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Verfahren zur Gewinnung von Proteinen bie erfindung betrifft ein Veriahren
sur Gewinnung von Proteinen, insbesondere von lbusinen und Globulinen aus Samen
von Raps, Sonnenblumen und Leguminosen, wobei sowohl eine stufenweise als auch eine
kombinierte Gewinnung von Globulinen und Albuminen erreicht werden soll.
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Das übliche Verfahren zur Gewinnung von Proteinen aus Pilansensamen
besteht in der isoelektrischen Fällung in saurem Milieu, wobei nur die säureiällbnre
Globulinfraktion erfaßt wird, während die säurelösliche Albuminfraktion ungefällt
in Lösung verbleibt.
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Zur Gewinnung der säurelöslichen Molkenproteine der Milch wird die
Hitzepräzipitation in saurem Milieu angewandt, die entweder für Molkenproteine allein
oder durch Kombination mit der isoelektrischen Kaseinfällung für Kasein und Molkenproteine
enthaltende Lösungen eingesetzt werden kann. Zur Trennung von Nucleinsäuren und
Proteinen aus mikrobieller Biomasse ist eine Fällung der Proteine aus alkalischer
Lösung durch Temperatureinwirkung beschrieben worden. Es ist weiterhin die Fällung
von Molkenproteinen mit polyanionischen Agent ion wie Natriusalginat oder Natriumpolyphosphat
bektuizit.
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Zur Gewinnung der Albumin-Praktion aus Samen wie Sonnenblume und Raps
ist das herkömmliche Hitzepräzipitationsverfahren ungeeignet.
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Erhitzen der nach der isoelektrischen Globulin-Fällung resultierenden
aauren Albuminlösung liefert entweder nur Spuren gefällter Albumine oder überhaupt
keine Albumin-Präzipitate. Aus diesem Grunde ist auoh das genannte Kopräzip@tationsverfahren
für Milchproteine auf Extrakte von Pflanzenprotein@n nicht übertragbar, zumal sich
auch pflanzliche Globulin durch relativ große Stabilität außerhalb des isoelektrischen
Bereiche auszeichnen und bei Hitzeeinwirkung unter günstigen Konzentrationsbedingungen
zwar zur Gelbildung neigen, nicht aber in allen Fällen aus weniger konzentrierten
Lösungen, wie sie bei den üblichen Extraktionsverfahren
erhältlich
sind, koagulieren, Die für die Gewinnung mikrobieller Proteine eingesetzte Eitzebehandlung
alkalischer Lösungen iührt bei den Proteinen aus Rizinus-Samen zwar zu einer Desaktivierung
toxischer Proteine, nicht aber zu einer nennenswerten Ausfällung von Proteinen.
Zudem wäre eine Ubertragung der für mikrobielle Proteine beschriebenen Verfahrensweise
aui pflanzliche Rohstoffe mit' dem Ziel der Proteingewinnung deshalb problematisch,
weil die in Lösung neben dem Protein vorliegenden Schleimstoffe, Polysaccharide,
Phytine und andere Nichtprotein-Komponenten des Samenmaterials durch Kopräzipitation
mit dem koagulierenden Protein ebenfalls ausfallen und dieses verunreinigen würden.
Das für die Gewinnung von Protein-Konzentraten beschriebene Verfahren ist deshalb
für die Gewinnung von Protein-Isolaten wenig geeignet. Der Einsatz polyanionischer
Agentien zur Proteinfällung liefert Protein-Fällungsmittelkomplexe, deren Gehalt
an Fällungsmittel in den meisten Fällen aus lebensmittelrechtlichen Gründen unzulässig
ist oder bei der Verarbeitung stört. Zudem ist die Fällung mit polyanionischen Agentien
als eine vorzugsweise auf ionische Wechselwirkungen mit dem Protein beruhende Reaktion
aui salzfreie oder salzarme lösungen beschränkt und somit bei stark salshaltigen
Protein-Extrakten nicht anwendbar. Lösungen mit relativ hohem Salzgehalt, z.B. 10
% Kochsalz, sind aber als wirksame Eiweiß-Extraktionsmittel bekannt, die auch Anwendung
in einem Verfahren zur kombinierten Ol-Protein-Gewinnung aus Ölsaaten gefunden haben.
