JPS6232886A - タバコモザイクウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ - Google Patents
タバコモザイクウイルスＲＮＡのｃＤＮＡInfo
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- JPS6232886A JPS6232886A JP60171317A JP17131785A JPS6232886A JP S6232886 A JPS6232886 A JP S6232886A JP 60171317 A JP60171317 A JP 60171317A JP 17131785 A JP17131785 A JP 17131785A JP S6232886 A JPS6232886 A JP S6232886A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- cdna
- tmv
- dna
- strain
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- Pending
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の費用
技術分野
本発明は、トマト系タバコモザイクウィルス（以下、Ｔ
ＭＶということがある）弱毒株ＲＮ△のｃＤＮＡに関す
る。このｃＤＮＡは、ＴＭＶの防除に用いられるＴＭＶ
弱毒株のＲＮＡをイン・ごトロで合成するのに有用なも
のである。
ＭＶということがある）弱毒株ＲＮ△のｃＤＮＡに関す
る。このｃＤＮＡは、ＴＭＶの防除に用いられるＴＭＶ
弱毒株のＲＮＡをイン・ごトロで合成するのに有用なも
のである。
先行技術
ＴＭＶの弱毒株は、それ自身は宿主植物であるトマトに
ごく軽微な病徴をひき起すだけであるが、先にこれに感
染したトマトには野生型強泪株が感染しないという性質
を持つ。この現象を利用して、トマトの幼苗にあらかじ
めＴＭＶ弱毒株（たとえば、ＴＭＶＬ 株）を接
種することにより野１Ａ 生型強毒株による病害を防除する技術が開発されて、す
でに広〈実施されている（大島信管：「農業および園芸
」、第５２巻、第５４８頁（１９７７年））。
ごく軽微な病徴をひき起すだけであるが、先にこれに感
染したトマトには野生型強泪株が感染しないという性質
を持つ。この現象を利用して、トマトの幼苗にあらかじ
めＴＭＶ弱毒株（たとえば、ＴＭＶＬ 株）を接
種することにより野１Ａ 生型強毒株による病害を防除する技術が開発されて、す
でに広〈実施されている（大島信管：「農業および園芸
」、第５２巻、第５４８頁（１９７７年））。
このような実用化の研究と共に、ＴＭＶ弱ｉｂ株ノーツ
テあるＴＭＶＬ ａＲＮＡ（７）ｃＤＮＡ１Ａ のクローン化のωＩ究も行なわれていて、該ｃＤＮＡの
全塩基配列がすでに明らかにされている（西口圧油はか
：「第６回国際ウィルス学会講演要旨集Ｊ （１９８
４年））。
テあるＴＭＶＬ ａＲＮＡ（７）ｃＤＮＡ１Ａ のクローン化のωＩ究も行なわれていて、該ｃＤＮＡの
全塩基配列がすでに明らかにされている（西口圧油はか
：「第６回国際ウィルス学会講演要旨集Ｊ （１９８
４年））。
先行技術の問題点
上記の所謂植物への予防接種は右意義な技術であるが、
現在の段階では必ずしも問題が無い訳ではない。寸なわ
ら、丁ＭＶ弱毒株はトマトに感染させることによって維
持・増殖されているのであるが、これには土地、時間、
管理の手間などがか）す、また増殖中に強ｍ株の混入や
復帰突然変異による強毒株の出現が起りうるからである
。
現在の段階では必ずしも問題が無い訳ではない。寸なわ
