kromatografert på 620 g silikagel 31 [ i (Grace) i to radialt komprimerte silika-patroner (vann, PrepLC/system 500 R ) med elueringsmiddelblandingen CHCl3/metanol/96% eddiksyre/vann = 80/10/ 10/2. Prøven ble i 65 ml av den mobile fasen påført på

den ekvilibrerte søylen og oppdelt i fraksjoner på 23 ml ved en strømning på 2 5 ml/min. Bedømmelsen foregikk tynn-sjiktskromatografisk og ved hjelp av den analytiske HPLC.

I fraksjon 29 -34 ble det oppnådd 195 mg cytorhodin V i

en renhet på 80% (Rf 0,38 i system A).

60 mg av denne prøven ble ytterligere renset ved preparativ tynnsjiktskromatografi (Merck, CD-Fertigplatten Kieselgel

60) med system A.

Elueringen av silikagel-båndet og oppnåelsen av rent cytorhodin V foregikk som beskrevet i eksempel 14. Det ble oppnådd 16 mg rent V.

V; <1>H-NMR Fig. 11

Absorbsjonsspektrum (nm):

a) 235 (4,72) 254 (Sch 4,48) 290 (4,04) 495 (4,20) b) 235 (4,73) 254 (Sch 4,48) 290 (4,06) 494 (4,24) c) 244 (4,61) 268 (4,63) - 570 (4,22)

601 (4,19)

<C>60<Hg>8<N>2O20, M ber. 1152 (FAB-MS bekreftet).

Eksempel 16.

Isolering av enkeltbestanddelen cytorhodin K ved søyle-

og preparativ tynnsjiktskromatografi.

6 g rå cytorhodin-blanding, oppnådd ved ekstraktsjon av kulturløsningen som beskrevet i skjema I, ble i 100 ml vann ved pH 7,5 ekstrahert med etylacetat. Etter inndamping av den organiske fasen ble resten opptatt i 15 ml CHCl^

og utfelt med et 10 ganger så stort volum petroleter. Fell-ningsproduktet ble avsentrifugert, vasket med petroleter og tørket i vakuum. Det ble oppnådd 3,6 g.

450 mg av denne mengden ble kromatografert på 80 g kieselgel 60, 15-40 n (Merck) med elueringsmiddelblandingen CHCl3/metanol/96%-ig eddiksyre/vann = 80/10/10/2. Prøven ble påført i den mobile fasen på den ekvilibrerte søylen og, etter et forløp på 210 ml, oppdelt i fraksjoner på 5 ml. I fraksjon 64 - 76, ble det oppnådd 15 mg cytorhodin K i en renhet på 62% (bestemt ved analytisk HPLC).

Denne mengde ble renset ytterligere ved preparativ tynnsjiktskromatografi (Merck, DC-Fertigplatten Kieselgel 60) med systemet A. Elueringen av silikagel-båndet og oppnåelsen av cytorhodin K, foregikk som beskrevet under eksempel , og førte til 3,6 mg rent cytorhodin K.

K: Ifølge "''H-NMR identisk med rhodomycin Y <*>)

<C>40<H>53<N>1°14' M ber"771

<*>) kjent fra litteraturen:

H. Brockmann og T. Waehneldt, Naturwiss. 48, 717 (1961)

s.a. E. Biedermann og H. Brauniger, Pharmazie 27, 782-789 ( 1972 ) .

Eksempel 17.

Isolering av enkeltbestanddelene cytorhodin L ved søylekroma-torgrafi og preparativ sjiktkromatografi. 6 g rå cytorhodinblanding, oppnådd ved ekstraksjon fra kul-turløsninger som beskrevet i skjema I, ble kromatografert på 800 g silikagel 15-40 u (Merck). For eluering ble det anvendt et gradientsystem av bestanddelene CHCl^/metanol 96% eddiksyre/vann: Det ble eluert med 1,65 liter av en 80/10/10/2-blanding (system A), så med 4 liter av det samme systemet under tilsetning av 0,01% heptansulfonsyre, videre 3,6 liter av en 70/20/10/2-blanding og til slutt med 2,8 liter av en 50/50/5/2-blanding. Prøven ble i 50 ml av ut-gangssystemet påført på søylen og etter 1,65 liters forløp oppdelt i fraksjoner på 25 ml. Bedømmelsen foregikk tynn-sjiktskromatografisk og ved hjelp av den analytiske HPLC.

