JPH0789915B2 - 微生物によるエンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダ−ゼの製造法 - Google Patents

微生物によるエンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダ−ゼの製造法

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JPH0789915B2
JPH0789915B2 JP62112059A JP11205987A JPH0789915B2 JP H0789915 B2 JPH0789915 B2 JP H0789915B2 JP 62112059 A JP62112059 A JP 62112059A JP 11205987 A JP11205987 A JP 11205987A JP H0789915 B2 JPH0789915 B2 JP H0789915B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 近年、生体内で複合糖質の糖鎖部分が細胞の分化・成
長、細胞間認識あるいは悪性腫瘍を含む多くの病気の発
症などに重要な役割を果たしていることが明らかにされ
てきている。複合糖質の内、糖タンパク質の糖鎖は、そ
のペプチド鎖への結合の仕方から、Ｎ−グリコシド結合
型とＯ−グリコシド結合型に分類される。この内Ｏ−グ
リコシド結合型糖鎖は主に血液型物質，免疫関与糖タン
パク質に存在している。最近Ｏ−グリコシド結合型糖鎖
はいろいろ重要な生理的機能を果たしている事が明らか
にされつつあるがその機能の解明には、糖鎖構造の究明
が必要不可欠である。こうした糖鎖構造の解析には、複
合糖質の糖鎖構造に高い基質特異性を有する各種のグリ
コシダーゼの利用が重要な手段となる。
エンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（以下
endo−α−GalNAcaseと略す。）は糖タンパク質のＯ−
グリコシド結合型の糖鎖に作用して、以下のように糖鎖
をタンパク質から遊離させる酵素である。
このようにendo−α−GalNAcaseはＯ−グリコシド結合
型糖鎖をタンパク質から遊離することができるため、糖
タンパク質糖鎖の構造解析に重要な手段を提供する酵素
である。
（従来の技術） （発明が解決しようとする問題点） 従来endo−α−GalNAcaseとしてはクロストリジウム（C
lostridium），パーフリンゲス（perfringens）および
ディプロコッカスニューモニアエ（Diplococcus pneum
oniae）の培養液中に本酵素の活性が見出されている
にすぎない。また酵素としての精製や性質の解明も十分
になされていると言い難く、実用的価値に乏しいもので
ある。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らはＯ−グリコシド結合型糖鎖に作用するendo
−α−GalNAcase生産能を有する微生物を広く自然界よ
り検索した結果、土壌より分離された一菌株がその目的
にかなった性質を有している事を見出し、本発明に到達
したものである。
本発明に用いられる菌株の菌学的性質は以下に示す通り
である。
（１）形態学的性質 形：短桿 大きさ:0.4〜0.5×1.2〜1.8μｍ 運動性：なし 鞭毛：なし 胞子：なし グラム染色：陰性 （２）各培地における生育状態 （イ） 肉汁寒天平板培養 形状：小円形 隆起：凸円状 周縁：全縁 表面：潤滑 （ロ） 肉汁寒天斜面培養 発育の良否：適度 表面：潤滑 生育の様相：帯状 色調：暗所にて黄白色，明所にて黄色 光沢：あり 透明度：半透明 （ハ） 肉汁液体培養 表面の生育：なし 濁度：適度 沈殿：適度 （ニ） 肉汁ゼラチン穿刺培養 生育の状態：表面のみ生育 ゼラチン液化：弱陽性 （ホ） リトマス・ミルク 凝固：陰性 pH:中性 （３）生理学的性質 硝酸塩の還元：＋ 脱窒反応：− MRテスト：− VPテスト：− インドールの生成：− 硫化水素の生成：− デンプンの加水分解：＋ クエン酸の利用：＋ 無機窒素源の利用 硫酸ナトリウム：＋ 硝酸アンモニウム：＋ 色素の生成：− ウレアーゼ：− オキシターゼ：＋ カタラーゼ ＋ 生育の範囲 pH:5.5〜9.4 温度:20〜37℃ 酸素に対する態度：好気性 糖類から酸及びガスの生成 糖類 酸 ガス Ｌ−アラビノース − − Ｄ−キシロース − − Ｄ−グルコース − − Ｄ−マンノース − − Ｄ−フラクトース − − Ｄ−ガラクトース − − マルトース − − シュークロース − − ラクトース − − ５％食塩中での生育：わずかに生育する ラクトースからの３ケトラクトースの生育：− プロトカテキュ酸のオルト，メタ開裂：− グルコン酸の還元：− 以上のような菌学的性質を有する菌について、バージェ
ーズ・マニュアル・オブ・ディタミネーティブ・バクテ
リオロジー（第８版）の分類に従って同定したところ、
本菌株はアルカリゲネス属に属するか、本菌株の特徴に
十分に合致する公知の種は見出せず、本菌株は新菌株と
同定し、アルカリゲネス・エスピー Ｆ−1906（Alcali
genes sp.F−1906）と命名した。本菌株は微生物工業技
術研究所に微工研菌寄第9343号として寄託されている
（FERM BP−1857として国際寄託に移管）。
次に、本発明により製造されるendo−α−GalNAcaseの
酵素化学的および理化学的性質を示す。
（１） 酵素の作用 本発明酵素は通タンパク質のＯ−グリコシド結合型の糖
鎖に作用して以下のようにGalNAc−Ser（or Thr）の結
合を切断する。
（２） 基質特異性 Galβ１→3GalNacα１→Ser（Thr）の構造を有する糖鎖
を持つ糖ペプチド・糖タンパク，アシアロフェツィン
（Asialofetuin），アシアロカゼィン（Asialocasei
n），アシアロムチン（Asialomucin）の糖鎖を遊離す
る。
（３） 力価の測定法 酸素活性の測定は、アシアロフェツィンを基質としてpH
4.5のクエン酸緩衝液中37℃で反応を行い、ホウ酸緩衝
液（pH9.1）を加えて反応を停止させた後、生成したGal
β１→3GalNacをReissig法により定量する方法により行
った。酸素活性の単位は１分間に１μmolのGalβ１→3G
