DE2145936A1 - Verfahren zum Isolieren von Protein aus Fischen oder Fischprodukten - Google Patents

Verfahren zum Isolieren von Protein aus Fischen oder Fischprodukten

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DE2145936A1 DE19712145936 DE2145936A DE2145936A1 DE 2145936 A1 DE2145936 A1 DE 2145936A1 DE 19712145936 DE19712145936 DE 19712145936 DE 2145936 A DE2145936 A DE 2145936A DE 2145936 A1 DE2145936 A1 DE 2145936A1
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Description

f eingegangen QmAlJML·
6.Weinhousen öU/1 —Zf^-— S
München 22
WldenmayersiraOe 48
Societe des Produitß Nestle S.A. Vevey / Schweiz
Verfahren zwo. >Isoiieren von Protein aus Fischen oder Fisehprodukten
Die Erfindung betrifft die Herstellung eines isolierten Fischproteins«
Gegenstand der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Hersfcel^ung eines hoch angereicherten Proteinpräpafats aus FieeJi und Fischresten, wobei das Protein in Form eines löslichen weißen Pulvers anfällt, das einen milden Geruch und Geschmack aufweist.
Erfindungsgemäß wird das Protein aus Fischen oder Fischprodukten (einschliesßlieh Frischfisch, Fischmehl und geringwertigen Fisehprodukten) nach einem Verfahren isoliert, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Fisch mit Alkali in einem wäßrigen Medium bei einer Temperatur von 90 bis 12O0C nicht langer a^B etwa 5 Minuten behandelt, wobei die Alkalikonzentration im Medium zwischen 0,02 und 0,5 -normal liegt, wodurch ein erheblicher Teil des im Fisch vorhandenen Proteins löslich gemacht wird, den pH-Wert des Mediums auf einen Wert von etwa 7 bis 10 einstellt, unlösliche Bestandteile aus dem Medium entfernt, die vorhandenen Lipoide durch flüssig-flüssig-Extraktion mit einem Lösungsmittel für die Lipoide entfernt und das Protein aus der Lösung gewinnt.
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Unter "Lipoide" werden im folgenden nicht nur Fette sondern auch Lipoproteine, Phospholipoide und ähnliche Substanzen verstanden.
Das geschilderte Verfahren umfaßt eine Reihe von Verfahrensschritt en, von denen jeder zu den angestrebten Eigenschaften des Endprodukts beiträgt. Von besonderer Bedeutung ist die Anfangsbehandlung mit Alkali, durch welche das Protein lös.-lich gemacht wird. Diese Behandlung wird vorzugsweise unter intensivem mechanischen Zerkleinern bei einer relativ hohen Temperatur in Gegenwart von Alkali in zur Löslichmachung ausreichender Konzentration , jedoch über eine sehr kurze Zeit spanne bewirkt, um eine Schädigung des Proteins zu vermeiden. Nach der ersten Alkalibehandlung und vor der Abtrennung unlöslicher Stoffe wird der pH-Wert auf einen Wert von etwa 7 bis eingestellt. Dies kann dadurch bewirkt werden, daß eine Säure (Schwefelsäure, Salzsäure) zugefügt oder gasförmiges Schwefeldioxid eingeleitet wird. Nach der Einstellung des pH-Wertes bleibt praktisch das gesamte Protein in Lösung, so daß die unlöslichen Nicht-Proteinbestandteile, wie Gräten, Schuppen und dergleichen, leicht entfernt werden, vorzugsweise durch Abzentrifugieren.
Wenn das Fisch-Ausgangsmaterial ein Fischmehl ist (das teilweise entfettet sein kann), wird dieses vorzugsweise in Wasser zu einer Aufschlämmung suspendiert, die etwa 5 bis 15 Gewichtsprozent Trockensubstanz enthält. Frischfisch oder geringwertige Fische haben einen relativ hohen Wassergehalt, so daß Wasser nur dann zugesetzt werden braucht, wenn der Feststoffgehalt außerhalb der angegebenen Grenzen liegt.
