FI85385C - Process for producing ribonucleic acid - Google Patents
Process for producing ribonucleic acid Download PDFInfo
- Publication number
- FI85385C FI85385C FI850864A FI850864A FI85385C FI 85385 C FI85385 C FI 85385C FI 850864 A FI850864 A FI 850864A FI 850864 A FI850864 A FI 850864A FI 85385 C FI85385 C FI 85385C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- solution
- ribonucleic acid
- rna
- ppm
- temperature
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
1 853851 85385
Menetelmä ribonukleiinihapon tuottamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää ribonukleiinihapon tuottamiseksi (jäljempänä käytetään nimitystä RNA). Erityisemmin se koskee menetelmää eristää RNA hiivasta, jota on kasvatettu kasvualustassa kuten esimerkiksi melassis-sa.This invention relates to a method for producing ribonucleic acid (hereinafter referred to as RNA). More particularly, it relates to a method for isolating RNA from yeast grown in a medium such as molasses.
RNA:n tuottamiseksi tunnetaan menetelmä, jossa RNA uutetaan hiivasta kuumalla suolaliuoksella, käsitellään uutettua RNA:ta sisältävä liuos hapolla, ja sitten eristetään RNA liuoksesta sedimentoimalla. Sellaisessa uutettua RNA:ta sisältävässä liuoksessa on kolloidisia tai suspendoituneita liukenemattomia aineita, jotka ovat peräisin hiivan epäpuhtauksista. Kun RNA sedimentoidaan lisäämällä happoa, sedimentoituvat liukenemattomat aineet yhdessä RNA:n kanssa. Näin ollen, saatua RNA:ta konta-minoivat liukenemattomat aineet alentavat sen puhtautta. Liukenemattomien aineiden poistamiseksi valmistetusta liuoksesta, jotta saataisiin RNA:ta, jonka puhtaus on suuri, on ehdotettu JP-patenttijulkaisussa 56-46837 RNA:n tuottamiseksi polyakrylaatin tai vastaavien proteiineja koaguloivien aineiden lisäämistä RNA:ta sisältävään liuokseen, liukenemattomien aineiden poistamista liuoksesta koaguloimalla ja sedimentoimalla, hapon lisäämistä sen jälkeen näin saatuun kirkkaaseen liuokseen sen saattamiseksi happameksi, ja sitten RNA:n eristämistä liuoksesta sedimentoimalla.To produce RNA, a method is known in which RNA is extracted from yeast with hot saline, a solution containing the extracted RNA is treated with acid, and then RNA is isolated from the solution by sedimentation. Such a solution containing extracted RNA contains colloidal or suspended insoluble substances derived from yeast impurities. When RNA is sedimented by the addition of acid, insoluble matter sediments together with the RNA. Thus, insoluble substances contaminating the resulting RNA reduce its purity. To remove insoluble matter from a prepared solution to obtain RNA of high purity, it is proposed in JP 56-46837 to produce RNA by adding polyacrylate or similar protein coagulants to the RNA-containing solution, removing the insoluble matter from the solution by coagulating, then adding the acid to the clear solution thus obtained to acidify it, and then isolating the RNA from the solution by sedimentation.
Toisaalta, mikrobiaalisten tuotteiden puhdistamiseksi liuoksesta on yleisesti käytetty menetelmää, jolla liukenematon aines, jota myös on mukana liuoksessa, hajotetaan lisäämällä liuokseen proteaasla, minkä seurauksena 2 85385 liukenematon aines poistuu siitä. Tätä menetelmää voidaan myös soveltaa liuokseen, jossa on hiivasta uutettua RNA:ta. Tällainen menetelmä tunnetaan esimerkiksi FI-patenttijulkaisusta 53590, jossa kuvataan menetelmä, jossa biomassaa käsitellään alkalilla, liukenematon aines erotetaan neutraloinnin jälkeen, liuoksessa olevat proteiinit hydrolysoidaan proteaasivalmisteella liukoisiksi hydrolyysituotteiksi, minkä jälkeen RNA seostetaan hapolla ja lopuksi saostunut RNA-pitoinen tuote erotetaan esimerkiksi sentrifugoimalla.On the other hand, in order to purify microbial products from solution, a method has been commonly used in which insoluble matter, which is also present in solution, is decomposed by adding protease to the solution, as a result of which 2,85,385 insoluble matter is removed therefrom. This method can also be applied to a solution of yeast-extracted RNA. Such a method is known, for example, from FI patent publication 53590, which describes a method in which biomass is treated with alkali, insoluble matter is separated after neutralization, proteins in solution are hydrolysed with a protease preparation to soluble hydrolysis products, then RNA is mixed with acid and finally the precipitated RNA-containing product is separated.
