JPS59162891A - 新規なｓｆ−２２５９物質およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な５Ｆ−２２５９物質およびその製造法ニ
関し、詳しくはストレプトコッカス・ミュータンス（以
下、ミュータンス菌と略称する。）の生産するグルコシ
ルトランスフェラーゼによるデキストラン多糖の合成を
阻害し、虫歯の予防あるいは治療に有用である新規な５
Ｆ−２２５９物質およびその製造法に関する。

虫歯は口腔内細菌の１種であるミュータンス菌の感染に
よって成立することが定説となっている。

その成因の１つとして、ミュータンス菌がシュークロー
、スから、グルコシルトランスフェラーゼの作用によシ
、デキストラン多糖を合成し、それが菌体と共に歯に粘
着して歯垢（デンタル・プラーク）を形成することが挙
げられる。さらに歯垢の中のミュータンス菌は口腔内の
糖を代翻して乳酪を産生し、それによシ歯のエナメル質
が脱灰されて、初期の虫歯が成立すると考えられている
。

そこで本発明者らは、ミュータンス菌のグルコシルトラ
ンスフェラーゼの活性を阻害し、デキストラン多糖の合
成を抑制、できれば、歯垢の形成を抑え、それＫより虫
歯を予防し、あるいは治療することが可能になる゛と考
えた。このような観点から、鋭意検索した結果、ミクロ
モノスポラ属に属する放線菌５Ｆ−２２５９株が極めて
強いグルコシルトラ〉ス７エラーゼ阻害活性を有する新
規な５Ｆ−２２５９物質を産生ずることを見出し、本発
明を完成した。

本発明の５ＩＦ−２２５９物質は下記の理化学的性質を
有している。

■作用二本物質はミュータンス菌の生産するグルコシル
トランスフェラーゼによるデキストラン多糖の合成を阻
害する。すなわち、グルコシルトランスフェラーゼ含有
液０．２５ｍ１．　α０４％デキストランＴ−１０含有
１０％シュークロース溶液１ｍ、α１Ｍす・ン酸緩衝液
（ｐａ７．　ｏ）　４．１５−および被試荻液ｌｉｍを
混合し、５７℃で６０分間インキュベートする。酵素作
用によシ生じたデキストラン多糖を濁度としてＯＤ５５
０ｍｍ　　で測定する。被検液にＳＦ−２２５９物質が
含まれている場合は、デキストラン多糖の合成が阻害さ
れ、被検液に阻害物質が含まれていない場合に比較し、
濁度が減少する。このことから５Ｆ−２２５９物質はミ
ュータンス菌の生産するグルコシルトランスフェラーゼ
によるデキストラン多糖の合成を阻害する作用を有する
ことが認められる。

■ｐＨ安定性二本物質のグルコシルトランスフェラーゼ
阻害作用に対するｐＨ安定性は第１図に示した通りで、
ｐＨ４〜１０である。処理条件は４０°Ｃ２６０分間で
あシ各ｐＨはプリットン・ロビンソ〉緩衝液によって調
整した。処理後、後述する阻害活性の力価測定法により
その残存活性を求めた。

■熱安定性二本物質のグルコシルトランスフェラーゼ阻
害作用に対する熱安定性は６０°Ｃでは安定であるが、
６５℃では残存活性が４０％に低下する。なお、加熱処
理は１）Ｈ６，０（プリットン・口ビ〉ソ〉緩衝液）で
、１０分間行ない、残存する阻害活性を力価測定法によ
り求めた。

■分子磁：約６．８万である。セファクリルＳ−３００
を用いたゲル濾過法にょシ測定した。用かた分子量測定
用の標準蛋白はアルブミン（＆８万）。

カタラーゼ（２４万）および７エリチン（４５万）であ
り、５Ｆ−２２５９物質はアルブミンとほぼ同じ溶出容
量を有する。

■等電点：Ｉ）Ｈ４，０付近忙ある。ｐＨＡ　５〜１σ
のキャリヤアンホライトを用いる等電点電気泳動法によ
り測定した。

■紫外部吸収スペクトル：Ｆ３Ｆ−２２５９物質のα１
％溶液〔ＣＬ１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，３））の紫外
部吸収スペクトルは第２図に示した通シで、λｍ＆！２
８０　ｎｍ　（Ｉｌｊ　１ｃｍ　＝Ｉ　Ｌ　４　）であ
り、２８５　ｎｍ付近にショルダーを有する。