ら、丁ＭＶ弱毒株はトマトに感染させることによって維
持・増殖されているのであるが、これには土地、時間、
管理の手間などがか）す、また増殖中に強ｍ株の混入や
復帰突然変異による強毒株の出現が起りうるからである
。
このような問題は、イン・ビトロでＴＭＶ弱８弱性１株
いはそのＲＮ△を増殖させることができれば、解決する
ことができよう。
いはそのＲＮ△を増殖させることができれば、解決する
ことができよう。
しかしながら、ことがらはそんなに筒中ではない。
イン・ビトロでＴ Ｍ ＶのＲＮＡ（以下、ＴＭＶ−Ｒ
ＮＡという）と同じ塩基配列のＲＮＡ分子を合成するた
めには、ＴＭＶ−ＲＮＡのｃＤＮＡの５′ 一端側に転
写制御信号配列（づ゛なわち、プロモーター配列）が隣
接した１？４造を持つＤＮＡを構築し、これを鋳型とし
てＲＮＡポリメラーゼににるイン・ご］・口転写反応を
行なえばよい。しかし、現在知られているＴＭＶ弱市株
ＲＮＡのｃＤＮＡは、その作成に当ってこの秤技術にお
りる標準手法ともいうべぎオカヤマーバーグの方法（モ
レキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｈｏｌ
Ｃｅｌｌ、 Ｂｉｏｌ ） 、２１１６１−１７０ （
１９８２））を用いたため、その５′ 一端側に約７０
塩基対のオリゴ（Ｇ−Ｃ）ディルを持っており、この（
Ｇ−Ｃ）ディルとｃＤＮＡ本体とを切離すことは事実上
不可能である。（Ｇ−Ｃ）ディルの切除はエキソヌクレ
アーゼ消化によることになろうところ、（Ｇ・Ｃ）ディ
ルの良さを正確に知ってこれを過不足なく切除すべくこ
の酸素反応を制御することは極めて困難だからである。
ＮＡという）と同じ塩基配列のＲＮＡ分子を合成するた
めには、ＴＭＶ−ＲＮＡのｃＤＮＡの５′ 一端側に転
写制御信号配列（づ゛なわち、プロモーター配列）が隣
接した１？４造を持つＤＮＡを構築し、これを鋳型とし
てＲＮＡポリメラーゼににるイン・ご］・口転写反応を
行なえばよい。しかし、現在知られているＴＭＶ弱市株
ＲＮＡのｃＤＮＡは、その作成に当ってこの秤技術にお
りる標準手法ともいうべぎオカヤマーバーグの方法（モ
レキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｈｏｌ
Ｃｅｌｌ、 Ｂｉｏｌ ） 、２１１６１−１７０ （
１９８２））を用いたため、その５′ 一端側に約７０
塩基対のオリゴ（Ｇ−Ｃ）ディルを持っており、この（
Ｇ−Ｃ）ディルとｃＤＮＡ本体とを切離すことは事実上
不可能である。（Ｇ−Ｃ）ディルの切除はエキソヌクレ
アーゼ消化によることになろうところ、（Ｇ・Ｃ）ディ
ルの良さを正確に知ってこれを過不足なく切除すべくこ
の酸素反応を制御することは極めて困難だからである。
従って、このようなｃＤＮＡを用いてイン・ビトロ転写
反応を行なおうとづると、生ずる二本鎖ＤＮＡはプロモ
ーター配列とウィルスｃＤＮＡとの間にオリゴ（Ｇ−Ｃ
）を持つｂのとなって、それを鋳型として得られる転写
産物であるＲＮＡはウィルスＲＮＡ本来のＲＮＡ鎖の５
′ 一端に約７０塩基のＧディルを持つものとなってし
まう（第２図参照）。このようなＲＮＡはこれをトマト
に接種しても感染能力を持たないことは明らかである。
反応を行なおうとづると、生ずる二本鎖ＤＮＡはプロモ
ーター配列とウィルスｃＤＮＡとの間にオリゴ（Ｇ−Ｃ
）を持つｂのとなって、それを鋳型として得られる転写
産物であるＲＮＡはウィルスＲＮＡ本来のＲＮＡ鎖の５
′ 一端に約７０塩基のＧディルを持つものとなってし
まう（第２図参照）。このようなＲＮＡはこれをトマト
に接種しても感染能力を持たないことは明らかである。
結局、現在知られているＴＭＶ弱市株ＲＮＡのｃＤＮＡ
クローンでは、感染性のあるＲＮＡ分子をイン・ビトロ
