CN102124120A - 透明质酸的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供以高收率简单地制备透明质酸的方法。此外，其目的还在于提供在短时间内制备透明质酸的方法。根据本发明，提供透明质酸的制备方法，其包括如下工序：培养具有透明质酸生产能力的微生物；以及在该微生物的对数增殖期后期，在培养液中添加谷氨酰胺和精氨酸。

Description

透明质酸的制备方法
技术领域
本发明涉及利用微生物制备透明质酸的方法。
背景技术
透明质酸除作为化妆品的保湿剂外，还在眼科、整形外科、皮肤科等领域中作为药品来使用。透明质酸能够用来自动物组织例如鸡的鸡冠、牛眼的玻璃体等的提取物进行制备，但由于混入作为夹杂物的硫酸软骨素等或者因组织内所含有的透明质酸酶等而易于被低分子量化，因此有人提出了通过培养具有透明质酸生产能力的微生物，由培养液制备透明质酸的方法(发酵法)(专利文献1)。与提取法相比，由发酵法制备的透明质酸是通过一定的原料、一定的方法进行制备的，因此，能够保持一定的产品品质，因而在产业上的利用价值较大。
而且，以工业透明质酸的生产为目的，有人开发出了使用了用于发酵法的含有各种培养基成分的培养基的发酵法(专利文献2-4)。专利文献2中记载了：使用对8种氨基酸进行了增量的培养基的发酵法，其中，上述8种氨基酸是作为透明质酸生产中的有效成分，是繁殖所必须的氨基酸。此外，专利文献3中记载了：使用对精氨酸和/或谷氨酸进行了增量的培养基的发酵法。此外，专利文献4中记载了：使用对精氨酸进行了增量的培养基的发酵法。
专利文献1：日本特公平4-12960号公报
专利文献2：日本特开平7-46992号公报
专利文献3：日本特开昭62-289198号公报
专利文献4：日本特开昭63-141594号公报
发明内容
但是，就现有的适合培养法的大多数培养基而言，其成分数较多，培养基配制繁杂，且从培养基分离和纯化透明质酸也较复杂等，因而作为工业生产方法期望进一步改善。此外，关于其他的现有技术方法，作为工业生产方法也期望进一步改善。
本发明鉴于上述情况而完成，其目的在于提供以高收率简单地制备透明质酸的方法。此外，其目的还在于提供在短时间内制备透明质酸的方法。
本发明人为解决上述目的而进行了专心研究，结果发现：在培养的特定时期，将精氨酸和谷氨酰胺组合并添加到培养液中，由此改善透明质酸的生产，从而完成了本发明。
即，根据本发明，提供包括如下工序的透明质酸的制备方法：培养具有透明质酸生产能力的微生物；以及在该微生物的对数增殖期后期，在培养液中添加谷氨酰胺和精氨酸。根据该制备方法，在培养的特定时期将精氨酸和谷氨酰胺组合并添加到培养液中，能够在短时间内以高收率简单地制备透明质酸。
根据本发明的透明质酸的制备方法，通过在培养具有透明质酸生产能力的微生物的特定时期将精氨酸和谷氨酰胺组合并添加到培养液中，能够在短时间内以高收率简单地制备透明质酸。
附图说明
图1是在培养用于生产透明质酸的微生物时的、培养液中的氨基酸浓度的曲线图。
图2是将一并添加了精氨酸的情况和后添加精氨酸的情况进行比较的曲线图，左侧的曲线图表示菌体浓度的随时间变化，右侧的曲线图表示粘度(透明质酸浓度的指标)的随时间变化。
具体实施方式
术语说明
本说明书中的“对数增殖期后期”是指微生物充分增殖后的状态，具体指对数增殖期的后半期至静止期(稳定期)。另外，“对数增殖期”是指在微生物的培养过程中，微生物每隔一定时间通过分裂进行增殖时细胞数的对数与时间呈线性关系的时期。对数增殖期的后期可由本领域技术人员采用已知的、任意的指标或方法进行判断。本发明并不简单地限于此，例如，也可以浊度或比增殖速度为指标进行判断。
本说明书中的“浊度”是通过培养液的浑浊情况(培养液中的菌体量)测定微生物增殖的、最普通简便且快速的测定方法。对培养液进行光照射并测定透射光由于散射及吸收而被阻抑的情况。用于生产透明质酸的微生物是微粒子，因此，微生物的量与培养液的浊度间存在正比关系。例如，浊度可进行如下测定。
