FI59613C - Foerfarande foer framstaellning av ett tumoerfoerhindrande rhodirubinkomplex och dess komponenter a och b - Google Patents

Description

ΡΕδ^Π Γβΐ ri1xKUULUTUSJULKAISU r η/4 -r J0A m (11)uTLÄOGNINOSSKRIFT 1 ^

C (45) Patentti siyonr.-^:y ' O 1 ’ U

(51) Kv.liJWci.3 c 12 P 19/56, C 07 H 15/24 SUOMI—FINLAND (11) PaMnttiMiMMM —PM«ntameMn| 772^1+2 (22) HakwnJifUvt —AiwAknlnfadac 15-08.77 ' (23) AlkupCM—GlMghatsdag 15-08-77 (41) Tulkit JuIMmIoI — Mint affamll| 17 - 02.78

Fatwttti. ja rekisterihallitut h

Fetent- oeh registeratyrelsen (44) 29-05-81 (32)(33)(31) h>hsy stuelkeut k|W prtortt* l6.08.76 Japani-Japan(JP) Shova 51-9Ö113 (71) Zaidanhojin Biseibutsu Kagaku Kenkyukai, 3-Chome lU-23 Kamiohsaki, Shinagavaku, Tokyo, Japani-Japan(JP) (72) Hamao Umezawa, Tokyo, Tornio Takeuchi, Tokyo, Masa Hamada, Tokyo,

Masaaki Ishizuka, Tokyo, Hiroshi Naganava, Tokyo, Toshikazu Oki, Kanagawa-ken, Taiji In ui, Kanagava-ken, Japani-Japan(jP) (7U) Oy Kolster Ab

(5M Menetelmä kasvaintenvastaisen rodirubiinikompleksin ja sen komponenttien A ja B valmistamiseksi - Förfarande for framställning av ett tumörförhindrande rhodirubinkomplex och dess komponenter A och B

/

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä kasvaintenvastaisen rodirubiinikompleksin valmistamiseksi, jolla on kaava I

OH 0 “0CH3 I il .L /Ch2ch3

OH I

OH 0 OH 0

R

ja sen komponentin A valmistamiseksi, jolla on kaava I, jossa R on V- 2 5961 3 tö O N-CH3

l/f~°\ 0H

( CH3 \

VV

HO 7 ja sen komponentin B valmistamiseksi, jolla on kaava I, jossa R on J-°\ /CH. \

Sv N-CH- t d _0V 0 CH» f} 0}

HO

ja näiden happoadditiosuolojen valmistamiseksi.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että jotakin seuraavista rodirubiinia tuottavista Streptomyces-kannoista 3 59613

Streptomyces sp. ME 505-HEI (ATCC 31273, FERM P-3667), Strepto-myces galilaeus MA 144-M (ATCC 31133, FERM P-2455), Streptomyces galilaeus (ATCC 14969, Streptomyces cinereoruber (ATCC 19740), Streptomyces niveoruber (ATCC 14971), Streptomyces antibioticus (ATCC 8663) ja Streptomyces purpurascens (ATCC 25489), viljellään aerobisissa olosuhteissa hiilen ja typen lähteitä ja epäorgaanisia suoloja sisältävässä ravintoliemessä, kunnes organismi on tuottanut olennaisen määrän rodirubiinikompleksia, joka eristetään viljely-liemestä tavanomaisella tavalla, edullisesti uuttamalla veden kanssa sekoittumattomalla orgaanisella liuottimena tai kromatogra-foimalla, ja josta standarditekniikalla, kuten uuttamalla ja kromatografoimalla, erotetaan rodirubiini A ja rodirubiini B, jotka haluttaessa puhdistetaan ja muutetaan happoadditiosuoloiksi.

Aikaisemmin on havaittu Streptomyces-kantojen viljelyliuok-sessa joukko antrasykliiniglykosideja. Näistä daunomysiiniä ja adriamysiiniä on pidetty kiinnostavina syöpälääkitykseen ja niitä on käytettykin kliinisesti ihmisten hoidossa. Tutkittaessa edelleen kasvaimia estäviä antibiootteja on nyt löydetty uusia yhdisteitä, joiden fysikokemiallisten ominaisuuksien perusteella suoritetun yksilöimisen ja puhdistuksen jälkeen on varmistettu, että nämä antibiootit, joita nyt nimitetään aklasinomysiineiksi A ja B, ovat uusia yhdisteitä, joilla on vähäinen myrkyllisyys sydämeen ja voimakas tuumoreita estävä vaikutus erilaisiin eläintuumoreihin.

Farmitalialla on adriamysiiniä (B-106FI; 14-hydroksidaunomy-siini; kansainvälinen nimitys on doksorubisiini) koskeva US-patentti 3 590 028, joka kohdistuu tuotteen rakenteeseen ja sen tuottamiseen käymistietä S. peuceticus var. caesiusin avulla. Farmitalian US-patentti 3 803 124 kohdistuu daunomysiinin kemialliseen muuttamiseen adriamysiiniksi. Daunomysiinin tuottaminen käymistietä (antibioottina FI 1762) S. peuceticusin avulla, on esitetty brittiläisessä patenttijulkaisussa 1 003 383.

Farmitalian daunomysiini (GB 1 003 383) saattaa olla sama kuin Rhone Poulencin antibiootti 1 3057 R.P. /aikaisemmin rubidomysiini ja nyt daunorubisiini, jota myös nimitetään dauno-mysiiniksi (GB 985 598; 1 188 262; 1 241 750 ja US 3 616 242/7 sekä on "luultavasti” identtinen Ciban danubomysiinin kanssa (US 3 092 550, GB 901 830). US-patentti 3 686 163 koskee dihydrodaunomysiiniä.

“ 59613

Sinerubiinia A ja sinerubiinia B käsitellään GB-patentti-julkaisussa 846 130 ja US-patenttijulkaisussa 3 864 480 sekä artikkelissa: Keller-Schierlein et al.; Antimicrobial Agents and Chemotherapy, p. 68 (1970) ja Chemical Abstracts, 5_4, 1466i (1960).

Antrasykliini-antibiootteja on edelleen selostettu julkaisussa: Index of Antibiotics from Actinomycetes, Hamao Umezawa, Editor-inchief, University Park Press, State College, Pennsylvania USA (1967), ja siinä esitetään yhteenvetona aineista seuraavaa:

Antibiootti Sivunumero

Aklaviini 111

Sinerubiini A 220

Sinerubiini B 221

Danubomysiini 242

Daunomysiini 243

Pyrromysiini 542

Rodomysiini A, B 561

Rubidomysiini 574

Oppikirja Antibiotics, Volyme 1, Mechanism of Action, jonka toimittajat ovat David Gottlieb ja Paul D. Shaw, Springer-Verlag New York, Inc., N.Y. (1967), sisältää sivuilla 190...210 A. DiMarcon artikkelin "Daunomycin and Related Antibiotics".

