DK146282B - Fremgangsmaade til fremstilling af anthracyclin-glycosid-antibiotika, kaldet rhodirubin a og b eller salte eller deoxyribonukleinsyrekomplekser deraf - Google Patents

Description

(Φ:

(19) DANMARK

|j| (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT (n) 146282 Β

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Patentansøgning nr.: 3646/77 (51) Int.CI.3: C12 P 19/56 (22) Indleveringsdag: 16 aug 1977 C 07 H 17/04 (41) Aim. tilgængelig: 17 feb 1978 (44) Fremlagt: 22 aug 1983 (86) International ansøgning nr.: -(30) Prioritet: 16aug1976JP51/98113 (71) Ansøger: 'ZAIDANHOJIN BISEIBUTSU KAGAKU KENKYUKAI; Tokyo, JP.

(72) Opfinder: Hamao ‘Umezawa; JP, Tomlo *Takeuchl; JP, Masa ‘Hamada; JP, Masaakl ‘Ishlzuka; JP,

Hiroshi ‘Naganawa; JP, Toshikazu *Oki; JP, Taiji Mnui; JP.

(74) Fuldmægtig: Th. Ostenfeld Patentbureau A/S

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af anthracyclin-glycosid-antibiotika, kaldet rhodirubin A og B eller salte eller deoxyribonuklelnsyrekomplekser deraf

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte anthracyclin-glycosid-antibio-tika, kaldet rhodirubin A og rhodirubin B med den almene formel COOCH, OH 0 I 3 N I i i i s,

£ OH

N . I

s Vytt OH 0 OH ‘ ' C 0

R

2 146282 hvori R betegner for rhodirubin A: for rhodirubin B:

tv V

Jv1 KH3 / k3}

Ho\|_^ H0\| i/ eller ikke-toksiske syreadditionssalte eller deoxyribo-nukleinsyrekomplekser deraf.

Det er kendt, at et antal anthracyclin-glycosid-antibio-tika dannes ved dyrkning af mikroorganismer. Blandt disse har f.eks. daunomycin og adriamycin klinisk anvendelse mod cancer hos mennesket.

Det har nu vist sig, at visse Streptomyces-stammer danner de hidtil ukendte anthracyclin-glycosid-antibiotika rhodirubin A og B, som besidder både antimikrobiel og antitumorvirkende aktivitet. Nærmere bestemt udviser de omhandlede forbindelser antimikrobiel aktivitet mod gram-positive bakterier, hæmmer væksten af faste og ascitiske former af ondartede tumorer i pattedyr, indbefattet mennesker (f.eks. museleukemia L 1210), besidder en høj cytotoksicitet og hæmmer således væksten af pattedyrs- og menneske-tumorceller i vækst og udviser lav toksicitet.

Udtrykket rhodirubin refererer her til et antibiotikum, som indeholder i det mindste ét antibiotikum i form af rhodirubin A eller B.

3 146282

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man dyrker en af stammerne Streptomyces sp. ME 505-HEI (ATCC 31273, FERM P-3667), Streptomyces galilaeus MA 144-M (ATCC 31133, FERM P-2455), Streptomyces galilaeus (ATCC 14969), Streptomyces cinereoruber (ATCC 19740), Streptomyces niveoruber (ATCC 14971), Streptomyces antibioticus (ATCC 8663) eller Streptomyces purpurascens (ATCC 25489) i et vandigt næringsmedium under submerse aerobe betingelser og udvinder rhodirubin A og B fra dyrkningsmediet, om ønsket i form af et ikke-toksisk syreadditionssalt eller DNA-kompleks deraf.

En foretrukken rhodirubin-producerende stamme af Streptomyces er blevet isoleret af opfinderne til den foreliggende opfindelse fra en jordprøve opsamlet i området omkring The Institute of Microbial Chemistry at Osaki, Shinagawa-ku,

Tokyo, Japan, og kulturer af denne stamme, betegnet stamme ME 505-HEI, er blevet deponeret i The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, og i The Fermentation Research Institute, Japan, og er blevet tilføjet deres permanente samlinger af mikroorganismer som henholdsvis ATCC 31273 og FERM P-3667.

I det følgende gives en morfologisk beskrivelse af Streptomyces Sp. ME 505-HEI: 1. Morfologiske egenskaber:

Under mikroskopet iagttoges forholdsvis lange og recti-flexibilis luftmycelier fra forgrenede substratmycelier. En moden sporekæde bestod af mere end 10 sporer, som måltes til 0,6-0,8 x 0,0-1,2 μ og dens overflade var glat.

2. Egenskaber på forskellige medier: (Beskrivelsen i parenteser følger den af Container

Corporation of America, USA, publicerede standard "Color Harmony Manual").

(1) På saccharose-nitrat-agar inkuberet ved 27°C; farveløs til lys rødlig purpur vækst (midten af kolonierne er lyserød til mørk rødlig purpur [9ic til 91c, Raspberry 4 146282

Rose]); intet eller ringe hvidt luftmycelium; intet opløseligt pigment. Når en dråbe IN HCl sattes til et stykke af myceliet udskåret ved hjælp af et korkbor efter 15 dages inkubation, skiftede vækstens rødlig purpur farve til bleg lyserød.

(2) På glukose-asparagin-agar inkuberet ved 27°C; farveløs til mørk rødlig orange [51c Copper] til lys rødlig orange [6ga, Lt Coral Rose] vækst; intet mycelium; intet opløseligt pigment.