Kun RNA uutetaan kuumalla suolaliuoksella hiivasta, jota on kasvatettu sokeria assimiloimalla lignosulfonaattia sisältävässä sulfiittijäteliemessä, voidaan uutettua RNA:ta sisältävän liuoksen liukenemattomat aineet poistaa siitä suhteellisen tehokkaasti lisäämällä liuokseen 5-100 ppm koaguloivaa ainetta, kuten esim. natriumpolyakry-laattia, ja sedimentoimalla liukenemattomat aineet koagu-loinnin kautta, tai lisäämällä liuokseen proteaasia liukenemattomien aineiden hajottamiseksi.When RNA is extracted with hot saline from yeast grown by assimilating sugar in lignosulfonate-containing sulfite waste liquor, insolubles in the extracted RNA-containing solution can be removed relatively efficiently by adding 5 to 100 ppm of coagulant, such as sodium polyacrylate, to the solution. or by adding a protease to the solution to degrade insoluble substances.
Kuitenkin, mitä tulee liuokseen, joka sisältää RNA:ta, joka on uutettu kuumentamalla suolaliuoksella hiivasta, jota on kasvatettu kasvuliemessä, joka ei sisällä lignosulfonaattia, kuten esim. melassissa, siinä olevia liukenemattomia aineita ei voi riittävästi poistaa proteaasia tai koaguloivaa ainetta, kuten esim. natriumpoly-akrylaattia, lisäämällä. Näin ollen on olemassa ongelma, että RNA-saanto huomattavasti laskee, verrattuna tapaukseen, jossa RNA eristetään liuoksesta, jossa on sulfiit-tijäteliemestä erotetusta hiivasta uutettua RNA:ta.However, with respect to a solution containing RNA extracted by heating saline from yeast grown in a broth that does not contain lignosulfonate, such as molasses, the insoluble matter therein cannot sufficiently remove the protease or coagulant, such as e.g. sodium polyacrylate, by adding. Thus, there is a problem that RNA yield is significantly reduced compared to the case where RNA is isolated from a solution of RNA extracted from yeast separated from sulfite waste broth.
3 85385 Tämän keksinnön pääkohtana on näin ollen luoda parannettu menetelmä RNA:n tuottamiseksi korkealla saannolla.3 85385 The main object of the present invention is therefore to provide an improved method for producing RNA in high yield.
Tämän keksinnön mukaisesti on aikaansaatu menetelmä ribonukleiinihapon tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheet, joissa a) lisätään 50-1000 ppm proteaasia liuokseen, jossa on hiivasta kuumennetulla suolaliuoksella uutettua ribonukleiinihappoa, ja pidetään syntyneen liuoksen lämpötila välillä 30-80°C 1-8 tunnin ajan, b) säädetään hiivasta uutettua ribonukleiinihappoa sisältävän liuoksen lämpötila välille 50-90eC, lisätään siihen koagulointiainetta, joka käsittää 5-100 ppm natriumpoly-akrylaattia ja 40-500 ppm vesiliukoista metallisuolaa valikoituna ryhmästä, jossa on ferrisuoloja ja alumiini-suoloja, mainitun liuoksen liukenemattoman aineen poistamiseksi koaguloimalla ja sedimentoimalla, ja lisätään sen jälkeen happoa mainittuun liuokseen, joka oli kirkastettu poistamalla liukenematon aine, liuoksen saattamiseksi happamaksi, ja eristetään sitten saadusta liuoksesta ribonukleiinihappo sedimentoimalla. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, että ensin suoritetaan edellä olevassa kohdassa a) esitetyt vaiheet ja tämän jälkeen kohdasta a) saadulle, ribonukleiinihappoa sisältävälle liuokselle suoritetaan edellä olevassa kohdassa b) esitetyt vaiheet, jolloin saadaan hyvin puhdasta ribonukleiinihappoa hyvällä saannolla.According to the present invention, there is provided a method of producing ribonucleic acid, the method comprising the steps of a) adding 50-1000 ppm protease to a solution of ribonucleic acid extracted from yeast in heated saline and maintaining the temperature of the resulting solution at 30-80 ° C for 1-8 hours; b) adjusting the temperature of the solution containing ribonucleic acid extracted from yeast to between 50-90 ° C, adding a coagulant comprising 5-100 ppm of sodium polyacrylate and 40-500 ppm of a water-soluble metal salt selected from the group consisting of ferric salts and aluminum salts to remove insoluble matter of said solution by coagulating and sedimenting, and then adding acid to said solution clarified by removing insoluble matter to acidify the solution, and then isolating the resulting solution by sedimenting ribonucleic acid. The process according to the invention is characterized in that the steps described in a) above are carried out first and then the ribonucleic acid-containing solution obtained in a) is subjected to the steps described in b) above to obtain very pure ribonucleic acid in good yield.