Information Bulletin n:o 10, International Center of Information of Antibiotics, on julkaissut WH0:n kanssa yhteistoimisesti joulukuussa 1972, Belgiassa, antrasykliinejä ja niiden johdannaisia koskevan selostuksen.

Streptomyces galilaeusta koskeva selostus on julkaisuissa Arch, fiir Mikrobiol., 3_1_, 356 (1958) ja International Journal of Systematic Bacteriology, 2_2 , 298 ( 1972). Sivulla 22 viitataan K. Echardt'in et ai. selostukseen galirubiineista, ks. Chemical Abstracts 6_4 , 3896 ja £7^ 90573z.

FI-patenttijulkaisusta 54 496 tunnetaan Streptomyces galilaeus-kannan (ATCC 31133) käyttö antrasykliiniantibioottien aklasinomy-siini A:n ja B:n valmistamiseksi.

Rodirubiini A: 11a ja B:llä on todettu olevan sekä mikrobien vastaista että kasvaimia ehkäisevää aktiivisuutta. Tarkemmin sanottuna tämän keksinnön yhdisteillä on mikrobien vastaista aktiivisuutta gram-positiivisia bakteereja kohtaan, ne estävät pahanlaatuisten 5 5961 3 kasvaimien kiinteiden ja askiittisten muotojen kasvua nisäkkäillä, esim. hiiren leukemiaa L1210, ne ovat erittäin sytotoksisia ja täten ne estävät nisäkkään kasvainsolujen kasvua viljelmässä ja niiden yleinen myrkyllisyys nisäkkäillä on alhainen.

Termillä rodirubiini tarkoitetaan tässä antibioottia, johon sisältyy ainakin toista rodirubiini-komponenteista A ja B.

Rodirubiinia, joka kuuluu antrasykliiniantibiootteihin , saadaan käyttämällä erilaisia rodirubiinia tuottavia Streptomyces-kantoja, joihin kuuluu useita tunnettuja pyrromysiiniä, sinerubiinia, aklasinomysiiniä ja galirubiinia tuottavia kantoja kuten esim. Streptomyces galilaeus MA 144-M (ATCC 31133, FERM P-2455), Streptomyces galilaeus (ATCC 14969), Streptomyces cinereoruber (ATCC 19740), Streptomyces antibioticus (ATCC 8663), Streptomyces purpurascens (ATCC 24589) ja Streptomyces niveoruber (ATCC 14971).

Paras rodirubiinia tuottava Streptomyces-kanta eristettiin maaperänäytteestä, joka on otettu laitoksen Institute of Microbial Chemistry alueelta Osakissa, Shinagawa-kussa, Tokiossa, Japanissa, ja tämän kannan, jota nimitetään ME 505-HEI-kannaksi, viljelmiä on talletettu kokelmaan American Type Culture Collectionissa,

Rockvillessä, Marylandissa ja laitokseen nimeltä Fermentation Research Institute, Japani, ja lisätty niiden pysyviin mikro-orga-nismikokoelmiin ATCC 31273:na ja FERM P-3667:nä tässä järjestyksessä.

Streptomyces sp. ME 505-HEI:n ominaisuudet: 1. Morfologiset ominaisuudet

Mikroskooppitutkimuksessa voidaan havaita haarautuneesta substraattihuovastosta kohoavaa suhteellisen pitkää ja taipunutta ilmahuovastoa. Kypsä itiöketju sisältää yli 10 itiötä, jotka ovat kooltaan 0,6-0,8 x 0,1-1,2 /um ja pinnaltaan sileitä.

2. Ominaisuudet eri kasvualustoilla

Suluissa oleva merkintä viittaa standarditeokseen "Color Harmony Manual", julkaisija Container Corporation of America, U.S.A.

(1) Sakkaroosi-nitraatti-agar, inkubointi 27°C:ssa:

Kasvusto värittömästä vaalean punertavan purppuranväriseen (pesäkkeiden keskustat ovat vaalean punaisesta himmeän punertavan purppuraan (9ic-91C vadelmanpunainenj ilmahuovastoa on vähän tai ei lainkaan·, ei liukoista pigmenttiä.

Kun 15 vrk inkuboinnin jälkeen huovastosta korkkiporalla otetulle kappaleelle tiputetaan 1-n HC1, niin sen väri muuttuu punertavan purppurasta vaalean punertavaksi.

6 59613 (2) Glukoosi-asparagiini-agar, inkubointi 27°C:ssa:

Kasvusto värittömästä himmeän punaoranssiin (51c, kuparinväri) tai vaalean punertavan oranssiin (6ga, vaalea korallinpunainen): ei ilmahuovastoa; ei liukoista pigmenttiä.

(3) Glyseroli-asparagiini-agar (ISP väliaine n:o 5), inkubointi 2 7°C:ssa:

Kasvusto värittömästä vaalean punertavan oranssiin (51c, kuparinväri) tai kellertävän punaiseen (6ne, punapuu) tai purppuran-" punaiseen (9nc, vadelma)-, ei ilmahuovastoa tai paikoitellen ohut valkeasta punertavan valkeaan tai lievästi punertavaan oleva ilmahuovasto*, ei liukoista pigmenttiä. Kun 15 vrk inkuboinnin jälkeen huovastosta korkkiporalla otetulle kappaleelle tiputetaan 1-n HC1, niin sen väri muuttuu kellertävän punaisesta purppuranväriseksi.

(4) Tärkkelys-epäorgaaniset suolat-agar (ISP väliaine n:o 4), inkubointi 27°C:ssa: Värittömästä harmahtavan punaruskeaan (4ni, mausteenruskea -51g, kaakaonruskea): ohut, valkeasta vaalean punertavaan oleva ilmahuovasto: hieman ruskehtava liukoinen pigmentti.

(5) Tyrosiini-agar (ISP väliaine n:o 7), inkubointi 27°C:ssa:

Kasvusto värittömästä vaalean ruskeaan tai harmahtavan punaruskeaan; noin 15 vrk inkuboinnin jälkeen väri muuttuu vaalean kellertävän ruskeaksi (61c, koralli) tai himmeän punaiseksi (6ne, punapuu) tai tumman punertavan ruskeaksi (7pn, tumman punertavan ruskea - 7 1/2 pl, tumman kastanjanruskea); 21 vrk inkuboinnin jälkeen ilmahuovastoa ei ole tai saadaan hieman valkeata ilmahuovastoa; hieman punertavan ruskeata liukoista pigmenttiä.

(6) Ravinto-agar, inkubointi 27°C:ssa:

Kasvusto vaalean kellertävän ruskeasta vaalean ruskeaan; 15 vrk inkuboinnin jälkeen saadaan hieman tai ei lainkaan valkeata ilmahuovastoa; ruskea liukoinen pigmentti.