I fraksjon 161-225 oppnåddes 1,1 g cytorhodinblanding med en andel på 24% cytorhodin L.

Denne mengde ble nå kromatografert på 160 g silikagel 15

-40 \ i med elueringsmiddelblandingen CHCl3/metanol/96%-ig eddiksyre/vann = 8C/10/10/2. Denne prøve ble i den mobile fasen påført på den ekvilibrerte søylen og, etter et forløp på 700 ml, oppdelt i fraksjoner på 10 ml. Fraksjonene 91-102 ble forenet (31 mg) med en andel på 64% cytorhodin L

og 103 - 118 (44 mg) med 68% cytorhodin L, hver bestemt ved analytisk HPLC. 50 mg av de forenede produktene ble renset videre ved preparativ tynnsjiktskromatografi (Merck, CD-Fertigplatten Kieselgel 60) med systemet A. Elueringen av silikagelbåndet og oppnåelsen av cytorhodin L foregikk som beskrevet under eksempel 14. Det ble oppnådd 18 mg cytorhodin L i en renhet på 74%, bestemt ved analytisk HPLC. Fornyet preparativ tynnsjiktskromatografi av denne mengden med det samme systemet og analog opparbeidelse, førte til 14 mg rent syto-rhodin L.

L: """H-NMR Fig. 12

Absorbsjonsspektrum (nm):

a) 235 (4,59) 253 (Sch) 295 (3,86) 495 (4,1) b) 235 (4,6) 255 (Sch) 295 (3,91) 495 (4,13) c) 244 (4,61) - 303 (3,87) 570 (4,1) 610 (4,15)

<C>34<H>43<N>1011, M ber. 641.

Eksempel 18.

Isolering av cytorhodin M ved preparativ "reversed phase" høytrykksvæskekromatografi (HPLC).

50 mg cytorhodin A fra preparativ HPLC på SiC^, som etter analytisk HPLC oppviste sterk "tailing", ble oppløst i 2

ml av en blanding av formel CHCl3/metanol/10% ammoniumacetat i H20 (150:1050:375) og påført på en stålsøyle

1,6 x 25 cm som er pakket med ca. 35 g LiCHrosorb T3 RP-18, 10 u (Merck) og kromatografert under trykk med den ovenstående blanding ved strømning på 2 ml/minutt. Elueringen ble fulgt med et gjennomstrømnings-spektralfotometer ved en bølgelengde på 490 nm, hvorved fraksjoner på 4 ml ble oppfanget og samlet etter prøvning med analytisk HPLC (ferdigsøyle 4,6 x 250 nm med LiChrosorb TD RP-18, 10u (Merck)):

Cytorhodin M kunne ikke skilles fra cytorhodin A hverken ved analytisk HPLS på silikagel eller ved DC med den mobile fase system A (se eksempel 9).

Egnet til adskillelse viste seg systemet CHCl^/MeOH/eddiksyre 99%/H20 75:15:10:2 på kiselplater (Merck)

(system C): R„ 0,41 (A) og R^ 0,37 (M) .

M: H-NMR Fig. 13.

Absorbsjonsspektrum.

a) 235 (4,56) 253 (Sch) 295 (3,83) 495 (4,1) b) 235 (4,58) 256 (Sch) 296 (3,89) 496 (4,15) c) 244 (4,59) - 305 (3,87) 610 (4,1)

C34<H>43N1°12' M ber' 657 (FAB-MS bekreftet).

Eksempel 19.

Isolering av cytorhodin W ved preparativ høytrykksvæske-kromatograf! (HPLC). 80 mg av den polare fraksjon Y ble oppløst i den mobile fase CHC13/metanol/96% eddiksyre/trietylamin 80:10:10:0,01 (vannmettet) og påført på en 3,2 x 2 5 cm stålsøyle pakket med 110 g 7 \ i LiChrosorb R Si 60 (Merck) og kromatograf ert under trykk ved en strømning på 8 ml/minutt. Fraksjoner på 4 ml ble opptatt og bedømt med analytisk HPLC, forenet og opparbeidet på vanlig måte. Ved siden av andre ikke identifiserte bestanddeler, ble det isolert 1,5 mg av for bindelsen cytorhodin W, som i systemet C på de vanlige DC-ferdigplater silikagel 60 (Merck) hadde RF-verdien 0,23.