Esillä olevassa keksinnössä käytetään edullisesti hiivaa, jota on viljelty kasvuliemessä, jossa ei ole lignosul-faattia. Hiivan sukua ja lajia ei ole rajattu, joskin on edullisempaa käyttää hiivaa, jolla on suuri RNA:n tuottokyky.The present invention preferably uses yeast cultured in a lignosulfate-free broth. The genus and species of yeast are not limited, although it is more preferable to use yeast with high RNA production capacity.
4 85385 RNA uutetaan hiivasta kuumennetulla suolaliuoksella. Tarkemmin kuvailtuna, suolaa lisätään kasvuliuokseen hiivan kasvatuksen päätyttyä, tai suolaliuosta lisätään kasvualustasta separoidun hiivan joukkoon. Liuos on edullista valmistaa niin, että hiivan kuiva-aine on välillä 7-14 paino-%, suolapitoisuus on välillä 4-7 paino-%, ja pH on välillä 7-8. Tämän jälkeen liuosta kuumennetaan lämpötilassa 90-99°C, edullisemmin välillä 95-99°C kolmesta kuuteen tunnin ajan. Tästä seuraa RNA:n ekstrahoituminen hiivasta liuosfaasiin. Jäähdyttämisen jälkeen käsitellään muodostunutta RNA-liuosta proteaasilla.4 85385 RNA is extracted from yeast with heated saline. More specifically, the salt is added to the medium after the growth of the yeast, or the saline is added to the yeast separated from the medium. The solution is preferably prepared so that the dry matter of the yeast is between 7 and 14% by weight, the salt content is between 4 and 7% by weight, and the pH is between 7 and 8. The solution is then heated to 90-99 ° C, more preferably between 95-99 ° C for three to six hours. This results in the extraction of RNA from the yeast into the solution phase. After cooling, the resulting RNA solution is treated with protease.
Tämän keksinnön mukaisesti käytetään proteaasia, joka on aktiivista alle neutraaleissa tai lievästi emäksisissä olosuhteissa. Tämän keksinnön mukaista on käyttää proteaaseja, joista esimerkkeinä voi mainita trypsiinin, papaiinin tai Bacillus-suvun, Streptomyces-suvun, Aspergillus-suvun ja Streptococcus-suvun tuottamat proteaasit. Liuokseen lisättävän proteaasin määrä on edullisemmin välillä 50-1000 ppm:ää.According to the present invention, a protease is used which is active under less than neutral or slightly basic conditions. It is in accordance with this invention to use proteases such as those produced by trypsin, papain or the genus Bacillus, the genus Streptomyces, the genus Aspergillus and the genus Streptococcus. More preferably, the amount of protease added to the solution is between 50 and 1000 ppm.
Liuosta käsitellään proteaasilla lähtö-pH:n ollessa välillä 4-8, lämpötilassa 30-80°C, edullisemmin 40-75°C yhdestä kahdeksaan tunnin ajan. Kun proteaasikäsittely on päättynyt, säädetään liuoksen lämpötila välille 50-90°C. Sen jälkeen liuokseen lisätään natriumpolyakrylaattia ja vesiliukoista metallisuolaa, joka on valittu ryhmästä, jossa on ferrisuolaa, kuten esim. ferrikloridi ja ferrisulfaatti, ja alumiinisuolaa, kuten esim. alumiinisulfaatti. Liuoksessa olevat liukenemattomat aineet koaguloituvat ja sen myötä sedimentoituvat.The solution is treated with a protease at a starting pH of 4-8, at a temperature of 30-80 ° C, more preferably 40-75 ° C for one to eight hours. When the protease treatment is complete, the temperature of the solution is adjusted to between 50 and 90 ° C. Sodium polyacrylate and a water-soluble metal salt selected from the group consisting of a ferric salt such as ferric chloride and ferric sulfate and an aluminum salt such as aluminum sulfate are then added to the solution. The insoluble substances in the solution coagulate and thereby sediment.
