CZ281277B6

CZ281277B6 - Výroba antibiotik skupiny pradimicinu

Info

Publication number: CZ281277B6
Application number: CS922274A
Authority: CZ
Inventors: Furumai Tamotsu; Kakushima Masatoshi; Ikeda Chiharu; Saitoh Kyoichiro; Hatori Masami; Kobaru Seikichi
Original assignee: Bristol-Myers Squibb Company
Priority date: 1991-07-31
Filing date: 1992-07-21
Publication date: 1996-08-14
Also published as: NZ243601A; IE922354A1; EP0525588A2; RU2057181C1; HUT66834A; US5374552A; AR247247A1; EP0525588A3; FI923310A7; PL169657B1; ZA924167B; CA2071140A1; KR930019833A; AU652268B2; FI923310L; TW215929B; PL295353A1; CZ227492A3; FI923310A0; IL102587A

Abstract

Fermentační postup, jímž lze produkovat BMY-28960 a desxylosyl-BMY-28960, jakož i nový organismus, produkujícího BMY-28960, patřící do rodu Actinomadura a označeného jako kmen AB 1236 (ATCC 55208).ŕ

Description

(57) Anotace:

Fermentační postup. Jímž lze produkovat BMY28960 a desxylosyl-BMY-28960, Jakož i nový organismus, produkujícího BMY-28960, patřící do rodu Actinomadura a označený Jako kmen AB 1236 (ATCC 55208).

CZ 281 277 B6

Způsob výroby antibiotik skupiny pradimicinu a kultura mikroorganismu, schopná produkovat toto antibiotikum.

Oblast techniky

Předmětem tohoto vynálezu je fermentačni způsob výroby antibiotik pradimicinové skupiny, jakož i mikroorganismus, produkující řečená antibiotika.

Dosavadní stav techniky

Mezi četnými antibiotiky pradimicinové skupiny, o nichž je známo, že jsou výsledkem činnosti mikroorganismů rodu Actinomadura, obsahující pradimicin FA-1 (Ia) a pradimicin FA-2 (Ib), uváděné v Americkém patentovém spisu 4 973 673, v molekule D-serin. V J. Antibiotics 41, 807-811 (1988) je popisován benanomycin

A (II), sloučenina, jež je ve velmi blízkém vztahu k pradimicinům, od kterých se liší tím, že postrádá cukernou aminoskupinu. Evropská patentová přihláška 432 527 (z 19. června 1991) popisuje sloučeninu složení 4'-deamino-4'-a-hexadroxypradimicin FA-2 (III, nadále označována jako BMY-28960), jež byla chemicky připravena z pradimicinu FA-2. V této souvislosti je také popisován desxylosyl-BMY-28960 (viz Evropský patentový spis 432 527) a může se připravit z desxylosyl-pradimicinu FA-2.

r'·

Ia: R¹ = CH2OH: R² = NHCH3

Ib: R¹ = CH2OH: R² = NH2

II: R¹ = CH₃: R² = OH

III: R¹ = CH₂OH: R² = OH

Chemické postupy, jimiž se dá připravit BMY-28960 a jeho •odpovídající desxylosyl-derivát, jsou nesnadné a velmi pracné, navíc se produkt získává ve velmi malém výtěžku. Je tedy vysoce žádoucí jiný způsob, který by se hodil pro výrobu takových antibiotik ve velkém. Výsledkem velmi intenzivního hledání mikroorganismu, který by byl schopen produkovat BMY-28960 a desxylosyl-BMY-28960, je nový kmen mikroorganismu, patřící do rodu Actinomadura, o kterém bylo zjištěno, že je producentem antibiotik.

-1CZ 281277 B6

Podstata vynálezu

ce	Předmětem tohoto vynálezu je způsob výroby antibiotika vzor-
		CH,OH 1 CCNH-CH-COOH
	HO. □ HO	1 CD) 1 li
	CH.0^ JI J< 1 II 1	1
	1 1
	C5 0		A
			\ CH RO

kde R znamená atom vodíku nebo β-D-xylosylový zbytek, a vyznačuje se tím, že se kultivuje kmen Actinomadura, schopný produkovat uvedené antibiotikum, a to ve vodném prostředí, obsahujícím asimilovatelné zdroje uhlíku, dusíku, jakož i D-serin, a to za aerobních podmínek, načež se ze zápary po kultivování izoluje řečené antibiotikum. Produkujícím mikroorganismem je s výhodou Actinomadura sp. AB 1236, ATCC 55208. Podle výhodného provedení obsahuje fermentační prostředí navíc ještě D-cykloserin.

Podle dalšího předmětu zajišťuje postup podle tohoto vynálezu čistou kulturu mikroorganismu Actinomadura sp. AB 1236 s identifikačními charakteristikami ATCC 55208, který je schopný produkovat BMY-28960 a desxylosyl-BMY-28960 kultivováním ve vodném prostředí, obsahujícím asimilovatelné zdroje uhlíku, dusíku a D-serin.