(7) Hiivauute-mallasuute-agar (ISP väliaine n:o 2), inkubointi 27°C:ssa:

Kasvusto värittömästä vaalean keltaiseen tai vaalean ruskeaan tai himmeän punaiseen tai tumman punertavan purppuraan (7 1/2 ng, vanha viini - 7 1/2 pg viini); 7 vrk virheettömän inkuboinnin jälkeen saadaan ohut valkea tai punertavan valkea ilmahuovasto; 10 vrk inkuboinnin jälkeen saadaan erittäin lievästi ruskehtavaa liukoista pigmenttiä.

7 5961 3 (8) Kaurajauho-agar (ISP väliaine n:o 3), inkubointi 2 7°C:ssa:

Kasvusto värittömästä vaalean ruskeaan tai himmeän punertavan oranssiin tai punertavan ruskeaan (6pi, ruskea mahonki); ei ilmahuovastoa aivan vähäisen himmeän oranssia liukoista pigmenttiä.

(9) Glyseroli-nitraatti-agar, inkubointi 27°C:ssa:

Kasvusto värittömästä vaalean punertavaan tai harmahtavan punaiseen tai himmeän punaiseen tai tumman punaiseen (8ne, ruusunpunainen viini) tai tumman punertavan purppuraan (9ne, vadelma -9pg, punainen luumu) tai tumman ruskehtavan purppuraan; valkeata ilmahuovastoa vähän tai ei lainkaan; kun 15 vrk inkuboinnin jälkeen huovastosta korkkiporalla otetulle kappaleelle tiputetaan tippa 1-n NaOH, niin tummanpunainen väri muuttuu purppuraksi; ei liukoista pigmenttiä.

(10) Tärkkelys-agar, inkubointi 27°C:ssa:

Kasvusto värittömästä vaalean punertavaan tai vaalean punertavan ruskeaan tai himmeän punertavan oranssiin tai himmeän punertavan purppuraan (8ne, ruusunpunainen viini); punertavan valkea ohut ilmahuovasto; ei liukoista pigmenttiä.

(11) Kalsiummalaatti-agar, inkubointi 27°C:ssa:

Kasvusto värittömästä vaalean punertavaan; ilmahuovastoa tuskin lainkaan tai ohut valkea ilmahuovasto; ei liukoista pigmenttiä.

(12) Selluloosa-agar, inkubointi 27°C:ssa:

Kasvusto värittömästä vaalean ruskeaan; ei ilmahuovastoa; ei liukoista pigmenttiä.

(13) Gelatiini-pistoviljelmä, inkubointi 20°C:ssa:

Kasvusto värittömästä vaalean kellertävän ruskeaan tai vaalean ruskeaan; ei ilmahuovastoa; ruskea liukoinen pigmentti.

Glukoosi-peptoni-gelatiini-pistoviljelmä, inkubointi 27°C:ssa: Kasvusto värittömästä vaalean kellertävän ruskeaan tai vaalean ruskeaan; ei ilmahuovastoa; tumman ruskea liukoinen pigme£tti.

(14) Rasvaton maito, inkubointi 30°C:ssa:

Kasvusto värittömästä vaalean kellertävän ruskeaan tai kellertävän ruskeaan; ilmahuovastoa tuskin lainkaan tai ohut ruskehtavan valkea ilmahuovasto; ruskea liukoinen pigmentti.

3. Fysiologiset ominaisuudet (1) Kasvulämpötila:

Optimikasvulämpötila tärkkelys-hiivauute-agarilla (liu- 8 5961 3 koista tärkkelystä 1,0 %, hiivauutetta (Daigosiyokagaku Co.) 0,2 %, agaria 3,4 %, pH 7,0-7,2) tutkittiin 20, 24, 27, 30, 37 ia 50°C:ssa. Kasvua havaittiin kaikissa muissa lämpötiloissa paitsi 37 ja 50°C:ssa. Optimilämpötila näytti ölevan noin 27°C.

(2) Gelatiinin nesteytyminen (15-%:isella gelatiinilla inkubointi 20°C:ssa ja peptoni-gelatiinilla inkubointi 27°C:ssa): Gelatiiniväliaineen nesteytyminen alkaa kohtuullisesti noin 3 vrk inkuboinnin jälkeen. Glukoosi-peptoni-gelatiinin nesteytyminen alkaa kohtuullisesti tai vahvasti noin 3 vrk inkuboinnin jälkeen.

(3) Tärkkelyksen hydrolyysi (tärkkelys-epäorgaaniset suolat-agar ja tärkkelys-agar, inkubointi 27°): 5 vrk inkuboinnin jälkeen havaitaan kohtuullinen tai vahva ^ hydrolysoituminen.

(4) Rasvattoman maidon koaguloituminen ja peptonisoituminen (rasvaton maito, inkubointi 30°C:ssa):

Ei havaita muutosta ennen kuin vasta 7 vrk inkuboinnin jälkeen. Koaguloituminen on täydellinen 10 vrk inkuboinnin jälkeen ja peptonisoituminen alkaa tällöin ja on täydellinen 3 viikon inkuboinnin jälkeen. Vaikutus on kohtuullinen tai vahva.

(5) Melanoidi-pigmentin muodostus (tryptoni-hiivauuteliemi, ISP väliaine n:o 1¾ peptoni-hiivauute-rautaCII)-agar, ISP väliaine n:o 6; tyrosiini-agar, ISP väliaine n:o 7, inkubointi 27°C:ssa):

Melanoidi-pigmenttiä muodostuu peptoni-hiivauute-rautaCII)-agarilla ja tyrosiini-agarilla, muttei muodostu tryptoni-hiivauute-liemessä).

(6) Hiilihydraattien hyväksikäyttö (inkubointi 27°C:ssa, Pridham-Gottlieb-perusagarilla, ISP väliaine n:o 9): ME 505-HEI pystyy käyttämään hyväkseen hyvin L-arabinoosia, D-ksyloosia, D-glukoosia, D-fruktoosia, inositolia, L-ramnoosia, raffinoosia ja D-mannitolia, muttei käytä hyväkseen sakkaroosia.

(7) Kalsiummalaatin nesteytyminen (inkubointi 27°C:ssa kalsiummalaattiagarilla):

Kalsiummalaatti alkaa nesteytyä kasvuston ympärillä 5 vrk inkuboinnin jälkeen kohtuullisesti tai vahvasti.

(8) Nitraatin pelkistys (inkubointi 27°C:ssa peptoni-vedessä, joka sisältää 1,0 % kaliumnitraattia, ISP väliaine n:o 8):

Negatiivinen tulos.