(3) På glycerin-asparagin-agar (ISP-medium nr. 5) inkuberet ved 27°C; farveløs til lys rødlig orange [51c,

Copper] til gullig rød [6ne, Redwood] til purpur rød [9nc, Raspberry] vækst; intet luftmycelium eller delvist og tyndt hvidt til lyserødt hvidt til svagt lyserødt luftmycelium; intet opløseligt pigment. Når en dråbe af IN NaOH sattes til et lille stykke mycelium udskåret ved hjælp af et korkbor efter 15 dages inkubation, skifter den gullig røde farve af væksten til purpur farve.

(4) På stivelse-(uorganiske salte)-agar (ISP-medium nr.

4) inkuberet ved 27°C; farveløs til grålig rød brun [4ni,

Spice Brown til 51g, Cocoa Brown] vækst; hvidt til blegt lyserødt tyndt luftmycelium; brunligt opløseligt pigment.

(5) På tyrosin-agar (ISP-medium nr. 7) inkuberet ved 27°C; farveløs til lysebrun til gullig brun til grålig rødbrun vækst; fra omkring 15 dages inkubation skiftede farven til lys-gullig brun [61c, Coral] til mørkerød [6ne, Redwood] eller dyb mørk rødlig brun [7pn, Dk Rode Brown til 7¾ pi, Deep Marcon]; intet eller ringe hvidt luftmycelium iagttoges efter 21 dages inkubation; ringe rødligt brunt opløseligt pigment.

(6) På nærings-agar, inkuberet ved 27°C; bleg gullig brun til lysebrun vækst; intet eller ringe hvidt luftmycelium efter 15 dages inkubation; brunt opløseligt pigment.

(7) På gærekstrakt-maltekstrakt-agar (ISP-medium nr.

2), inkuberet ved 27°C; farveløs til lysegul til lysebrun til mørkerød til dyb mørk rødlig purpur [7¾ ng, Old Wine til 7¾ pg, Wine) vækst; tyndt hvidt til lyserødligt hvidt luftmycelium efter ca. 7 dages inkubation; meget svagt brunligt opløseligt pigment efter 10 dages inkubation.

5 146282 (8) På havregryn-agar (ISP-medium nr. 3) inkuberet ved 27°C; farveløs til lysebrun til mørk rødlig orange til rødlig brun [6pi, Brown Mahogany] vækst, intet luftmycelium; meget svagt mørkt orange opløseligt pigment.

(9) På glycerin-nitrat-agar inkuberet ved 27°C; farveløs til svag lyserød til grålig rød til mørkerød til dyb mørkerød [8ne, Rose Wine] til mørk rødlig purpur [9ne, Raspberry til 9pg, Red Plum] til mørk brunlig purpur vækst; intet eller svagt hvidt luftmycelium; når en dråbe af IN NaOH sattes til et lille stykke mycelium udskåret ved hjælp af et korkbor efter 15 dages inkubation, skifter den dyb mørkerøde farve af væksten til purpur; intet opløseligt pigment.

(10) På stivelse-agar inkuberet ved 27°C; farveløs til bleg lyserød til bleg rødlig brun til mørk rødlig orange eller mørk rødlig purpur [8ne, Rose Wine] vækst; lyserødligt hvidt tyndt luftmycelium; intet opløseligt pigment.

(11) På kalcium-malat-agar, inkuberet ved 27°C; farveløs til lyserød vækst; næsten intet luftmycelium eller tyndt hvidt luftmycelium; intet opløseligt pigment.

(12) På cellulose-agar, inkuberet ved 27°C; farveløs til lysebrun vækst; intet luftmycelium, intet opløseligt pigment.

(13) På gelatine-stik: På gelatine-stik, inkuberet ved 20°C; farveløs til bleg gullig brun til lysebrun vækst; intet luftmycelium; brunt opløseligt pigment.

På glukose-pepton-gelatine-stik, inkuberet ved 27°C; farveløs til bleg gullig brun til lysebrun vækst; intet luftmycelium; mørkebrunt opløseligt pigment.

(14) På skummet mælk, inkuberet ved 30°C; farveløs til bleg gullig brun til gullig brun vækst; næsten intet eller brunligt hvidt tyndt luftmycelium, brunt opløseligt pigment.

3. Fysiologiske egenskaber (1) Væksttemperaturområde:

Optimal temperatur for vækst på stivelse-gærekstrakt--agar (opløselig stivelse 1,0%; gærekstrakt (Daigoeiyokagaku 6 146282

Co.) 0,2%; agar 3,4%; pH 7,0-7,2) undersøgtes ved 20, 24, 27, 30, 37 og 50°C. Vækst iagttoges ved alle temperaturer med undtagelse af 37 og 50°C, og optimal temperatur var tilsyneladende omkring 27°C.

(1) Smeltning af gelatine (inkuberet ved 20°C på 15% gelatine og ved 27°C på peptongelatine). På gelatinemedium begyndte smeltning moderat efter omkring 3 dages inkubation.

På glukose-pepton-gelatinemedium begyndte smeltning moderat til stærk efter omkring 3-dages inkubation.

(3) Hydrolyse af stivelse (inkuberet ved 27°C på stivel-se-uorganiske-salte-agar og stivelse-agar): Moderat til stærk hydrolytisk aktivitet iagttoges efter 5 dages inkubation.