Krátký popis připojených výkresu

Na obr. 1 je IČ-spektrum BMY-28960 (v bromidu draselném). Na obr. 2 je ¹H-NMR spektrum (DMSO-d₆, 400 MHz) BMY-28960.

Na obr. 3 je ¹³C-NMR spektrum (DMSO-dg, 100 MHz) BMY-28960.

Na obr. 4 je IČ-spektrum desxylosyl-BMY-28960 v bromidu draselném. Na obr. 5 je ^H-NMR spektrum (DMSO-dg, 400 MHz) desxylosyl-BMY-28960 v bromidu draselném.

Podrobný popis vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je fermentační způsob, vhodný pro výrobu BMY-28960 a desxylosyl-BMY-28960 ve velkém. Postup využívá nový mikroorganismus, náležející do rodu Actinomadura.

I. Izolace mikroorganismů, produkujících BMY-28960

Očkem odebraný vzoreček každého z actinomycetů, izolovaného z půdy, se očkuje jako malá skvrnka na 3 agarové destičky o složení :

-2CZ 281277 B6 glukóza, kvasnice, sojový extrakt v agaru (1 % glukózy, 0,05 % extraktu z kvasnic, 0,05 % sojového extraktu od Difco Laboratories, 0,01 % dihydrátu chloridu vápenatého a 1,5 % agaru), nebo glycerol, kvasnice, sojový extrakt v agaru (1 % glycerolu, 0,05 % extraktu z kvasnic, 0,05 % sojového extraktu, 0,01 % dihydrátu chloridu vápenatého a 1,5 % agaru), anebo škrob, extrakt z kvasnic a sojový extrakt v agaru (1 % rozpustného škrobu, 0,05 % extraktu z kvasnic, 0,05 % sojového extraktu, 0,01 % dihydrátu chloridu vápenatého a 1,5 % agaru). Inkubováním za teploty 37 'C po dobu jednoho až dvou týdnů vytvoří kmeny, produkující temně až tmavě růžové rozpustné barvivo a ty se přeočkují do Erlenmeyerovy baňky, obsahující jako produkční prostředí 2 % glycerolu, 1,5 % Esusan mito (Ajimoto Co., Ltd., je to moučka ze sojových bobů) 0,0001 % hexahydrátu chloridu kobaltnatého, 0,1125 % dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,0025 % monohydrogenfosforečnanu draselného a 0,2 % D-serinu. Inkubování se provádí za teploty 32 “C na rotačce (200 otáček za minutu). Po deseti dnech inkubování se sleduje průběh vzniku BMY-28960 v zápaře testem na zvlněném agaru, přičemž se jako testovací organismus v horní kapalině použije Candida albicans A9540. Ty zápary, které se vyznačují účinností proti Candida, se odstředí, zředí desetinásobkem dimethylsulfoxidu a filtrují (Gelman Sciences Japan, Ltd., Akicrodisc 13 CR, velikost pórů 0,45 μιη) . Filtráty se potom analyzují vysokotlakou kapalinovou chromatografii na Excel pak SIL-C185 R (Yokogawa Electronic Co., Ltd) za použiti acetonitrilu : 0,02 M fosfátového pufru o pH 7,0 (15:85), rychlost toku 1 ml/min s detekcí 254 nm a chromatografickou analýzou na tenké vrstvě silikagelu na destičkách (Kiesel gel 60 F254 0,25 mm, Měrek). K vyvíjení se použije rozpouštědlový systém n-butanol: octová kyselina:voda (2:1:1, BW-14) a methylacetát-n-propanol:28% vodný roztok amoniaku (45:105:60, S-114). Při vysokotlaké kapalinové chromatografii má BMY-28960 retenční dobu 11,5 min při použiti výše uvedeného systému rozpouštědel a hodnoty Rf 0,50 a 0,24 za použiti soustav BW-14 a S-114 v tom kterém případě.

Takto byly soustředěny a testovány různé actinomycety a u kmene AB 1236, náležejícího do rodu Actinomadura, bylo zjištěno, že produkuje žádanou sloučeninu v míře, jež dostačuje k produkci ve velkém. Taxonomické charakteristiky kmene AB 1236 zde budou dále ještě popsány.

II. Organismus, produkující BMY-28960

Actinomadura sp. AB 1236 je nový kmen, který byl izolován z půdního vzorku, odebraného v Shinjuku, Tokio, Japonsko 24. října 1990. Kultura kmene AB 1236 byla deponována v Američan Type Culture Collection se zřetelem na BUDAPEŠŤ TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDUŘE s tím, že všechna omezeni stran dostupnosti deponovaného mikroorganismu pro obecné použití budou neodvolatelně odvolána, jakmile na základě této přihlášky bude udělen patent. Deponovaná kultura byla označena číslem ATCC 55208.

A. Morfologie a charakteristiky kultury kmene AB 1236

Jako prostředí a postupy, použité pro taxonomické studie kmene, byly použity ty, které popsali Shirling a Gottlieb v Methods for Characterization of Streptomvces species v Int. J.