Yhteenvetona edellisestä: kanta ME 505-HEI kuuluu sukuun Streptomyces; ilmahuovasto ei muodosta avoimia spiraaleja tai kier- 9 5961 3 teitä, ja itiön pinta on sileä. Eri väliaineilla kasvusto on vaalean ruskeasta himmeän punertavan oranssiin tai himmeän punertavan purppuraan tai tumman punertavan purppuraan. Ilmahuovasto puuttuu tai on ohutta, väriltään valkeasta punertavan valkeaan tai hieman punertavaan. Liukoista pigmenttiä esiintyy tuskin millään kasvualustalla. Joillakin kasvualustoilla muodostuu hieman ruskehtavaa tai punertavan ruskeata liukoista pigmenttiä. Lisäksi pesäkkeen alapuolen väri on tyypillisesti viininpunainen ja sillä on pH-indikaat-toriominaisuudet. Melanoidipigmenttiä muodostuu peptoni-hiivauute-rauta(II)-agarilla ja tyrosiiniagarilla, muttei tryptoni-hiivauute-liemessä. Proteiinin ja tärkkelyksen hydrolyysi on kohtuullisesta vahvaan. Lisäksi kannan tyypillinen ominaisuus on, ettei kasvua tapahdu 37°C:ssa. Vertaamalla tunnettujen kantojen ominaisuuksia edellä lueteltuihin näyttää Streptomyces capoamus muistuttavan eniten kantaa ME 505-HEI (viite: Journal of Systematic Bacteriology, voi, 22, 282, 1972. Seuraavassa taulukossa on esitetty kannan ME 505-HEI ja Streptomyces capoamus standardikannan vertailu.

ME 505-HEI Streptomyces capoamus ISP '5494

Ilmahuovaston muoto Taipunut Päätespiraaleja (Retinaculia perte)

Itiön pinta sileä sileä

Ilmahuovaston väri ruskehtavan ruskehtavan valkeasta valkeasta vaalean punaiseen tai punertavan vaalean harmaaseen valkoiseen tai punertavan purppuraan

Kasvuston väri himmeän punerr himmeän punertavan tavan purppu- oranssista punertavan rasta tumman ruskeaan tai tumman punertavan punertavan purppuraan purppuraan

Liukoinen pigmentti ruskehtava tai ruskehtava tai vaalean punertavan punertavan oranssi ruskea 10 5961 3

Melanoidipigmentin muodostus ME 505-HEI Streptomyces capoamus ISP 5494 ISP väliaine n:o 1 - (+) ISP väliaine n:o 6 ++ ISP väliaine n:o 7 ++ Tärkkelyksen hydrolysoituminen + +

Maidon koaguloituminen +

Maidon peptonisoituminen + +

Gelatiinin nesteytyminen gelatiini pistoviljelmä + + glukoosi-peptoni-gelatiini pistoviljelmä +

Nitraatin pelkistyminen

Hiilihydraattien hyväksikäyttö D-glukoosi + + L-arabinoosi + + D-ksyloosi + + D-fruktoosi + +

Sakkaroosi

Inositoli + L-ramnoosi +

Raffinoosi + + D-mannitoli + + (+):mahdollisesti +, _+:heikosti positiivinen, +:lähes negatiivinen

Kuten taulukosta ilmenee eroavuudet kantojen ME 505-HEI ja Streptomyces capoamus välillä ovat lähinnä ilmahuovaston muodossa; Streptomyces capoamus muodostaa spiraaleja ilmahuovaston päätteisiin, kun sensijaan kannan ME 505-HEI ilmahuovasto on vähäistä eikä suoritettujen tutkimusten mukaan sisällä spiraaleja. Eroavuutta on edelleen melanoidipigmentin muodostuksessa ISP väliaineessa n:o 1, maidon koaguloitumisessa, gelatiinin nesteytyksessä sekä inositolin ja L-ramnoosin hyväksikäytössä. Muut ominaisuudet ovat suhteellisen hyvin yhtäpitävät.

Phodirubiinin valmistus suoritetaan viljelemällä rhodirubiinia tuottavaa Streptomyces-kantaa tavanomaisessa ravintoliuoksessa, joka 11 5961 3 sisältää tunnettuja Aktinomycetes-lajien viljelyssä käytettyjä ravinteita, ts, hiilen ja typen assimiloituvia lähteitä sekä valinnaisia epäorgaanisia suoloja ja muita tunnettuja kasvutekijöitä. Suuria antibioottimääriä tuotetaan edullisesti viljelemällä submersisti aerobisesti. Elatusaine sisältää mieluiten kaupasta saatavia valmisteita kuten glukoosia, glyserolia, tärkkelystä, dekstriiniä, ruokosokeria, maltoosia hiililähteenä sekä muita assimiloituvia hiilihydraatteja, alkoholeja, orgaanisia happoja, öljyjä ja rasvoja joko puhdistettuina tai raakoina. Typen lähteenä käytetään esim. soijajauhoa, puuvillansiemenjauhoa, lihauutetta, peptonia, kuivattua hiivaa, hiivauutetta, maissinliotusjätettä ja muita vastaavia orgaanisia typen lähteitä ja epäorgaanisia suoloja kuten (NH^^SO^,

NaNOg, NH^Cl ja vastaavia epäorgaanisia typen lähteitä. Voidaan myös lisätä epäorgaanisia suoloja, kuten klorideja (NaCl tai KC1) tai fosfaatteja, hivenmetalleja (esim. sinkki, magnesium, mangaani, koboltti tai rauta) tai vaahdonpoistoaineita, kuten Adekanolia^ (Asahi Denka Ind. Corn tavaramerkki), silikonia Shinetsu Chem.

Ind. Corn tavaramerkki), parafiiniöljyä, soijapapuöljyä. Viljely-lämpötilan pitää olla noin 20°C - 37°C, mieluiten 25°C- 30°C. Viljelmän pH on normaalisti noin 5-8 välillä. Rodirubiinin tuotanto kasvuliemessä kestää tavallisesti enintään noin 3-7 päivää istuttamisen jälkeen.

Rodirubiini-yhdisteet voidaan eristää kasvuliemestä ja puhdistaa tunnetuin menetelmin esim. uuttamalla, saostamalla, konsentroimalla, geelisuodattamalla, käyttämällä vastavirtajakautumista, kela-toimalla metalli-ionien kanssa, adsorboimalla ioninvaihtohartsille, silikageelille tai synteettiselle adsorbentille ja eluoimalla frak-tioivasti, tai käyttämällä edellä esitettyjen menetelmien yhdistelmiä.

Edullisessa menetelmässä rodirubiini Arta ja Brtä saadaan viljelmästä uuttamalla. Rodirubiini-antibiootteja on sekä huovastossa että kasvuliemessä, pääasiassa huovastossa. Edullisesti huovastot ensin erotetaan kasvuliemen suodoksesta tavanomaisella tavalla, kuten suodattamalla tai sentrifugoimalla, vaikkakin antibiootit voidaan myös uuttaa suoraan kasvuliemestä. Rodirubiini A ja B voidaan uuttaa suodoksesta neutraalissa tai heikosti happamassa pHrssa (esim. pH 7-9) veteen sekoittumattomalla orgaanisella liuottimena, kuten etyyliasetaatilla, butyyliasetaatilla, kloroformilla tai υ 59613 n-butanolilla. Huovastossa olevat Rodirubiini A ja B voidaan uuttaa orgaanisella liuottimena, kuten kloroformilla, etyyliasetaatilla, n-butanolilla, metanolilla, asetonilla tai metyylietyyliketonilla tai orgaanisen tai epäorgaanisen hapon vesiliuoksella, kuten kloori-vetyhapolla tai etikkahapolla. Aktiiviset rodirubiini uutteet konsentroidaan sen jälkeen ja kuivataan vakuumissa, jolloin saadaan raakatuotteena punertavaa tai punertavan purppuraa jauhetta, joka on rodirubiini A:n ja B:n seosta.