alNAcを遊離する酵素量を１ユニットとした。
（４） 至適pHおよび安定pH範囲 反応の至適pHは4.5〜5.0にあった。安定pH範囲は、pH4.
2〜6.5の範囲で30℃,1時間の処理条件で約90％以上の活
性が残存していた。
（５） 反応至適温度および安定温度範囲 反応の至適温度は40〜45℃であった。安定温度範囲はpH
6.0,リン酸緩衝液中に10分間保温したとき30℃以下であ
り、40℃では約70％の活性が残存していた。
（６） 阻害剤等の影響 本酵素に対する種々の添加物質の影響について検討した
結果を第１表に示した。表から明らかなように本酵素は
水銀により完全に阻害された。また銅，マンガンにより
25〜35％阻害された。SH阻害剤ではシスティンにより約
30％の阻害が見られた。単糖類の添加は本酵素の活性に
ほとんど影響しなかった。
（７） 精製方法 本酵素の精製は、塩析法，各種のクロマトグラフ法等を
適宜に組合わせて行うことができる。精製の具体例は実
施例に示すとりである。
（８） 分子量 本酵素の分子量はセファデックＧ−200を用いるゲル
過法により約160,000,SDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動法によって約160,000と算出された。
（９） ポリアクリルアミドゲル電気泳動 精製された酵素は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
おいて単一のバンドを示した。
次に本発明をより具体的に説明する。
本発明に使用する微生物は、アルカリゲネス属に属し、
上記性質を有するendo−α−GalNAcaseを生産する能力
を有するものであれば如何なるものでもよい。このよう
な微生物の具体例としては、本発明者らにより土壌から
分離されたＦ−1906株があげられる。
当該菌を用いてendo−α−GalNAcaseを生産するには、
豚胃粘膜ムチンを1N硫酸中で80℃,1時間処理したものを
0.1〜10％，好ましくは0.5〜５％含む培地が使用され
る。培地のpHは6.5,培養温度は28℃，培養時間は48時間
程度が適当であり、好気的に培養を行う。
培養終了後、培養液からendo−α−GalNAcaseを採取，
精製するには既知の方法を適当に組合せて行うことがで
きる。本酵素は培養液中に分泌されるので遠心分離等に
より菌体を除いた培養上澄液を硫安画分後、イオン交
換，ゲル過，アフィニティー等のクロマトグラフィー
を行い精製することができる。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、以
下の実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではな
い。
実施例 市販豚胃粘膜ムチンを1N−硫酸中、80℃,1時間加水分解
し、脱シアル化して得られる分解産物１％を含む培地を
２容振盪フラスコ40本に各500ml分注し、滅菌した
後、同培地で前培養したアルカリゲネス・SP Ｆ−1906
を5ml接種し、28℃で３日間振盪培養した。培養終了
後、遠心分離により菌体を除き、培養液を得た。
この液を０〜５℃に保ちながら硫安を添加し、0.4〜
0.8飽和の間の沈殿画分を採取した。得られた沈殿を0.0
1Mリン酸緩衝液（pH6.0）に溶解し、同緩衝液で一夜透
析した。この透析内液を0.01Mリン酸緩衝液で予め平衡
化したDEAE−セファデックスＡ−50のカラム（5.0×32.
5cm）に通し、0.2M Naclを含む同緩衝液で洗浄後、0.4
M Naclを含む同緩衝液で酵素を溶出した。活性が画分
を80％硫安飽和にて沈殿濃縮後0.001Mリン酸緩衝液（pH
6.0）で一夜透析後、同緩衝液で平衡化したハイドロキ
シアパタイトカラム（2.0×2.0cm）通し、同緩衝液およ
び0.4Mリン酸緩衝液（pH6.0）で洗浄後、0.5Mリン酸緩
衝液（pH6.0）で溶出した。活性画分を限外３過にて濃
縮後、0.2M Naclを含む0.01Mリン酸緩衝液（pH6.0）で
平衡化したセファデックスＧ−200カラム（1.0×110c
m）を用いてゲル過を行った。活性画分を濃縮後0.05M
リン酸緩衝液（pH6.0）で平衡化したCanAセファロース
カラス（0.5×3cm）に通した。同緩衝液で非吸着画分に
溶出された活性画分を濃縮し、endo−α−GalNAcaseの
精製標品3mg（比活性2.2units/mg 収率1.0％）を得
た。
（発明の効果） 本発明によれば、endo−α−GalNAcaseを大量かつ簡
便，安価に製造できるので、糖蛋白質のムチン型糖鎖の
構造や、機能の解析に極めて有用な手段を提供するもの
である。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アルカリゲネス属に属し、エンド−α−Ｎ
    −アセチルガラクトサミニダーゼを生産する能力を有す
    る微生物を培養し、培養物からエンド−α−Ｎ−アセチ
    ルガラクトサミニダーゼを採取することを特徴とする微
    生物によるエンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダ
    ーゼの製造法。
JP62112059A 1987-05-07 1987-05-07 微生物によるエンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダ−ゼの製造法 Expired - Lifetime JPH0789915B2 (ja)

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US07/189,135 US4990450A (en) 1987-05-07 1988-05-02 Method of producing endo-α-N-acetylgalactosaminidase from microorganisms
DE8888304102T DE3874961T2 (de) 1987-05-07 1988-05-06 Verfahren zur herstellung von endo-alpha-n-acetylgalactosaminidase durch mikroorganismen.
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