W:

Absorbsjons- a) 235 (4,53) 253 (Sch) 293 (3,64) 495 (4,01) spektrum b) 235 (4,57) 253 (Sch) 293 (3,65) 495 (4,13)

c) 241 (4,49) - 282 (3,78) 575 (3,81) 610 (3,96)

<C>60<H>88<N>2°22' M ber- 1184

Identifiseringen av bestanddelene i de foranstående eksempl-ene, foregikk under de målebetingelser som er beskrevet i det følgende: Proton-resonansspektra ("^H-NMR-spektra) ble målt på et HX-270 Bruker Fourier-Transform kjerneresonansspektrometer ved 270 MHZ. Konsentrasjonene oppgikk til 2-4 mg/0,5

ml 99,8% CDCl^; løsningene ble like etter fremstillingen rystet med 0,1 m 5%-ig Na2C03 99,5% D20.

De signaler i figurene som er utstyrt med en stjerne, kommer av lavmolekylære forurensninger i %o-området og av løsnings-middelrester.

Massespektra ble målt på massespektrometeret MS-902 S, AEI, under anvendelse av en FAB-(Fast-Atom-Bombardment-)ionekilde. Substansene ble innbragt i en matrise av tioglycerol i ione-kilden, delvis under tilsetning av ammoniumklorid.

Absorbsjonsspektra ble målt i området 200 - 700 nm i:

a) vann-metanol 1:9

b) 10% i HC1 i metanol

c) 10% i NaOH i metanol.

Substanskonséntrasjonen oppgikk til 10 - 30 mg/l. Angitt blir absorbsjonsmaksima i nm og den molare ekstinksjons-koeffesienten (log e ).

Bestemmelse av den cytotoksiske aktiviteten.

Bestemmelsen av den cytostatiske virksomheten til de forbindelser som er beskrevet her, foregikk på L1210 leukemiceller fra mus. I detalj ble følgende testsystemer anvendt:

a) Proliferationsassay.

Ved denne metoden bestemmes in vitro etter inkubering av

cellene med forskjellige konsentrasjoner av test-substansen, i hvilken grad cellene kan innebygge radioaktive DNA-forløp-ere (f.eks. C14-markert tymidin). Ubehandlede L1210-celler underkastes de samme testbetingelser og tjener som kontroll. I det følgende beskrives metoden i korthet: L1210-celler i eksponensiell vekstfase (5 x 10^/ml i RPMI 1640) inkuberes i en mikrotiterplate i 72 timer ved forskjellige konsentrasjoner av testsubstansen (37°C, 5% CC^, 95% relativ luftfuktighet). Kontrollene består av celler, som bare inkuberes med friskt medium. Alle bestemmelser ble gjennomført som 4-gangers bestemmelser. Etter 65 timer tilsettes 50 ul C114 tymidin (l,5u Ci/ml), for å markere DNA

i cellen radioaktivt. Etter 7 timers inkubering avsuges cellene, DNA utfelles med 5%-ig trikloreddiksyre og vaskes etter hverandre med vann hhv. metanol.

Etter tørking ved 50°C bestemmes den radioaktivitet som

er innebygget i DNA etter tilsetning av 5 ml scintillasjons-væske.

Resultatene angis som forholdet til scintillasjonsindeks etter inkubering med testsubstansen i % av den ubehandlede kontrollen fra de således oppnådde måleverdiene, beregnes dosevirkningskurven og grafisk beregnes IC^q, dvs. den kon-sentrasjon, som under testbetingelsene senker innebyggingen av radioaktivt tymidin med 50% sammenlignet med kontrollen. ICj-^-verdiene til de her beskrevne forbindelsene sammenlignet med adriamycin (ADM) er sammenfattet i tabell 1.

b) Kolonidannelse av L1210-leukemiceller i myk agar.

Denne metode tjener til påvisning av en innvirkning av test-substansene på vekstforholdene til celler i løpet av flere genereasjoner (ved en cellesyklustid på 10 - 12 timer betraktes i testtiden på 7 dager ca. 14 på hverandre følgende generasjoner).