向培养液入射波长为660nm的单波长的光，通过分光光度计测定透射光。这里，将入射光和透射光的强度分别设为I0、I，将透射层的厚度设为L，将吸光度设为τ，并将通过下式求出的吸光度定义为培养液的浊度(OD)。
[公式1]
I＝I0Exp(-τL)
另外，当培养前的培养基本身具有无法忽视的浊度时，可以从培养液的浊度减去对照培养基的浊度。
作为本说明书中的对数增殖期后期，采用培养液的浊度在660nm光波长条件下显示为0.5以上的时期。另外，作为上述对数增殖期，优选浊度显示为1.0以上的时期，更优选浊度显示为2.0以上的时期，进一步优选浊度显示为3.0以上的时期。
本说明书中的“比增殖速度”是指通过下式所定义的值。
[公式2]
Figure BPA00001299998300041
这里，菌体的世代时间是指生产透明质酸的微生物增殖为二倍所需要的时间。若生产透明质酸的微生物充分增殖，则由营养耗竭、代谢物的蓄积导致增殖速度下降，比增殖速度也降低。
作为本说明书中的对数增殖期后期，采用比增殖速度显示为0.5h-1以下的时期。另外，作为上述对数增殖期，优选比增殖速度显示为0.4h-1以下的时期，更优选比增殖速度显示为0.3h-1以下的时期，进一步优选比增殖速度显示为0.2h-1以下的时期，更进一步优选比增殖速度显示为0.1h-1以下的时期。另外，比增殖速度当然大于0h-1。
本说明书中的“链球菌属细菌”包括能够生产透明质酸的链球菌(Streptococcus)属的任意的细菌或其突变株，例如，可以列举但不限于：马链球菌(Streptococcus equi)、兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)、似马链球菌(Streptococcusequisimilis)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)以及它们的突变株等。
关于本说明书中的“谷氨酰胺”“精氨酸”“透明质酸”等化学物质的定义，如果没有特别说明，在不损害发明目的的范围内，还包括可使用的任意的盐(例如，可列举但不限于：钠盐、钾盐等金属盐；盐酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐等酸加合物等)、水合物、以及它们的混合物。
此外，关于本说明书中的各数值范围，分别包括由“～”所示的上限值和下限值。
实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明的某一实施方式为透明质酸的制备方法，其包括如下工序：培养具有透明质酸生产能力的微生物；以及在该微生物的对数增殖期后期，在培养液中添加谷氨酰胺和精氨酸。根据该制备方法，通过在培养后期一并添加精氨酸和谷氨酰胺，能够抑制高浓度精氨酸的环境对微生物繁殖的阻碍作用，并能够在短时间内以高收率制备透明质酸。此外，在本实施方式中，在培养开始后添加谷氨酰胺及精氨酸，由此，可使用普通的培养基而无需特别准备制备工艺繁杂的培养基。而且，由于不添加不必要的营养成分，因此可减轻透明质酸分离、纯化工序的负担，能够保持稳定的品质和生产性。
作为用于上述实施方式的培养方法，可以采用通常使用的培养方法。即，可在培养基中优选使用例如：含有葡萄糖、果糖、半乳糖及蔗糖等糖成分的碳源，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硝酸镁、亚硫酸钠、硫代硫酸钠及磷酸铵等无机盐类，多聚蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母膏、玉米浆及大豆水解液等有机营养源，并根据需要使用各种维生素类等。培养可以使用例如有氧的培养方法等已知的方法来进行，所述有氧的培养方法例如通气搅拌培养等。培养温度优选为30℃～35℃，但并不限于此。培养液的pH随微生物的繁殖而降低，因此，例如，可通过添加氢氧化钠、氢氧化钾、氨等pH调节剂将pH控制在7.0～9.0。