(4) Koagulation og peptonisering af skummet mælk, (inkuberet ved 30°C på skummet mælk): ingen forandring iagttoges indtil efter 7 dages inkubation, koagulation var komplet efter 10 dages inkubation og dernæst begyndte peptonisering og var komplet efter 3 ugers inkubation. Aktiviteten var moderat til stærk.

(5) Melanoid-pigment-dannelse. (inkuberet ved 27°C på trypton-gærekstrakt-næringsvæske, ISP-medium nr. 1; pepton--gærekstrakt-jern-agar, ISP-medium nr. 5; tyrosin-agar, ISP-medium nr. 7, inkuberet ved 27°C): Melanoid-pigment . iagttoges på pepton-gærekstrakt-jern-agar og tyrosin-agar og ikke på trypton-gærekstrakt-næringsvæske.

(6) Udnyttelse af carbonhydrater (inkuberet ved 27°C på Pridham-Gottlieb basal-agar, ISP-medium nr. 9): god vækst med L-arabinose, D-xylose, D-glukose, D-fruktose, inositol, L-rhamnose, raffinose og D-mannitol, men ingen vækst med saccharose.

(7) Smeltning af kalcium-malat. (inkuberet ved 27°C på kalcium-malat-agar): Smeltning af kalcium-malat omkring væksten begyndte efter 5-dages inkubation med moderat til stærk aktivitet.

(8) Reduktion af nitrat (inkuberet ved 27°C på pepton--vand indeholdende 1,0% kaliumnitrat, ISP-medium nr. 8): negativ.

7 146282 Når man sammenfatter det ovenfor anførte, hører stammen ME505-HEI til slægten Streptomyces; luftmycelium dannede ingen åbne spiraler eller hvirvler og sporeoverfladen er glat. Væksten på forskellige medier var lysebrun til mørk rødlig orange til mørk rødlig purpur til dyb mørk rødlig purpur, og der iagttoges intet luftmycelium eller tyndt hvidt til lyserødligt hvidt til svagt lyserødligt luftmycelium. Der iagttoges intet opløseligt pigment på så godt som alle medier, men der optrådte nogle tilfælde, hvor der produceredes svagt brunligt eller rødligt brunt opløseligt pigment. Ydermere viste den modsatte side af kolonien en karakteristisk vinrød farve med pH-indikator egenskab.

Produktion af melanoid-pigment var positiv på pepton-gærekstrakt- jern- agar- og tyrosin-agar-medier og negativ på trypton--gærekstrakt-næringsvæske. Hydrolytiske aktiviteter af protein og stivelse er begge moderate til stærke. Endvidere viste sig som et karakteristik træk for denne stamme ingen vækst ved 37°C. Ved at kontrollere kendte arter til sammenligning med de ovenfor anførte egenskaber, er Streptomyces capoamus tilsyneladende nært beslægtet med den foreliggende stamme. (Reference 1, Journal of Systematic Bacteriology, bind 22, 282, 1972). Når stammen ME505-HEI sammenlignedes med standard stammen af Streptomyces capoamus, opnåedes de i den følgende tabel sammenfattede resultater.

8 146282 ME505-HEI Streptomyces capoamus ISP 5494

Form af luftmycelium Rectiflexibilis Endespiraler (Retinaculia perte)

Sporeoverflade Glat Glat

Farve af luftmycelium Brunlig hvid til Brunlig hvid til lyserød hvid - lyserød - lysegrå lyserød

Farve af vækst Mørk rødlig purpur Mørk rødlig orange til dyb mørk til rødlig brun til rødlig purpur dyb mørk rødlig purpur

Opløseligt pigment Brunligt eller Brunligt eller lyst rødligt brunt rødligt orange

Dannelse af melanoid-pigment ISP-medium nr. 1 - (+) ISP-medium nr. 6 + + ISP-medium nr. 7 + +

Hydrolyse af stivelse + ±

Koagulation af mælk +

Peptonisering af mælk + +

Smeltning af gelatine:

Gelatinestik + “+

Glukose-pepton-gelatine-stik +

Reduktion af nitrat Udnyttelse af carbonhydrat: D-glukose + + L-arabinose + + D-xylose + + D-fruktose + +

Saccharose

Inositol + L-rhamnose +

Raffinose + + D-mannitol + + (+): sandsynligvis +, ±: svagt positiv, +: næsten negativ 9 146282

Som vist i tabellen, bestod forskellene mellem stammen ME505-HEI og Streptomyces capoamus hovedsagelig i formen af luftmycelium; Streptomyces capoamus danner spiraler ved luftmyceliernes ender, mens stammen ME505-HEI har svagt luftmycelium, og så vidt det blev undersøgt, iagttoges ingen spiraler. Dannelse af melanoid-pigment på ISP-medium nr. 1, koagulation af mælk, smeltning af gelatine og udnyttelse af inositol og L-rhamnose af de to stammer adskiller yderligere hver stamme, men andre egenskaber af begge stammer var i temmelig god overensstemmelse.

Fremstilling af de omhandlede forbindelser udføres ved dyrkning af en af ovennævnte rhodirubin-producerende stammer af Streptomyces i konventionelt vandigt næringsmedium indeholdende kendte næringskilder for actinomycetes, dvs. assimi-lerbare carbon- og nitrogen-kilder samt eventuelle uorganiske salte og andre kendte vækstfaktorer.