-3CZ 281277 B6

Syst. Bact., 16, 313-340 (1966); dále Waksman v The Actinomycetes, sv. II-, Classification, Identification and Description of Genera and Species, str. 328-334, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1961; dále Arai v Culture Media for Actinomycetes, The Society for Actinomycetes Japan, 1975. Kmen byl inkubován 2 až 4 týdny za teploty 37 ’C. Barevná stanovení byla provedena porovnáním barevnosti kultury s barevnými vzorky podle Manual of Color Names, Japan Color Enterprise Co., Ltd., 1987.

Kmen AB 1236 rostl lépe na organických prostředích ve srovnání s anorganickými za teploty v rozmezí 20 až 41 °C za vzniku větveného mycelia. Barva vyzrálého vzdušného mycelia byla bílá až šedavé bílá, ať již byl použit agar s kvasnicemi a škrobem, nebo agar s kvasnicemi, škrobem a sladovým extraktem o složení 1 % kvasnic a rozpustného škrobu, 0,1 % extraktu z kvasnic, 0,1 % sladového extraktu, 0,05 % dihydrátu chloridu vápenatého a 1,5 % agaru. Pod světlem a elektronovým mikroskopem připadá na vrcholek krátkých sporoforů 2-8 spor na jednotlivý řetězec. Tvar těchto spor je takřka kulový (velikost 0,8-1,0 na 1,0-1,2 μ,πι) a jejich povrch je hladký. Barva vegetativního mycelia a rozpustných barviv na organickém agarovém prostředí kolísá od něžně růžové do temně růžové. Přidáním 0,1 N roztoku chlorovodíku se barva mění do rozmezí od něžně oranžové až do silně žlutavo oranžové. Kultivační charakteristiky kmene AB 1236 na různých agarových prostředích jsou shrnuty v tabulce 1.

Tabulka 1

Kultivační charakteristiky kmene AB 1236
Prostředí	Vzrůst	Odvrácená strana	Vzdušné mycelium	Rozpustné barvivo
Agar se sacharózcu a dusičnanem, prostředí Waksman, č.l	žlutavě-bílý (393)	žlutavě-bílá (393
Agar s gíycerolem a dusičnanem	šedavé-červený (60), dobrý	šedavě-červená (60),	--	růžovo-bílé (391)
Agar s glukózou a asparaginem, prostředí Waksman, č.2	žlutavě-bílý (393),dobrý	žlutavě-bílá (393)
Agar s extraktem z kvasnic a sladovým, prostředí ISP č.2	temné červený (57), dobrý	temné červená (57)	žlutavo - bílé (390) až růžovo-bilé (391)	temně červené (58)
Agar s ovesnou mou* kou, prostředí ISP č.3	něžně růžový (25), dobrý	něžně růžová (26)	bílé (388) typu bavlny	něžně růžové (26)
Agar s anorganickými solemi a škrobem, prostředí ISP č.4	žlutavo-bílý (393), dobrý	žlutavo-bílá (393) až růžovo-bílá	··

-4CZ 281277 B6

Tabulka 1 (pokračování)

Kultivační charakteristiky kmene AB 1236

Prostředí	Vzrůst	Odvrácená strana	Vzdušné mycelium	Rozpustné barvivo
Agar s glycerolem a asparaginem, prostředí ISP č.5	temné červený (58), dobrý	temně červená (58)	—	něžně růžové (25)
Agar s tyrosinem, prostředí ISP č.7	temně červený (58), dobrý	temně červená (58)	—	něžné růžové (25)
Živný agar, prostředí Waksman č.14	žlutavo-bílý (393) chudý	žlutavo-bílá ( 393)		—
Agar s kvasnicemi a skřetem	temně šedavcčerver.ý (51) dobrý	temně šedavcčervená (51)	bílé (388) až šedavo-bílé (390) typ bavlny	temné žlutavočervené (53)
Bennettův agar	temně červený (57), dobrý	temně červená (57)	šedavo-bílé (390), sporé	temně růžové (22)

B. Fyziologické charakteristiky kmene AB 1236

Fyziologické charakteristiky a příklady využiti uhlíkatých zdrojů kmenem AB 1236 jsou dále v tabulkách 2 a 3.

Tabulka 2

Fyziologické charakteristiky kmene AB 1236

Test	Výsledky
Hydrolýza škrobu, prostředí ISP 4	+
Redukce dusičnanů, Difco, dusičnanová zápara	-
10%-ní sebrané mléko Difco, sledování srážení	+
peptonizace	-
Rozklad celulózy (roztok sacharózy a dusičnanu
s proužkem papíru jako jediným zdrojem
uhlíku)	-
Ztekucování želatiny	žádný vzrůst
Tvorba melaninu na ISP prostředí č. 7	-
Teplotní rozmezí růstu	20-41’C
Nejvýhodnější teplota na agaru s kvasnicemi
a škrobem	30,5-35,5’C
Rozsah pH pro růst	6-8
Nejvýhodnější hodnota pH (na sojové zápaře
s tryptikázou, BBL)	7

