CN107630055A - 添加丝氨酸生产普鲁兰多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种添加丝氨酸生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：将保存在4℃的PDA斜面菌种于培养箱中活化，制得斜面菌种；将培养好的斜面菌种接种于种子培养基中，培养，制得种子液；将种子液接种于发酵培养基发酵罐中，进行发酵培养；发酵结束后，所得发酵液经板框过滤除菌，然后加入预冷的乙醇，搅拌至多糖充分沉淀，静置过夜，过滤，再用乙醇冲洗，烘干，得到普鲁兰多糖。本发明通过添加丝氨酸来生产普鲁兰多糖，普鲁兰多糖产量有明显的提高，进而降低普鲁兰多糖的生产成本，从而降低了普鲁兰多糖应用在食品、医疗、环保等行业的成本，这对普鲁兰多糖在其他领域的应用有重大意义。
Description
技术领域
本发明属于高分子多糖材料技术领域，涉及一种添加丝氨酸生产普鲁兰多糖的方法。
背景技术
普鲁兰多糖是一种由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）产生的天然高分子多糖，且其是一种无毒无味的非结晶不定型粉末。由于其具有良好的成膜性、可塑性、生物相容性等理化性质，同时人体可食用且无副作用，因此，普鲁兰多糖广泛应用于食品、医药、环境保护以及化妆品等行业中。普鲁兰多糖是一种具有很大开发价值和潜能的新型生物制品，其将越来越受到广泛研究和重视。
丝氨酸处于氨基酸代谢的中间位置，其参与磷脂、半胱氨酸、嘌吟等的合成，这些物质是合成蛋白、核酸、氨基酸等的前体物质。丝氨酸还利于细胞膜的合成，进而利于细胞增殖。
随着人们环境保护意识的增强，发展对环境友好材料和改善环境问题是未来的发展趋势，普鲁兰多糖作为一种天然高分子，且广泛应用于环保、食品、医疗等领域。因此，当下提高普鲁兰多糖的产量变得越来越关键。本发明提出添加丝氨酸来提高普鲁兰多糖的产量，从而可以降低生产成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种添加丝氨酸生产普鲁兰多糖的方法。本发明方法通过在发酵培养基添加一定浓度的丝氨酸，使发酵前期菌体量有所增大，从而使普鲁兰多糖产量得到提高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种添加丝氨酸生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将保存在4℃的PDA斜面菌种于28℃培养箱中活化2-3h，制得斜面菌种；本发明利用出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）生产普鲁兰多糖，所用的出芽短梗霉为专利CN103060204B 公开的，该菌 株已经于2012年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，（邮编100101），保藏编号 为CGMCC NO.7055。
（2）种子液制备：将培养好的斜面菌种接种于种子培养基中，28 ℃，180 rpm培养28~32 h；
（3）发酵罐发酵：按照发酵培养基体积计，以3-4%的接种量将种子液接种于发酵培养基发酵罐中，以300-400r/min的转速、1:1-1.25的通风比进行发酵培养88h；所述发酵培养基中包括0.05-0.4g/L的丝氨酸；
（4）提取：发酵结束后，所得发酵液经板框过滤除菌，然后加入预冷的乙醇，搅拌至多糖充分沉淀，静置过夜，过滤，再用乙醇冲洗，烘干，得到普鲁兰多糖。
作为优选的技术方案：
优选的，所述种子培养基（g/L）：蔗糖95-110，酵母浸粉2-3，(NH4)2SO4 0.5-1.0，K2HPO41.5-2.0，MgSO4·7H2O 0.3-0.5，NaCl 2-3，FeSO4·7H2O 0.04-0.07，余量为水，pH 6.5，121℃灭菌20 min。