10 146282

Submers aerob dyrkning anvendes fortrinsvis med henblik på fremstilling af store mængder af de omhandlede antibiotika, men med henblik på fremstilling af begramsede mængder kan overfladedyrk-ninger og kolber også anvendes. Medier bestående af kendte typer næringskilder for actinomycetes er velegnede, og de sædvanlige til dyrkning af andre actinomycetes anvendte fremgangsmåder er anvendelige ved den omhandlede fremgangsmåde. Fortrinsvis indeholder mediet kommercielt tilgængelige produkter, såsom glucose, glycerol, stivelse, dextrin, saccharose, maltose eller lignende som carbon-kilde, idet andre carbonhydrater, alkoholer, organiske syrer, olier og fedtarter i enten renset eller rå tilstand også er anvendelige til dette formål, afhængig af stammens assimilerbarhed. Kommercielt tilgængelige produkter, såsom soyabønnemel, bomuldsfrømel, kødekstrakt, pepton, tørgær, gærekstrakt, majsstøbevand eller lignende, anvendes fortrinsvis som organiske nitrogenkilder og uorganiske salte, såsom (NH4)2S04, NaNO^, NH4C1 eller lignende, som uorganiske nitrogenkilder. Der kan også om nødvendigt tilsættes uorganiske salte, såsom chlorider (NaCl eller KC1) eller phosphater, spormetaller (f.eks. zink, magnesium, mangan, kobolt, jern eller lignende), eller skumdæmpningsmidler, såsom "Adekanol" (varemærke, som indehaves af Asahi Denka Ind. Co.), "Silicone" (varemærke, som indehaves af Shinetsu Chem. Ind. Co.), flydende paraffin, soyabønne-olie eller fedt. Dyrkningstemperaturen bør være i området fra ca.

20 til ca. 37 °C, fortrinsvis ca. 25 til ca. 30 °C. Dyrkningsmediets pH-værdi ligger normalt i området fra ca. 5 til ca. 8. Fremstilling af rhodirubin i dyrkningssubstratet når sædvanligvis et maksimum ca. 3 til 7 dage efter podning.

Forskellige kendte fremgangsmåder kan anvendes ved isoleringen og oprensningen af rhodirubin-forbindelserne fra fermenteringsmediet, f.eks. opløsningsmiddelekstraktion, opløsningsmiddeludfældning, koncentrering, gelfiltrering, modstrømsfordeling, chelatdannelse med metalioner, adsorption efterfulgt af eluering fra en ionbytter-harpiks, adsorberende silica-jordmateriale eller syntetisk adsorptionsmiddel, eller en kombination af en af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder med en eller flere af de øvrige.

Ved en foretrukket udvindingsfremgangsmåde udvindes rhodirubin A og B fra dyrkningsmediet ved opløsningsmiddelekstraktion. Rhodi-rubin-antibiotikaene findes intracellulært såvel som extracellulært, 11 U6282 men findes hovedsageligt i myceliet. Med fordel skilles mycelierne fra dyrkningssubstrat-filtratet på konventionel måde, såsom ved filtrering eller centrifugering, skønt antibiotikaene dog også kan ekstraheres direkte fra dyrkningssubstratet ved de nedenfor beskrevne fremgangsmåder uden fraskillelse af mycelierne. Rhodi-rubin A og B kan ekstraheres fra filtratet ved neutral eller svagt basisk pH-værdi (f.eks. pH-værdi 7-9) med et vand-ublandbart organisk opløsningsmiddel, såsom ethylscetat, butylacetat, chloroform, n-butanol etc. Rhodirubin A og B i mycelierne kan ekstraheres med et organisk opløsningsmiddel, såsom chloroform, ethylacetat, n-butanol, methanol, acetone eller methylethylketon, eller en vandig opløsning af en organisk eller uorganisk syre, såsom saltsyre eller eddikesyre. De aktive rhodirubin-ekstrakter koncentreres derefter og tørres i vakuum til opnåelse af et rødligt eller rødligt violet pulver, som er en blanding af rå rhodirubin A og B.

Med henblik på adskillelse af de enkelte rhodirubin A og B bestanddele fra den rå blanding kan anvendes yderligere oprensnings-og adskillelses-teknik, såsom søjlekromatografi med adsorptionsmidler som silicagel, modificerede dextraner (f.eks. "Sephadex LH-20", varemærke, som indehaves af Pharmacia Fine Chemicals,

Sweden), svagt sure ionbytter-harpikser, aktiveret carbon eller aluminiumoxid, modstrømsfordeling eller væskekromatografi med velegnede organiske opløsningsmidler. Som et eksempel på en velegnet adskillelsesfremgangsmåde kan rå rhodirubin-pulver (blanding af A og B bestanddele) opløses i toluen-methanol, udsættes for søjlekromatografi over silicagel og elueres med et passende organisk opløsningsmiddel, såsom toluen-methanol, til dannelse af de enkelte rhodirubin A og B bestanddele. De aktive eluater indeholdende rhodirubin A og B koncentreres under formindsket tryk, og de enkelte bestanddele renses derefter yderligere ved kromatografi over "Sephadex LH-20".

Opløsninger af renset rhodirubin A og B kan også lyofiliseres efter tilsætning af et eller flere stoffer i form af deoxyribonu-cleinsyre, glycerol, sukkerarter, aminosyrer eller organiske eller uorganiske syrer.