Rodirubiini A ja B-komponenttien erottamiseksi raakaseoksesta käytetään lisäpuhdistus- ja erottamismenetelmiä kuten pylväskroma-tografiaa, jossa käytetään adsorboivina aineina silikageelia, modifioituja dekstraaneja (esim. Sephadex LH-20, Pharmacia Fine Chemicals'n tavaramerkki, Ruotsi), heikosti happamia ioninvaihto-hartseja, aktiivihiiltä tai alumiinioksidia, vastavirta]akautumista tai nestekromatografiaa sopivin orgaanisin liuottimin. Esimerkkinä sopivasta erotusmenetelmästä: raaka rodirubiinijauhe (A ja B komponenttien seos) voidaan liuottaa tolueeni-metanoliin, kromatografoida silikageelikolonnissa eluoimalla sopivalla orgaanisella liuottimella kuten tolueeni-metanolilla, jolloin saadaan erikseen rodirubiini A ja B komponentit. Aktiiviset eluaatit, jotka sisältävät rodirubiini A:ta ja B:tä, konsentroidaan alennetussa paineessa, ja komponentit puhdistetaan edelleen kromatografisesti Sephadex LH-30:llä.

Puhdistetut rodirubiini A ja B voidaan myös muuttaa happoaddi-tiosuoloiksi.

Rodirubiini A:n ja B:n fysikokemialliset ominaisuudet ovat seuraavat:

Rodirubiini A:

Punainen jauhe, jonka sulamispiste on 141-143°C.

Alkuaineanalyysi antaa seuraavat arvot:

Saatu: Laskettu kaavasta Ch0HCCN0._ 42 55 1b C = 60,39 % C = 60,77 % H = 6,63 % H = 6,68 % 0 = 30,72 % 0 = 30,81 % N = 1 ,71 % N = 1,69 %

Molekyylipaino: 829,9 - 20

Ominaiskiertokyky: Lt+ 120 (C = 0,1, CHCl^) 13 5961 3

Liukoisuus :

Rodirubiini A liukenee metanoliin, n-butanoliin, asetoniin» etyyliasetaattiin, kloroformiin, tolueeniin, bentseeniin ja dimetyy lisulfoksidiin, on liukenematon veteen, n-heksaaniin ja petroli-eetteriin ja liukenee heikosti dietyylieetteriin.

Väri ja reaktio:

Rodirubiini A:n metanoliuos on punainen, mutta muuttuu punertavan purppuraksi alkalisessa liuoksessa. Se antaa negatiivisen ninhydriinireaktion eikä pelkistä Fehlingin liuosta.

Absorptiospektri:

Ultravioletti- ja näkyvän alueen absorptiomaksimit nähdään aallonpituudella 235 nm.

e! % = 507; 258 nm, e! * = 267; 295 nm, 1 cm ’ ’ 1 cm ’ * e] %„ = 100; 457 nm, e\ * = 127; 490 nm, 1 cm ’1 cm ’ ’ e] % = 153; 510 nm, eJ * = 117; 522 nm, 1 cm 1 cm 1 ^ E1 cm = 100 (metanolissa konsentraatiolla 15 mcg/ml).

Absorptiospektri:

Infrapuna IR-spektri KBrissa osoittaa huiput seuraavilla aallonpituuksilla -1 cm : 3430, 2950, 2930, 2810, 2750, 1735 1640, 1600, 1450, 1320, 1300, 1220, 1160 1120, 1040, 1000, 970, 960, 920, 800 ja 760.

NMR:

Rodirubiini A:n PMR-spektri CDCl^ssa (100 MHz) osoittaa seuraavat kemialliset siirtymät (ppm): 7,6 s; 7,24, s; 5,50 m; 5,62, m; 5,02, m; 4,84, m; 4,52, q; 4,7^~>»/ 3,90, peittymä m; 3,72, s; 360 0,09, peittymä m ja 2,18.

Rodirubiini B:

Punainen jauhe, jonka sulamispiste on 135-137°C Alkuaineanalyysi antaa seuraavat arvot: 14 5961 3

Saatu: Laskettu kaavasta 0 = 61,23% C = 61 ,99 % H = 6,80 % H = 6,77 % 0 = 28,77 % 0 = 29,52 % N = 1 ,94 % N = 1,72 %

Molekyylipaino: = 813,9

Ominaiskiertokyky: = + 190 (C = 0,1, CHClg)

Liukoisuus:

Rodirubiini B liukenee metanoliin, n-butanoliin, asetoniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin, tolueeniin, bentseeniin ja dime-tyylisulfoksidiin, on liukenematon veteen, petrolieetteriin ja n-heksaaniin ja liukenee heikosti dietyylieetteriin.

Väri ja reaktio:

Rodirubiini B:n metanoli-liuos on punainen, mutta muuttuu punertavan purppuraksi alkaalisessa liuoksessa. Se antaa negatiivisen ninhydriinireaktion eikä pelkistä Fehlingin liuosta. Absorptiospektri:

Ultravioletti- ja näkyvän alueen absorptiomaksimit nähdään aallonpituudella 235 nm, e] % = 593; 257 nm, * = 307; 295 nm, 1 cm 1 cm e\ % = 113, 457 nm, % = 153; 490 nm, 1 cm 1 cm e] % = 187; 510 nm, e] % = 147; 522 nm, 1 cm * ’ 1 cm * ’ e] % = 120 1 cm

Absorptiospektri: Infrapuna IR-spektri KBr:ssa osoittaa huiput seuraavilla aallon--1 pituuksilla cm : 3470, 2960, 2940, 2820, 2790, 1740, 1640, 1600, 1450, 1300, 1220, 1160, 1120, 1040, 1000, 980, 960, 920, 800, 790 ja 760.

NMR:

Rodirubiini B:n PMR spektri CDCl^issa (100 MHz) osoittaa seuraavat kemialliset siirtymät (ppm): 15 5961 3 7,6, s; 7,24, s; 5,50, m; 5,02, m; 4,52, q;4 ,7,-^ 3,90 , peittymä m; 3,72, s; 3,6^^0,09, peittymä m ja 2,18, s.

Rodirubiini A:11a ja B:llä on seuraavat R^-arvot silikageeli-ohutlevykromatogrammeissa, kun käytetään seuraavia liuotinsysteemejä:

Rj.-arvot

Liuotinsysteemi Rodirubiini A Rodirubiini B

Etyyliasetaatti:bentseeni: metanoli (5:5:1) (til./til.) 0,37 0,42

Kloroformi:metanoli (10:1) (til./til.) 0,19 0,28

Kloroformi:metanoli (10:1) (til./til.) 0,17 0,20

Rodirubiini A:n ja B:n rakenteet määritettiin seuraavasti: Rodirubiini A:n ja B:n aglykoneja saatiin hydrolysoimalla laimealla kloorivetyhapolla (0,1 N) 85°C:ssa 30 minuuttia. Saatujen aglyko-nien fysikokemialliset ominaisuudet esim. IR, UV, NMR, sulamispiste ja ohutlevykromatografiän R^-arvot vastaavat täysin kirjallisuudessa esitettyjä ^'Chem. Ber. , 92 , 1904 (1959)7 £ -pyrromysinonin ominaisuuksia.