■溶解性：水および塩類溶液に可溶であるが、５０％飽
和硫安により塩析される。また、メタノール、アセトン
、酢酸エチルおよびクロロホルムには不溶である。

■呈色反応：ビューレット反応、キサントプロティン反
応、フオーリシ反応、フェノール硫酸反応は陽性である
。

■性状：白色粉末（凍結乾燥標品）。

［相］その他の活性：本物質はプロテアーゼ活性を有し
、カゼインを基質にした場合、至適ｐＨＪＩ′ｉ９〜１
０である。プロテアーゼ活性に対するｐＨ安定性はｐＨ
４〜１０の範凹では安定であり、また６０℃。

１０分間の処理では安定である。

次に１本発明のＳ’Ｗ−２２５９物質のグルコシルトラ
ンスフェラーゼ阻害活性の測定法について説明する。こ
の阻害活性の測定はシュークロースを基質としてグルコ
シルトランスフェラーゼの作用により生じるデキストラ
ン多糖を濁度として吸光度の増加により定垣することに
より行なう。すなわち、ストレプトコッカス拳ミュータ
〉スＰｓ−１４株を第１表に示した組成のＭ〜４培地で
２４時間培養したのち培養液を遠心分離して菌体と上澄
に分別する。菌体は０．１　Ｍ　ＩＪシ酸緩勘液（Ｉ）
Ｈ７，Ｏ，）に懸濁し、水冷上超音波処理して菌体を破
砕する。

次に１この懸濁液を遠心分離して上澄を得、前記上澄と
合わせて限外濾過にょシ濃縮する。濃縮液に０．０１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を加えながら限外濾過によ
り脱塩、濃縮し、最終的には培養液の約１５倍まで濃縮
する。このようにして得た濃縮液をグルコシルトランス
フェラーゼ含有液とする。

グルコシルトランスフェラーゼ含有液（１２５−１［１
０４％デキストランＴ−１０含有１０％シュニクロース
溶液ｉｍ、　αＩ　Ｍ　リ＞酸緩衝液（ｐＨ７，０）４
．１５ｍおよび被検液α１−を混合し、５７℃で６０分
インキュベートする。生じたデキストラ〉多糖の濁υを
ＯＤ　５５０　ｎｍで測定する。

被検液にグルコシルトランスフェラーゼ阻害活性がない
場合、対照の蒸留水と同じ吸光度の増加（第６図）を示
す。一方、被検液Ｋ　５Ｆ−２２５９物質が含まれる場
合は、その量の増加と共に吸光度は減少する。

被検液として蒸留水を用いた場合の吸光度をＡ１５Ｆ−
２２５９物質含有液を用いた場合の吸光度なりで表わす
と、グルコシルトランスフェラーゼ阻害率ｅ％）は次式
で計算される。

阻害率が５０％を示すときの５Ｆ−２２５９物質の鼠を
１単位（Ｕ）と定砂する。第４図は５ＩＦ−２２５９物
質の皺と阻害率の関係を示したグラフである。図から明
らかなように、本発明のｈ−２２ｓ　ｑ物質はグルコシ
ルトランスフェラーゼに対する阻害活性を有している。

カザミノ酸　　　　　　　　　　　５？塩酸Ｌ−シス゛
ティシ　　　　　　α２ｆｔグアニン　　　　　　　　
　　　２ｏｌＩｇウラシル　　　　　　　　　　２０ｍ
ｇ硫酸アデニン　　　　　　　　１０ｍｇニコチン酸　
　　　　　　　　４寓ｇ バントテシ酸カルシウム　　　　４ｍｇ第１表　Ｍ−４
培地　（続き） リボフラビン　　　　　　　　　　２禦９塩酸ピリドキ
サール　　　　　　　　２■塩酸チアミ＞　　　　　　
　　　　　　　２ｔｎｇｐ−アミノ安息香酸　　　　　
　　ｏ、　２　ｍｇビズチン　　　　　　　　　　　α
００５冨ｇｆ＋ｔＪマグネシウム・７水塩　　　　　　
２００■硫酸マンガン・４〜６水塩　　　　　　　　１
寓ｇ塩化第二鉄・６水塩　　　　　　　　　　１＋ｇ食
塩　　　　　　　　　　　　１０貫ｇリン酸二カリウム
　　　　　　　　　５１リン酸−カリウム　　　　　　
　　３１酢酸ナトリウム・５水塩　　　　　　　　　５
１硫安　　　　　　　　　　　　　１ｆＰ炭酸ナトリウ
ム　　　　　　　　　　１ｆアセト酢酸ナトリウム　　
　　　　０．６Ｐツイーンａｏ　　　　　　　　　　　
　Ｏ，ｓｙグルコース　　　　　　　　　　　　　５１
本発明に使用される５ＩＰ−２２５９物質生産菌の一例
としては、福岡布の土壌よシ分・離されたミクロモノス
ポラ属に属する放線菌５Ｆ−２２５９株がある。