- znamená negativní + znamená pozitivní

-5CZ 281277 B6

Tabulka 3

Využití zdrojů uhlíku kmene AB 1236

Zdroj uhlíku	Využití
D-Glukóza	+
L-Arabinóza	+
D-Xylóza	+
Inositol	+
Mannitol	+
D-Fruktóza	+
L-Rhamnóza	+
Sacharóza	+
Rafinóza	+

+ znamení pozitivní, prostředí ISP 9, 37 °C, 3 týdny

Citlivost kmene AB 1236 na antibiotika byla testována za použití antibiotických kotoučků (Tridisk, Eiken Chemical Co., Ltd). Kotoučky byly umístěny na povrchu agaru s kvasnicemi, glukózou a sladovým extraktem (extrakt z kvasnic 0,1 %, glukóza %, sladový extrakt 0,1 %, dihydrát chloridu vápenatého 0,05 % a agar 1,5 %), na kterých byl nanesen kmen AB 1236 (4% očko). Kotoučky byly inkubovány 4 dny za teploty 3 7 .°C. Kmen AB 123 6 byl rezistentní na 50 μg fosfomycinu a 300 jednotek polymixinu B, ale byl citlivý na 20 jednotek ampicilinu, 1 μg klavulanové kyseliny, μg ticarcilinu, 10 μg cefalexinu, 30 μg tetracyklinu, 10 μg chloramfenikolu, 0,5 μg erythromycinu, 2 μg josamycinu, 2 μg linkomycinu, 5 μg kanamycinu, 5 μg gentamicinu, 5 μg tobramycinu, 2 μg nalidixové kyseliny, 2 μg norfloxacinu a 50 jednotek kolistinu.

C. Chemická analýza buněk AB 1236

Složení celých buněk bylo analyticky zjišťováno postupem, který popsal Becker a Lechevalier v Rapid Differentiation between Nocardia and Streptomyces by Páper Chromatography of Whole Cell Hydrolysate, Appl. Microb. 12, 421-423 (1964) a v Chemical Compositions of Cell-Wall Preparations from Strains of Various Form-Genera of Aerobic Actinomycetes, Appl. Microb., 13, 236-243 (1965). Kmen AB 1236 obsahoval meso-diaminopimelovou kyselinu, madurózu, ribózu, mannózu, glukózu a galaktózu. Má tedy kmen AB 1236 buněčnou stěnu, náležející k typu III B. Nepodařilo se dokázat přítomnost mykolové kyseliny za použití postupu Minnikina a spol., Differentiation of Mycobacterium, Nocardia, and Related Taxa by Thin-Layer Chromatographic Analysis of Whole-Organism Methanolysates, J. Gen. Microb., 88., 200-204 (1975). Z analýzy fosfolipidů za použití postupu Lechevaliera a spol. v Identification of Aerobic Actinomycetes of Clinical Importance, J. Lab. Clin. Med. 71, 934-944 (1968) a v Chemotaxonomy of Aerobic Actinomycetes: Phospholipid Composition, Biochem. Syst. Ecol. 5 249-260 (1977) vyplynulo, že buněčné stěny kmene AB 1236 patří k typu PÍ s obsahem difosfatidylinositol-mannosidu, fosfatidylinositolu a difosfatidylglycerolu. Z analýzy složení menachinonu za použiti postupu Collinse a spol. v A Notě on the

-6CZ 281277 B6

Separation of Natural Mixtures of Bacterial Menaquinones Using Reverse-Phase Thin-Layer Chromatography, J. Appl. Bacteriol., 48, 277-282 (1980) vyplynulo složení 47 % MK-9 (H8), 35 % MK-9 (H6), 10 % MK-9 (H4) a 8 % MK-9 (H10). Složení mastných kyselin z celých buněk stanovením postupem dle Suzuki a spol., Taxonomie Significance of Cellular Fatty Acid Composition in Some Coryneform Bacteria, Int. J. Syst. Bacteriol., 33., 188-200 (1983):49 % 14-methylpentadekanové kyseliny (iso 16:0), 13 % 14-methylhexadekanové kyseliny (anteiso-17:0) a 8 % 10-methylheptadekanové kyseliny (10Me-17:0) s menším podílem dalších mastných kyselin.

Kmen AB 1236 má morfologické, kultivační a chemotaxonomické vlastnosti, které jsou v souladu s oněmi pro genus Actinomadura Lechevalier a Lechevalier a s definicí tohoto rodu, jak to navrhl Kroppenstedt a spol., v Taxonomie Revision of the Actinomycete Genera Actinomadura and Microtetraspora. Systém. Appl. Microbiol. , 13 , 148-160 (1990), takže kmen AB 1236 byl identifikován jako species Actinomadura.

