JP2013249275A - 美白剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】海洋細菌の産生する酸性ムコ多糖類またはその生理学的に許容される塩もしくは誘導体を有効成分として含有する美白剤。
【選択図】図1
Description
尚、本酸性ムコ多糖類としては、コベチア(Cobetia)属に属し寄託番号がFERM P-21297として寄託されている菌株またはその変異株の培養物より分離精製された酸性ムコ多糖類を用いることが好ましい。これら酸性ムコ多糖類は、本明細書において単に「本酸性ムコ多糖類」と表記する。
本発明の美白剤の有効成分として用いられる海洋細菌が産生する本酸性ムコ多糖類は、次の構造式で示される化合物である。
本発明の有効成分である酸性ムコ多糖類はまた、美容食品などの経口用途にも用いることができる。
本発明の美白用経口用組成物は、有効成分である本酸性ムコ多糖類と、経口用組成物に一般的に用いられている各種成分、例えば、賦形剤、防腐剤、色剤、香料などとを、その剤形にあわせ、本発明の効果を損なわない範囲で適宜配合することにより調製される。
本発明の美白用経口剤の剤型は任意であり、例えば錠剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤などの剤型をとることができる。
こうして所望の美白効果、例えば顔などのシミの発生を防ぐことができ、また既に生成しているシミの脱色に使用できる美白剤が提供される。
本発明で使用される本酸性ムコ多糖類は、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。本ムコ多糖類の調製方法としては、各種の方法が知られている。例えば、海洋微生物を炭素源として蔗糖、窒素源としてペプトン、酵母エキスを含有する海水を寒天で固めた培地で培養して産生する多糖類を採取、精製して得ることができる。
次に、本発明の美白剤の有効成分である本酸性ムコ多糖類の製造方法について、好ましい実施形態を挙げて説明する。尚、本酸性ムコ多糖類の生産方法は以下の製法に限定されない。
好ましい1実施形態としての本酸性ムコ多糖類の製造方法は、(a)前記培地において微生物を培養し多糖類を産生する工程と、(b)産生された本酸性ムコ多糖類を抽出・回収する工程とを有する。
前記した本発明の培地を用いることが望ましく、その際に炭素源として蔗糖、窒素源としてペプトン、酵母エキスを用いることがより望ましい。
(a)前記培地において微生物を培養し多糖類を産生する工程
前記のようにして調製した培地を用いて微生物を培養して目的の多糖類を産生させるわけであるが、本酸性ムコ多糖類を得るためには微生物としてコベチア(Cobetia)属の細菌を用いることが好ましい。さらに好ましくはコベチア(Cobetia)属に属し寄託番号がFERM P-21297として寄託されている菌株またはその変異株を用いることが望ましい。微生物として該菌株またはその変異株を用いることで、本酸性ムコ多糖類を効率的に産生することができる。
そして、以下に説明する抽出・回収工程を経ることにより高純度の本酸性ムコ多糖類を高収率で得ることが可能となる。
上記製造方法で得られた培養液から本酸性ムコ多糖類を抽出する方法としては、従来公知の方法を用いることができる。例えば、培養液をそのまま、あるいは高温で殺菌した後で、遠心分離により菌体を除去し、これをそのまま、あるいは濃縮してから、2〜3倍量のエタノール、イソプロパノール、あるいはアセトン等を加え、沈殿を生じさせる。この沈殿物を再度、水あるいは1〜15%塩化ナトリウム溶液に溶解させた後で、アルコール等による沈殿を2〜3回繰り返し、水で透析を行い、噴霧乾燥や凍結乾燥機等を用いて乾燥させることにより、本酸性ムコ多糖類を得る。これ以外にも電気透析法や限外濾過法も利用することができる。さらに精製するためには、イオン交換、ゲル濾過等の各種クロマトグラフィーや第4級アンモニウム塩による沈殿や塩析などを用いることができる。
この本酸性ムコ多糖類を有効成分として含有する外用美白剤は、通常使用されている皮膚外用剤基材を使用することにより、クリーム、乳液、化粧水等の適当な形態とすることができる。さらに、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、アルブチン等のメラニン合成抑制剤、その他の薬効成分、増粘剤、可塑剤、着色料、香料等、任意の添加物をこの美白剤に含有させることができる。なお、本発明の美白剤の有効成分である本酸性ムコ多糖類については、皮膚に対する毒性も刺激も無く、副作用も無い。また一般に多糖類には保湿効果があること、および本酸性ムコ多糖類には天然保湿因子のグルタミン酸が含まれていることからして、本酸性ムコ多糖類またはそれらの生理学的に許容される塩もしくは誘導体を有効成分として含む本発明の美白剤は、美白効果に加えて好ましい保湿効果を有することは当業者であれば容易に推測できるであろう。
この本酸性ムコ多糖類は、上述のように、美容食品や機能性食品などの美白用経口剤に配合することもできる。