谷氨酰胺和精氨酸可以同时添加，也可以分别添加，还可以在不损害本发明的目的的范围内同时添加缓冲剂、盐等其它成分，但考虑到之后的分离、纯化工序等，优选需要纯化的成分越少越好，例如：除谷氨酰胺、精氨酸以外的营养成分或活性成分为0.001％以下，进一步优选为0.0005％以下或不含有。
此外，本发明的另一实施方式为上述的制备方法，其中，上述对数增殖期后期是培养液的浊度在660nm波长条件下显示为0.5以上的时期。在浊度达到0.5以上的时期添加谷氨酰胺和精氨酸，由此，能够更加可靠地提高透明质酸的收率。而且，优选在上述浊度显示为2.0以上的时期添加谷氨酰胺和透明质酸。在显示上述浊度的时期添加谷氨酰胺和精氨酸，由此能够以更高的收率得到透明质酸，其中，上述浊度是微生物充分增殖状态下的浊度。进一步优选在上述浊度显示为3.0以上的时期添加谷氨酰胺和精氨酸，由此能够可靠地提高收率、缩短时间。
此外，关于浊度，可以直接使用培养液的浊度，但在培养前的培养基等对照培养基的浊度大到无法忽视的情况下(例如，可以列举但不限于：0.01或0.05以上)，也可以将从培养液的浊度减去对照培养基的浊度而得到的浊度作为指标。作为对照培养基，可以使用培养前的培养基，也可以使用没有接种微生物的培养液。
另外，基于上述浊度的添加时期的定义是根据某一指标对时期范围所进行的具体例示，因而在上述条件下测定浊度的工序不一定是必须的。因此可知，理所当然，即使假设在测定600nm波长条件下的浊度并进行判断的情况下，上述实施方式仍包括：660nm波长条件下的浊度在上述实施方式的范围内的情况。
此外，本发明的另一实施方式为上述的制备方法，其中，上述对数增殖期后期是比增殖速度显示为0.5h-1以下的时期。通过在比增殖速度达到0.5h-1以下的时期添加谷氨酰胺和精氨酸，能够更加可靠地提高透明质酸的收率。而且，优选在上述比增殖速度显示为0.4h-1以下的时期添加谷氨酰胺和精氨酸。在显示上述比增殖速度的时期添加谷氨酰胺和精氨酸，由此能够以更高的收率得到透明质酸，其中，上述比增殖速度是微生物充分增殖状态下的比增殖速度。进一步优选在上述浊度显示为0.3h-1以下的时期添加谷氨酰胺和精氨酸，由此能够可靠地提高收率、缩短时间。
另外，基于上述比增殖速度的添加时期的定义是根据某一指标对时期范围所进行的具体例示，在上述条件下测定比增殖速度的工序不一定是必须的。
此外，本发明的另一实施方式为上述制备方法，其中，上述具有透明质酸生产能力的微生物是链球菌属细菌。通过使用具有透明质酸生产能力的、通常所使用的链球菌属细菌，能够简单且可靠地在工业上制备透明质酸。这里所使用的链球菌属细菌包括从自然界分离的链球菌属细菌以及其突变株。
而且，作为上述实施方式中的链球菌属细菌，可以优选使用马链球菌、马链球菌突变株FM-100(微工研条寄第9027号)或马链球菌突变株FM-300(微工研条寄第2319号)。通过使用这些以高收率稳定地生产透明质酸的菌株，能够以更高的收率、稳定的生产性制备透明质酸。
此外，上述实施方式中的谷氨酰胺的添加量在不损害本发明目的的范围内不受特别限定，但如果过量添加则效果的改善减小，因此谷氨酰胺优选为0.01-0.3％，更优选为0.05％以上、0.1％以上、和/或0.2％以下。通过使用该浓度范围的谷氨酰胺，能够更加可靠地起到提高收量及稳定化生产的效果。此外，通过使用上述上限值以下的谷氨酰胺，能够减轻之后的分离、纯化工序的负担。
此外，上述实施方式中的精氨酸的添加量在不损害本发明目的的范围内不受特别限定，但如果过量添加则效果的改善减小，因此精氨酸优选为0.01-0.2％，更优选为0.05％以上、0.1％以上、和/或0.1％以下。通过使用该浓度范围的精氨酸，能够更加可靠地起到提高收量及稳定化生产的效果。此外，通过使用上述上限值以下的精氨酸，能够减轻之后的分离、纯化工序的负担，并且还能够进一步强力防止由精氨酸引起的繁殖阻碍作用。