优选的，所述发酵培养基（g/L）：蔗糖 140-160，蛋白胨 4-6，K2HPO4 6-8，MgSO4·7H2O 0.3-0.4，NaCl 2.5-3.5，FeSO4·7H2O 0.04-0.07，丝氨酸0.05-0.4，余量为水，然后再按上述总质量的0.1-0.15 ‰量添加泡敌；121 ℃灭菌20 min。
优选的，所述发酵时的初始温度为30-37℃。
有益效果
本发明通过添加丝氨酸来生产普鲁兰多糖，普鲁兰多糖产量有明显的提高，进而降低普鲁兰多糖的生产成本，从而降低了普鲁兰多糖应用在食品、医疗、环保等行业的成本。普鲁兰多糖的合成需要脂质体磷脂协助，丝氨酸参与磷脂、嘌呤等物质的合成，这些物质为合成多糖提供了物质基础。并且添加丝氨酸可以增加增强糖酵解途径和TCA循环，为多糖的合成提供更多的能量。因此，添加丝氨酸对普鲁兰多糖生产及应用有重大意义。
本专利只添加一种影响因子—丝氨酸，来高效提高普鲁兰多糖的产量，生产成本低。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种添加丝氨酸生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将保存在4℃的PDA斜面菌种于28℃培养箱中活化2-3h，制得斜面菌种；本发明利用出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）生产普鲁兰多糖，所用的出芽短梗霉为专利CN103060204B 公开的，菌种保藏编号为CGMCCNO.7055；
（2）种子液制备：将培养好的斜面菌种接种于种子培养基中，28 ℃，180 rpm培养28h；种子培养基（g/L）：蔗糖95，酵母浸粉3，(NH4)2SO4 0.5，K2HPO4 2.0，MgSO4·7H2O 0.3，NaCl3，FeSO4·7H2O 0.04，余量为水，pH 6.5，121 ℃灭菌20 min。
（3）发酵罐发酵：按照发酵培养基体积计，以4%的接种量将种子液接种于发酵培养基发酵罐中，以400r/min的转速、1:1的通风比进行发酵培养88h；发酵时的初始温度为30℃；发酵培养基（g/L）：蔗糖 160，蛋白胨 4，K2HPO4 8，MgSO4·7H2O 0.3，NaCl 3.5，FeSO4·7H2O 0.07，丝氨酸0.05，余量为水，然后再按上述总质量的0.1‰量添加泡敌；121 ℃灭菌20 min。
（4）提取：发酵结束后，所得发酵液经板框过滤除菌，然后加入预冷的乙醇，搅拌至多糖充分沉淀，静置过夜，过滤，再用乙醇冲洗，烘干，得到普鲁兰多糖。
实施例2
一种添加丝氨酸生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将保存在4℃的PDA斜面菌种于28℃培养箱中活化2-3h，制得斜面菌种；本发明利用出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）生产普鲁兰多糖，所用的出芽短梗霉为专利CN103060204B 公开的，菌种保藏编号为CGMCCNO.7055；
（2）种子液制备：将培养好的斜面菌种接种于种子培养基中，28 ℃，180 rpm培养28~32h；种子培养基（g/L）：蔗糖110，酵母浸粉2，(NH4)2SO4 1.0，K2HPO4 1.5，MgSO4·7H2O0.5，NaCl3，FeSO4·7H2O 0.04，余量为水，pH 6.5，121 ℃灭菌20 min。
（3）发酵罐发酵：按照发酵培养基体积计，以3-4%的接种量将种子液接种于发酵培养基发酵罐中，以300r/min的转速、1:1.25的通风比进行发酵培养88h；发酵时的初始温度为37℃；发酵培养基（g/L）：蔗糖140，蛋白胨6，K2HPO4 6，MgSO4·7H2O 0.3，NaCl 3.5，FeSO4·7H2O 0.07，丝氨酸0.4，余量为水，然后再按上述总质量的0.15 ‰量添加泡敌；121℃灭菌20 min。
（4）提取：发酵结束后，所得发酵液经板框过滤除菌，然后加入预冷的乙醇，搅拌至多糖充分沉淀，静置过夜，过滤，再用乙醇冲洗，烘干，得到普鲁兰多糖。
实施例3
一种添加丝氨酸生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：