De physicokemiske egenskaber af rhodirubin A og B er som følger: 12 146282

Rhodirubin A; Rødt pulver med et smeltepunkt på 141-143 °C.

Grundstofanalyse giver de følgende værdier:

Beregnet for ^42Η55ΝΟΐ6: C = 60,77%, H = 6,68%, 0 = 30,81%, N = 1,69%.

Fundet: C = 60,39%, H = 6,63%, O = 30,72%, N = 1,71%.

Molekylvægt: 829,9

Specifik rotation: [a]28 = +120° (C = 0,1, CHCl^)

Opløselighed: Rhodirubin A er opløselig i methanol, n-butanol, acetone, ethylacetat, chloroform, toluen, benzen og dimethyl-sulfoxid, uopløselig i vand, n-hexan og petroleumsether og tungt opløselig i diethylether.

Farve og reaktion: Methanolopløsning af rhodirubin A er rød, men bliver rødlig violet i basisk tilstand. Den giver en negativ ninhydrin-reaktion og reducerer ikke Fehlings væske.

Absorptionsspektrum: Ultraviolette og synlige absorptionsmaksima ses ved 235 nm,

Elcm = 507f 258 nm' Elcm = 267' 295 nm

Elcm = 100' 457 EiJm = 127 f 490 E1cti = 153' 510 Tm' ElJm = 117f 522 Tm' 19- E,° = 100 (i methanol ved en koncentration lem på 15 mcg/ml).

13 146282

Absorptionsspektrum: Infrarødt IR-spektret i KBr viser toppe ved de følgende bølgelængder i cm 3430, 2950, 2930, 2810, 2750, 1735, 1640, 1600, 1450, 1320, 1300, 1220, 1160, 1120, 1040, 1000, 970, 960, 920, 800 og 760.

NMR: PMR-spektret for rhodirubin A.i CDClg (100 MHz)

Viser de følgende kemiske skift (ppm): 7,6, s? 7,24, s; 5,50, m? 5,62, mj 5,02, m; 4,84, m; 4,52, q; 4,7~3,90, overlappende m; 3,72, s; 3,60^0,02, overlappende m og 2,18, s.

Rhodirubin B: Rødt pulver med et smeltepunkt på 135-137 °C.

Grundstofanalyse giver de følgende værdier:

Beregnet for C42H55N015: C = 61,99% H = 6,77% O = 29,52% N = 1,72%

Fundet: C = 61,23% H = 6,80% O = 28,77% N = 1,94%.

Molekylvægt: 813,9.

Specifik rotation: [a]p°= +190° (C = 0,1, CHClg)

Opløselighed: Rhodirubin B er opløselig i methanol, n-butanol, acetone, chloroform, ethyl-acetat, toluen, benzen og dimethyl-sulfoxid, uopløselig i vand, petroleums-ether og n-hexan og tungt opløselig i diethylether.

146282 14

Farve og reaktion: Methanolopløsning af rhodirubin B er rød, men bliver rødlig violet i basisk tilstand. Den giver en negativ ninhydrid-reaktion og reducerer ikke Fehlings væske.

Absorptionsspektrum: Ultraviolette og synlige absorptionsmaksima ses ved 235 nm, E*1 = 593; 257 nm, E?-% = 307; 295 nm, lem lem

Elcm = 113’* 457 nm' Eicm = 153' 490 Im' Ε?·% = 187; 510 nm, E^ = 147; 522 nm, lom lem - 120

Absorptionsspektrum: Infrarødt IR-spektret i KBr viser toppe ved de følgende bølgelængder i cm 3470, 2960, 2940, 2820, 2790, 1740, 1640, 1600, 1450, 1300, 1220, 1160, 1120, 1040, 1000, 980, 960, 920, 800, 790 og 760.

NMR: PMR-spektret for rhodirubin B i CDCl^ (100 MHz) viser de følgende kemiske skift (ppm): 7,6, s; 7,24, s; 5,50, m; 5,02, m; 4,84, m; 4,52, q; 4,7^3,90, overlappende m; 3,72, s; 3,6^0,09, overlappende m og 2,18, s.

Rhodirubin A og B har de følgende R^-værdier på silicagel-tyndtlagskromatogrammer ved anvendelse af de angivne opløsningsmiddelsystemer: R^-værdier

Opløsninqsmiddelsystem Rhodirubin A Rhodirubin B

ethyl:acetat:benzen methanol (5:5:1) (vol/vol) 0,37 0,42 chloroform:methanol (10:1) (vol/vol) 0,19 0,28 chloroform:methanol (20:1) (vol/vol) 0,17 0,20.

is 146282

Strukturerne af rhodirubin A og B bestemtes som følger: Aglyconer af rhodirubin A og B opnåedes ved syrehydrolyse med fortyndet saltsyre (0,1N) ved 85 °C i 30 minutter. Physico-kemiske egenskaber, f.eks. IR, UV, NMR, smeltepunkt og R^-værdier pånået ved tyndtlagskromatografi, af de opnåede aglyconer var i fuld overensstemmelse med de i litteraturen beskrevne egenskaber af ε-pyrromycinon (se Chem. Ber., 92, 1904 (1959)).