Nach Entfernung der unlöslichen Stoffe kann das Protein aus der Lösung abgetrennt werden, z.B.durch Ausfällen bei einem pH-Wert 4,5 bis 6,0. Ausgefälltes Protein, mit welchem die meisten Lipoide verbunden sind, kann durch Zentrifugieren abgetrennt werden , wobei es gewöhnlich zweckmäßig ist, dieses mit Wasser
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oder einer Natriumchloridlösung zu waschen. Im allgemeinen beträgt die Menge Waschflüssigkeit zwischen dem etwa 2- bis 6-fachen des Proteingewichts. Das Waschen kann mehrfach wiederholt werden und die Waschflüssigkeit kann nach dem Entsalzen wiedergewonnen werden, um sie Fischmehl zuzufügen. Nach dem Waschen wird das Protein erneut in Alkali gelöst, vorzugsweise unter Bedingungen, die denen der ersten Behandlung ähnlich sind.
Vor der Extraktion der Lipoide kann das gelöste Protein einer milden Hydrolyse mit einem proteolytischen Enzym unterworfen werden, vorzugsweise bei einem pH-Wert von ? bis 10. Der pH-Wert soll vorzugsweise nach der Alkalibehandlung auf einen Wert von 7 bis 8 eingestellt sein und das verwendete Enzym sollte bei alkalischen pH-Werten aktiv sein. Das bevorzugte Enzym ist Papain, mit welchem die Hydrolyse bei einer Temperatur von 60 bis 800C über einen Zeitraum von 5 bis 30 Minuten bewirkt werden kann. Die Hydrolysetemperatur wird gewöhnlich bezüglich der Erfordernisse des verwendeten Enzyms eingestellt.
Nach der Hydrolyse wird das Enzym durch Erhitzen inaktiviert und die Lösung wird auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Danach werden die unlöslichen Bestandteile entfernt (z.B. durch Zentrifugieren) und die vorhandenen Lipoide werden mit einem Lösungsmittel extrahiert. Dieser Verfahrenssehritt kann kontinuierlich durchgeführt werden unter Verwendung eines mit Zentrifugalkraft arbeitenden Extraktionsgeräts oder einer geeigneten Extraktionskolonne mit einem mit Wasser unmischbaren Lösungsmittel oder mit einem Löeungsmittelsyitem, das wenigstens ein derartiges Lösungsmittel enthält. Der Ausdruck "mit Wasser, unmischbar" wird im gewöhnlichen technologischen Sinn gebraucht und umfaßt somit Lösungsmittel, die bis zu einem geringfügigen Grad mit Wasser mischbar sind,' sowie auch Lösungsmittel, die mit Wasser unmischbar sind. Es sollte Sorge dafür getragen werden, daß die Bildung einer Emulsion vermieden wird, weshalb bevorzugt ist, ein Lösungsmittelsystem zu verwenden, das als
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primäres Lösungsmittel aus einem mit Wasser mischbaren polaren Lösungsmittel für die Lipoide , wie Äthanol oder Isopropanol, zusammen mit einem sekundären Lösungsmittel, das weniger polar als das primäre Lösungsmittel ist, z.B. Methylisobutylketon oder Hexan, besteht. Bevorzugte Lösungsmittelkombinationen sind Isopropanol/Methylisobutylketon, Äthanol/Methylisobutylketon und Isopropanol/Hexan. Das Verhältnis von primärem zu sekundärem Lösungsmittel kann.zwischen 1:1 und 1:2,5 » bezogen auf das Volumen, betragen. Das Mengenverhältnis der Proteinlösung zur gesamten Lösungsmittelmenge beträgt allgemein 60 bis 80 Teile Lösung (die 3,5 bis .10,5 Gewichtsprozent gelöstes Protein enthält) zu 20 bis 40 Teilen Lösungsmittel. Das Lösungsmittel und die extrahierten Lipoide können durch übliche Verfahren isoliert werden und die Lösungsmittelreste werden vorzugsweise aus der Proteinlösung durch Rektifikation oder Abstreifen mit Wasserdampf entfernt.