1) 将保存在4 ℃的PDA斜面菌种于28 ℃培养箱中活化2.5 h。
2）挑取一环培养好的斜面菌种接种于种子培养基中，28℃，180 rpm培养28h。本发明利用出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）生产普鲁兰多糖，所用的出芽短梗霉为专利CN103060204B 公开的，菌种保藏编号为CGMCCNO.7055。
上述种子培养基（g/L）：蔗糖100，酵母浸粉2.5，(NH4)2SO4 0.5，K2HPO4 2.0，MgSO4·7H2O 0.4，NaCl 3，FeSO4·7H2O 0.05，pH 6.5，121 ℃灭菌20 min。
3）将所得种子液的3%（v/v）的量接种于装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，以350r/min的转速、1:1-1.15的通风比进行培养88h。
上述发酵培养基（g/L）：蔗糖 150，蛋白胨 5.5，K2HPO4 7，MgSO4·7H2O 0.35，NaCl3，FeSO4·7H2O 0.06，添加0.05g/L丝氨酸，按0.12 ‰量添加泡敌（植物油），121 ℃灭菌20min。
4）所得发酵液经板框过滤除菌，然后加入预冷的乙醇，搅拌至多糖充分沉淀，静置过夜，过滤，再用乙醇冲洗得到69g/L的普鲁兰多糖，与未添加丝氨酸组（对比例1），普鲁兰多糖产量提高了11.2%。
实施例4
一种添加丝氨酸生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：
1) 将保存在4 ℃的PDA斜面菌种于28 ℃培养箱中活化2.5 h。
2）挑取一环培养好的斜面菌种接种于种子培养基中，28 ℃，180 rpm培养28 h。本发明利用出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）生产普鲁兰多糖，所用的出芽短梗霉为专利CN103060204B 公开的，菌种保藏编号为CGMCCNO.7055。
上述种子培养基（g/L）：蔗糖100，酵母浸粉2.5，(NH4)2SO4 0.5，K2HPO4 2.0，MgSO4·7H2O 0.4，NaCl 3，FeSO4·7H2O 0.05，pH 6.5，121 ℃灭菌20 min。
3）将所得种子液的3%（v/v）的量接种于装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，以350r/min的转速、1:1.15的通风比进行培养88h。
上述发酵培养基（g/L）：蔗糖 150，蛋白胨 5.5，K2HPO4 7，MgSO4·7H2O 0.35，NaCl3，FeSO4·7H2O 0.06，按0.12 ‰量添加泡敌（植物油），添加0.1g/L丝氨酸，121 ℃灭菌20min。
4）所得发酵液经板框过滤除菌，然后加入预冷的乙醇，搅拌至多糖充分沉淀，静置过夜，过滤，再用乙醇冲洗得到72g/L的普鲁兰多糖。与未添加丝氨酸组，普鲁兰多糖产量提高了16.1%。
实施例5
一种添加丝氨酸生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：
1) 将保存在4 ℃的PDA斜面菌种于28 ℃培养箱中活化2.5 h。
2）挑取一环培养好的斜面菌种接种于种子培养基中，28 ℃，180 rpm培养28h。本发明利用出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）生产普鲁兰多糖，所用的出芽短梗霉为专利CN103060204B 公开的，菌种保藏编号为CGMCCNO.7055。
上述种子培养基（g/L）：蔗糖100，酵母浸粉2.5，(NH4)2SO4 0.5，K2HPO4 2.0，MgSO4·7H2O 0.4，NaCl 3，FeSO4·7H2O 0.05，pH 6.5，121 ℃灭菌20 min。
3）将所得种子液的3%（v/v）的量接种于装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，以350r/min的转速、1:1.15的通风比进行培养88h。