５Ｆ−２２５９株の菌学的性状は下記の通りである。

■　形態的性質 ５Ｆ−２２５９株は、一般に使用されている各種の寒天
培地上で気菌糸を形成しない。比較的基土菌糸の生育が
良好なベネット寒天およびイースト麦芽寒天の寒天表面
を顕微鏡で観察すると、分校をもってよく伸長した基土
菌糸の各所に短かい柄を介して胞子が１個ずつ着生して
いるのが認められる。胞子の着生は寒天を含まない同培
地による液体培養においてさらに顕著である。

電子顕微鏡で観察すると、胞子はほぼ球型で直径は約１
μｍ９表面は円滑ないしややいぼ電子のう、鞭毛胞子、
菌核等は認められない。

■　各柚培地上での生育状態 第　　２　　表 なお、培養は２８℃、観察は１４〜２１日後に行なった
。

■　生理高４五質 （１）生育温度範囲：ベネット寒天において１５〜４２
℃の温度範囲で生育し、 ２５〜３５℃で良好に生育す る。

（２）ゼラチンの液化：陰性 （３）スターチの加水分解：疑わしい （４）脱脂乳のペプトン化：陰性 脱脂乳の凝固：陰性 （５）硝酸塩の還元：陰性 （６）耐塩性二食塩３％までは生育するが、４％以上に
なると生育は著しく阻害される。

（７）メラニ〉様色素の生成：陰性 ■　炭素源の利用性　（ブＩＪ　−Ｆ／−ム・ボッ）Ｉ
Ｊ　−７’：寒天培地）（１）Ｑ用する糖：　Ｄ−グル
コース、Ｄ−キシロース、Ｄ−７ラクトース、Ｄ−ア ラビノース、Ｌ−アラビノース Ｌ−ラムノース （２）利用が疑わしい糖：シュークロース、ラフィノー
ス （３）利用しない糖：１−イノシトール、Ｄ−マンニト
ール ■　細胞壁組成 細胞壁中のジアミノピメリン酸はメン型であった。また
１、全菌体中の糖を分析するとキシロース、リボース、
アラビノース、マンノース、グルコースが検出された。

以上より、５ＩＦ−２２５９株は気菌糸を着生せず、基
土菌糸に胞子を単一形成する中温菌であり、細肪壁組成
などからミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏ
ｒａ　）属に分類される。本発明者らは５ＩＦ−２２５
９株をミクロモノスポラ中エスピー　５Ｆ−２２５９（
Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｓｐ、　５Ｆ−２２５
９）と称することにした。本菌は工業技術院微生物工業
技術研究所に受託されており、その受託番号はＩＦＩＣ
ＥＭ　Ｐ−６９５３である。

５Ｆ−２２５９物質の生産にあたっては、ＳＦ’−２２
５９株以外のミクロモノスｌう属の微生物でもｓｙ　−
２２５９物質生産能を示す菌株であれば、天然または人
工変異株であっても、さらには本積に限らず使用するこ
とができる。

５Ｆ−２２５９物質の生産は、５Ｆ−２２５９物質生産
菌を用いて酵素や抗生物質を生産する通常の培養方法で
行なうが、培養の形態としては液体培養示有利である。

培養に使用する培地には当該菌体が利用し得る炭素源、
窒素源、無機塩類およびその他の栄養素が使用される。

すなわち炭素源としては可溶性でんぷんが好ましいが、
グルコース、コーンミール。

デキストリン、糖蜜なども使用し得る。窒素源としては
ペプトン、肉エキス、大豆粒、小麦フスマ。

ニーンスチープリカーなどの有機質もしくはアンモニウ
ム塩類、硝ｒ３Ｎ塩類等の無機窒素化合物が使用される
。また、無機塩類として各種リン酸塩。

硫酸塩および炭酸塩等の化合物、さらに菌の生育を促進
する目的で各種ビタミン、酵母エキス等の添加が効果的
である。

培養は菌が生育し、５Ｆ−２２５９物質を生産する条件
で行なえばよく、通常は２０〜４０℃、好ｆしくは２５
〜３０℃の温度で５〜７日間培養し、５ＩＦ−２２５９
物質の生産緻が最高に雌した時点で培養を終了すればよ
い。

