JPH01277493A - 新規物質ｒｋ−６９９ａ、その製造法および農園芸用殺菌剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規物質ＲＫ−６９９Ａ、その製造法およびこ
れを有効成分とする農園芸用殺菌剤に関する。

〔発明の背景〕

土壌微生物の代謝産物には農薬用として利用しうるちの
が数多く見出されている。

本発明者らは従来より上記の如き有用な代謝産物の探索
を目的として多数の土壌中から微生物を分離しその代謝
産物について精製、同定および用途の開発を行ってきた
。

その結果、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ）属に属する微生物の代謝産物中に文献未載の新規物
質が産生、蓄積されることの知見を得、その単離、精製
に成功した。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、新規な物質、該物質を放線菌ストレプ
トミセス属に属する微生物から分離・採取する方法およ
び該物質を有効成分とする農園芸用殺菌剤を提供するこ
とにある。

〔発明の構成〕

〈使用する微生物〉 まず、本発明において用いる微生物は、新規物質ＲＫ−
６９９Ａの生産能を有するものであり、ストレプトミセ
ス属に属する菌種である。

その−例として、ストレプトミセス・エスピー・Ｎｏ、
６９９　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、１ＩｋＬ
６９９）　　（以下“Ｎｏ、６９９株°゛という）と呼
称される微生物は上記の特性を有し、本発明の新規物質
ＲＫ−６９９Ａを有利に生産するものであり、本発明方
法に有効に利用し得るものである。

また、上記Ｎｏ、６９９株の自然的及び人工的変異株は
勿論、ストレゾ１ヘミセス属に属する菌種で後述の新規
物質ＲＫ−６９９Ａの生産能を有する微生物はずべて本
発明方法において使用することができる。

上記陽６９９株は、本発明者により埼玉県栗橋町で採取
された土壌中より発見された土壌放線菌であり、工業技
術院微生物工業技術研究所に昭和６３年４月１日付受託
され、その微生物受託番号は、微工研菌寄第９９７９　
（ＰＥＲＭ　　Ｐ−９９７９）である。

上記陽６９９株は、次の菌学的性質を有する。

１、形態的特徴 本菌株は埼玉県栗橋町に於て採集した土壌より分離され
たもので、本菌株の菌体塩酸加水分解物はり、Ｌ−ジア
ミノピメリン酸を与える。

本菌株を寒天培地上にて発育させたものは、螺旋状の気
菌糸を豊富にもち長い胞子鎖を形成する。胞子の表面は
スビニーであり、本菌株はスターチ・イース１−寒天、
イーストエキス・マルツエキス寒天、スターチ無機塩寒
天培地上によく発育し、気菌糸はうすい桃色を呈する。

オートミール寒天、シュクロース・硝酸塩寒天、グルコ
ース・アスパラギン寒天、グリセロール・アスパラギン
寒天、栄養寒天培地上に発育するが、グルコース・アス
パラギン寒天、グリセロール・アスパラギン寒天、栄養
寒天培地での気菌糸の着生は少ないか、またはない（表
１）。

炭素源としてグルコース、フラクトース、キシロース、
シュクロース、はよく利用し、ラフィノース、マンニト
ールも利用するがアラヒノース、イノシトール、ラムノ
ースの利用はうたがわしい（表２）。澱粉の加水分解、
脱脂乳のべ１１〜ン化は認められるがゼラチンは利用せ
ずチロシン寒天と、ペプトン・イーストエキス・鉄寒天
培地でメラノイド色素の生成が認められた。