Efter neutralisering og koncentrering af det vandige lag af rhodirubin A og B-hydrolysåterne oparbejdedes sukkerdelen, som fraskiltes ved tyndtlagskromatografi (silicagel, type TLC, Merck ^254^ opløsningsmidler: butanol:eddikesyre:vand = 4:1:1 (volumen/volumen)). Tre sukkerenheder (R^ = 0,14:0,53:0,67) opnåedes fra rhodirubin A og to sukkerenheder (Rf = 0,14:0,67) fra rhodirubin B. Ved sammenligning af disse med de fra aclacinomycin (se J. Antibiotics, 28, 830-8234 (1975)) og fra streptolydizin (se J. Am. Chem. Soc. 86, 3592-3594 (1964)), opnåedes sukkerarter med hensyn til forskellige farvereaktioner (se Pharmazie, 2_7, H12, 782-789 (1972)), specifikke rotationer og NMR, identificeredes sukkerarterne med Rf = 0,14, 0,53 og 0,67 til at være henholdsvis rhodosamin, 2-deoxyfucose og rhodinose.

Methanolyse af rhodirubin A og B gav pyrromycin (rhodosaminyl-ε-pyrromycinon). Tillige frigjordes rhodinose fra rhodirubin A eller B ved en mild hydrolyse (0,5% HCl, 20 °C, 10 minutter) ifølge den i Naturwise, j50, 43-44 (1963) beskrevne metode.

Pra de ovenfor beskrevne resultater bestemtes strukturerne af de omhandlede rhodirubin A eller B at være som følger: COOCH^ OH 0

OH

0

R

hvori R betegner 16 146282 for rhodirubin A: for rhodirubin B: iM Ifo V/ K-/ 0 jl-CH, j_ 0 (Sls .0’ 1-0°

j/cH3 \ /°¾ N

Ho\| |/ H0\|_|/

Blandt anthracyclin-antibiotika, som er beskrevet i litteraturen, er det kendt, at cinerubin, aclacinomycin, violamycin og rhodomycin består af en aglycon og 3 sukkerenheder. Deres sammensætninger er vist herunder: 17 146282 g jg φ S ω Φ ø O to ω d 2

3 C

<D G = O - •n SJ Ό

^ G O

<u ή χ;

G O G

μ _

G

Φ I

-y >3 -¾ Hil S O ra w (U o +> Ύ § = =

$ OJ-S

G

fd

G

S G £ C C

yi Ή *r4 *r-4 t4 3 s ε a ε yj irf (rf trf ®

CQ CO td CQ

(U O O O O

-p Ό Ό Ό TS

W O O O O

G Jti Æ Æ -G

^Θν G G G G

M-l__ i i

H O

Mg H

O Φ

ftH tn M

MH O ,2 tre) ti £ ^ EISHO r- ^ •G (l)U ti Φ ό c λ: >i 2 SOM·! -¾ ' •H -G ti tn ti cn pq -μ t n Φ

ti ti C

O O o C

G G G G i o

•G o *G *G G G

0 g o o i ή

G >3 G *rl >3>3>iO

O £ O ,u Ξ S X ?>i

CJ O G m>> OOOS

>3 G -G _2S Ό Ό Φ O

H G > (rtO O OtlO

fcfl !>J trf -gTJ £ X! I o < P« HO G G O Λ

1 i-1 cd XI 1 I H G

ω cd >G

^ x (d < M ti ti

•G ti I *G *G

-P -GO O Ό O XI ti< >> t>> •g g ή s ε

XI G o G trf O

•Η Φ td Ή iG *Ό -P G H o o o G -G ϋ >3 -Η x; < o g ε > g 18 148282

Det ses således, at rhodirubin-antiMotikaene let kan skelnes fra de ovenfor nævnte anthracydiner.

Rhodirubin A og B udviser antimikrobiel aktivitet mod forskellige mikroorganismer. Den mindste inhiberende koncentration af rhodirubin A og B bestemt ved substratfortyndingsmetoden er vist i tabellen herunder:

Mindste inhiberende koncentration af rhodirubin A og B.

MIC (ug/ml)

Test-mikroorganisme -

rhodirubin A rhodirubin B

Staph, aureus FDA 209P 1,56 1,5β

Staph aureus Smith 0,½ 0,78 B. subtilis ATCC 6633 0,78 1,56 B. cereus ATCC 363k 0,2 0,4 B. megaterium HERL-938 0,78 156

Sarcina lutea ATCC 9341 0,½ 0,78

Micrococcus flavus 0,2 0,2

Coryne: bovis 0,2 0,½

Ps. fluorescens NIEJB-254 100 100

Proteus morganii >100 >IOO

Mycobacterium smegmafcjs ATCC 607 6,25 3,1

Candida albicans IAM 4905 >100 >100

Candida tropicalis IAM 4942 >100 >100 t -—________L____

Som vist ovenfor besidder rhodirubin A og B antimikrobiel aktivitet, især mod gram-positive bakterier, og de er således terapeutisk værdifulde ved behandling af dyr, indbefattet mennesker, for infektionssygdomme forårsaget af sådanne mikroorganismer.

Rhodirubin A og B udviser en udpræget antitumor-aktivitet med lav toksicitet i eksperimentelle dyre-tests og er således terapeutisk værdifulde til hæmning af væksten af pattedyrs- eller menneske-tumorer. Især udviser rhodirubin A og B udpræget inhiberende virkninger 19 146282 på muse-L1210 leukemia. F.eks. podedes CDF,-mus intraperitonealt 6 med 1 x 10 L1210 celler/mus/ og 0,1-0,2 ml medikamentopløsning administreredes derefter intraperitonealt i 10 efter hinanden følgende dage. Observation foretoges i 30 dage, og den procentvise forlængelse af overlevelsestiden i forhold til kontrolmus, intraperitonealt indgivet fysiologisk saltvandsopløsning, var som følger:

Forlængelse af overlevelsestiden T/C (%)

Dosering rhodirubin A rhodirubin B

(mg/kg/dag) (HCl-salt) (HCl-salt) 10 87 104 8.5 121 160 5 195 179 2.5 167 215 1,25 117 126 0,6 102 107.