III. Výroba antibiotika

BMY-28960 a desxylosyl-BMY-28960 lze produkovat působením kmene AB 1236 za podmínek, běžně používaných při výrobě fermentačních produktů. Produkující organismus roste na živném prostředí, obsahujícím asimilovatelný zdroj D-serinu navíc k známým živným zdrojům pro aktinomycety, t.j. asimilovatelné zdroje uhlíku a dusíku a navíc případně anorganické soli a další známé růstové faktory. Při výrobě velkých množství antibiotika se využívají s výhodou submerzní aerobní podmínky, i když se při přípravě menších množství mohou použít také povrchové kultury a láhve.

Jako asimilovatelný zdroj D-serinu se může použít bud přímo D-serin nebo DL-serin. Jako příklady asimilovatelných zdrojů uhlíku lze uvést glycerol, z cukrů ribózu, glukózu, sacharózu a cellobiózu, dále škrob, případně další sacharidy, jako je dextran. Jako příklady asimilovatelných zdrojů dusíku lze uvést chlorid amonný, síran amonný, močovinu, dusičnan amonný, dusičnan sodný, dále organické zdroje dusíku, jako je pepton, masový výtažek, extrakt z kvasnic, kukuřičný vývar, prášek ze sojových bobů, moučka z bavlněných semen a podobné zdroje. Je-li to vhodné, mohou se přidávat anorganické soli, jako je chlorid kobaltnatý a fosforečnan draselný. Dále se produkce antibiotika zvýší přidáním threoninu do produkčního prostředí; v takovém případě se může použít D-threonin, L-threonin nebo jejich směs. Přidáním D-cykloserinu se ještě více zvýši produkce antibiotika. Jako výhodné kapalné prostředí lze uvést některé z těch, jak jsou popsány v příkladech 2 nebo 3. Další vhodné kapalné prostředí se skládá z glukózy a/nebo glycerolu (1-4 %), pharmedia (1-3 %), dihydrogenfosforečnanu draselného (0,1-0,2 %) a D-serinu (0,1-0,2 %). Z činidel proti tvorbě pěny se dají použít adekanol, silikon a další podobná činidla.

Při výrobě antibiotika se může postupovat za jakékoli teploty, jež je spojena s uspokojivým růstem produkujícího organismu. Zpravidla se dochází k nejvýhodnější produkci antibiotika za použití potřásaných lahví po inkubační době 5-14 dnů, i když v některých případech mohou být nutné doby delší. Provzďušňování v třepacich lahvích se dociluje pohybováním, např. protřepáváním

-7CZ 281277 B6 na rotační třepačce. Má-li se fermentování provádět ve fermentačních tancích, pak je žádoucí připravit předem vegetativní očko na živné zápaře očkováním kultury zápary ze skloněné kultury nebo z lyofilizované kultury organismu. Jakmile se získá tímto způsobem aktivní očko, pak se přenese asepticky do fermentačního tanku a tamního prostředí. Pohyb v tankovém fermentačním zařízení se dociluje mícháním a provzdušnění se dá provádět injikováním vzduchu nebo i kyslíku do míchané směsi. Vzestup tvorby antibiotika se dá sledovat použitím chromatografických nebo spektroskopických postupů, nebo za použití běžných biologických testů. Jako výhodné fermentační podmínky lze pro aerobní kultivování uvést pH 5-8 za teploty 20-37 ’C po 5-14 dnů, s výhodou pH 6-7 za teploty 28-35 °C po dobu 5-12 dnů.

Ačkoliv tento vynález popisuje výrobu antibiotika působením specifického kmene mikroorganismu, je obecně známo, že taxonomické vlastnosti Actinomycet lze obměňovat přirozeně nebo uměle. Takže se má za to, že tento vynález není jakkoli omezován citovaným konkrétním organismem, ale zahrnuje varianty a mutanty, které lze odvodit od uvedeného kmene různými a četnými umělými postupy, jako je účinek ultrafialového záření a ozařování X-paprsky, nebo chemickými mutagenními činidly, jako je N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin. Takto vyrobené mutanty a varianty lze získat pro výrobu antibiotika za použití postupů, jež byly zde již popsány v předchozím výkladu.

IV. Izolace a čištěni antibiotika

Z kultivačních zápar lze izolovat BMY-28960 a desxylosyl-BMY-28960 běžnými postupy, jak se používají při izolování hydrofilních kyselých látek. Jako příklady takových postupů lze uvést extrahování do organického rozpouštědla, iontoměničové pryskyřice, rozdělovači chromatografii a kyselé srážení. Tyto postupy se mohou použit jako takové či v kombinaci. Příkladný postup izolování a čištění je dále ještě popisován. Po skončení fermentování se pH zápary upraví na 2,0, sraženina se odstředí nebo odfiltruje. Z kapaliny nad sedlinou nebo z filtrátu se adsorbuje účinná látka na vysoce porézní polymerní pryskyřici, jako je Diaion HP-20 (Mitsubishi Kasei Co), načež se provede eluování vodou, lépe organickým rozpouštědlem, mísitelným s vodou, jako je methanol nebo aceton. Takto získaný eluát se zahustí a lyofilizovánim se získá surový komplex antibiotika. Pro další čištění se může surový materiál nanést na silikagelovou kolonu s reverzní fází, jako je YMC-ODS A60 (Yamamura Chemical Lab.), s následujícím eluováním směsí acetonitrilu a 0,02 M fosfátového pufru při pH 7,0. Frakce, obsahující BMY-28960, se spojí a odsolením se získá čistý BMY-28960. Podobným způsobem izolace a čištění se dá získat desxylosyl-BMY-28960, ale s výhodou se fermentační zápara neokyselí.