另外，通过上述实施方式说明的制备方法等并不对本发明进行限定，是为进行例示而公开的内容。本发明的技术范围由权利要求书所记载的范围决定，本领域技术人员可在权利要求书所记载的发明的技术范围内进行各种设计上的变更。
例如，上述制备方法还可以包括其他的工序，或者在上述制备方法之后实施其他的工序或方法。作为这样的工序或方法，例如，可以列举：利用活性炭或过滤等的除菌工序、中和工序、结晶化工序、利用色谱或离心分离等除去或纯化内毒素、蛋白质、核酸、金属等杂质等的工序等。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行进一步说明，本发明并不限于下述实施例。
首先，本发明所涉及的预实验的概要如下所示。这些预实验例采用与后述的实施例1类似的培养条件，并在相同的预实验内条件一致地进行研究。此外，在各实验的曲线图等中，将透明质酸记为“HA”，将谷氨酰胺记为“Gln”，将精氨酸记为“Arg”，将培养开始时预先在培养基中加入某种成分的情况记为“一并添加”，将培养开始后(特别是对数增殖期后期)在培养液中添加某种成分的情况记为“后添加”。此外，在部分实验例等中，以透明质酸相关的粘度作为指标来对透明质酸的生产量进行评价。
[预实验1]
对现有标准条件下的用于生产透明质酸的微生物的培养中各种氨基酸的浓度变化进行研究。将结果的曲线图示于图1。各种氨基酸随着培养时间的推移，根据种类的不同而显示出减少、固定、增加中的任一种变化情况，特别是观察到谷氨酰胺和精氨酸的量大幅减少，在标准的培养条件下，观察到它们被耗尽。
[预试验2]
基于预试验1的结果，考虑添加谷氨酰胺和精氨酸的情况，并进行了进一步的研究。精氨酸在该菌体内的机制不明，有报道称单一成分对透明质酸收量的提高没有帮助，并导致繁殖阻碍。因此，关于上述问题，考虑通过改良精氨酸的添加方法来进一步改善，并进行了研究。
其结果是，如图2的曲线图所示，培养时没有一并添加精氨酸而是进行后添加，由此，发现透明质酸的浓度(曲线图中，透明质酸浓度通过粘度进行评价)大幅提高。该精氨酸的实验结果可总结于下表。
[表1]
Figure BPA00001299998300091
[预实验3]
基于由以上的实验结果所得到的认识，在标准条件下，进行了后添加谷氨酰胺和精氨酸来培养用于生产透明质酸的微生物的实验。将该实验结果示于以下的表2。
[表2]
通过Gln和Arg的组合大幅提高透明质酸(HA)收量
如表2所示，观察到通过组合谷氨酰胺和精氨酸并进行后添加，透明质酸的生产量大幅提高。
[比较实验例1]
在与实施例1相同的条件下，进行以下所示的实施例1-4及比较例1-4的实验，计量透明质酸的浓度以及达到一定的透明质酸的浓度(以粘度进行评价)所需要的时间。结果如表3所示。
[表3]
Gln增量与Arg添加效果的研究结果
达到稳定期的时间：OD达到6.8以上、粘度达到7000mPs·s以上的时间，()内为达到最高粘度的时间
*表中的谷氨酰胺的量是表示在培养中添加的量。
[实施例1]
将1L含有1.5％的多聚蛋白胨和0.5％的酵母膏的培养基加热杀菌后，添加6％的葡萄糖、0.1％的磷酸氢二钾以及0.06％的谷氨酰胺从而达到培养初期的条件，接种马链球菌FM-100(微工研条寄第9027号)，在1vvm的条件下通入空气，并在搅拌速度500转/分钟、温度33℃、pH8.0(通过25％的氢氧化钠的自动滴入进行控制)的条件下开始培养。随着时间的推移采集培养液，并在培养液在660nm波长条件下浊度达到3.6、比增殖速度达到0.34h-1时添加0.1％的谷氨酰胺和0.05％的精氨酸。持续培养直到透明质酸的蓄积所引起的培养液的粘度上升停止。培养液的粘度上升停止后，使用硝酸将培养液调节至pH3，通过离心除去菌体，回收上清液。
为了对培养基中的透明质酸进行定量，将该上清液逐级稀释，并通过装备视差折射型检测器的体积排阻色谱法测定培养基中所含的透明质酸的浓度。培养基中的透明质酸获得6.2g/L的高收量，对于培养时间，透明质酸浓度达到4.0g/L的时间为17小时，时间较短。