Rodirubiini A- ja B-hydrolyysituötteiden vesiliuoksen neutraloinnin ja konsentroinnin jälkeen sokeriryhmiä kehitettiin ja erotettiin ohutlevykromatografisesti (silica gel TLC, Merck liuottimet: butanoli:etikkahappo:vesi = 4:1:1) (til./til.) rodirubiini A:sta saatiin 3 sokeriryhmää (R^ = 0,15:0,53:0,67) ja rodirubiini B:stä 2 sokeriryhmää (R^ = 0,14; 0,67). Verrattaessa näitä sokereihin, joita saatiin aklasinomysiinistä {j. Antibiotics, 28 , 830-834 (1975)7 ja streptolyditsiinistä /j. Am. Chem. Soc., 86, 3592-3594 (1964)7, erilaisiin värireaktioihin Z^harmazie, 27 H12, 782-789 (1972)7, ominaiskiertokykyihin ja NMR:ään, sokereiden, joiden R^ = 0,14, 0,53 ja 0,67, tunnistettiin olevan rodosamiini, 2-deoksi-fukoosi ja rodinoosi, tässä järjestyksessä.

Rodirubiini A:n ja B:n metanolyysi antoi pyrromysiiniä (rodosaminyyli € -pyrromysinoni). Edelleen mieto hydrolyysi (0,5 % HC1, 20°C, 10 min:) (ks. Naturwiss, 50, 43-44 (1963)) vapautti rodinoosia rodirubiini A:sta ja B:stä.

Edellä esitettyjen tulosten mukaan rodihubiini A:n ja B:n rakenteet tässä keksinnössä määriteltiin seuraaviksi: 16 5961 3 OH 0 GOOCH,

^ i T^T--0H

R

jossa R on

rodirubiini A rodirubiini B

R on R on id fr n ° N~CH„ 0 N-CH- j °\ * 3 f) “· föl - I ' o f) f) ' HO [ 17 5961 3

Kirjallisuudessa esitetyistä antrasykliiniantibiooteista sinerubiinin, aklasinomysiinin, violamysiinin ja rodomysiinin tiedetään sisältävän aglykonin ja 3 sokeriryhmää. Niiden koostumukset on esitetty seuraavassa:

Antibiootti Aglykoni Sokerin ja Ensimmäinen Toinen Kolmas aglykonin sokeri sokeri sokeri sitoutumis- paikka

Sinerubiini A £-pyrromysi- 7 Rodosamii- 2-deok- Sineroni ni sifu- ruloo- koosi si

Aklasinomy- aklavinoni 7 " " "

siini A

Violamysiini Erilaisia ei tiedetä " " rodonoosi rodomysi- noneja

Rodomysiini X -rodomysinoni 9- tai 10- n " M

-rodomysinoni 10-deoksi-r-rodomysinoni

Rodirubiini-antibiootit ovat helposti erotettavissa edellä mainituista antrasykliineistä.

Rodirubiini A:11a ja B:llä on mikrobien vastaista aktiivisuutta erilaisia mikro-organismeja kohtaan. Rodirubiini A:n ja B:n minimi-estokonsentraatio (MIC) määritettynä kasvuliemilaimennusmenetelmällä on esitetty seuraavassa taulukossa:

Rodirubiini A:n ja B:n minimiestokonsentraatio MIC (mcg/ml)

Testattu mikro-organismi rodirubiini A rodirubiini B

Staph, aureus FDA 209P 1,56 1,56

Staph, aureus Smith 0,4 0,78 B. subtilis ATCC 6633 0,78 1,56 B. cereus ATCC 9634 0,2 0,4 B. megaterium NRRL-938 0,78 1,56

Sareina lutea ATCC 9341 0,4 0,78

Micrococcus flavus 0,2 0,2

Coryne. bovis 0,2 0,4 is 5961 3 MIC (mcg/ml

Testattu mikro-organismi rodirubiini A rodirubiini B

Ps. fluorescens NIHJB-254 100 100

Proteus morganii >100 >100

Mycobacterium smegmatis ATCC 607 6,25 3,1

Candida albicans IAM 4905 >100 >100

Candida tropicalis IAM 4942 >100 >100

Kuten edellä on esitetty, rodirubiini A:11a ja B:llä on mikrobien vastaista aktiivisuutta, varsinkin gram-positiivisia bakteereja kohtaan, ja täten ne ovat terapeuttisesti käyttökelpoisia eläinten ja ihmisten hoidossa sellaisten mikro-organismien aiheuttamissa infektiosairauksissa.

Rodirubiini A ja B osoittavat huomattavaa kasvainten vastaista aktiivisuutta ja alhaista toksisuutta koe-eläintesteissä ja täten ne ovat terapeuttisesti käyttökelpoisia estettäessä kasvainten kasvua nisäkkäillä. Rodirubiini A ja B osoittavat huomattavaa estovaikutusta erityisesti hiiren L1210 leukemiaan. Esim. CDF1 6 hiiriin istutettiin intraperitoneaälisesti 1 x 10 L1210 solua/ hiiri ja senjälkeen annettiin 0,1-0,2 ml lääkeaineliuosta intraperi-toneaalisesti 10:nä seuraavana päivänä. Tarkkailua suoritettiin 30 päivää, ja eloonjäämisajan pidentymisprosentti kontrollihiiriin nähden, joille oli annettu intraperitoneaalisesti fysiologista suolaliuosta, oli seuraava:

Eloonjäämisajan pidentyminen T/C (%)

Annos rodirubiini A rodirubiini B

(mg/kg/vrk) (HCl-suola) (HCl-suola) 10 87 104 8.5 121 160 5 195 179 2.5 167 215 1,25 117 126 0,6 102 107

Rodirubiini A:n ja B:n akuutti toksisuus (LD5q) hiirillä (intraperitoneaalinen injektio) on seuraava: 19 5961 3 LD50 (mg/kg) rodirubiini A 7,5-10 rodirubiini B 10 -12,5

Rodirubiini A ja B muodostavat myrkyttömiä happoadditiosuoloja monenlaisten orgaanisten ja epäorgaanisten suoloja muodostavien rea-genssien kanssa. Farmaseuttisesti hyväksyttävien happojen, suoloja kuten rikki-, fosfori-, kloorivety-, etikka-, propioni-, oleiini-, palmitiini-, sitruuna-, meripihka- ja viinihapon suoloja voidaan käyttää samalla tavalla kuin rodirubiini-yhdisteitä. Suoloja muodostetaan, eristetään ja puhdistetaan menetelmillä, joita yleensä käytetään antibioottien suolan muodostuksessa. Tämän keksinnön tarkoituksiin rodirubiini-yhdisteet vapaana emäksenä vastaavat niiden myrkyttömiä happamia suoloja.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Esimerkki 1

Valmistettiin seuraavan koostumuksen omaava ravintoliuos:

Perunatärkkelys 1 % (paino/til.-% )

Glukoosi 1 % "Prorich” (soijapapujauhe, 1,5 %

Ajinomoto Co.) k2hpo4 0,1 %

MgS04.7H20 0,1 %

NaCl 0,3 %

Mineraaliaineita 0,125 % (pH 7,4)

Mineraaliaineseoksen koostumus oli seuraava:

CuS04.5H20 2,8 g

FeS04.7H20 0,4 g

MnCl2.4H20 3,2 g

ZnS04.7H20 0,8 g 500 ml:ssa vettä.