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Zweck der Erfindung ist sowohl die stufenweise ala auc, die kombinierte
Gewinnung von Albuminen und Globulinen aus salzhaltigen oder salzfreien Extrakten
eiweißhaltiger Pflanzenteile durch Abstellung der genannten Mängel des Stands der
Technik, Die Notwendigkeit einer Gerinnung der Alhuminfraktion besteht insbesondere
bei Pflanzensamen mit hohem Albuminanteil; dieser macht z.B. bei Rapssamen 50 %
des Proteinanteils aus.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die in Extrakten aus pflanzlichem
Material gelöst vorliegenden Proteine, insbesondere.
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Globuline und Albumine ohne Anwendung von Fällungsmitteln, die mit
den Proteinen Komplexe oder schwer zu trennende Verbindungen eingehen, in hoher
Ausbeute und Reinheit zu gewinnen. Entsprechend
dem Verwendungszweck
sollte die Gewinnung sowohl eine kombinierte Fällung der Globuline und Albumine
als auch eine getrennte, stufenweise Pällung beider Proteine unter gleichseitiger
Abtrennung von Nichtproteinkomponenten des Samenmaterials ermöglichen, weiterhin
sollte die Proteinfällung weitgehend unabhängig vom Elektrolytgehalt durchführbar
und auf Extrakte verschiedener Eiweißquellen übertragbar sein.
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Es wurde gefunden, daß die störenden Schleimstoffe, Phytine und Polysaccharide
vor der Ausfällung der Proteine dadurch entfernt werden können, daß die bei den
üblichen Extraktionsverfahren mit Salzlösungen neutralen bis schwach sauren Protein-Extrakte
oder die nach isoelektrischer Fällung der Globuline resultierenden und die Albumine
enthaltenden Überstandslösungen bei Temperaturen zwischen 0 und 50 ° C aui pH-Werte
zwischen 7 und 9,5, vorzugswoiso zwischen 7,0 und 8,5 eingestellt werden.
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Die unter milden pH- und Temperaturbedingungen (pH 7,0 - 8,0, 20°
C) abgeschiedenen Nichtprotein-Stoffe enthalten keine nennenswerten Mengen an Protein-Stickstofi,
Hingegen fallen bei höheren pH-werten, insbesondere über 9,0 und Temperaturen, insbesondere
über 800 C, zunehmende Mengen an Protein aus. Zur Gewinnung der Proteine aus der
schleimstoffreien Lösung wird daß PH zweckmäßig auf werte zwischen 9,0 und 10,0
und die Temperatur auf Werte zwischen 80 und 100° C eingestellt. Im Gegensatz zu
den Proteinen aus mikrohieller Biomasse, die als funktionelle Proteine eine größere
Labilität gegenüber denaturierenden @gentien besitzen als die Speicherproteine der
Pflanzensamen und bereits im neutralen oder sauren Bereich in guter Ausbeute durch
Hitzeeinwirkung gefällt werden können, besitzen pflanzliche Proteine in den bei
der Extraktion aus dem Samenmaterial erzielbaren Konzentrationen ton 0,5 bis 2,5
(bzw. von 0,2 bis 1,0 * in den Uberständen der isoelektrischen Fällung) eine ausgesprochene
Temperatur- und pH-Schwelle, unterhalb deren eine Koagulation nicht eintritt. Im
angegebenen Temperatur- und pH-Bereich lassen sich Protein-Ausbeuten von über 90
er erzielen.
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Bei höheren Protein-Konzentrationen (> 10 %) gelingt eine Hitzefällung
der Proteine in geringerem Maße bereits bei pH-Werten zwischen 7,0 und 8,0, Jedoch
lassen sich derartige Konzentrationen durch die üblichen Extraktionsschritte nicht
realisiegen.
Albumine aus den Samen von Raps und Sonnenblume zeichnen
sich durcn stark basischen Charakter (isoelektrische Punkte über pH 9,p) aus. Ihre
Fällbarkeit ist umso beeaer, Je näher der pH-Wert ihrer Lösung im isoelektrischen
Bereich liegt. In stärker alkalischem Gebiet geht die Fällbarkeit Jedoch zurück.
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Die gelösten proteine koagulieren unter den genannten Bedingungen
schlagartig, so daß bereits kurzzeitiges erhitzen von 1 bis 5 min zur Erzielung
maximaler Ausbeuten ausreicht, »9 wurde weiter gefunden, daß eine gemeinsame fällung
der Globuline und Albumine aus Eiweißextrakten durch Hitzekoagulation aus' alkalischer
Lösung erfolgen kann. Die anwesenheit saurer (Globuline) und basischer (Albumine)
Proteine in Pflanzenextrakten und ihre Wechselwirkung ermöglichen die Gewinnung
beider Fraktionen durch Einwirkung von Hitze unter den Bedingungen der Albuminfällung,
obwohl die Globuline allein nicht in allen Fällen durch Hitze koaguliert werden.