以上のことから本菌株はストレプトミセスに属する。本
菌株を各種寒天培地上で２７℃３週間培養したものの生
育状態は次の様である。

（Ｇ：発育、ＡＭ：気菌糸の色調、Ｒ：裏面の色調、Ｓ
Ｐ：可溶性色素の生成、色調はディスクリティブ・カラ
ー・ネームズ・デイクシＪナリによる。） ２、各種培地での生育状態 １）スターチ・イースト寒天培地 Ｇ　：良好 ＡＭ：豊富、７ｂａ−ピンク　ナンド（ｐｉｎｋｔｉｎ
ｔ） Ｒ：５ｐｎ−ダークブラウン ＳＰ：褐色 ２）イーストエキス・マルツエキス寒天培地Ｇ　：良好 ＡＭニアｃｂ−クラウド　ピンク（Ｃ１ｏｕｄ　ｐｉｎ
ｋ）ＲニアＶ２ｐｇ−ワイン ＳＰ：赤色 ３）オートミール寒天培地 Ｇ　：不良 ＡＭ：８ｅｃ−ローズ　ミスト（ｒｏｓｅ　ｍ１ｓｔ）
Ｒ：５ｈａ−シェル　ピンク（ｓｈｅｌｌ　ｐｉｎｋ）
ＳＰ：無色 ４）スターチ無機塩寒天培地 Ｇ　：普通 ＡＭ：５ｄｃ−トーン　ピンク（ｄａｉｉｎ　ｐｉｎｋ
）Ｒ：２ｆｂ＝ハフ（ｂｕｒｆ） ＳＰ：無色 ５）シュクロース・硝酸塩寒天培地 Ｇ　：不良 ＡＩｖＩ：２ｄｂ−フイボリイ Ｒ：２ｄｂ−アイボリイ ＳＰ：無色 ６）グルコース・アスパラギン寒天培地Ｇ　；不良 へＭ：着生せず Ｒ’　　：２ｆｂ−八ツ（ｂｕｆｆ） ＳＰ；無色 ７）グリセロール・アスパラギン寒天培地Ｇ　：不良 へＭ：着生せず Ｒ：３ｇｃ−ライト　タン（ｌｉｇｈｔ　ｔａｎ）ＳＰ
：無色 ８）栄養寒天培地 Ｇ　：不良 ＡＭ：着生せず Ｒ：２ｄｂ−アイボリイ　（ｉｖｏｒｙ）ＳＰ：無色 ３、炭素源の利用 利用 Ｄ−グルコース　　　　　　」−＋ Ｄ−フラクトース　　　　　→−＋ Ｄ−キシロース　　　　　　」−十 シュクロース　　　　　　　＋＋ Ｌ−アラビノース　　　　　　± イノシトール　　　　　　　　± Ｌ−ラムノース　　　　　　　± ラフィノース　　　　　　　　＋ Ｄ−マンニトール　　　　　＋ （＋＋・・・生育良好、＋・・・生育普通、±・・・生
育不良） 以上の性質を有するストレプトミセス属のものはストレ
プトミセス・バブラセンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ）が最も近縁のものである（
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｒｉｏｌｏＨｙ上１．３
９１　　（１９６９）による）。

〈培養法及び精製法〉 本発明の新規物質ＲＫ−６９９Ａを得るに当っては、ス
トレプトミセス属に属する上記新規物質生産菌を、抗生
物質を生産させる通常の方法で培養すればよい。培養の
形態は、液体培養でも固体培養でもよく、工業的に有利
に培養するためには、前記生産菌の胞子懸濁液又は培養
液を培地に接種し、通気攪拌培養を行えばよい。

培地の栄養源としては特に限定されることはなく、微生
物の培養に通常用いられる炭素源、窒素源その他を培地
中に含有させることができる。炭素源としては、澱粉、
デキストリン、グリセリン、グルコース、シュクロース
、ガラク１−−ス、イノシトール、マンニト−ルなどが
、また窒素源としては、ペプトン、大豆粉、肉エキス、
米ぬか、麩、尿素、コーンステイープリカー、アンモニ
ウム塩、硝酸塩、その他の有機または無機の窒素化合物
が用いられる。その他、無機塩類、たとえば食塩、燐酸
塩類、カリウム、カルシウム、亜鉛、マンガン、鉄等の
金属塩類等を適宜に添加してもよく、必要に応じて消泡
剤として、動、植、鉱物油等を添カロしでもよい。培養
温度、培養時間等の培養条件は使用菌の発育に適し、し
かもＲＫ−６９９Ａの生産が最高となるような条件が選
ばれる。たとえば、培地のｐＨは６〜７が好ましく、培
養の適温は２５〜３５℃程度がよい。しかし、これらの
培養組成物、培地の水素イオン濃度、培養温度、攪拌条
件などの培養条件は使用する菌株の種類や、外部の条件
などに応じて好ましい結果が得られるように適宜調節さ
れるべきであることはいうまでもない。このようにして
得られる代謝産物から、ＲＫ−６９９Ａを得るには、代
謝産物を採取するのに通常用いられる手段を適宜に利用
して採取し得る。たとえば、ＲＫ−６９９Ａと不純物と
の溶解度差を利用する手段、イオン結合力の差を利用す
る手段、吸着親和力の差を利用する手段、分子量の差を
利用する手段のいずれも、それぞれ単独、又は、適宜組
合わせて、あるいは反復して使用される。具体的には、
ＲＫ−６９９Ａは、菌体中にその大部分が存在する。菌
体をアセトンで抽出し、アセトンを溜去しブタノールで
抽出した後、減圧下濃縮乾固してＲＫ−６９９への粗粉
末を得る。