V. Fyzikálně-chemické vlastnosti antibiotika

BMY-28960, získané postupem podle tohoto vynálezu má tyto fyzikálně-chemické vlastnosti, jež jsou jinak totožné s oněmi antibiotiky BMY-28960, získanými polosynteticky, jak je uvedeno v Evropském patentovém spisu 432 257.

-8CZ 281277 B6 (1) Vzhled: amorfní, temně červenavo-oranžový prášek.

(2) t.t. nad 220 ’C za postupného rozkladu.

(3) FAB-MS (pozitivní): m/z 844 (M + H)⁺.

(4) Molekulární vzorec: C₃gH₄₁NO₂₀.

(5) Ultrafialové abs. spektrum: Amax nm (e).

0,02 N NaOH:MeOH (1:0:211 (34,700), 320 (15,100), 498 (14,100) (6) Infračervené spektrum: viz obr. 1.

(7) Rozpustnost v rozpouštědlech:

látka je rozpustná: dimethylsulfoxid, N,N- dimethylformamid a alkalizovaná voda, látka je mírně rozpustná: ethanol, methanol a aceton, látka je nerozpustná: ethylacetát, benzen, chloroform, okyselená voda atd.

(8) Chromatografie na tenké vrstvě (silikagelová destička) Rf = 0,24 (methylacetát : n. propanol : 28% vodný roztok amoniaku - 45 : 105 : 60).

(9) Vysokotlaká kapalinová chromatografie kolona: Cosmosil 5C₁₈-AR, 5 μπι, 46 MM I.D. x 150 mm; eluujicí činidlo: CH₃CH: 0,02 mol fosfátový pufr o pH

7,0 (15:85); průtoková rychlost: 1,0 ml/min; UV detekce: 254 nm; retenční doba: 11,5 min;

vnitřní standard: pradimicin A (retenční doba 9,7 min).

(10) ^XH NMR-spektrum: viz obr. 2.

(11) ¹³C NMH-spektrum: viz obr. 3.

Desxylosyl BMY-2890 má tyto dále uvedené fyzikálně-chemické vlastnosti:

(1) Vzhled: temně červeno-oranžový prášek.

(2) t.t. nad 180 ’C.

(3) HR-FAB-MS (pozitivní): m/z 712.1871 (M+N)⁺.

(4) Molekulární vzorec: C₃₄H₃₃NO₁₆.

(5) Ultrafialové abs. spektrum, Amax nm (e):

v H₂O-MeOH-DMSO (4,5:4,5:1): 470 (10.100), v 0,02 N HCl-MeOH-DMSO (4,5:4,5:1): 461 (10.600) v 0,02 N NaOH-MeOH (1:1): 213 (31.500), 242 (30.100), 320 (13.600), 498 (12.600).

(6) Infračervené spektrum ^max⁰¹¹¹ ¹ (^v bromidu draselném, viz obr. 4.

(7) Rozpustnost v rozpouštědlech látka je rozpustná v dimethylsulfoxidu, dimethylformamidu a alkalizované vodě, látka je mírné rozpustná: ethanol, methanol, aceton a acetonitril, látka je nerozpustná: okyselená voda, n-butanol, ethylacetát, chloroform a další obvyklá organická rozpouštědla .

(8) ¹H NMR-spektrum: viz obr. 5.

-9CZ 281277 B6

VI. Biologická účinnost antibiotika

Antifungální účinnosti (in vitro), jak byly zjištěny pro BMY-28960 a desxylosyl-BMY-28960, získané fermentačním postupem podle tohoto vynálezu, byly stanoveny běžným postupem ředění na agaru, na morfologickém agaru s kvasnicemi s obsahem 1/15 M fosfátového pufru (pH 7,0). Výsledky jsou v tabulkách 4 a 5.

Tabulka 4

Antifungální účinnost in vitro BMY-28960

Testovaný organismus BMY-28960 Amfotericin B Ketoconazol

Saccharomyces cerevisiae

ATCC 9763	3,1	0,4	100
Candida albicans A9540	6,3	0,4	25
ATCC 38247 '	1,6	6,3	6,3
ATCC 32354 (B311)	3,1	0,2	50
83-2-14
(Juntěndo)	12,5	0,4	25
Candida tropicalis 85-8
(Kitasato)	12,5	0,4	100
IFO 10241	3,1	0,4	50
Cryptococcus neoformans D49	3,1	0,4	6,3
IAM 2034
	6,3	0,4	6,3
Aspergillus fumigatus IAM 2034	6,3	0,4	3,1
Trichophyton mentagrophytes
4329	6,3	0,4	0,8

Prostředí: Morfologický agar s kvasnicemi + 1/15 M fosfátový pufr (pH 7,0).