Die lösungsmittelfreie Proteinlösung wird vorzugsweise auf etwa 10 bis 2OjS. Peststoff gehalt konzentriert und auf einen pH-Wert 4,5 bis 5,5 angesäuert (z.B. mit Salzsäure) ,um eine unerwünschte, dunkel gefärbte Proteinfraktion mit einem Fischgeschmack auszufällen. Die ausgefällte Fraktion kann durch Zentrifugieren entfernt werden, während das gereinigte Protein vor dem Trocknen entfärbt und entsalzt wird. Aktivkohle wird vorzugsweise zur Entfärbung verwendet und das Entsalzen kann durch Ionenaustausch oder Ultraf iltration l^iwirkt werden. Vor dem Trocknen kann die Proteinlösung weiter konzentriert werden auf einen Gehalt von etwa 30 bis 50 Gewichtsprozent Feststoffe, z.B. durch umgekehrte Osmose oder andere Verfahren, bei denen schädliche Hitzeeinwirkungen auf das Protein vermieden werden. Das Trockenprodukt ist ein weißes Pulver, das in Wasser löslich ist und einerjmilden Geschmack aufweist. Der Proteingehalt liegt zwischen 95 und 100 Gewichtsprozent.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, wobei sich Teile und Prozentsatz auf das Gewicht beziehen.
Beispiel 1 2O08U/O922 Beispiel 1
Eine wässrige Aufschlämmung , die 10 % niehtextrahiertes Fischmehl enthält, wird auf 7O0G erhitzt und mit einer ausreichenden Menge Natriumhydroxidlösung versetzt, daß die Alkalikonzentration 0,3 η beträgt. Die alkalische Aufschlämmung wird schnell auf 100 bis 1200C durch Einleiten von Wasserdampf in einem kontinuierlichen Strom erhitzt. Die Strömung wird so eingestellt, daß die Verweilzeit vor dem Abkühlen auf 650G etwa 30 Sekunden beträgt.
Nach dem Abkühlen wird der pH-Wert auf etwa 8 durch Injizieren von gasförmigen Schwefeldioxid eingestellt und die Aufschlämmung weiter auf Umgebungstemperatur abgekühlt.
Die in der Aufschlämmung vorhandenen unlöslichen Stoffe, wie Fischgräten, werden durch Zentrifugieren entfernt und eine klare Proteinlösung, die etwa 11 $ Feststoffe enthält, wird isoliert. Diese Lösung wird auf den pH-Wert 5,2 durch Zugabe von Schwefel-, dioxid angesäuert und der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren äagetrennt.
Die Mutterlauge wird entsalzt und getrocknet zur Wiederverwendung als Zusatz zu Fischmehl für Futterzwecke. Der rohe Proteinniederschlag wird dreimal mit Wasser (oder einer 10 #igen Na* triumchloridlösung) gewaschen in einer Menge von 4 Teilen Waschflüssigkeit für jedes Teil Protein.
Nach dem Waschen wird das protein in Wasser suspendiert und durch Zugabe von Alkali bis zu einer Konzentration von 0,2 η gelöst. Die Lösung wird schnell auf 1000G erhitzt, 30 Sekunden auf dieser Temperatur gehalten und auf 600C abgekühlt. Der pH-Wert der Lösung wird auf 7f5 eingestellt und es werden 2 i» Papain, bezogen auf Protein, zugefügt und die Temperatur 10 Minuten auf 600C gehalten. Das Enzym wird anschließemd durch Erhitzen über 3 Minuteri auf etwa 1000C inaktiviert und die Lösung wird auf Umgebungstemperatur abgekühlt.