得られた粗粉末をシリカゲル、セファデックス、トヨパ
ール等のカラムクロマトグラフィーにより精製すること
ができる。カラムクロマトグラフィ−は前記のものを組
み合わせて行うことが好ましい。更に、高速液体クロマ
トグラフィーによる溶出物から単離したＲＫ−６９９Ａ
を■ＲＣ５０のカラム等に吸着させて脱塩し、凍結乾燥
させて、ＲＫ−６９９Ａの純物質を得ることができる。

かくして得られたＲＫ−６９９Ａの理化学的性質及び生
物学的性質は、次のとおりである。

＜ＲＫ−６９９Ａの理化学的性質および生物学的性質〉 （イ）形　状：白色粉末 （口）分子量：１７２５（ＳＩＭＳによる）（ハ）融　
点：２４５〜２９５℃（徐々に黄変する）（二）元素分
析：炭素５　５．　０　５％、水素６４０％、窒素１３
．６７％ （ハロゲン、硫黄を含まない） （ホ）比旋光度：　〔α）ｌ［ｌ　　−３１°　（Ｃ＝
０．５、メタノール） （へ）アミノ酸分析：アスパラギン酸、セリン、グルタ
ミン酸、クリシン、アラニン、 イソロイシン、リジン、トリプトフ アン（６Ｎ−ＨＣｆｆｉ、１１０℃、 ２０時間の加水分解） （ト）紫外部吸収スペクトル：λｍａｘ　ｎｍ　（Ｅｌ
ｃｍ　）第１図のとおり ＭｅＯＨ２２２ｎｍ　（４４，５） ２８４肩（１４４） ２９５屑（１３７） ３０５層（１０９） ０、　Ｉ　Ｎ−１（Ｃ＃−ＭｅＯＨＣｌ：　４）２２２
層ｍ（４６１） ２８４肩（１５３） ２９５肩（１４６） ３０５肩（１１９） ０．１Ｎ−ＮｌＮ−Ｎａ０Ｈ−（１：　４）２２２ｎｍ
　（４４７） ２８２層（８９） ２９５肩（８１） ３４８肩　（１５０） （チ）光外部吸収スペクトルニジｍａｘ第２図のとおり ３３００．３１００．２９８０．２９５０．１７２０．
１６５０．１５２０．１４５０．１３９０．１３３５．
１３００．１２７２．１２２８．１１７０．１１００．
１００８．８３２．８００．７４５゜ （す）溶解性　：メタノール、含水ブタノールに可溶、 水、酢酸エチルに難溶、 クロロホルム、アセトンに不溶 （ヌ）呈色反応：陽性：ライトン−スミス反応、過マン
ガン酸カリ反応、 ニンヒドリン反応、 ２．４．−ＤＮＰ反応 （）ト）塩基性、酸性、中性の区別：酸性物質（ｐＫａ
　：　２．　Ｔ、４．１．５．４．６．７（７０％メチ
ルセロソルブ中）） （ヲ）毒性：マウス腹腔内投与２００ｍｇで毒性を示さ
ない。

（ワ）Ｒｆ値：　シリカゲル薄層クロマトグラフィー（
Ｍｅｒｃｋ　ＦＺ５４） 溶媒系　　　　　　Ｒｆ値 ブタノール−メタノール−水　　　　　０．４（４：　
ｌ　：　２） ｎ−プロパノ−ルーピリジン−０，８ 酢酸−水（１０：　１０　：　３　：　ｌ　２）（力）
抗菌スペクトル二通常の寒天平板希釈法による検定を行
った。

〈他物質との比較〉 ６Ｎ−塩酸を用いた１１０℃、２０時間の加水分解によ
りアミノ酸分析装置でアスパラギン酸、セリン、グルタ
ミン酸、グリシン、アラニン、イア６ ソ ロイシン ているが、トリプトファンを含んだ既知のペプチドとの
比較において、アミノ酸組成と分子量が異なるのでＲＫ
−６９９−Ａは新規物質である。

〈農園芸用殺菌剤〉 本発明は、更にＲＫ−６９９Ａを有効成分とする各種農
作物、園芸作物の病害に対する殺菌剤に関する。

ＲＫ−６　９　９Ａは特にキュウリ炭痕病菌（Ｃｏｌｌ
ｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ　Ｉａｇｅｎａｒｉｕｍ）、ブド
ウ晩腐病菌（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ　ｃｉｒ＋ｇｕｌａ
ｔａ）に対し、著しい生育阻害作用を示す。