Akut toksicitet.

LDj-Q-værdierne ved intraperitoneal injektion (i mus) af rhodirubin A og B er som følger: LD50. (mg/kg) rhodirubin A 7,5-10 rhodirubin B 10-12,5.

Som ovenfor anført er de omhandlede forbindelser rhodirubin A og B hidtil ukendte antibiotika, som er nyttige i både human og veterinær medicin, og er antitumor-midler med udpræget inhiberende virkning mod ondartede pattedyrs- og menneske-tumorer, omfattende både ascitiske og faste typer.

De omhandlede forbindelser danner ikke-toksisk syreadditionssalte med forskellige organiske og uorganiske saltdannende reagenser og danner ikke-toksiske komplekser med deoxyribonucleinsyre. Syreadditionssalte dannet med farmaceutiske acceptable syrer, såsom svovl-, phosphor-, salt-, eddike-, propion-, olie-, palmi^in-, citron-, rav-, vin-, glutamin- eller pantothensyre, og ikke-toksiske komplekser med deoxyribonucleinsyre kan således anvendes på samme måde som rhodirubin-forbindelserne i sig selv. Saltene dannes, isoleres, renses og formuleres ved metoder, som sædvanligvis an- 20 166282 vendes ved saltdannelse for antibiotika. I tilfælde af DNA-komplek-serne kan DNA ekstraheret fra dyr og mikroorganismer, såsom kalve-thymus, Hela-celler, menneske- og dyre-embryo-celler, gærarter osv., anvendes. Fremstilling af rhodirubin-DNA-komplekser kan udføres ved metoder, som er beskrevet i litteraturen for fremstilling af DNA-komplekser af andre anthracyclin-antibiotika, såsom adriamycin, daunorubicin etc. (se f.eks. Nature, New Biol., 239, 110 (1973) og Europ. J. Cancer, 1£, 399 (1974)). De omhandlede rhodirubin-forbin-delser i den frie baseform er for de omhandlede formåls skyld ækvivalente med deres ikke-toksiske syreadditionssalte og DNA-komplekser.

De omhandlede forbindelser kan anvendes ved en metode til terapeutisk behandling af et pattedyr eller menneske, som er angrebet af en infektion af gram-positive bakterier eller angrebet af en ondartet tumor (dvs. en tumor af fast eller ascitisk type, såsom L1210 leukemia), hvilken metode indbefatter, at man administrerer til pattedyret eller mennesket en effektiv antibakteriel eller tumor-inhiberende dosis af rhodirubin A eller B eller en blanding deraf eller et ikke-toksisk syreadditionssalt eller DNA-kompleks deraf.

De omhandlede forbindelser kan anvendes til fremstilling af et farmaceutisk præparat, som indeholder en effektiv antibakteriel eller tumor-inhiberende mængde af rhodirubin A eller B eller en blanding deraf eller et ikke-toksisk syreadditionssalt eller DNA-kompleks deraf i kombination med en inert farmaceutisk acceptabel bærer eller fortynder. Disse præparater kan fremstilles i en hvilken som helst farmaceutisk form, som er passende til parenteral administrering.

De omhandlede præparater til parenteral administrering omfatter sterile vandige eller ikke-vandige opløsninger, suspensioner eller emulsioner. De kan også fremstilles i form af sterile faste præparater, som kan opløses i sterilt vand, fysiologisk saltvandsopløsning eller et andet sterilt injicerbart medium umiddelbart før brug.

Det er indlysende, at de aktuelle foretrukne mængder af anvendt rhodirubin-antibiotikum vil variere alt efter den bestemte forbindelse, som anvendes, den bestemte sammensætning, som formuleres, anvendelsesmåden og de bestemte tilstande, det bestemte dyr eller menneske og den bestemte sygdom, som skal behandles. Sædvanligvis 21 146282 injiceres rhodirubin-antibiotikaene intraperitonealt, intravenøst, subkutant eller lokalt i dyr og intravenøst eller lokalt i mennesker. Mange faktorer, som ændrer medikamentets virkning, skal tages i betragtning af fagmanden, f.eks. alder, legemsvægt, køn, diæt, administreringstid, administreringsvej, ekskretionshastighed, patientens tilstand, medikamentkombinationer, overfølsomhedsreaktioner og sygdommens alvorlighed. Administrering kan udføres kontinuerligt eller periodisk indenfor den maksimalt tålte dosis. Optimale applikationshastigheder for et givet sæt betingelser kan konstateres af fagmanden ved hjælp af konventionelle doseringsbestemmelsestests under hensyntagen til de ovenstående ledetråde.

Med henblik på anvendelse som et antibakterielt middel administreres rhodirubin-præparateme sædvanligvis således, at koncentrationen af aktiv bestanddel er større end den mindste inhibe-rende koncentration for den bestemte organisme, som skal behandles.

De følgende eksempler skal nærmere belyse opfindelsen uden at være begrænsende herfor.

Eksempel 1.