Dank einem günstigen Albumin-Globulin-Verhältnis in den Samen von Raps und Sonnenblume
können hier Ausbeuten von über 90 % des gelösten Proteins erzielt werden.
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Wie weiter gefunden wurde, läßt sich die nach Fällung der Proteine
verbleibende uberstandslösung wiederhplt zur Extraktion von Samenmaterial einsetzen,
ohne daß eine Verminderung der durch Hitzekoagulation erzielbaren Proteinausbeute
eintritt.
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Der pH-Wert des hitzegefällten Proteins liegt gewöhnlich zwischen
8,5 und 9,0. Für seine Aufarbeitung und im Hinblick auf die Weiterverarbeitung erweist
es sich als zweckmäßig, die alkalische Lösung unmittelbar vor der Separation des
Proteins zu neutralisieren.
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kit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können Proteine aus entfettetem
oder nicht entfettetem ochrot von ulsaaten oder anderen eiweißhaltigen samen oder
Pflanzenteilen, insbesondere aber aus Samen von Raps, Sonnenblume und Leguminosen,
in hohen Ausbeuten gewonnen werden. Damit wird ein viel größerer Eiweißanteil als
bei den bisher angewandten Verfahren iür Ernährungszwecke nutzbar gesucht. Im Zusammenhang
mit ökonomischen Überlegungen, wonach pflanzliche Proteine als Primärproteine bei
ihrem Einsatz für die menschliche Ernährung durch den Wegfall der Transformationsverluste
eindeutige Vorzüge gegenüber tieriachem Protein besitzen, ist diese Ausbeuteerhöhung
von Bedeutung.
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Die Fällung aus alkalischer Lösung führt bei gleichzeitiger IIitzeeinwirkung
zu einer Inaktivierung von Ensyminhibitoren, die in der Albuminfraktion von Ölsaaten
und Leguminosen enthalten sind und den einsatz des Proteine für Ernährungszwecke
begrenzen. Da die Verweilzeit in der alkalischen Lösung bei günstiger Verfahrensführung
nur kurz ist, wird auch der schädigende Einfluß des Mediums gering. Gleichzeitig
wird die @asserlöslichkeit herabgesetzt, so daß eine Neutralisation erfolgen oder
eine Reinigung der Proteine von Salzen und anderen niedermolekularen Verunreinigungen
bedenkenlos durch Waschen mit Wasser vorgenommen werden kann. Das Protein kann so
zusammen mit der Globuliniraktiont zB. durch Strukturierung, in eine für die ernährung
gewünschte Form gebracht oder in anaerer weise , z.B. in pulveriörmiger, gelöster
oder hydrolysierter Form, weiterverarbeitet bzw. generell åhrzwecken zugeführt werden.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Proteine
irei von Nichtprotein-Substanzen sind, die in anderes Verfahren als Fällungsmittel
dienen. Dadurch erübrigt sich die meist problematische und technisch schwer zu realisierende
Abtrennung dieser Fällungsmittel. Die hohen Proteinausbeuten aus salzhaltigen Extrakten
ermöglichen uaerdies eine Kombination des Verfahrens mit der in einer früheren Patentanmeldung
vorgeschlagenen lösungsmittelfreien @lgewinnung aus @lsaaten, was erhebliche ökonomische
Vorteile mit eich bringt. Lie Kopräzipitation von Albuminen und Globulinen bringt
nicht nur verfahrens technische Vorteile gegenüber einem behrstufenprozeß, sie liefert
auch ein hochprozentiges Feuchtprotein, dessen Konsistenz - z.B. durch Zugabe von
Salzen, - noch verbessert werden kann. Darüber hinaus ist sie für die Herstellung
von gemischten Proteinisolaten aus unterschiedlichen nohetoffen von besonderem Interesse.
uie erfindung ermöglicht weiterhin eine Rückführung des Lösungsmittels in den Extraktionsprozeß
und eine Verwertung der Nebenprodukte und ilückstände für Futterzwecke oder als
Zusatz für mikrobielle Nährböden. Sie zeichnet sich gegenüber anderen Verfahren
zur Albumingewinnung durch technische Einfachheit und wegen des Wegfalls besonderer
Eiweißfällungsmittel und deren Abtrennung vom gefällten Protein durch geringen Kostenaufwand
aus.
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Die Erfindung soll an nachstehenden Beispielen näher erläutert werden.