50 ml tätä liuosta steriloitiin 500 ml:n pullossa, siihen siirrostettiin silmukalla Streptomyces galilaeusta (ATCC 31133) agarvinoviljelmästä ja inkuboitiin 28°C:ssa 48 tuntia kiertoravisti-messa (230 kierr/min.) ymppiviljelmän saamiseksi.

Sen jälkeen valmistettiin seuraava elatusaine:

Perunatärkkelys 2 % (paino/til.-%)

Glukoosi 2 % 20 5 9 6 1 3 "Nisshin toast" (murskattua soijapapua, Nishin Soiya

Company ) 2 %

Hiivauute 0,5 %

NaCl 0,25 %

CaC03 0,3 %

Mineraaliaineita 0,125 % (pH 7,4)

Mineraaliaineseoksen koostumus oli seuraava:

CuS04.5H20 1 ,25 g

MnCl2.4H20 1 ,25 g

ZnSO^.7H20 1 ,25 g 500 ml:ssa vettä.

2 ml ymppiviljelmää siirrostettiin sen jälkeen 100 ml:aan aikaisemmin steriloitua, edellä esitettyä elatusainetta 500 ml pullossa. Fermentointi suoritettiin 28°C:ssa kiertoravistimessa (230 kierr./min.) ja rodirubiinin saanto oli maksimissa 4 päivän kuluttua. Kasvuliemi suodatettiin huovastokakun ja suodoksen erottamiseksi. Puoli tilavuusosaa kloroformia lisättiin suodokseen ja uuttaminen suoritettiin kahdesti. Asetonia lisättiin huovastokak-kuun (2 litraa asetonia/1 kg märkää kakkua) ja uuttaminen suoritettiin kahdesti, minkä jälkeen asetoni poistettiin haihduttamalla alennetussa paineessa. Puoli tilavuusosaa kloroformia lisättiin jäännökseen ja uuttaminen suoritettiin kahdesti. Saadut klorofor-miuutteet yhdistettiin suodoksesta saatujen kloroformiuutteiden kanssa ja konsentroitiin alennetussa paineessa tervan kaltaisen aineen saamiseksi. Mainittu aine liuotettiin pieneen määrään etyyliasetaattia ja kun tätä liuosta tiputettiin 10 tilavuusosaan n-heksaania, muodostui saostuma (saatiin 4,5 g punaista raakajauhetta). Tämä raakajauhe liuotettiin 30 ml:aan tolueenin ja metanolin seosta (50:1) (til./til.), liuos vietiin pylvääseen (3 x 50 cm), joka oli täytetty samalla seoksella tasapainotetulla silikageelillä (100 g), ja sen jälkeen rodirubiini A ja B eluoitiin tolueeni-metanoli seoksella (50:1). Kumpikin eluaatti kuivattiin alennetussa paineessa. Saatiin 27 mg raakaa rodirubiini A:ta ja 60 mg raakaa rodirubiini B:tä.

Esimerkki 2

Esimerkissä 1 saatu raaka rodirubiini A (27 mg) ohutlevy-kromatografoitiin (Merck ^254’ liuotinseos:kloroformi:metanoli 10:1) epäpuhtauksien poistamiseksi, joihin kuului myös rodirubiini B. Aktiivinen fraktio kromatografoitiin liuotettuna 2 ml:aan 21 5961 3 metanolia Sephadex LH-20 (verkkoutettu dekstraani, Pharmacia) pylväässä (1 x 70 cm). Näin saatu eluaatti konsentroitiin ja saostettiin n-heksaanilla, jolloin saatiin 16,5 mg puhdistettua punaista rodirubiini A-jauhetta. 10 mg tätä punaista jauhetta liuotettiin seokseen, joka sisälsi 200 /ui kuivaa asetonia ja 70 /ui kuivaa metanolia, ja liuokseen lisättiin 10/ui 3N HCl-metanoliliuosta.

1 minuutin sekoittamisen jälkeen muodostui saostuma, kun lisättiin 10 tilavuusosaa dietyylieetteriä. Saostuma kerättiin suodattamalla ja kuivattiin, jolloin saatiin 7,2 mg rodirubiini A-HCl-suolaa.

Esimerkki 3

Rodirubiini B:n puhdistus esimerkissä 1 valmistetusta epäpuhtaasta rodirubiini B:stä (80 mg) suoritettiin samoin kuin esimerkissä 2 ohutlevykromatogafiällä (Merck F254’ liuotinseos: kloroformi: metanoli 10:1) ja sen jälkeen metanoliliuoksessa Sephadex LH-20 pylväässä. Saatu eluaatti konsentroitiin ja saostettiin n-heksaanilla, jolloin saatiin 63,4 mg punaista rodirubiini B-jauhetta. Saatu rodirubiini B muutettiin HCl-suolaksi esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.

Esimerkki 4

Streptomyces galilaeusta (ATCC 14969) viljeltiin esimerkissä 1 esitetyssä ravintoliuoksessa ymppiviljelmän saamiseksi, jota käytettiin esimerkissä 1 esitetyn elatusaineen ymppinä.

Rodirubiinikompleksi eristettiin viljelmästä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, jolloin saatiin 4,8 g raakatuotetta. Rodirubiini A ja rodirubiini B erotettiin raakaseoksesta esimerkissä 1 kuvatulla tavalla; saatiin 103 mg raakaa rodirubiini A:ta ja 42 mg raakaa rodirubiini B:tä.

Puhdistamalla esimerkkien 2 ja 3 mukaisesti saatiin 103 mg:sta raakaa rodirubiini A:ta 37 mg puhdistettua rodirubiini A:ta ja 42 mg:sta raakaa rodirubiini B:tä 21 mg puhdistettua rodirubiini B:tä.

Esimerkki 5

Streptomyces cinereoruberia (ATCC 19740) viljeltiin esimerkissä 1 esitetyssä ravintoliuoksessa ymppiviljelmän saamiseksi, jota käytettiin esimerkissä 1 esitetyn elatusaineen ymppinä.