Tämän keksinnön mukaisesti on natriumpolyakrylaatin molekyyli-paino vähintään 5 000 000, edullisemmin vähintään 10 000 000. Polyakrylaatin vaikutusteho koaguloivana aineena on huonompi, jos sen molekyylipaino on alle 3 000 000. On edullista lisätä liuokseen polyakrylaatti ja yllä mainittu metallisuola määrinä, jotka vaihtelevat välillä 5-100 ppm ja 40-500 ppm vastaavasti. Lisättäessä vesiliukoinen metallisuola yhdessä natriumpoly-•V; akrylaatin kanssa, koaguloituvat liuoksessa olevat liukene- mattomat ainekset tehokkaammin. Jos kuitenkin vesiliukoistaAccording to the present invention, the sodium polyacrylate has a molecular weight of at least 5,000,000, more preferably at least 10,000,000. The effectiveness of the polyacrylate as a coagulant is inferior if it has a molecular weight of less than 3,000,000. It is preferable to add polyacrylate and the above metal salt to the solution. -100 ppm and 40-500 ppm, respectively. When adding a water-soluble metal salt together with sodium poly- • V; with acrylate, the insoluble matter in solution coagulates more efficiently. However, if water soluble
IIII
5 85385 metallisuolaa lisätään ylenmäärin, osa RNAssta menetetään, koska se sedimentoituu yhdessä liukenemattomien aineiden kanssa. Vaikkakin koaguloitumista tapahtuu merkittävästi huoneenlämmössä, edistää liuoksen lämpötilan pitäminen välillä 50-90°C suotuisasti aggregaattien kasvamista.5 85385 metal salts are added in excess, some of the RNA is lost as it co-sediments with insoluble substances. Although coagulation occurs significantly at room temperature, maintaining the temperature of the solution between 50-90 ° C favorably promotes the growth of aggregates.
Kuten edellä on kuvattu, poistetaan koaguloituneet ja sitten sedimentoituneet liukenemattomat aineet liuoksesta sentrifu-goimalla, suodattamalla tai luonnollisella sedimentaatiolla, jossa liuoksen annetaan seistä lämpötilassa 50-90°C yhdestä neljään tunnin ajan. Näin menetellen kirkastuu uutettua RNA:ta sisältävä liuos.As described above, coagulated and then sedimented insolubles are removed from the solution by centrifugation, filtration, or natural sedimentation, where the solution is allowed to stand at 50-90 ° C for one to four hours. In this way, the solution containing the extracted RNA is clarified.
Tämän jälkeen jäähdytetään muodostunut kirkas liuos lämpötilaan 3-15°C, minkä jälkeen sen pH säädetään noin l,5:ksi suolahappoa lisäämällä, mikä aiheuttaa RNA:n saostumisen.The resulting clear solution is then cooled to 3-15 ° C, after which its pH is adjusted to about 1.5 by the addition of hydrochloric acid, causing RNA to precipitate.
Tämä saostuma otetaan talteen ja liuotetaan natriumhydroksi-dilla neutraloimalla. Näin saatu liuos kuivataan spray-kuivu-rilla tai vastaavilla kuivureilla, jolloin saadaan RNA:ta, jonka puhtaus on suuri ja saanto korkea.This precipitate is collected and dissolved by neutralization with sodium hydroxide. The solution thus obtained is dried in a spray dryer or similar dryers to obtain RNA of high purity and high yield.
Voidaan katsoa, että RNA:ta, jolla on suuri puhtaus, voidaan jatkuvasti saada korkealla saannolla tämän keksinnön mukaan seuraavalla perusteella.It can be considered that RNA of high purity can be obtained continuously in high yield according to the present invention on the following basis.