上述发酵培养基（g/L）：蔗糖 150，蛋白胨 5.5，K2HPO4 7，MgSO4·7H2O 0.35，NaCl3，FeSO4·7H2O 0.06，按0.12 ‰量添加泡敌（植物油），添加0.3g/L丝氨酸，121 ℃灭菌20min。
4）所得发酵液经板框过滤除菌，然后加入预冷的乙醇，搅拌至多糖充分沉淀，静置过夜，过滤，再用乙醇冲洗得到79g/L的普鲁兰多糖。与未添加丝氨酸组，普鲁兰多糖产量提高了21.5%。
对比例1
一种添加丝氨酸生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：
以发酵培养基不添加丝氨酸作为对照
1） 将保存在4 ℃的PDA斜面菌种于28 ℃培养箱中活化2.5h。
2）挑取一环培养好的斜面菌种接种于种子培养基中，28 ℃，180 rpm培养28 h。利用出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）生产普鲁兰多糖，所用的出芽短梗霉为专利CN103060204B 公开的，菌种保藏编号为CGMCCNO.7055。
上述种子培养基（g/L）：蔗糖100，酵母浸粉2.5，(NH4)2SO4 0.5，K2HPO4 2.0，MgSO4·7H2O 0.4，NaCl 3，FeSO4·7H2O 0.05，pH 6.5，121 ℃灭菌20 min。
3）将所得种子液的3%（v/v）的量接种于装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，以350r/min的转速、1:1.15的通风比进行培养88h。
上述发酵培养基（g/L）：蔗糖 150，蛋白胨 5.5，K2HPO4 7，MgSO4·7H2O 0.35，NaCl3，FeSO4·7H2O 0.06，按0.12 ‰量添加泡敌（植物油），121 ℃灭菌20 min。
4）所得发酵液经板框过滤除菌，然后加入预冷的乙醇，搅拌至多糖充分沉淀，静置过夜，过滤，再用乙醇冲洗得到62g/L的普鲁兰多糖。
通过实验结果可以看出，本发明的制备方法与现有技术相比，通过在发酵培养基添加一定浓度的丝氨酸，使发酵前期菌体量有所增大，从而使普鲁兰多糖产量得到提高。
Claims (4)
1.一种添加丝氨酸生产普鲁兰多糖的方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将保存在4℃的PDA斜面菌种于28℃培养箱中活化2-3h，制得斜面菌种；
（2）种子液制备：将培养好的斜面菌种接种于种子培养基中，28 ℃，180 rpm培养28~32h；
（3）发酵罐酵：按照发酵培养基体积计，以3-4%的接种量将种子液接种于发酵培养基发酵罐中，以300-400r/min的转速、1:1-1.25的通风比进行发酵培养88h；所述发酵培养基中包括0.05-0.4g/L的丝氨酸；
（4）提取：发酵结束后，所得发酵液经板框过滤除菌，然后加入预冷的乙醇，搅拌至多糖充分沉淀，静置过夜，过滤，再用乙醇冲洗，烘干，得到普鲁兰多糖。
2.根据权利要求1所述的一种添加丝氨酸生产普鲁兰多糖的方法，其特征是，所述种子培养基（g/L）：蔗糖95-110，酵母浸粉2-3，(NH4)2SO4 0.5-1.0，K2HPO4 1.5-2.0，MgSO4·7H2O0.3-0.5，NaCl 2-3，FeSO4·7H2O 0.04-0.07，余量为水，pH 6.5，121 ℃灭菌20 min。
3.根据权利要求1所述的一种添加丝氨酸生产普鲁兰多糖的方法，其特征是，所述发酵培养基（g/L）：蔗糖 140-160，蛋白胨 4-6，K2HPO4 6-8，MgSO4·7H2O 0.3-0.4，NaCl 2.5-3.5，FeSO4·7H2O 0.04-0.07，丝氨酸0.05-0.4，余量为水，然后再按上述总质量的0.1-0.15‰量添加泡敌；121 ℃灭菌20 min。
4.根据权利要求1所述的一种添加丝氨酸生产普鲁兰多糖的方法，其特征是，所述发酵时的初始温度为30-37℃。
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