Cytostatisk virksomme substanser bevirker i denne test en reduksjon av det kolonitall som kan betraktes like overfor en ubehandlet kontroll. I detalj gjennomføres testen på følgende måte: 500 leukemiceller pr. plate inkuberes med forskjellige konsentrasjoner av test-substans i 1 time ved 37°C. Deretter vaskes cellene to ganger med McCoy 5A medium og helles til slutt over i petriskåler etter tilsetning av 0,3% agar. Kontroller inkuberes bare med friskt medium. Istedet for inkubering i 1 time, tilblandes i mange tilfeller forskjellige konsentrasjoner av testsubstansen i det øvre agar-sjikt, for å oppnå at cellene i hele inkubasjonstiden eks-poneres kontinuerlig. Etter stivningen av agaren, inkuberes platene i varmeskap i 7 dager ved 37°C (5% C02, 95% relativ luftfuktighet). Deretter telles antallet fremkomne kolonier med en diameter på 60u. Resultatene angis som kolonitall i behandlede agarplater i % av de ubehandlede kontrollene. Fra den således oppnådde dosevirkningskurve beregnes IC ^ som mål på substansens virksomhet. Resultatene for de forbindelser som er beskrevet her, sammenlignet med adriamycin er sammenfattet i tabell 1.

c) Fysikalske egenskaper.

1. Temperaturområde for veksten: vokser på gjær-malt-agar

i et temperaturområde fra 24-40°C med optimal vekst ved 30°C.

2. Nitratredusering: positiv

3. Melanindannelse: " 4. Gelatinutnyttelse: " 5. Stivelseshydrolyse: " 6. Tyrosinhydrolyse: " 7. Natriumkloridtoleranse: >7,0% men <10,0%

8.. Kaseinhydrolyse: positiv

9. Flytendegjøring av gelatin: " 10. Ureasefremstilling: " 11. Streptomycin-hemming: hemming ved 12,5ug/ ml

12. pH-følsomhet:

Substrat-mycelet og det diffusjonsdyktige pigmentet er pH-følsomt. Fiolett (purpurrød) under alkaliske betingelser, rød (rosa) under sure betingelser.

d) Utnyttelse av karbon.

D-glukose, L-arabinose, sukrose, D-xylose, I-inositol, D-mannitol, D-fruktose, ramnose, raffinose, galaktose,

salicin, maltose, cellobiose, ribose, Na-glutamat og sorbi-i tol ble anvendt for tilvekst. Utnyttelsen av cellulose

er ikke entydig.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av terapeutisk virksomme forbindelser med formel I hvori betyr resten -OR^, R2 betyr resten -OR^, og R3 og R^ er like eller forskjellige og betyr sukkerkombinasjoner med følgende sammensetning: Roa-dF-Rod, Roa-dF-Cin A, Roa-dF- = Cin B, Roa-Rod-Rod, Roa-Rod-Cin A, Roa-Rod-Acu, Rod-Rod-Rod, Roa-dF-Acu, Roa-Rod eller Roa-dF, hvorved

   Roa betyr rhodesamin,

   dF betyr desoksyfucose ,

   Rod betyr rhodinose,

   Acu betyr aculose,

   Cin A betyr cinerulose A,

   Cin B betyr cinerulose B,

   dF = Cin B betyr at begge sukkerbyggestenene er sammen-knyttet med en ytterligere eterbro ved siden av den vanlige flukosidiske bindingen, såvel som deres fysiologisk godtag-bare syreaddisjonssalter,karakterisert ved at mikroorganismen Streptomyces purpurascens Y-11472 DSM 2658 fermenteres aerobt i et næringsmedium som inneholder karbon- og nitrogen-kilder samt uorganiske næringssalter og sporelementer, ved temperaturer på 24-40°C og en pH på 6,4-8,5, de dannede forbindelser ekstraheres fra kulturvæsken og mycelet ved behandling med organiske oppløsningsmidler og fra

   ekstraheringsoppløsningen isoleres de ønskede forbindelser ved anvendelse av kiselgelsøylekromatografi, "reversed phase"-adsorbsjon, motstrømskromatografi og etterfølgende tynnsjikts- eller høytrykksvæskekromatografi.