Osa RNA:s ta, joka on uutettu kuumennetulla suolaliuoksella hiivasta, jota on kasvatettu kasvualustassa, jossa ei ole lignosulfonaattia, muodostaa kompleksin proteiinin kanssa. Tälle kompleksille on ominaista, ettei se saostu happoa lisäämällä. Kun suolahappoa lisätään RNA:ta sisältävään liuokseen, ei proteiinin kanssa kompleksin muodostanut RNA saostu. Tämä voi olla syy RNA:n saannon putoamiseen tavanomaisten menetel-: : : mien mukaan toimittaessa.A portion of the RNA extracted with heated saline from yeast grown in a medium free of lignosulfonate forms a complex with the protein. This complex is characterized by the fact that it does not precipitate with the addition of acid. When hydrochloric acid is added to the RNA-containing solution, the RNA complexed with the protein does not precipitate. This may be the reason for the decrease in RNA yield when delivered according to conventional methods.
Tämän keksinnön mukaisesti, päinvastaisesta, suurin osa RNA-proteiini-kompleksista, jota yllä kuvailtiin, erotetaan ensin - RNA:ksi ja hajonneeksi proteiiniksi käsittelemällä liuosta proteaasilla. Niin ollen, kun koaguloivaa ainetta, muodostuen 6 85385 natriumpolyakrylaaLista ja vesiliukoisesta metallisuolasta, lisätään liuokseen seuraavassa vaiheessa, liukenemattomat aineet, kuten liuoksen proteiini, poistetaan tehokkaasti liuoksesta koagulaation ja sedimentaation kautta, ilman RNA:n tappioita. Sen tähden, lisättäessä suolahappoa näin saatuun kirkkaaseen liuokseen sen saattamiseksi happamaksi, sekä RNA, joka alunperin oli vapaana, että kompleksista vapautettu RNA, voidaan ottaa talteen ilman tappiota. Tästä syystä, tämän keksinnön mukaisesti, voidaan jatkuvasti saada korkealla saannolla RNA:ta, jolla on suuri puhtaus.According to the present invention, in contrast, most of the RNA-protein complex described above is first separated into RNA and degraded protein by treating the solution with a protease. Thus, when a coagulant consisting of 6,85,385 sodium polyacrylates and a water-soluble metal salt is added to the solution in the next step, insoluble substances such as solution protein are effectively removed from the solution through coagulation and sedimentation without RNA losses. Therefore, by adding hydrochloric acid to the clear solution thus obtained to acidify it, both the RNA which was originally free and the RNA released from the complex can be recovered without loss. Therefore, according to the present invention, high purity RNA of high purity can be obtained continuously.
Myöskin liuoksista, jotka sisältävät RNA:ta, joka on eristetty hiivasta, jota kasvatetaan sokerin assimilaatioon perustuen sulfiittijäteliemessä, jossa on lignosulfonaatLia, voidaan joissakin tapauksissa saada RNA:ta puhtaampana ja paremmalla saannolla käyttämällä proteaasia yhdessä koaguloivan aineen kanssa. Vaikutus ei kuitenkaan tässä tapauksessa ole niin huomattava kuin liuoksessa, jossa on RNA:ta, joka on uutettu hiivasta, jota on kasvatettu liemessä, jossa ei ole lignosul-fonaattia.Also, solutions containing RNA isolated from yeast grown on the assimilation of sugar in sulfite waste liquor containing lignosulfonate can in some cases be obtained in purer and better yield than using RNA in combination with a coagulant. However, the effect in this case is not as significant as in a solution with RNA extracted from yeast grown in a broth without lignosulfonate.
Seuraavat esimerkit kuvaavat tämän keksinnön mukaisia yksityiskohtia.The following examples illustrate the details of this invention.
Esimerkki 1Example 1
Saccharomyces cerevisiae, viljeltynä melassissa, erotettiin sentrifugoimalla ja pestiin, jolloin saatiin 1 kg:n hiiva-kakku. Tämä kakku suspendoitiin 3 l:aan vettä, ja 150 g nat-riumkloridia lisättiin uuttamista varten. Näin saatua liuosta kuumennettiin lämpötilassa 95°C neljän tunnin ajan, jossa yhteydessä RNA ekstrahoitui. Seuraavaksi poistettiin hiiva liuoksesta sentrifugoimalla. Erotettu hiiva pestiin 800 ml:11a vettä. Lisäämällä hiivan pesuvesi liuokseen, josta hiiva erotettiin, saatiin 3,8 1 liuosta, jossa oli uutettua RNA:ta.Saccharomyces cerevisiae, cultured in molasses, was separated by centrifugation and washed to give 1 kg of yeast cake. This cake was suspended in 3 L of water, and 150 g of sodium chloride was added for extraction. The solution thus obtained was heated at 95 ° C for four hours, during which time RNA was extracted. Next, the yeast was removed from the solution by centrifugation. The separated yeast was washed with 800 ml of water. Addition of the yeast wash water to the solution from which the yeast was separated gave 3.8 L of a solution of extracted RNA.
