JP5303186B2 - 新規微生物およびその変異株並びにそれを用いた多糖類の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明の第2の特徴は、コベティア(Cobetia)属に属し寄託番号FERM P-21295として寄託されている新規微生物またはその変異株を培地中で培養し多糖類を産生させて培養物を得る工程と、培養物から多糖類を単離する工程と、を含む多糖類の製造方法を要旨とする。
本発明の第3の特徴は、構成成分がN−アセチル−D−グルコサミン、D−ガラクトロン酸、N−アセチル−D−ガラクトサミン、D−ガラクトース、ピルビン酸、D−アラニンであり、ゲルろ過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として100万〜150万である多糖類を要旨とする。
本発明の第4の特徴は、多糖類の製造方法により得られた多糖類またはそれらの生理的に許容される塩もしくは誘導体を有効成分として含有する美白剤を要旨とする。
本発明の第5の特徴は、多糖類の製造方法により得られた多糖類またはそれらの生理的に許容される塩もしくは誘導体を有効成分として含有する化粧料を要旨とする。
実施形態にかかる新規微生物は、コベティア(Cobetia)属に属し、寄託番号FERM P-21295として寄託されている微生物である。実施形態にかかる新規微生物は以下の菌学的性質を有する。
<形態>
細胞の形態:桿菌
運動性:無し
胞子形成:無し
<生育状態>
コロニーの形態:円形
コロニーの色調:クリーム色
コロニーの表面:スムーズ
生育温度:10℃、37℃及び45℃で生育する。
生育pH:5.5〜9.5(至適生育pH:6.5〜7.5)
酸素要求性:好気性
<生理学的性質>
グラム染色性:陰性
カタラーゼ反応:陽性
オキシダーゼ反応:陰性
O/Fテスト(酸化/発酵) :陰性/陰性
β−ガラクトシダーゼ活性:陰性
インドール産生:陰性
硝酸塩還元:陰性
でんぷん加水分解:陰性
ゼラチン加水分解:陰性
エスクリン加水分解:陰性
ウレアーゼ:陰性
アルギニンジヒドロラーゼ:陰性
資化性 (D-グルコース、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、こはく酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、L-アラニン):有り
資化性 (L-アラビノース、マルトース、ラクトース、サッカロース、D-マンノース、D-マンニトール、N-アセチル-D-グルコサミン、n-カプリン酸、アジピン酸、dl-リンゴ酸、酢酸フェニル、L-ヒスチジン、L-セリン):無し
実施形態にかかる新規微生物は、16S rDNA塩基配列がCobetia marina DSM 4741のそれと99.4%の相同率を有し、かつ100%は一致しない配列番号1の塩基配列を有する。
尚、Cobetia marina DSM4741株は、Cobetia marina の標準株として位置付けられている。寄託番号と公の寄託先は、下記のとおりである。
1.ATCC253741(American Type Culture Collection, Manassas, VA. USA)
2.DSM4741(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Braunschweig, Germany)
3.NCIMB1877(National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, UK)
コベティア(Cobetia)属も海洋微生物で、海洋資源開発の進展の中で興味が持たれているものの一つであり、DSM4741株は、Arahalら(上記文献2)によって命名され、承認されているものである(上記文献1)。
実施形態にかかる新規微生物は、後に実施例の欄で説明するように、コベティア(Cobetia)属に属することが、16S rDNA塩基配列分析などの分類学的調査を通じて決定されたことより、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(〒305−8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に寄託し、平成19年5月2日、寄託番号 FERM P-21295として受託された。本菌株は本発明者が瀬戸内海において海水より分離した海洋性微生物であり、その分類学的特性は、後に説明する実施例に記載した。
実施形態にかかる多糖類の製造方法は、(ア)コベティア(Cobetia)属に属し寄託番号FERM P-21295として寄託されている新規微生物を培地中で培養し多糖類を産生させて培養物を得る工程と、(イ)培養物から多糖類を単離する工程と、を含む。以下詳細に説明する。
多糖類を得るためには、上記実施形態にかかる微生物(FERM P-21295)またはその変異株を用いる。微生物として本菌株またはその変異株を用いることで、多糖類を効率的に生産することができる。液体培養は静置、振とう(攪拌)、通気培養法、および固形培養には寒天平板法を用いることができる。