で合成することはできない。
クローンでは、感染性のあるＲＮＡ分子をイン・ビトロ
で合成することはできない。
発明の概要
要 旨
本発明は上記の点に解決を与えることを目的とし、５′
一端側に（Ｇ−Ｃ）ディルを持たないＴＭＶ弱毒株Ｒ
ＮΔのｃＤＮＡを提供づ゛ることによってこの目的を達
成しようとするものである。
一端側に（Ｇ−Ｃ）ディルを持たないＴＭＶ弱毒株Ｒ
ＮΔのｃＤＮＡを提供づ゛ることによってこの目的を達
成しようとするものである。
そして、本発明は、このｃＤＮＡがオカヤマーバーグの
方法以外の方法によって合成しうろことを確認して成さ
れたものである。
方法以外の方法によって合成しうろことを確認して成さ
れたものである。
従って、本発明にＪ：るタバコモザイクウィルス弱毒株
ＲＮΔのｃＤＮＡは、５′ 一端に（Ｇ−Ｃ）ディルが
ついていないこと、を特徴とするものである。
ＲＮΔのｃＤＮＡは、５′ 一端に（Ｇ−Ｃ）ディルが
ついていないこと、を特徴とするものである。
なお、本発明でｒｃＤＮＡＪというときは、ＴＭＶ弱毒
株ＲＮＡに対して相補性の一木鎖ＤＮΔの外に、二本鎖
’ＤＮＡをも包含するものとする。
株ＲＮＡに対して相補性の一木鎖ＤＮΔの外に、二本鎖
’ＤＮＡをも包含するものとする。
効 果
本発明によれば、５′ 一端側に（Ｇ−Ｃ）ディルを持
たないＴＭＶ弱毒株ＲＮＡのｃＤＮＡが、オカヤマーバ
ーグの方法とは別の方法によって与えられる。
たないＴＭＶ弱毒株ＲＮＡのｃＤＮＡが、オカヤマーバ
ーグの方法とは別の方法によって与えられる。
そして、このＴＭＶ弱毒株ｃＤＮＡを用いることにより
、感染性のある転写産物ＲＮＡをイン・ごトロで合成す
ることができる。このようにして合成したＲＮＡは、従
来用いられてきた弱毒性ウィルスと同様に、強毒株ＴＭ
Ｖの病害を防除するのに有効である。
、感染性のある転写産物ＲＮＡをイン・ごトロで合成す
ることができる。このようにして合成したＲＮＡは、従
来用いられてきた弱毒性ウィルスと同様に、強毒株ＴＭ
Ｖの病害を防除するのに有効である。
本発明によるＴＭＶ弱毒株ＲＮＡのｃＤＮＡは、５′
一端に（Ｇ−Ｃ）ディルが（＝」Ｗしていないという点
で従来技術に属すべきＴＭＶ弱ｍ株ＲＮＡのｃＤＮＡと
相異している。
一端に（Ｇ−Ｃ）ディルが（＝」Ｗしていないという点
で従来技術に属すべきＴＭＶ弱ｍ株ＲＮＡのｃＤＮＡと
相異している。
ＴＭ、Ｖ弱毒株には種々のものがありうるが、そのうち
の一つの例はＴＭＶＬ 株である。こ１Ａ の株のＲＮＡのｃＤＮＡの全塩基配列が明らかにされて
いることは前記したところである。
の一つの例はＴＭＶＬ 株である。こ１Ａ の株のＲＮＡのｃＤＮＡの全塩基配列が明らかにされて
いることは前記したところである。
ｃＤＮＡの製造
本発明によるＴＭＶ弱汚株ＲＮＡのｃＤＮＡは、（イ）
このＲＮＡの取得、（ロ）逆転写酵素による、該ＲＮＡ
と相補性のＤＮＡの合成／ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド
の合成、（ハ）生成したＲＮＡ −ＤＮＡハイブリッド
のＲＮＡ鎖の分解によるｃＤＮＡの合成、および（ニ）
ＤＮＡポリメラーゼによる、該ｃＤＮ△の二本鎖化／ｃ
ｊｓｃ［）ＮＡの合成、という単位工程からなる方法に
よって合成することができる。
このＲＮＡの取得、（ロ）逆転写酵素による、該ＲＮＡ
と相補性のＤＮＡの合成／ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド
の合成、（ハ）生成したＲＮＡ −ＤＮＡハイブリッド
のＲＮＡ鎖の分解によるｃＤＮＡの合成、および（ニ）
ＤＮＡポリメラーゼによる、該ｃＤＮ△の二本鎖化／ｃ