Tämä liuos jaettiin kahteen yhtä suureen osaan.This solution was divided into two equal portions.
Toisen osan yllä kuvatuista jaetuista liuoksista, jonka tila-The second part of the divided solutions described above,
IIII
7 85385 vuus oli 1,9 1, pH säädettiin 6:ksi natriumhydroksidilla. Tämän jälkeen liuokseen lisättiin papaiinia (proteaasi) noin 300 ppm, minkä jälkeen liuosta pidettiin sekoitettuna lämpötilassa 40°C kuuden tunnin ajan. Tämän jälkeen 70°C:ksi kuumennettuun liuokseen lisättiin 200 ppm ferrikloridia. Liuosta sekoitettiin ja siihen lisättiin vielä 40 ppm nat-riumpolyakrylaattia, minkä seurauksena liuoksessa olleet liukenemattomat aineet koaguloituivat ja sedimentoituivat. Sen jälkeen kun koaguloitunut liete oli poistettu liuoksesta suodattamalla, ja syntynyt kirkas, RNArta sisältävä liuos oli jäähdytetty 5°C:n lämpötilaan, säädettiin kirkkaan liuoksen pH l,5:ksi suolahapolla. Tästä seurasi RNA:n saostuminen.7 85385 was 1.9 L, the pH was adjusted to 6 with sodium hydroxide. Papain (protease) was then added to the solution at about 300 ppm, after which the solution was kept stirred at 40 ° C for six hours. Then 200 ppm ferric chloride was added to the solution heated to 70 ° C. The solution was stirred and an additional 40 ppm of sodium polyacrylate was added, as a result of which the insolubles in the solution coagulated and sedimented. After the coagulated slurry was removed from the solution by filtration, and the resulting clear RNA-containing solution was cooled to 5 ° C, the pH of the clear solution was adjusted to 1.5 with hydrochloric acid. This was followed by precipitation of RNA.
Sen jälkeen kun saostunut RNA oli otettu talteen sentrifugoi-malla, suspendoitiin talteen otettu RNA veteen ja liuotettiin säätämällä suspendoidun liuoksen pH arvoon 5,6 natriumhydroksidilla. Tämän jälkeen liuos kuivattiin spraykuivaus-menetelmällä ja näin saatiin 12 g RNA:ta. Liuoksesta saadun RNA:n saanto oli 96 % ja sen puhtaus oli 86,5 %.After the precipitated RNA was recovered by centrifugation, the recovered RNA was suspended in water and dissolved by adjusting the pH of the suspended solution to 5.6 with sodium hydroxide. The solution was then dried by spray drying to give 12 g of RNA. The yield of RNA obtained from the solution was 96% and its purity was 86.5%.
Vertailuesimerkki 1 Käyttäen esimerkissä 1 valmistettujen jaettujen liuoserien toista osaa, jonka määrä oli 1,9 1, toistettiin esimerkin 1 mukainen menettely sillä poikkeuksella, ettei papaiinia lisätty liuokseen, jolloin saatiin 10,5 g RNA:ta. Liuoksesta saadun RNA:n saanto oli 84 % ja sen puhtaus oli 76 %.Comparative Example 1 Using a second portion of the 1.9 L portions prepared in Example 1, the procedure of Example 1 was repeated except that no papain was added to the solution to give 10.5 g of RNA. The yield of RNA obtained from the solution was 84% and its purity was 76%.
Esimerkki 2Example 2
Candida utilis, viljeltynä glukoosilla, separoitiin sentrifu-goimalla ja pestiin, jolloin saatiin 2 kg:n hiivakakku.Candida utilis, cultured with glucose, was separated by centrifugation and washed to obtain a 2 kg yeast cake.