[实施例2]
与实施例1相同地开始培养，添加0.1％的谷氨酰胺和0.1％的精氨酸。培养基中的透明质酸获得6.0g/L的高收量，对于培养时间，透明质酸浓度达到4.0g/L的时间为17小时，时间较短。
[实施例3]
与实施例1相同地开始培养，谷氨酰胺的添加量少于实施例1为0.04％，精氨酸的添加量为0.05％。在菌体浓度为OD5.3、比增殖速度为0.16的时期进行添加。由于谷氨酰胺的添加量较少，因此与实施例1、2相比，培养基中的透明质酸较少，但仍获得5.2g/L的高收量，对于培养时间，透明质酸浓度达到4.0g/L的时间为18小时，时间较短。
[实施例4]
与实施例3相同地开始培养，谷氨酰胺和精氨酸的添加情况与实施例3相同。在菌体浓度为OD7.0、比增殖速度为0.05的时期进行添加。培养基中的透明质酸获得5.0g/L的高收量，对于培养时间，透明质酸浓度达到4.0g/L的时间为18小时，时间较短。
[比较例1]
与实施例1相同地开始培养，未添加谷氨酰胺和精氨酸。培养基中的透明质酸为4.1g/L，收量较低，对于培养时间，透明质酸浓度达到4.0g/L的时间为23小时，时间较长。
[比较例2]
与实施例1相同地开始培养，仅添加了0.05％的精氨酸。对于培养时间，透明质酸浓度达到4.0g/L的时间为18小时，但培养基中的透明质酸为4.3g/L，收量较低。
[比较例3]
与实施例1相同地开始培养，仅添加0.1％的谷氨酰胺。培养基中的透明质酸为5.3g/L，收量较低。对于培养时间，透明质酸浓度达到4.0g/L的时间为21小时，时间较长。
[比较例4]
与实施例3相同地开始培养，谷氨酰胺和精氨酸的添加情况与实施例3相同。在菌体浓度为OD0.0001、比增殖速度为1.0的时期进行添加。培养基中的透明质酸为4.0g/L，收量较低。
[比较实验例2]
通过与上述实施例1-4及比较例1-4相同的方法(葡萄糖浓度为6％)，进行进一步的比较实验。将结果示于以下的表4。由该比较实验也可知，在对数增殖期后期，在培养液中添加了谷氨酰胺和精氨酸的情况下，透明质酸的生产量(表中HA浓度)增加。
[表4]
Figure BPA00001299998300131
*表中的谷氨酰胺量表示在培养中添加的量。
总结
由以上的实验可知，与现有技术相比，通过在对数增殖期后期在培养液中添加谷氨酰胺和精氨酸的方法能够在短时间内以高收率制备透明质酸。
以上，基于实施例对本发明进行了说明。该实施例仅为例示，可存在各种变形例，并且本领域技术人员能够理解这些变形例也属于本发明的范围。

Claims (8)

1.一种透明质酸的制备方法，其包括如下工序：培养具有透明质酸生产能力的微生物；以及在该微生物的对数增殖期后期，在培养液中添加谷氨酰胺和精氨酸。
2.如权利要求1所述的制备方法，其中，所述对数增殖期后期是培养液的浊度在660nm波长条件下显示为0.5以上的时期。
3.如权利要求1所述的制备方法，其中，所述对数增殖期后期是培养液的浊度在660nm波长条件下显示为2.0以上的时期。
4.如权利要求1所述的制备方法，其中，所述对数增殖期后期是比增殖速度显示为0.5h-1以下的时期。
5.如权利要求1～4中任一项所述的透明质酸的制备方法，其中，所述具有透明质酸生产能力的微生物是链球菌属细菌。
6.如权利要求5所述的透明质酸的制备方法，其中，所述链球菌属细菌为马链球菌、马链球菌突变株FM-100(微工研条寄第9027号)或马链球菌突变株FM-300(微工研条寄第2319号)。
7.如权利要求1～6中任一项所述的透明质酸的制备方法，其中，所述谷氨酰胺的浓度为0.01～0.3％。
8.如权利要求1～7中任一项所述的透明质酸的制备方法，其中，所述精氨酸的浓度为0.01～0.2％。
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