基本培地としては、多糖類を産生しうる微生物が生育できるものであって、少なくとも炭素源と、窒素源と、各種無機塩とおよび微量元素とを適量含有するものが用いられる。さらに好ましくは、上記基本培地として、コベティア(Cobetia)属に属する微生物が生育できるものが用いられる。炭素源としては、グルコース等の糖、あるいは糖蜜や廃糖蜜が挙げられる。炭素源として1種または2種以上を単独でまたは組み合わせて用いることができる。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム塩等の化合物やペプトン、酵母エキス、アミノ酸などの天然物が挙げられる。窒素源として1種または2種以上を単独でまたは組み合わせて用いることができる。無機塩としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩等が挙げられる。無機塩として1種または2種以上を単独でまたは組み合わせて用いることができる。固体培地の場合は寒天を用いる。
上記製造方法で得られた培養物から多糖類を抽出する方法としては、多糖類の分離回収に用いられる種々の方法を用いることができる。例えば、液体培養の場合は培養物をそのまま、あるいは高温で殺菌した後で、遠心分離により菌体を除去し、これをそのまま、あるいは濃縮してから、2〜3倍量のエタノール、イソプロパノール、あるいはアセトン等を加え、沈殿を生じさせる。この沈殿物を再度、水あるいは1〜15重量%塩化ナトリウム溶液に溶解させた後で、アルコール等による沈殿を2〜3回繰り返し、水で透析を行い、噴霧乾燥や凍結乾燥機等を用いて乾燥させることにより、多糖類を得る。これ以外にも電気透析法や限外濾過法も利用することができる。さらに精製するためには、イオン交換、ゲル濾過等の各種クロマトグラフィーや塩析および活性炭処理法などを用いることができる。
多糖類の製造方法により得られた多糖類またはそれらの生理的に許容される塩もしくは誘導体を有効成分として含有する美白剤が提供される。また多糖類の製造方法により得られた多糖類またはそれらの生理的に許容される塩もしくは誘導体を有効成分として含有する化粧料が提供される。
本発明者は、ヒト皮膚美白剤として使用が可能な物質を求めて、鋭意研究を進めていたところ、海洋微生物が産生する多糖類にメラノーマ細胞のメラニンの生成を抑制する効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明者は、優れた美白効果を有する物質を見出すべく、マウスのB16メラノーマ細胞株を用いたメラニン生成抑制を指標に種々検索を行った。その結果、海洋微生物(FERM P-21295)の作る多糖類が、メラニン生成を強く抑制すると共に細胞毒性が極めて弱く、化粧料の美白成分として極めて有効であることを見出した。
「美白剤」とは、シミ、ソバカス等の予防又は治療に有効な皮膚用化粧料組成物であって、医薬部外品としてのローション、乳液、クリーム、パック剤、石鹸等の薬用化粧品および医薬品としてのローション、乳液、クリーム、軟膏等の皮膚外用剤を含むものである。
〈多糖類産生菌の分離〉
ペプトン0.5%、 酵母エキス0.1%、蔗糖3%及び寒天1.5%の組成を有し海水で調製した培地を、温度121℃としたオートクレーブ中で15分間滅菌し平板培地とした。瀬戸内海の海水サンプルを探索源としてこの寒天平板培地に画線し、粘稠性を示して生育したコロニーを2〜3回植え継いで純粋分離し、多糖類産生菌候補として寒天斜面培養に画線培養し保存した。保存培養から、1白金耳を試験管中の上記組成より寒天を除いた滅菌培地(10ml)に接種し、25℃の温度で24時間振とう培養を行い、次いでこの前培養液を500ml容の三角フラスコ中に上記組成の液体培地200ml(121℃、15分間滅菌)に接種し、25℃の温度で3日間の振とう培養を行った。培養後培養液を遠心分離した後濾過助剤(ラジオライト#500)を用いて濾過し、菌体を除いた上澄液にエタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後再度エタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後透析し凍結乾燥により多糖画分を得た。
〈新規菌株の分類学的位置〉
新たに単離した多糖類産生菌株(FERM P-21295)を16S rDNA塩基配列の分析によって同定した。この新たに単離された本菌株(FERM P-21295)の16S rDNA塩基配列は、Cobetia marina DMS4741株の16S rDNA塩基配列と99.4%の相同性を示しコベティア(Cobetia)属に属すると決定された。しかし、この菌株は、コベティア(Cobetia)属の基準株であるCobetia marina DSM4741とは以下に記載されるいくつかの培養特性および生化学的特性によって明らかに区別される。