Tämä kakku suspendoitiin 6 l:aan vettä, ja siihen lisättiin 300 g natriumkloridia uuttamista varten. Näin saatua liuosta kuumennettiin lämpötilassa 95°C neljän tunnin ajan, missä yhteydessä RNA ekstrahoitui. Tämän jälkeen hiiva poistettiin ; liuoksesta sentrifugoimalla. Erotettu hiiva pestiin 1,6 1:11a vettä. Lisäämällä hiivan pesuvesi liuokseen, josta hiiva erotettiin, saatiin 7,6 1 liuosta, jossa oli uutettua RNA:ta. Tämä liuos jaettiin kahteen yhtäsuureen osaan.This cake was suspended in 6 L of water, and 300 g of sodium chloride was added for extraction. The solution thus obtained was heated at 95 ° C for four hours, during which time the RNA was extracted. The yeast was then removed; from the solution by centrifugation. The separated yeast was washed with 1.6 L of water. Addition of the yeast wash water to the solution from which the yeast was separated gave 7.6 L of a solution of extracted RNA. This solution was divided into two equal portions.
s 85385s 85385
Toisen osan yllä kuvatuista jaetuista liuoksista, jonka tilavuus oli 3,8 1, pH säädettiin arvoon 6 natriumhydroksidilla. Tämän jälkeen liuokseen lisättiin 300 ppm Daiwa Kasei Co.The pH of the second portion of the 3.8 L divided solutions described above was adjusted to 6 with sodium hydroxide. 300 ppm of Daiwa Kasei Co. was then added to the solution.
Ltd.:n toimittamaa PROTIN PC-10 (proteaasi) ja sitten liuosta pidettiin sekoitettuna 75°C:n lämpötilassa kuuden tunnin ajan. Seuraavaksi liuokseen lisättiin 150 ppm ferrikloridia. Liuosta sekoitettiin ja siihen lisättiin vielä 30 ppm nat-riumpolyakrylaattia, minkä seurauksena liuoksessa olleet liukenemattomat aineet koaguloituivat ja sedimentoituivat. Sen jälkeen kun koaguloitunut liete oli poistettu liuoksesta suodattamalla, ja syntynyt kirkas RNA:ta sisältävä liuos oli jäähdytetty 5°C:n lämpötilaan, säädettiin kirkkaan liuoksen pH l,5:ksi suolahapolla. Tästä seurasi RNA:n saostuminen.Ltd. supplied PROTIN PC-10 (protease) and then the solution was kept stirred at 75 ° C for six hours. Next, 150 ppm ferric chloride was added to the solution. The solution was stirred and an additional 30 ppm of sodium polyacrylate was added, as a result of which the insolubles in the solution coagulated and sedimented. After the coagulated slurry was removed from the solution by filtration, and the resulting clear RNA-containing solution was cooled to 5 ° C, the pH of the clear solution was adjusted to 1.5 with hydrochloric acid. This was followed by precipitation of RNA.
Sen jälkeen kun saostunut RNA oli otettu talteen sentrifu-goimalla, suspendoitiin talteen otettu RNA veteen ja liuotettiin säätämällä suspendoitun liuoksen pH arvoon 5,6 natriumhydroksidilla. Tämän jälkeen liuos kuivattiin spraykuivausmene-telmällä ja näin saatiin 24,1 g RNA:ta. Liuoksesta saadun RNA:n saanto oli 96,4 %, ja sen puhtaus oli 87 %.After the precipitated RNA was recovered by centrifugation, the recovered RNA was suspended in water and dissolved by adjusting the pH of the suspended solution to 5.6 with sodium hydroxide. The solution was then dried by spray drying to give 24.1 g of RNA. The yield of RNA obtained from the solution was 96.4% and its purity was 87%.
Vertailuesimerkki 2 Käyttäen esimerkissä 2 valmistettujen liuoserien toista osaa, jonka määrä oli 3,8 1, toistettiin esimerkin 2 mukainen menettely sillä poikkeuksella, että liuos jäähdytettiin lämpötilaan 5°C ilman, että lisättiin ferrikloridia ja natriumpolyakrylaat-tia, jolloin saatiin 22,4 g RNA:ta. Liuoksesta saadun RNA:n saanto oli 89,6 % ja sen puhtaus oli 78 %.Comparative Example 2 Using a second portion of 3.8 L of the solutions prepared in Example 2, the procedure of Example 2 was repeated except that the solution was cooled to 5 ° C without the addition of ferric chloride and sodium polyacrylate to give 22.4 g of RNA. added. The yield of RNA obtained from the solution was 89.6% and its purity was 78%.