Velikost očka: 10⁶ buněk/ml (10⁷ buněk/ml pro T.mentagrophytes). Inkubační podmínky: 28 °C, 40 hodin (60 hodin pro T.mentagrophytes ) .

-10CZ 281277 B6

Tabulka 5

Antifungální účinnost in vitro desxylosyl-BMY-28960

Testovaný organismus Desxylosyl- BMY-28960	BMY-28960	Amfotericin B
Saccharomyces cerevisiae
ATCC 9763	3,1	1,6	0,8
Candida albicans A9540	3,1	3,1	0,8
IAM 4888	3,1	3,1	0,8
ATCC 32354
(B311)	3,1	3,1	0,8
83-2-14
(Juntendo)	1,6	3,1	0,8
Candida tropicalis 85-8
(Kitasato)	1,6	12,5	1,6
IFO 10241	6,3	12,5	1,6
Cryptococcus neoformans D49	1,6	3,1	0,8
sp. IAM 4514	3,1	1,6	0,8
Aspergillus Fumigatus IAM
2034	6,3	3,1	0,8
Trichophyton mentagrophytes
4329	6,3	3,1	1,6

Prostředí: morfologický agar s kvasnicemi 1/15 M fosfátový pufr (pH 7,0)

Velikost očka: 10⁶ buněk/ml, (10⁷ pro T.mentagrophytes)

Inkubačni podmínky: 28 “C, 40 hodin (60 hodin pro T.mentagrophytes ) .

Účinnost BMY-28960 proti Candida albicans in vivo byla sledována systematickým infikováním samečků ICR myší (hmotnost těla 20-24 g). Pro každou sledovanou dávku byla použita skupina pěti myší. Myším byla intravenózně podána desetinásobná střední smrtelná dávka patogenního organismu, suspendovaného v solném roztoku a bezprostředně potom bylo intravenózně podáno antibiotikum BMY-28960. Střední ochranná dávka (protective dose, PD₅₀) byla propočtena z poměru přeživších, jak to bylo zaznamenáno 21. dne. Výsledky jsou zahrnuty v tabulce 6.

Tabulka 6

Účinnost proti C.Albicans A 9540 in vivo při systematickém •infikování myší.

Látka ^pd50 intravenózně)

BMY-289606,7

Pradimicin A10

Amfotericin B0,31

Fluconazol nad 50

-11CZ 281277 B6

ICR-myši dobře snášejí BMY-28960; nejeví se zde ani úmrtnost ani patrné vedlejší účinky při intravenóznim podávání BMY-2860 až do dávky 600 mg/kg.

Další příklady jsou připojeny v úmyslu názorně doložit postup podle tohoto vynálezu a nemají v žádném směru omezovat rozsah tohoto vynálezu.

Příklad 1

Vypěstování kultury

Ze zásobní kultury produkčního organismu Actinomadura sp. AB 1236 (ATCC 55208) se nanesou proužky na YSM-agarové řezy a po inkubování 2 týdny při 37 °C se přenese očko kmene do 500-ml Erlenmeyerovy baňky, obsahující 100 ml prostředí se složením: 0,5 % glukózy, 2 % rozpustného škrobu, 0,2 % extraktu z kvasnic, 0,3 % NZ-case, 0,5 % extraktu z rybí moučky D30X (Banyu Eiyou

K.K. a 0,3 % uhličitanu vápenatého; hodnota pH prostředí se upraví před autoklávovánim na 7,0. Kultura se pak inkubuje na rotační třepačce 5 dní při 32 °C a použije se jako základní kultura.

Příklad 2

Fermentování v baňkách

Dávka (5 ml) základní kultury, jak byla popsána v příkladu 1, se přepraví do Erlenmeyerovy baňky o objemu 500 ml, jež obsahuje 100 ml produkčního prostředí tohoto složení: 2 % glycerolu,

1,5 % Esusan mi-to (moučka ze sojových bobů, Ajinomoto Co., Inc.), 0,0025 % monohydrogenfosforečnanu draselného, 0,1125 % dihydrogenfosforečnanu draselného 0,0005 % hexahydrátu chloridu kobaltnatého a 0,125 % D-serinu, jakož i 10 μg/ml D-cykloserinu (Wako Pure Chemical Industries Ltd.). Kultura se inkubuje na rotační třepačce (200 otáček za minutu) 12 dní při 28 “C; za tu dobu dosáhne produkce BMY-28960 530 μg/ml.