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Die unlöslichen Bestandteile werden durch Zentrifugieren entfernt und die Proteinlösung wird nach dem Vermischen mit 17 ^ Isopropanol in einem Zentrifugalextraktionsgerät entfettet, zuTjelchem Methylisobutylketon in einer Menge von 1 Teil je 4 Teilen Proteinlösung mit etwa 7 # Feststoffgehalt zugefügt wird.
Der das Extraktionsgerät verlassende Lösungsmittelstrom, der Fette, Phospholipoide, Lipoproteine und ähnliche Substanzen enthält, wird zur Wiedergewinnung des Lösungsmittels und der Lippidfraktion aufgearbeitet, während die Proteinlösung mit ψ Wasserdampf abgestreift wird , um Lösungsmittelreste zu entfernen, und auf 15 ^ Feststoffgehalt eingeengt. Der pH-Wert der konzentrierten Lösung wird auf 5,0 mit Salzsäure eingestellt, wodurch eine kleine Menge einer unerwünschten Proteinfraktion ausgefällt wird, die durch Zentrifugieren abgetrennt wird. Die klare Lösung aus der Zentrifuge wird mit Aktivkohle entfärbt und durch Ionenaustausch unter Verwendung eines stark basischen und eines st aril sauren Ionenaustauscherharzes entsalzt. Nach der Konzentration (umgekehrte Osmose) auf 30 $> Feststoffe wird die Proteinlösung bei einer Produkttemperatur von nicht über 800C sprühgetrocknet.
Das erhaltene trockene Pulver ist praktisch völlig in Wasser löslich und hat einen milden Qeschmack. Der Proteingehalt beträgt 99 $ und das Produkt kann zu verschiedenen Nahrungsmitteln und Getränken zugesetzt werden. Es kann auch durch Extruflieren oder Spinnen geformt werden.
Es wird eine wäßrige Aufschlämmung , die 25 # Abfallprodukte aus der Fischfilettierung enthält, hergestellt und deren pH-Wert durch Zugabe von 30 j£iger Natriumhydroxidlösung auf 9 eingestellt. Die Aufschlämmung wird heftig 1 Stunde gerührt und anschliessend durch Einleiten von Wasserdampf nach der Einstellung der Alkalikonzentration auf 0,04 η durch Zugabe von 30 #iger NaOH-Lösung auf 10Qo
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— 7 "*
von 30 ^iger NaOH-Lösung auf 10O0G erhitzt.
Das Erhitzen wird in einem kontinuierlichen System durchgeführt, wobei die Strömungsgeschwindigkeit so eingestellt wird, daß die Verweilzeit etwa 2 Minuten bei 1000G vor dem Kühlen auf etwa 600G beträgt.Nach dem Abkühlen wird der pH-Wert auf 7,5 duch Zugabe von η-Salzsäure eingestellt und die unlöslichen Stoffe werden zusammen mit einer Pettphase durch Zentrifugieren entfernt. Es wird eine klare Lösung, die 4 $ Protein enthält, erhalten.
Zu der Lösung wird 1 i» Papain, bezogen auf Protein, zugefügt und die Temperatur wird 30 Minuten auf 650C gehalten und danach wird das Enzym durch Erhitzen auf etwa 10O0G über 3 Minuten inaktiviert. Nach dem Abkühlen auf Umgebungstemperatur werden die unlöslichen Stoffe, die während der Enzymbehandlung ausgefallen waren, durch Zentrifugieren abgetrennt und die Proteinlösung wird auf 10 i» ikrockensubetanz durch umgekehrte -Osmose eingeengt.
Die konzentrierte Lösung wird mit 17 i» Isopropanol gemischt und die Lipoide werden in einem Zentrifugalextraktionsgerät extrahiert, zu welchem Methylisobutylketon in einer Menge von 1 Teil je 4 Teile der Protein/Isopropanollösung eingespeist wird. Der austretende Lösungsmittelstrom wird nach Zurückgewinnung des Lösungsmittels .und der Lipoide aufgearbeitet, während die Proteinlösung zur Entfernung von Spuren des Lösungsmittels rektifiziert wird.