ペプトン0.5%、酵母エキス0.1%、蔗糖3%の組成を有し海水で調製した培地を、温度121℃としたオートクレーブ中で15分間滅菌し、本菌株(FERM P-21297)の斜面培養から、1白金耳を試験管中の上記滅菌培地(10ml)に接種し、25℃の温度で24時間静置培養を行い、次いでこの前培養液を500ml容の三角フラスコ中に上記組成の培地100ml(121℃、15分間滅菌)に接種し、25℃の温度で3日間の静置培養を行った。培養後培養液を遠心分離した後濾過助剤(ラヂオライト#500)を用いてGF-75濾紙(Advantec)で濾過し、菌体を除いた培養濾過液から分子量5万カットの中空糸UF膜モジュール(Spectrum社製)を備えた膜濾過装置により得られる高分子画分を短時間のうちに濃縮、脱塩回収し、活性炭処理し、凍結乾燥により粉末化した。膜濾過装置は東洋紡エンジニアリング社製SYLS-SB04型を用いた。
このようにして得られた多糖画分については、セルロースアセテート膜電気泳動を用いて均一性を確認すると共に、DEAE-セルロースイオン交換カラムクロマト分析、化学分析、核磁気共鳴分析により、公知の本酸性ムコ多糖類であることを確認した。
前培養までは実施例1と同様に処理し、次いでこの前培養液を500ml容の三角フラスコ中に上記組成を有する海水から調製した滅菌培地100ml(121℃、15分間)に接種し、25℃の温度で3日間振とう培養を行った。次いで培養液を遠心分離した後濾過助剤(ラヂオライト#500)を用いてGF−75濾紙(Advantec)で濾過し、菌体を除いた培養濾液から分子量5万カットの中空糸UF膜モジュール(Spectrum社製)を備えた膜濾過装置により得られる高分子画分を短時間のうちに濃縮、脱塩回収し、活性炭処理し、凍結乾燥により粉末化した。膜濾過装置は東洋紡エンジニアリング社製SYLS-SB04型を用いた。このようにして得られた多糖画分については、セルロースアセテート膜電気泳動を用いて均一性を確認すると共に、DEAE-セルロースイオン交換カラムクロマト分析、化学分析、核磁気共鳴分析により、公知の本酸性ムコ多糖類であることを確認した。
前培養までは実施例1と同様に処理し、上記実施例2で述べた培地に寒天を1.5%添加した寒天平板培地250mlを平板(18×26cm)に広げて前培養液を塗沫し、25℃の温度で4日間培養を行った。寒天平板の表面に生じた粘質物をかきとり、1%フェノール液に懸濁させ、遠心分離した後濾過助剤(ラヂオライト#500)を用いてGF-75濾紙で濾過し、菌体を除いた上澄液にエタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後再度エタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後透析した。次いで活性炭処理し、凍結乾燥により多糖画分を得た。尚、実用的な精製レベルとしては、培養濾過液から分子量5万カットの中空糸UF膜モジュール(Spectrum社製)を備えた膜濾過装置により得られる高分子画分を短時間のうちに濃縮、脱塩回収し、活性炭処理し、凍結乾燥により粉末化した。膜濾過装置は東洋紡エンジニアリング社製SYLS-SB04型を用いた。このようにして得られた多糖画分については、セルロースアセテート膜電気泳動を用いて均一性を確認すると共に、DEAE-セルロースイオン交換カラムクロマト分析、化学分析、核磁気共鳴分析により、公知の本酸性ムコ多糖類であることを確認した。
(マウス培養細胞株によるメラニン生成抑制試験)
実施例1で得られた本酸性ムコ多糖類を使用して,メラノーマ細胞に対する細胞増殖と美白効果を調べ試料無添加の場合と比較して試料添加系での細胞増殖率,メラニン生成量を求めた。
(1)前培養したB16F10細胞を12穴マルチウェルプレートの各ウェルに1.0x104細胞/ウェルの細胞数に播種した。播種48時間後、所定濃度の被験物質を含む0.5mMテオフィリン含有DMEM+10%FBS培地に交換した。被験物質の濃度は、25μg/ml、50μg/ml、100μg/mlに設定した。各試料濃度毎に3ウェルを割り当てアッセイに供した(N=3)。細胞増殖計数用のプレートとメラニン定量用のプレート2枚を1組として各試料のアッセイに使用した。培地交換後、72時間培養を続けた。
(2)細胞増殖計数用プレートを用いて各ウェル内の細胞数(相対値)をWST-1法を用い450nmの吸光度を測定することにより、細胞の生育度を測定した。
B-16メラノーマ細胞を培養し、細胞中に産生したメラニンをアルカリで溶解し、吸光度を測定することによりメラニン生成量を求めた。72時間培養後のメラニン定量用のプレートを用いて各ウェル内の細胞を10%トリクロロ酢酸溶液で処理した後にエタノール/エーテル(1:1(V/V))で処理した。
これに1N-NaOH/10%DMSO溶液を加え、メラニンを可溶化した後吸光度475nmを測定した。合成メラニン(Sigma)を1N-NaOH/10%DMSO溶液に溶解した溶液を所定の濃度に希釈し標準液として使用し、本標準液と測定溶液の吸光度を比較することにより測定溶液中のメラニン含有量を算出した。(2)で求めたウェル内細胞数(相対値)と本ウェル内メラニン量から細胞内メラニン量(相対値)を計算した。これらの結果を図1に示す。
処方例5(乳化型ファンデーション)
下記成分Aを充分に混合粉砕した粉末部Aとし、成分BをB液、成分CをC液とする。C液を加温攪拌後、Aを添加しホモミキサー処理し、さらに加温混合したB液を加えてホモミキサー処理する。攪拌しながら室温まで冷却して乳化型ファンデーションを調製した。
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