ＲＫ−６　９　９Ａを農園芸用殺菌剤として使用する場
合は、通常当該技術分野において知られている農薬製剤
と同様に適当な固体担体、液体担体、乳化分散剤等を用
いて粒剤、粉剤、乳剤、水和剤、錠剤、油剤、噴霧剤、
煙霧剤等の任意の剤型に製剤化して適用することが出来
る。これらの担体としては、クレー、カオリン、ヘン１
へナイト、酸性白土、珪藻土、炭酸カルシウム、固体担
体として、ニ１用コセルロース、デンプン、アラヒアゴ
ム等カ、また液体担体として水、メタノール、エタノー
ル、アセ１ヘン、ジメチルホルムアミド、エチレングリ
コール等が挙げられる。また、製剤上、一般に使用され
る補助剤、例えば、高級フルコールの硫酸エステル、ポ
リオキシエチレン、アルキル・アリルエーテル、アルキ
ル・アリル・ポリエチレン・グリコールエーテル タン・モノラウレー１−、アルキル・アリル・スルボネ
ート、アルキル・アリル・スルポン酸塩、第４級アンモ
ニウム塩、ポリアルキレンオキザイト等を適宜配合する
ことができる。

有効成分の配合割合は、乳剤、水和剤としては、１０〜
９０％程度が適当であり、粉剤、油剤等としては０．　
１〜１０％程度が適当であるが、使用目的によってこれ
らの濃度を適宜増減してもよい。

また、本発明の薬剤は、他の殺菌剤や除草剤、殺虫剤、
肥料物質、土壌改良剤と適宜混合して使用することがで
きる。

（実施例〕 実施例Ｉ ＲＫ−６９　９株（ＦＢＲＭＰ−９　９７　９）をグル
コース２％、可溶性デンプン１％、肉エキス０、１％、
酵母０．４％、大豆粉２．５％、食塩０．２％、第ニリ
ン酸カリウム０．　０　０　５％の組成の液体培地（Ｃ
４培地）に接種して、４８時間前培養した培養液を１５
βに対し１００ｍ４の割合で同培地に加え、ジャーノア
メンタ−中、２７°Ｃ、７２時間３　５　０ｒ．ｐ．ｍ
．ｉＪ！ｌ気量１８ｐ／分で通気攪拌培養を行った。

この培養液５０７！を濾過して濾液と菌体にわける。菌
体を８０％アセ１−ン５０βで抽出する。減圧下でアセ
トンを溜去し、５βになるまで濃縮する。濃１宿ン夜は
ｐｌ＋４．０に３周整し、５βのフ゛タノールで２回抽
出する。ｐＨ８．０の水１ｐで洗浄後、減圧下、濃縮乾
固すると３１．３ｇの粗粉末が得られた。

粗粉末をクロロボルムで充填したシリカゲルカラム（φ
５Ｘ３０ｃｍ）を用いてクロマトを行った。

クロロホルムの２ｐで洗滌したあとクロロホルム一メタ
ノールの比を（３０：１）から（１　：　］）まで順次
変えていくと、クロロボルム−メタノール（３１）から
（１　：　１）のところに活性の大部分は溶出した。活
性画分を集め、濃縮すると粗粉末８．０ｇが得られた。

このあとブタノール−メタノール−水（３：１：２）で
８周整したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｌｌ
ｌ−２０のカラム（φ５Ｘ１２０ｃｍ）に試料を８等分
し、１回に１ｇづつの試料でクロマトグラフィーを行っ
た。

このようにして粗粉末８．０ｇから７９０ｍｇの粗Ａ物
質が得られた。次にブタノール−メタノール−水（３　
：　Ｌ　：　２）で調整した１〜ヨパール（Ｔｏｙｏｐ
ｅａｒｌ）カラム（φ３Ｘ１２０ｃｍ）に１００ｍｇの
粗Ａ物質をかけクロマ１−を行うとＡ物質５３ｍｇが得
られた。同様に残りを処理し、白色粉末のＡ物質を３６
０ｍｇ得た。