Die Proteinlösung wird anschließend mit Aktivkohle behandelt und entsalzt und durch Ultrafiltration,, auf 30 i* Festet off gehalt konzentriert. Sie kann sprühgetrocknet oder gefriergetrocknet werden, wobei im ersten Fall vorzugsweise die Produkttemperatur nicht über 800C beträgt.
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Es wird ein weißes, wasserlösliches Pulver mit einem milden Geschmack, das 95 $ Protein enthält, erhalten. Das Pulver ist geeignet als Zusatz zu verschiedenen Nahrungsmitteln und Getränken und kann auch durch Extrudieren oder Spinnen geformt werden.
Beispiel 3
Es wird eine wäßrige Aufschlämmung, die 10 $ eines teilweise entfetteten Fischmehls enthält, auf 7O0G erhitzt.Zu der Aufschlämmung wird eine ausreichende - Menge Kaliumhydroxidlösung gegeben, daß die Alkalikonzentration 0,3 η beträgt. Die alkali-
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sehe Aufschlämmung wird schnell durch Einleiten von Wasserdampf in einem kontinuierlichen Strom auf 1000G erhitzt. Der Strom wird so eingestellt, daß eine Verweilzeit von etwa 30 Sekunden vor dem Abkühlen auf 65°G erreicht wird.
Nach dem Abkühlen wird der pH-Wert auf etwa 8 durch Zugabe von η-Salzsäure eingestellt und die Aufschlämmung wird weiter auf Umgebungstemperatur abgekühlt.
Die in der Aufschlämmung vorliegenden unlöslichen Stoffe ,wie Fischgräten, werden durch Zentrifugieren entfernt und es wird eine klare Proteinlösung, die etwa 11 % Feststoffe enthält, isoliert. Diese Lösung wird durch Zugabe von η-Salzsäure auf einen pH-Wert von 5,2 angesäuert und der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt.
Die Mutterlauge wird entsalzt und getrocknet und dient als Zusatz zu Fischmehl für Futterzwecke. Der rohe Proteinniederschlag wird dreimal mit 10 #iger Natriumchloridlösung in einer Menge von 4 Teilen Waschflüssigkeit je Teil Protein gewaschen·
Nach dem Waschen wird das Protein in Wasser suspendiert und
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durch Zugabe von Alkali bis zu einer Konzentration von 0,1 η gelöst.Die Lösung wird schnell auf 1000O erhitzt, 30 Sekunden auf dieser Temperatur gehalten und auf 600C abgekühlt. Der pH-Wert der Lösung wird auf 7,5 eingestellt und es werden 2 # Papain, bezogen auf Protein, zugefügt und die !Temperatur wird 10 Minuten auf 600G gehalten. Das Enzym wird dann durch Erhitzen.über 3 Minuten auf etwa 1000C inaktiviert und die Lösung wird auf Umgebungstemperatur abgekühlt.
Die während der Enzymbehandlung gebildeten unlöslichen Stoffe werden durch Zentrifugieren abgetrennt unddie Proteinlösung wird nach dem Vermischen mit 17 i* Isopropanol in einem Zentrifugalextraktionsgerät entfettet, zu welchem Methylisobutylketon in einer Menge von 1 Teil je 4 Teilen Proteinlösung mit einem Gehalt von etwa 7 fi Feststoffen zugegeben wird.
Der das Extraktionsgerät verlassende Lösungamittelstrom, der Fette, Phospholipoide, Lipoproteine und ähnliche Substanzen enthält ,wird zur Rückgewinnung des Lösungsmittels und der Lipoidfraktion aufgearbeitet, während die Proteinlösung mit Wasserdampf zur Entfernung von Lösungsmittelresten abgestreift und auf 15 "fr Feststoffe konzentriert wird» Der pH-Wert der konzentrierten Lösung wird mit Salzsäure auf 5,0 eingestellt, wodurch eine kleine Menge einer unerwünschten Proteinfraktion ausgefällt wird, die durch Zentrifugieren entfernt wird. Die klare Lösung aus der Zentrifuge wird mit Aktivkohle entfärbt und durch Ultrafiltration entsalzt. Nach dem Konzentrieren (umgekehrte Osmose) auf 30 $> Fetsstoffe wird die Proteinlösung gefriergetrocknet.