ペプトン0.5%、酵母エキス0.1%、蔗糖3%の組成を有し海水で調製した培地を、温度121℃としたオートクレーブ中で15分間滅菌し、本菌株(FERM P-21295)の斜面培養から、1白金耳を試験管中の上記滅菌培地(10ml)に接種し、25℃の温度で24時間静置培養を行い、次いでこの前培養液を500ml容の三角フラスコ中に上記組成の培地200ml(121℃、15分間滅菌)に接種し、25℃の温度で3日間の静置培養を行った。培養後培養液を遠心分離した後濾過助剤(ラジオライト#500)を用いて濾過し、菌体を除いた上澄液にエタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後再度エタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後透析し、活性炭処理し、凍結乾燥により多糖画分を得た。
尚、実用的な精製レベルとしては、培養濾過液から分子量5万カットの中空糸UF膜モジュール(Spectrum社製)を備えた膜濾過装置により得られる高分子画分を短時間のうちに濃縮、脱塩回収し、活性炭処理し、凍結乾燥により粉末化した。膜濾過装置は東洋紡エンジニアリング社製SYLS-SB04型を用いた。
本多糖を2Mのトリフルオロ酢酸(TFA)、または4N−HClで100℃、12時間加水分解し、ロータリーエバポレイターでTFAまたはHClを除いたものを検体とし、構成成分の分析を行った。その結果、本多糖類は、セルロースアセテート膜電気泳動、高速液体クロマトグラフィーまたはアミノ酸自動分析法でN−アセチル−D−グルコサミン、D−ガラクトロン酸、N−アセチル−D−ガラクトサミン、D−ガラクトース、ピルビン酸、D−アラニンが構成成分として認められ、それらのモル比がN−アセチル−D−グルコサミン:D−ガラクトロン酸:N−アセチル−D−ガラクトサミン:D−ガラクトース:ピルビン酸:D−アラニンが(1.0〜1.2):(1.6〜1.8):(2.4〜2.6):1:(1.2〜1.4):(1.1〜1.3)であり、ピルビン酸は酵素法においても同様な結果が得られた。またGFA-7M(昭和電工製)をカラムによるゲルろ過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として100万〜150万であることが認められた。
前培養までは実施例3と同様に処理し、次いでこの前培養液を500ml容の三角フラスコ中に上記組成を有する海水から調製した滅菌培地200ml(121℃、15分間)に接種し、25℃の温度で3日間振とう培養を行った。次いで培養液を遠心分離した後濾過助剤(ラジオライト#500)を用いて濾過し、上澄液にエタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後再度エタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後透析し、活性炭処理し、凍結乾燥により多糖画分を得た。尚、実用的な精製レベルとしては、培養濾液から分子量5万カットの中空糸UF膜モジュール(Spectrum社製)を備えた膜濾過装置により得られる高分子画分を短時間のうちに濃縮、脱塩回収し、活性炭処理し、凍結乾燥により粉末化した。膜濾過装置は東洋紡エンジニアリング社製SYLS-SB04型を用いた。本多糖を2Mのトリフルオロ酢酸(TFA)、または4N−HClで100℃、12時間加水分解し、ロータリーエバポレイターでTFAまたはHClを除いたものを検体とし、構成成分の分析を行った。その結果、本多糖類は、セルロースアセテート膜電気泳動、高速液体クロマトグラフィーまたはアミノ酸自動分析法でN−アセチル−D−グルコサミン、D−ガラクトロン酸、N−アセチル−D−ガラクトサミン、D−ガラクトース、ピルビン酸、D−アラニンが構成成分として認められ、それらのモル比がN−アセチル−D−グルコサミン:D−ガラクトロン酸:N−アセチル−D−ガラクトサミン:D−ガラクトース:ピルビン酸:D−アラニンが(1.0〜1.2):(1.6〜1.8):(2.4〜2.6):1:(1.2〜1.4):(1.1〜1.3)であり、ピルビン酸は酵素法においても同様な結果が得られた。またGFA-7M(昭和電工製)をカラムによるゲルろ過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として100万〜150万であることが認められた。
前培養までは実施例3と同様に処理し、上記実施例3で述べた培地に寒天を1.5%添加した寒天平板培地250mlを平板(18×26cm)に広げて前培養液を塗沫し、25℃の温度で4日間培養を行った後、寒天平板の表面に生じた粘質物をかきとり、1%フエノール液に懸濁させ、遠心分離した後濾過助剤(ラジオライト#500)で菌体を濾過により除いて得られた上澄液にエタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後再度エタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後透析し、活性炭処理し、凍結乾燥により多糖画分を得た。尚、実用的な精製レベルとしては、培養濾過液から分子量5万カットの中空糸UF膜モジュール(Spectrum社製)を備えた膜濾過装置により得られる高分子画分を短時間のうちに濃縮、脱塩回収し、活性炭処理し、凍結乾燥により粉末化した。