このあとＯＤＳカラム（ψ２　０　Ｘ　３　０ｍ／ｍ）
を用いて高速クロマトグラフィーを行った。溶媒は０、
１％ジエチルアミンーギ酸緩衝液ｐｌ＋５．２を含む７
１％メタノール溶液を用いて流速５．２ｍβ／１６０ｋ
ｇで行うと、４２分後にＡ物質は溶出されてくる。単離
されたＡ物質は、大部分のメタノールを減圧下で溜去し
、そのままＩＲＣ５０（Ｈ）のカラト（ψ１．　８　Ｘ
２０ｃｍ）に吸着させる。水洗後、０、６Ｎ−ピリジン
水溶液で７容出し凍結乾燥すると、脱塩されたＡの純物
質１２０ｍｇが得られた。

実施例２ 次に本発明の農業用殺菌剤の製剤例を示す。製剤例中「
部」は重量部を表わす。

（製剤例１−永和剤） ＲＫ−６９９Ａ１０部、ラウリル硫酸すトリウム５部、
ジナフチルメタンジスルホン酸ソーダポルマリン縮金物
２部およびクレー８３部を混合粉砕して水和剤１００部
を得る。

（製剤例２−乳剤） ＲＫ−６９９Ａ８合トコニチレングリコール１０部、ジ
メチルポルムアミド２０部、アルキル・ジメチルペンシ
ル・アンモニウムクロライド１０部およびメタノール５
２部を混合溶解して乳剤１００部を得る。

試験例 水和剤を使用した圃場試験においてキュウリの炭痕病に
ついては次表のような結果が得られた。

表

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＲＫ−６９９Ａの紫外部吸収スペクトルを示
す図であり、第２図は、ＲＫ−６９９Ａの赤外部スペク
トルを示す図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質および生物学的性質を有する
   新規物質ＲＫ−６９９Ａ。 （イ）形状：白色粉末 （ロ）分子量：１７２５（ＳＩＭＳによる）（ハ）融点
   ：２４５〜２９５℃（徐々に黄変する） （ニ）元素分析：炭素５５．０５％、水素６．４０％、
   窒素１３．６７％ （ハロゲン、硫黄を含まない） （ホ）比旋光度：〔α〕＾２＾２＿Ｄ−３１゜（Ｃ＝０
   ．５、メタノール） （ヘ）アミノ酸分析：アスパラギン酸、セリン、グルタ
   ミン酸、グリシン、アラニ ン、イソロイシン、リジン、トリ プトファン（６Ｎ−ＨＣｌ、１１０ ℃、２０時間の加水分解） （ト）紫外部吸収スペクトル：λ＿ｍ＿ａ＿ｘｎｍ（Ｅ
   ＾１＾％＿１＿ｃ＿ｍ）ＭｅＯＨ２２２ｎｍ（４４５） ２８４肩（１４４） ２９０（１４８） ２９５肩（１３７） ３０５肩（１０９） ０．１Ｎ−ＨＣｌ−ＭｅＯＨ（１：４） ２２２ｎｍ（４６１） ２８４肩（１５３） ２９０（１６０） ２９５肩（１４６） ３０５肩（１１９） ０．１Ｎ−ＮａＯＨ−ＭｅＯＨ（１：４） ２２２ｎｍ（４４７） ２８２肩（８９） ２８９（９１） ２９５肩（８１） ３４８（１５０） （チ）赤外部吸収スペクトル：ν＾Ｋ＾Ｂ＾ｒ＿ｍ＿ａ
   ＿ｘ３３００、３１００、２９８０、２９５０、１７２
   ０、１６５０、１５２０、１４５０、１３９０、１３３
   ５、１３００、１２７２、１２２８、１１７０、１１０
   ０、１００８、８３２、８００、７４５。 （リ）溶解性：メタノール、含水ブタノールに可溶、 水、酢酸エチルに難溶、 クロロホルム、アセトンに不溶 （ヌ）呈色反応：陽性：ライドン−スミス （Ｒｅｙｄｏｎ−Ｓｍｉｔｈ）反応、 過マンガン酸カリ反応、 ニンヒドリン反応、 ２，４−ＤＮＰ反応 （ル）塩基性、酸性、中性の区別：酸性物質（ｐＫａ：
   ２．７、４．１、５．４、６．７（７０％メチルセロソ
   ルブ中））
2. （２）ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
   属に属する新規物質ＲＫ−６９９Ａ生産菌を培養し、そ
   の代謝産物から新規物質ＲＫ−６９９Ａを分離採取する
   ことを特徴とする請求項（１）記載の新規物質ＲＫ−６
   ９９Ａの製造法。
3. （３）請求項（１）記載の新規ＲＫ−６９９Ａを有効成
   分とする農園芸用殺菌剤。