Das erhaltene trockene Pulver ist praktisch völlig in Wasser löslich und hat einen milden Geschmack. Die Proteingehalt beträgt 99 i> und das Produkt kann zu verschiedneen Nahrungsmitteln und Getränken zugesetzt werden. Es kann auch durch Extrudieren oder Spinnen geformt werden.
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Claims (19)

2H5936 Patentansprüche
1. Verfahren zum Isolieren von Protein aus Fischen oder Fischprodukten, dadurch gekennze i ohne t, daß man durch Behandeln des Fisches oder Fischprodukts mit Alkalien in wäßrigem Medium , wobei die Alkalikonzentration im Medium zwischen 0,02 bis 0,5 —normal beträgt, bei einer Temperatur von 90 bis 1200G nicht langer als etwa 5 Minuten einen erheblichen Teil des Fischproteins löslich macht, den pH-Wert des Mediums auf etwa 7 bis 10 einstellt, unlösliche Bestandteile aus dem Medium entfernt, die vorhanden Lipoide durch flüssig—flüssig—Extraktion mit einem Lösungsmittel für die Lipoide entfernt und das Protein aus der Lösung gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial elm wäßriges Medium verwendet, das 5 bis 15 Gewichtsprozent (als Trockensubstanz) Fisch oder Fischprodukte enthält.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, daß man nach dem Entfernen der unlöslichen Stoffe das Protein bei einem pH-Wert von etwa 4,5 bis 6,0 ausfällt, wäseht und vor dem Extrahieren der Lipoide in Alkali löst.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das protein mit Wasser oder einer wäßrigen Natriumchloridlösung wäscht.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das ausgefällte Protein in Alkali einer Konzentration von 0,02 bis 0,5 η löst.
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6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das ausgefällte Protein in Alkali bei einer Temperaturvon 90 bis 120°G löst» wobei die Temperatur nicht länger als etwa 5 Minuten aufrecht erhalten wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennze i chne t, daß man das gelöste Protein vor der Entfernung der Lipoide mit einem proteolytischen Enzym behandelt.
8. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß man die Enzymbehandlung bei einem pH-Wert von 7 bis 10 durchführt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8m dadurch gekennzeichnet, daß man die Enzymbehandlung bei einer Temperatur von 60 bis 800C durchführt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9» dadurch g ekennzeiehnet, daß man als Enzym Papain verwendet.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch g ekennzeichnet, daß man nach der Enzymbehandlung unlösliche Stoffe , die während der Behandlung gebildet worden sind, entfernt.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Entfernung der Lipoide ein mit Wasser mischbares polares Lösungsmittel zu der Proteinlösung zufügt.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel Isopropanol verwendet.
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14. Verfahren nach -einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lipoide durch Extraktion mit einem im wesentlichen mit Wasser unmischbaren Lösungsmittel entfernt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel Methylisobutylketon verwendet.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11,dadurch g e kenn ze ichne t, daß man die Lipoide durch Extraktion mit einem Lösungsmittelsystem aus einem mit Wasser mischbaren
w Lösungsmittel und einem mit Wasser unmischbaren Lösungsmittel entfernt.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet*, daß man die Lipoide mit 20 bis 40 Teilen Lösungsmittel je 60 bis 80 Teilen Proteinlösung extrahiert.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Entfernung der Lipoide den pH-Wert der Proteinlösung auf 4,5 bis 5,5 einstellt und den erhaltenen Niederschlag entfernt.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichne t, daß man das isolierte Protein trocknet.
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