本多糖を2Mのトリフルオロ酢酸(TFA)、または4N−HClで100℃、12時間加水分解し、ロータリーエバポレイターでTFAまたはHClを除いたものを検体とし、構成成分の分析を行った。その結果、本多糖類は、セルロースアセテート膜電気泳動、高速液体クロマトグラフィーまたはアミノ酸自動分析法でN−アセチル−D−グルコサミン、D−ガラクトロン酸、N−アセチル−D−ガラクトサミン、D−ガラクトース、ピルビン酸、D−アラニンが構成成分として認められ、それらのモル比がN−アセチル−D−グルコサミン:D−ガラクトロン酸:N−アセチル−D−ガラクトサミン:D−ガラクトース:ピルビン酸:D−アラニンが(1.0〜1.2):(1.6〜1.8):(2.4〜2.6):1:(1.2〜1.4):(1.1〜1.3)であり、ピルビン酸は酵素法においても同様な結果が得られた。またGFA-7M(昭和電工製)をカラムによるゲルろ過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として100万〜150万であることが認められた。
(マウス培養細胞株によるメラニン生成抑制試験)
実施例3で得られた多糖類を使用して,メラノーマ細胞に対する細胞増殖とメラニン生成抑制効果を調べ試料無添加の場合と比較して試料添加系での細胞増殖率,メラニン生成量を求めた。また陽性コントロールとしてメラニン生成抑制作用を有することが知られている多糖類(Okazakiら:Fragrance Journal, 8, 61-64, 2004)を使用した。
(1)前培養したB16F10細胞を12穴マルチウェルプレートの各ウェルに1.0x104細胞/ウェルの細胞数に播種した。播種48時間後、所定濃度の被験物質を含む0.5mMテオフィリン含有DMEM+10%FBS培地に交換した。被験物質の濃度は、25μg/ml、50μg/ml、100μg/mlに設定した。各試料濃度毎に3ウェルを割り当てアッセイに供した(N=3)。細胞増殖計数用のプレートとメラニン定量用のプレート2枚を1組として各試料のアッセイに使用した。培地交換後、72時間培養を続けた。
(2)細胞増殖計数用プレートを用いて各ウェル内の細胞数(相対値)をWST-1法を用い450nmの吸光度を測定することにより、細胞の生育度を測定した。この結果を表4に示す。
B16メラノーマ細胞を培養し、細胞中に産生したメラニンをアルカリで溶解し、吸光度を測定することによりメラニン生成量を求めた。72時間培養後のメラニン定量用のプレートを用いて各ウェル内の細胞を10%トリクロロ酢酸溶液で処理した後にエタノール/エーテル(1:1(V/V))で処理した。
これに1N− NaOH/10%DMSO溶液を加え、メラニンを可溶化した後吸光度475nmを測定した。合成メラニン(Sigma)を1N−NaOH/10% DMSO溶液に溶解した溶液を所定の濃度に希釈し標準液として使用し、本標準液と測定溶液の吸光度を比較することにより測定溶液中のメラニン含有量を算出した。(2)で求めたウェル内細胞数(相対値)と本ウェル内メラニン量から細胞内メラニン量(相対値)を計算した。
Claims (6)
- コベティア(Cobetia)属に属し寄託番号FERM P-21295として寄託されている新規微生物を培養して得られる培養物から単離される多糖類、またはそれらの生理的に許容される塩もしくは誘導体を有効成分として含有することを特徴とする美白剤。
- 前記多糖類は、構成成分がN−アセチル−D−グルコサミン、D−ガラクトロン酸、N−アセチル−D−ガラクトサミン、D−ガラクトース、ピルビン酸、D−アラニンであり、ゲルろ過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として100万〜150万である、請求項1に記載の美白剤。
- 前記多糖類の構成成分のモル比が、N−アセチル−D−グルコサミン:D−ガラクトロン酸:N−アセチル−D−ガラクトサミン:D−ガラクトース:ピルビン酸:D−アラニン=(1.0〜1.2):(1.6〜1.8):(2.4〜2.6):1:(1.2〜1.4):(1.1〜1.3)である、請求項2に記載の美白剤。
- コベティア(Cobetia)属に属し寄託番号FERM P-21295として寄託されている新規微生物を培養して得られる培養物から単離される多糖類、またはそれらの生理的に許容される塩もしくは誘導体を有効成分として含有することを特徴とする化粧料。
- 前記多糖類は、構成成分がN−アセチル−D−グルコサミン、D−ガラクトロン酸、N−アセチル−D−ガラクトサミン、D−ガラクトース、ピルビン酸、D−アラニンであり、ゲルろ過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として100万〜150万である、請求項4に記載の化粧料。
- 前記多糖類の構成成分のモル比が、N−アセチル−D−グルコサミン:D−ガラクトロン酸:N−アセチル−D−ガラクトサミン:D−ガラクトース:ピルビン酸:D−アラニン=(1.0〜1.2):(1.6〜1.8):(2.4〜2.6):1:(1.2〜1.4):(1.1〜1.3)である、請求項5に記載の化粧料。
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