Příklad 3

Fermentování v baňkách (vliv přidaného threoninu)

Dávka (5 ml) základní kultury, jak bylo popsáno v příkladu 1, se přepraví do Erlenmeyerovy baňky o objemu 500 ml, jež obsahuje 100 ml produkčního prostředí tohoto složení: 2 % glycerolu,

1,5 % Pharmedia (Traders Protein), 0,1 % dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,2 % L- nebo D-threoninu, 0,0005 % hexahydrátu chloridu kobaltnatého, 0,2 % D-serinu a 10 μg/ml D-cykloserinu. Kultura se inkubuje na rotační třepačce (200 otáček za minutu) 11 dni při 28 ”C. K ozřejmění vlivu threoninu na produkci BMY-28960 byl proveden postup fermentování, ale za nepřítomnosti threoninu.

-12CZ 281277 B6

Výsledky jsou tyto:

Aminokyselina L-threonin D-threonin

Produkce BMY-28960

II

1008 ug/ml 954

780

Příklad 4

Izolování a čištění BMY-28960

Fermentační zápara objemu 2,0 1 z příkladu 2 se okyselí přidáním 6 N roztoku chlorovodíku na pH 2,0 a odstředí. Kapalina nad sedlinou (1,7 litrů) se nanese na kolonu 300 ml Diaion HP-20, kolona se promyje nejprve za použiti 1,5 litrů vody a potom se eluuje 1,6 litry methanolu. Eluát se zahustí, načež se lyofilizováním získá 2,1 g surového pevného podílu. Ten se rozpustí v litru vody, přidáním 1N roztoku hydroxidu sodného se upraví hodnota pH na 6,3, roztok se nanese na kolonu Diaion HP-20, načež se kolona promyje nejprve směsí 0,002 N roztoku chlorovodíku a acetonu (1:1) a potom se eluuje litrem směsi 0,002 N roztoku hydroxidu sodného a acetonu (1:1). Zahuštěním eluátu se získá 690 mg pevných podílů. Část (400 mg) se rozpustí ve směsi acetonitrilu a 0,02 M fosfátového pufru o pH 7,0 (12,5 : 87,5, použije se ml) a provede se chromatografování na koloně YMC-gelu, ODS A 60 (Xamamura Chemical Lab) o objemu 500 ml. Ta byla uvedena do rovnovážného stavu použitím téže soustavy rozpouštědel. Eluování se provádí týmž rozpouštědlem. Frakce, obsahující BMY-28960, se zahustí, zbaví solí na Diaionu HP-20 a dalším lyofylizovánim se získá 82 mg BMY-28960.

Příklad 5

Izolování a čištění desxylosyl-BMY-28960

1 zápary kultury, jak byla získána fermentováním kmene AB 1236 za přítomnosti D-serinu, se odstředí. Kapalina nad sedlinou (27 1) se pustí kolonou 3,8 1 Diaionu HP-20. Pryskyřice se promývá postupně použitím 8 1 80% vodného acetonu a směsí acetonu a 0,01 N roztoku chlorovodíku (60:40) v množství 12 1, načež se eluovánim směsí acetonu a 0,01 N roztoku hydroxidu sodného (60:40) v množství 12 1 získá 16,04 g surového pevného podílu. 2 g tohoto komplexu se rozpustí v 200 ml směsi acetonitrilu a 0,02 M fosfátového pufru o pH 7,0 (13:87) a roztok se nanese na kolonu YMC-gelu, ODS A60 (10 1, Yamamura Chemical Lab), který byl uveden do rovnovážného stavu použitím téže rozpouštědlové soustavy. Eluování se provede stejnou rozpouštědlovou soustavou, jak byla použita k rozpuštění vzorku a eluáty se sledují použitím vysokotlaké kapalinové chromatografie na koloně Cosmosilu 5C₁₈AR, 5 μιη, 4,6 mm vnitřní průměr na 150 mm, Nacalai Tesque lne., mobilní fáze : směs acetonitrilu a 1/15 M fosfátového pufru o pH 3,5 (27:71), průtoková rychlost 1,0 ml/min, detekce: Absorbce v UF oblasti při 254 nm, retenční doba: desxylosyl-BMY-28960:

8,3 min, BMY-28960: 7,6 min. Rychleji eluovaná červená frakce (3,7 1), obsahující desxylosyl-BMY-28960, se zahustí a provede se

-13- ’ chromatografování na koloně Diaionu HP-20 (30 ml) za použití směsi acetonu a 0,1 N roztoku hydroxidu sodného (60:40) v množství 50 ml k eluování. Červeně zbarvené eluáty se zahustí a lyofilizováním se získá 29 mg pevného podílu. 30 ml vodného roztoku vzorku se okyselí přidáním 0,1 N roztoku chlorovodíku na pH 2,5, čímž se vyloučí 19 mg čistého desxylosyl-BMY-28960.

Claims

1. Způsob výroby antibiotika vzorce kde R znamená vodík nebo β-D-xylosylovou skupinu, vyznačující se tím, že se pěstuje kmen Actinomadura AB 1236, uložený v Američan Type Culture Collection pod označením ATCC 55 208, v prostředí, jež navíc obsahuje D-cykloserin a threonin.

2. Kultura mikroorganismu Actinomadura AB 1236 s identifikačními charakteristikami ATCC 55208, schopná produkovat antibiotikum dle nároku 1.