Rodirubiinikompleksi eristettiin viljelmästä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, jolloin saatiin 3,3 g raakatuotetta. Rodirubiini A ja rodirubiini B erotettiin raakaseoksesta esimerkissä 1 kuvatulla tavalla; saatiin 60 mg raakaa rodirubiini A:ta ja 25 mg raakaa rodirubiini B:tä.

22 5961 3

Puhdistamalla esimerkkien 2 ja 3 mukaisesti saatiin 60 mg:sta raakaa rodirubiini A:ta 36,7 mg puhdistettua rodirubiini A:ta ja 25 mg:sta raakaa rodirubiini Brtä 11,4 mg puhdistettua rodirubiini Brtä.

Esimerkki 6

Streptomyces purpurascensia (ATCC 25489) viljeltiin esimerkissä 1 esitetyssä ravintoliuoksessa ymppiviljelmän saamiseksi, jota käytettiin esimerkissä 1 esitetyn elatusaineen ymppinä.

Rodirubiinikompleksi eristettiin viljelmästä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, jolloin saatiin 3,7 g raakatuotetta. Rodirubiini ' A ja rodirubiini B erotettiin raakaseoksesta esimerkissä 1 kuvatulla tavalla; saatiin 34 mg raakaa rodirubiini A:ta ja 21 mg raakaa rodirubiini B:tä.

Puhdistamalla esimerkkien 2 ja 3 mukaisesti saatiin 34 mg:sta rodirubiini A:ta 17,3 mg puhdistettua rodirubiini A:ta ja 21 mgrsta ' raakaa rodirubiini B:tä 13 mg puhdistettua rodirubiini B:tä.

Esimerkki 7

Streptomyces antibioticusta (ATCC 8663) viljeltiin esimerkissä 1 esitetyssä ravintoliuoksessa ymppiviljelmän saamiseksi, jota käytettiin esimerkissä 1 esitetyn elatusaineen ymppinä.

Rodirubiinikompleksi eristettiin viljelmästä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, jolloin saatiin 2,2 g raakatuotetta. Rodirubiini A ja rodirubiini B erotettiin raakaseoksesta esimerkissä 1 kuvatulla tavalla; saatiin 23 mg raakaa rodirubiini A:ta ja 19 mg raakaa rodirubiini B:tä.

Puhdistamalla esimerkkien 2 ja 3 mukaisesti saatiin 23 mgrsta raakaa rodirubiniini A.rta 11,5 mg puhdistettua rodirubiini A:ta ja 19 mgrsta raakaa rodirubiini Brtä 11,9 mg puhdistettua rodirubiini Brtä.

Esimerkki 8

Streptomyces sp. ME 505-HEI:tä (ATCC 31273) viljeltiin esimerkissä 1 esitetyssä ravintoliuoksessa ymppiviljelmän saamiseksi, jota käytettiin esimerkissä 1 esitetyn elatusaineen ymppinä.

Rodirubiinikompleksi eristettiin viljelmästä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, jolloin saatiin 6,4 g raakatuotetta. Rodirubiini A ja rodirubiini B erotettiin raakaseoksesta esimerkissä 1 kuvatulla tavalla; saatiin 84 mg raakaa rodirubiini A:ta ja 105 mg raakaa rodirubiini B:tä.

Puhdistamalla esimerkkien 2 ja 3 mukaisesti saatiin 84 mgrsta 2 3 5961 3 raakaa rodirubiini A:ta 32,5 mg puhdistettua rodirubiini A:ta ja 105 mg:sta raakaa rodirubiini B:tä 48 mg puhdistettua rodirubiini B: tä.

Esimerkkien 4-8 mukaisesti valmistetut rodirubiini A ja rodirubiini B muutettiin HCl-suoloikseen esimerkeissä 2 ja 3 kuvatulla tavalla.

Käytetyn ouhdistetun punaisen rodirubiini A- tai B-jauheen muuttaminen vastaaviksi HCl-suoloiksi tapahtui käyttämällä seuraa-vassa taulukossa esitettyjä ainemääriä.

Rodirubiini A-HCl-suola

Esimerkki 45 678 puhdistettua rodirubiini A:ta (mg) 30 30 17,3 11,5 30 kuivaa asetonia (/ui) 600 300 400 200 600 kuivaa metanolia (μΐ) 200 >00 140 70 200 3N HCl-metanoli liuosta (μΐ) 30 30 20 10 30 saanto (mg) 23 16 11 8 21

Rodirubiini B-HCl-suola

Esimerkki 45 6 7 8 puhdistettua rodirubiini B:tä (mg) 21 11,4 13 11,9 60 kuivaa asetonia

Qul) 400 >00 200 200 000 kuivaa metanolia (jul) 140 70 70 70 400 3N HCl-metanoli- liuosta (/ui) 20 10 10 10 50 saanto (mg) 14 5 7 10 48

Claims (1)

1. 24 5961 3 Patenttivaatimus : Menetelmä kasvaintenvastaisen rodirubiinikompleksin valmistamiseksi, jolla on kaava OH 0 COOCHg I OH I ΟΗ/ΟΜ|/ R ja sen komponentin A valmistamiseksi, jolla on kaava I, jossa R on vv> , „ N-CH„ Λγ ja sen komponentin B valmistamiseksi, jolla on kaava I, jossa R on 1— 0 0 N-CH ch3 ö HO^ ' 25 5961 3 ja näiden happoadditiosuolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että jotakin seuraavista rodirubiinia tuottavista Strepto-myces-kannoista Streptomyces sp. ME 505-HEI (ATCC 31273, FERM P-3667), Streptomyces galilaeus MA 144-M (ATCC 31133, FERM P-2455), Streptomyces galilaeus (ATCC 14969), Streptomyces cinereoruber (ATCC 19740), Streptomyces niveoruber (ATCC 14971), Streptomyces antibioticus (ATCC 8663) ja Streptomyces purpurascens (ATCC 25489), viljellään aerobisissa olosuhteissa hiilen ja typen lähteitä ja epäorgaanisia suoloja sisältävässä ravintoliemessä, kunnes organismi on tuottanut olennaisen määrän rodirubiinikompleksia, joka eristetään viljelyliemestä tavanomaisella tavalla, edullisesti uuttamalla veden kanssa sekoittamattomalla orgaanisella liuottimena tai kromatografoimalla, ja josta standarditekniikalla, kuten uuttamalla ja kromatografoimalla, erotetaan rodirubiini A ja rodi-rubiini B, jotka haluttaessa puhdistetaan ja muutetaan happoaddi-tiosuoloiksi. 26 5961 3 Förfarande för framställning av ett .fcumörförhindrande rhodirubin-komplex med formeln I OH 0 COOCHg I I I r oh OH 0 OH 0 R och dess komponent A med formeln I, väri R är (Öl N-CHr -0 0 ’ Λ \ c"3 \V •f T och dess komponent B med formeln I, väri R ät_n M y)-0 \° ',-CH3 V™3 J CH3 _0 0 H OS_/