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Beispiel 1 Zur Extraktion von Rapssaat werden 200 g Samenmaterial
in Gegenwart von 1,6 1 10%iger Kochsalzlösung mit Hilfe eines Homogenisators zerkleinert.
Zentrifugation des erhaltenen Homogenats ergibt drei Phasen, eine feste, ungelöste
Zellbestandteile enthaltende Rückstandsphase, eine mittlere wäßrige, das extrahierte
Protein enthaltende Phase und eine fetthaltige obere Sahnesohicht.
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Nach Dekantation und Filtration werden 1260 ml wäßriger Proteinextrakt
mit 39 XZ des Saatstickstoffs erhalten, der durch Zugabe von 1 N Salzsäure auf einen
pH-Wert von 3,0 gebracht wird. Nach Abzentrifugieren wird ein 10%iger Proteinschlamm
isoliert, der insgesamt 6,7 g Rapeglobulin enthält. Das entspricht einer Ausbeute
von 40 % des aus der Saat extrahierten Stickstoffes bzw.
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50 Vo des extrahierten Proteine oder 15,6 % des Gesamt-Stickstoffanteils
der Saat. Der nach Abtrennung der Globulinfraktion erhaltene Überstand wird mit
1 N Natronlauge aui einen pH-Wert von 9,5 gebracht, die präzipitierenden Schleimstoffe
abzentrifugiert und die Lösung 10 min auf 90 - 950 C erhitzt, wobei die Albuminfraktion
ausfällt. Der nach der Zentrifugation gewonnene Proteinschlamm entspricht einer
Albumin-Menge von 4,8 g oder 29 % des Extraktstickstoffes bzw. 36 % des im Extrakt
enthaltenen Proteins.
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Beispiel 2 Zur Extraktion von Sonnenblumensaat werden 160 g geschältes,
vorzerkleinerter Samenmaterial in Gegenwart von 1280 ml 10 einer Kochsalzlösung
homogenisiert. Nach Trennung der drei Phasen wie im Beispiel 1 beschrieben werden
1000 ml Extrakt mit einem Eiweißgehalt von 11,1 g erhalten. Durch pH-Einstellung
auf 3,0 mit 1 N Salzsäure werden 9,1 g Protein (82 %), gefällt, Hitzebehandlung
des auf pH 9,5 eingestellten und von den ausgefallenen Nichtproteinstoffen abgetrennten
uberstandes ergibt weitere 1,1 g Protein (11,2 X des Gesamtproteins oder 54 , des
Albumins) Beispiel 3 Zur Extraktion der Proteine aus Ackerbohnen-Samen (vicia faba)
werden 100 g geschälte (oder ungeschälte) Samen in einer Schlagmühle zu Mehl vermahlen
und in 800 ml 10%iger Kochsalzlösung mit Hilfe eines Homogenisators intensiv verteilt.
Aus den nach Zentrifugation gewonnenen 680 ml Extrakt werden durch Einstellung
des
pH-Wertes auf 3,0 13,8 g Eiweiß (68 % des extrahierten Stickstoffes) gefällt. Der
nach Zentrifugation erhaltene Überstand wird auf einen pH-wert von 9,0 gebracht,
der entstehende Niederschlag abzentrifugiert und der @berstand 10 min auf 900 C
erhitzt, wobei weitere 1,2 g Eiweiß (5,8 % des extranierten Stickstoffes) gefällt
werden.
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Beispiel 4 1260 ml, nach Beispiel 1 gewonnener Rapssaat-Extrakt werden
mit 1 N Natronlauge auf pH 7,5 eingestellt, vom Niederschlag abgetrennt und auf
pH 9,5 gebracht. Anschließend wird 10 min auf 90 bis 950 C erhitzt und dae ausgefallene
Protein abzentrifugiert. Der so gewonnene Proteinschlamm enthält 11,5 g Albumin-Globulin-Gemisch
(86 % des extrahierten Proteins).
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Beispiel 5 Zur Extraktion von Sonnenblumensaat werden 160 g geschältes,
vorzerkleinertes Samenmaterial in Gegenwart von 1280 ml 10%iger Kochsalzlösung homogenisiert.
Nach Trennung der drei Phasen wie im Beispiel 1 beschrieben, werden 1000 ml Extrakt
mit einem Eiweißgehalt von 11,1 g erhalten. Durch Zugabe von 24 ml 1 N Natronlauge
wird der pH-Wert auf 8,5 gebracht, wobei sich @ineral- und Schleimstoffe abscheiden.
10 min Erhitzen des nach Zentrifugation erhaltenen uberstandes auf 85 bis 950 C
ergibt 9,3 g Eiweiß (83,8 %)