Kuten edellä on kuvattu, tämän keksinnön mukaisesti, voidaan liukenemattomat ainekset tehokkaasti poistaa lisäämällä - liuokseen vuorotellen ensin proteaasia ja sitten koaguloivaa ainetta, jossa on natriumpolyakrylaattia jne., näissä erityisolosuhteissa, jolloin RNA:ta, jolla on suuri puhtaus, voidaan jatkuvasti tuottaa korkealla saannolla ilman tappioita.As described above, in accordance with the present invention, insoluble materials can be effectively removed by adding - to the solution alternately first a protease and then a coagulant with sodium polyacrylate, etc., under these special conditions, where high purity RNA can be continuously produced in high yield without losses.
lili
Claims (1)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2259285A JPS61181394A (en) | 1985-02-06 | 1985-02-06 | Method of isolating and collecting ribonucleic acid |
JP2259285 | 1985-02-06 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI850864A0 FI850864A0 (en) | 1985-03-04 |
FI850864L FI850864L (en) | 1986-08-07 |
FI85385B FI85385B (en) | 1991-12-31 |
FI85385C true FI85385C (en) | 1992-04-10 |
Family
ID=12087114
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI850864A FI85385C (en) | 1985-02-06 | 1985-03-04 | Process for producing ribonucleic acid |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS61181394A (en) |
FI (1) | FI85385C (en) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1110265C (en) * | 1996-02-29 | 2003-06-04 | 宇宙食品株式会社 | Preparation of yeast extract |
US6122226A (en) * | 1996-09-05 | 2000-09-19 | Citizen Watch Co., Ltd. | Combination electronic watch |
JP6385201B2 (en) * | 2013-08-31 | 2018-09-05 | 栄研化学株式会社 | Sample preparation method and reagent kit suitable for nucleic acid amplification |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5646837A (en) * | 1979-09-27 | 1981-04-28 | Kowa Yakuhin Kogyo Kk | Preparation of ibuprofen clathrate compound |
-
1985
- 1985-02-06 JP JP2259285A patent/JPS61181394A/en active Pending
- 1985-03-04 FI FI850864A patent/FI85385C/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI850864L (en) | 1986-08-07 |
FI850864A0 (en) | 1985-03-04 |
FI85385B (en) | 1991-12-31 |
JPS61181394A (en) | 1986-08-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105002247A (en) | Micromolecule walnut peptide and preparation method thereof | |
WO2001064047A9 (en) | Process for producing soybean protein hydrolyzate | |
US20090162905A1 (en) | Method for Purification of Hyaluronic Acid Salt | |
WO1991009943A1 (en) | Method for crystallization of enzymes | |
JPH04158796A (en) | Production of aqueous solution of sodium hyaluronate | |
CN105384758B (en) | The preparation method of clavulanic acid amine salt | |
US6335043B1 (en) | Method for extracting soybean proteins using an enzyme | |
CN103060297B (en) | Method for separating and purifying trypsin | |
FI85385C (en) | Process for producing ribonucleic acid | |
US20060014256A1 (en) | Sodium chondroitin sulfate, chondroitin-sulfate-containing material and processes for producing the same | |
JPH02171185A (en) | Preparation of physiologically-active substance | |
GB2272697A (en) | Process for producing crystalline type A botulinum toxin | |
US4024000A (en) | Stabilization of β-amylase in aqueous medium | |
CN108101980B (en) | Preparation method of high-purity phycocyanin | |
JP2018502592A (en) | Method for fractionating components of protein-rich microalgal biomass | |
JP2002537804A (en) | Method for quickly obtaining crystals having desired morphology | |
RU2081915C1 (en) | Method of sodium nucleinate preparing | |
KR940000810B1 (en) | Process for the preparation of crystallized glutamic acid | |
JPH05155900A (en) | High-purity acid-insoluble fish scale collagen and its production | |
JP2685424B2 (en) | Protamine production method | |
RU2055482C1 (en) | Method of protein-nucleinic hydrolysate preparing | |
RU2103365C1 (en) | Method for producing ribonucleic acid | |
JP4224313B2 (en) | Method for preparing amylase inhibitor | |
KR880001120B1 (en) | Process for purifying elastase | |
JPH10179084A (en) | Production of yeast extract |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM | Patent lapsed | ||
MM | Patent lapsed |
Owner name: KOHJIN CO., LTD. |