Et næringsmedium med den følgende sammensætning fremstilledes:

Kartoffelstivelse 1 % (vægt/volumen %) glucose 1 %

Sayabø.nnepulver 1,5 % k2hpo4 0,1 %

MgS04,7H20 0,1 %

NaCl 0,3% mineraler * 0,125 % (pH-værdi 7,4) % mineraler består.af følgende:

CuS04,5H20 2,8 g

FeS04,7H20 0,4 g

MnCl2,4H20 3,2 g

ZnS04,7H20 0,8 g i 500 ml vand.

22 146282 59 ml af dette medium steriliseredes i en 500 ml kolbe, podedes ved hjælp af en øjenål fra agarskråglaskulturen af Strep-tomyces galilaeus (ATCC 31133) og inkuberedes ved 28 °C i 48 timer på en rotationsryster (230 omdr./minut) til opnåelse af podekulturen.

Det følgende medium fremstilledes derefter:

Kartoffelstivelse 2 % (vægt/volumen%) glucose 2 % affedtet soyabønne 2 % gærekstrakt 0,5 %

NaCl 0,25 %

CaC03 0,3 % mineraler ¥ 0,125 % (pH-værdi 7,4) * mineraler består af følgende:

CuS04,5H20 1,25 g

MnCl2,4H20 1,25 g

ZnS04,7H20 1,25 g i 500 ml vand.

2 ml af denne podekultur podedes over i 100 ml af det umiddelbart ovenfor beskrevne på forhånd steriliserede medium i en 500 ml kolbe. Fermentering udførtes ved 28 °C på en rotationsryster (230 omdr./minut), og produktionen af rhodirubin nåede et maksimum efter 4 dages forløb. Substratet filtreredes til adskillelse af myceliekage og filtrat. Chloroform i en mængde på et halvt volumen sattes til filtratet, og ekstraktionen udførtes to gange. Acetone sattes til myceliekagen (2 1 acetone/1 kg våd kage), og ekstraktionen udførtes to gange, hvorefter acetonen fjernedes ved afdampning under formindsket tryk. Chloroform i en mængde på et halvt volumen sattes til remanensen, og ekstraktionen udførtes to gange.

De opnåede chloroformekstrakter kombineredes med chloroformeks-trakterne fra filtratet, hvorefter de koncentreredes under formindsket tryk til opnåelse af en tjæreagtig substans. Denne substans opløstes i en lille mængde ethylacetat, og et bundfald dannedes ved dråbevis tilsætning af denne opløsning til 10 voluminer n-hexan (4,5 g rødt råt pulver opnåedes). Dette rå pulver opløstes i 30 ml af en blanding af toluen og methanol (50:1 volumen/volumen), som derefter overførtes til en søjle (3 x 50 cm) fyldt med 100 g 23 146282 silicagel, som var i ligevægt med den samme blanding, og rhodi-rubin B og derefter rhodirubin A elueredes. Hvert eluat tørredes under formindsket tryk til opnåelse af 27 mg rå rhodirubin A og 60 mg rå rhodirubin B.

Eksempel 2.

Rå rhodirubin A (27 mg) opnået ifølge Eksempel 1, kromatogra-feredes på en tyndtlagsplade (Merck F254# °pl^snin9smi^er: chloroform: methanol - 10:1 volumen/volumen) til fjernelse af urenheder indbefattet rhodirubin B og efter opløsning i 2 ml methanol chro-matograferedes den aktive fraktion på en "Sephadex LH-20"-søjle (1 x 70 cm). Det således opnåede eluat koncentreredes og udfældedes med n-hexan til opnåelse af 16,5 mg renset rhodirubin A som et rødt pulver. 10 mg af dette røde pulver opløstes i en blanding af 200 yl tør acetone og 70 μΐ tør methanol, og der tilsattes 10 yl 3N HCl-methanolopløsning. Efter omrystning i et minut dannedes et bundfald ved tilsætning af 10 voluminer diethylether. Bundfaldet opsamledes ved filtrering og tørredes til dannelse af 7,2 mg rhodirubin A-HCl-salt.

Eksempel 3.

80 mg rå rhodirubin B opnået ifølge Eksempel 1 rensedes ved metoden beskrevet i Eksempel 2 til dannelse af 63,4 mg rhodirubin B som et rødt pulver.

Eksempel 4.

Ved samme almene metode som beskrevet i Eksempel 1, 2 og 3 dyrkedes de følgende mikroorganismer til opnåelse af rhodirubin A og B i de anførte udbytter.

Udbytte af rhodirubin (mer)

Mikroorganismer A B

Streptomyces galilaeus 23 14 ATCC 14949

Streptomyces cinereoruber 16 5 ATCC 19740

Streptomyces purpurascens 11 7 ATCC 25489

Streptomyces antibioticus 8 10 ATCC 8663

Streptomyces sp. ME 505-HEI 21 48 ATCC 31273

Claims (1)

1. 24 146282 Fremgangsmåde til fremstilling af anthracyclin-glycosidantibiotika kaldet rhodirubin A og rhodirubin B med den almene formel: COOCHj OH 0 I ^ ' | ^ N OH I 0 R hvori R betegner for rhodirubin A: for rhodirubin B: K-/ Nv 0 1-CH, j_ —n ch, Å~ \ ch3 /m \ 3 (0¾ ) 3 LP J—o ™ J—o /cHj ) /ch3 \ H0\j_H0\|_j/