ｔｇｔ養終了後、培養物中から５ＩＰ−２２５９物質を
採取する方法としては、従来、蛋白あるいは酵素の精製
に使用されている公知の方法を適用すれ＆ずよく、５Ｆ
−２２５９物質の性状を考慮して適当な手段を組合オつ
せることによシ精製される。すなわち培養液より濾過ま
たは遠心分離によら゛て菌体や固型分などを除去し、濾
液を回収する。この濾液を限外濾過あるいは減圧濃縮に
よって濃縮し、濃縮液に硫安あるいは硫酸す）　ＩＪウ
ム等の水溶性無機塩類を添加して塩析を行ない５ＩＰ−
２２５９物質を沈澱として回収する。この沈澱物を安定
ｐＨ域を有する緩衝液に溶解し、限外濾過あるいはゲル
ー過により脱塩する。この脱塩画分をＤＫＡＥ−セルロ
ース。

ＤＩＡＩ−セファデックス等めイオン交換体に吸着せし
め、食塩あるいは緩衝液濃度を上げることにより活性画
分と選択的に溶出する。さらに、セファデックス、セフ
ァクリルのようなゲルを用いてのゲル濾過により５Ｆ−
２２５９物質を精製すること力（できる。

本品の純品（″ディスク電気泳動的に）は、上記精製物
をキャリヤアンホライトを用いての等電点分画を行なう
ことによって得ることができる。

このようにして得られた５Ｆ−２２５９物質はミュータ
ンス菌の生産するグルコシルトランスフェラーゼによる
デキストラン多糖の合成を阻害する。

それによってミュータンス菌による歯垢の形成を抑制し
、虫歯の予防あるいは治療に有用なものである。

本発明の５Ｆ−２２５９物質は虫歯予防剤として通常の
粉あるいは練歯磨に添加してもよく、またうがい薬、チ
ューイ〉ガムあるいは食品、飲料などに広く応用するこ
とができる。

次に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れによって制限されるものではない。

実に４例１ 可溶性でんぷん１％、グルコース１％、ボリペブトシα
５％、肉エキスα２％、酵母エキスα６％、脱脂大豆粉
α２％および炭酸カルシウム［１２％からなる培地を１
００１三角フラスコ２本に２０ｄづつ分注し、１２０℃
で２０分間加熱殺菌を行ｆｇ　”）だ。冷却後、これに
５Ｆ−２２５９物質生産菌〔ミクロモノスざう・エスピ
ー８７−２２５９株（ＩＦＩｉＲＭＰ−６９５５））　
　スラントから植菌し、２８°Ｃで５日間振盪培養を行
なった。これを１次種菌とした。

次いで、上記培地を１を三角フラスコ５本に１５０−づ
つ分注し、加熱殺菌したのち冷却したものに１次種菌を
ｚ５ｄづつ移植し、ざらに２８℃で５日間培養した。こ
れを２次種菌とした。

最後に可溶性でんぷん４％、ファーマメディア２％、ゲ
リペプトンα５％、肉エキス０５％、硫酸第１鉄α０５
％、硫酸マグネシウムα１％および炭酸カルシウム１．
０％からなる培地１５ｔをジャーファーメンタ−に仕込
み、１２０°Ｃで２０分間加熱殺菌し、冷却したものに
、２次種菌７５０鳳ｉを植菌した。ジャーファーメンタ
−での培養は２８℃で５日間、好気的条件下で行なった
。

培養終了後、セライトを用いて培養液を濾過し、少量の
水で洗浄して培養濾液１０４ｔを得た。この濾液は１６
７単位／ＩＬｔのグルコシルトランスフェラーゼ阻害活
性を示した。

この濾液に酢酸カルシウムをα１Ｍ濃度になるように加
え、生じた沈澱を遠心分離および七ライトを用いての濾
過によシ除去した。

この濾液と限外濾過によシ１ｔまで濃縮し、７０％飽和
になるように硫安を加え、５°Ｃで１晩放置した。生じ
た沈澱を遠心分離によシ回収し、蒸留水に溶解して限外
濾過により脱塩濃縮し、さらにα１Ｍアトキン・パンチ
ン緩衝液（ｐＨａ５）Ｋ交換し、最終容量を２００ｄと
した。

これを、あらかじめ同一緩衝液で平衡化したＤ］Ｃｊｌ
セファデックスＡ−ｆｏのカラム・（初発ベッド容量３
７０１Ｌｔ）に吸着せしめ、同緩衝液で洗浄後、食塩濃
度を段階的に高めて活性画分を溶出した。活性画分は食
塩濃度［ＬＩＭでは溶出されず、α５Ｍで溶出した。回
収した活性画分５００ｍ１を限外濾過で脱塩濃縮し、さ
らに減圧濃縮して最終容量を５１とした。

この濃縮液を、α１Ｍアトキン・パンチン緩衝液（ｐＨ
ａ５）で平衡化したセファクリルＳ−５００のカラム（
ベッド容量ｓ　ｏ　ｏｗｔｔ、高さ１−）にチャージし
、同緩衝液により溶出した。活性画分を回収し、限外濾
過によシ濃縮して凍結乾燥を行ない粉末化した。凍結乾
燥粉末は４５０■得られ、比活性は５０単位／ＩＩｇ、
活性回収率１．６％であった。

【図面の簡単な説明】

第１図はｓｙ　−２２５９物質のグルコシルトランスフ
ェラーゼ阻害作用に対するｐＨ安定性を示すグラフ、第
２図は該物質の紫外部吸収スペクトル、第５図はグルコ
シルトランスフェラーゼ阻害活性のない被検液の吸光度
の増加を示すグラフ１．第４図は８？−２２５５’物質
の鼠とグルコシルトランスフェラーゼ阻害率の関係を示
すグラフである。 特許出願人　明治製菓株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　下記の理化学的性質を有する新生理活性物質８１
   Ｆ−２２５９物質。 ■作用 本物質はストレプトコッカス・ミュータシスの生産する
   グルフシルトラ〉ス７エラーゼによるデキストラン多糖
   の合成を阻害する。 ■ｐＨ安定性 ｐＨ４〜１０の範囲で安定。 ■熱安定性 ６０℃、１０分間の処理では安定。 ■分子社 ＆８万（七フアクリルＳ−５００ゲル濾過法）■等電点 ｐＨ４，０（キャリヤアンホライト等電点電気泳動法） ■紫外部吸収スペクトル λｍａｗ　　２８０ｚｕｎ ■溶解性 水および塩類溶液に可溶であるが、５０％飽和硫安によ
   シ塩析される。また、メタノール、アセトン、酢酸、ク
   ロロホルムに不溶。 ■呈色反応 ビューレット反応、キサシトブロティシ反応、フォーリ
   ン反応、フェノール硫酸反応は陽性。 ２　ミクロモノスポラ属に属し、下記の理化学的性質を
   有する新生理活性物質５Ｆ−２２５９物質■作用 本物質はストレプトコッカス・ミュータンスの生産する
   グルフシルトランスフエラーゼによるデキストラン多糖
   の合成を阻害する。 ■ｐＨ安定性 ｐｎ　４〜１０の範囲で安定。 ■熱安定性 ６０℃、１０分間の処理では安定。 ■分子組 ６．８万（セファクリルＳ−５００ゲル濾過法）■等電
   点 ｐＨ４，０（キャリヤアンホライト等電点電気泳動法） ■紫外部吸収スペクトル λｍａｘ　　２８０　ｎｍ ■溶解性 水および塩類溶液に可溶であるが、３０％飽和硫安によ
   シ塩析される。また、メタノール、アセトン、酢酸、ク
   ロロホルムに不溶。 ■呈色反応 ビューレット反応、キサントプロティン反応、フォーリ
   ン反応、フェノール硫酸反応は陽性。 を生産する能力を有する微生物を培養し、その培養物か
   ら上記１３Ｆ−２２５９物質を採取することを特徴とす
   る新生理活性物質５Ｆ−２２５９物質の製造法。 五　ミクロモノスポラ属に属し、新生理活性物質５Ｆ−
   ２２５９物質を生産する能力を有する微生物カミクロ七
   ノスざう・エスピーＳＦ　−２２５９（アＩＣＲＭＰ−
   ｓｓ＋ｓｇ）　　である特許請求の範囲第２項記載の方
   法。