ｊｓｃ［）ＮＡの合成、という単位工程からなる方法に
よって合成することができる。
これらの単位工程それ自身は公知のものであって、それ
ぞれの詳細についてはたとえばセル（Ｃｅｌｌ） 、２
８．３０３−３１３ （１９８２）を参照することがで
きる。
ぞれの詳細についてはたとえばセル（Ｃｅｌｌ） 、２
８．３０３−３１３ （１９８２）を参照することがで
きる。
なお、本発明ではｃＤＮＡという用語が一本鎖ＤＮＡの
外に二本鎖ＤＮＡをも包含することは前記したところで
あり、従って前記の工程（ニ）は所望工程ということに
なる。
外に二本鎖ＤＮＡをも包含することは前記したところで
あり、従って前記の工程（ニ）は所望工程ということに
なる。
（イ） ＴＭＶ弱毒株ＲＮＡの取得
この工程は、ＴＭＶ弱毒株をタバコに接種づることによ
り増殖させ、得られた感染菓を磨砕し、ウィルス粒子を
精製しくたとえば、ＰＥＧ沈澱−分画遠心法による）、
次いで得られたウィルス粒子をフェノールで処理するこ
とによって外被タンパク質を除いてウィルスＲＮＡを得
ることから成る。
り増殖させ、得られた感染菓を磨砕し、ウィルス粒子を
精製しくたとえば、ＰＥＧ沈澱−分画遠心法による）、
次いで得られたウィルス粒子をフェノールで処理するこ
とによって外被タンパク質を除いてウィルスＲＮＡを得
ることから成る。
（ロ） 逆転写酵素による相補性ＤＮＡの合成／ＲＮＡ
−ＤＮＡハイブリッドの合成 この工程は、具体的には、所与のＤＮＡの３′に（７）
ＲＮＡｖＡ（鎖長は１５〜２０塩基対程度）と相補的な
オリゴＤＮＡ （鎖長は、したがって１５〜２０塩基対
程度）を合成しくおよび好ましくは精製しくたとえば、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動による））、これをブ
ライマーとして逆転写酵素およびその基質としての４種
類のデオキシヌクレオシド三リン酸により相補性ＤＮＡ
鎖を合成することからなる。
−ＤＮＡハイブリッドの合成 この工程は、具体的には、所与のＤＮＡの３′に（７）
ＲＮＡｖＡ（鎖長は１５〜２０塩基対程度）と相補的な
オリゴＤＮＡ （鎖長は、したがって１５〜２０塩基対
程度）を合成しくおよび好ましくは精製しくたとえば、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動による））、これをブ
ライマーとして逆転写酵素およびその基質としての４種
類のデオキシヌクレオシド三リン酸により相補性ＤＮＡ
鎖を合成することからなる。
（ハ） 生成ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖の
分解 この工程は、前工程（ロ）産物であるＲＮＡ−ＤＮＡハ
イブリッドを適当濃度のアルカリ水溶液で処理して、Ｒ
ＮＡ鎖を選択的に除去することからなる。
分解 この工程は、前工程（ロ）産物であるＲＮＡ−ＤＮＡハ
イブリッドを適当濃度のアルカリ水溶液で処理して、Ｒ
ＮＡ鎖を選択的に除去することからなる。
分解産物は、たとえばアルカリ−ショ糖密度勾配遠心に
付して、ＤＮＡ鎖（所与のＴＭＶ−ＲＮＡの全長に対応
する相補性ＤＮＡ）を精製標品として得ることが好まし
い。
付して、ＤＮＡ鎖（所与のＴＭＶ−ＲＮＡの全長に対応
する相補性ＤＮＡ）を精製標品として得ることが好まし
い。
ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドからのＲＮＡ鎖の除去は、
リボヌクレアーゼ１」によって酵素的に行なうこともで
きる。リボヌクレアーゼＨは市販されているのでぞれを
利用するのが便利であるが、リボヌクレアーゼ日活性は
前工程で使用した逆転写酵素によって供給することもで
きる。なお、リボヌクレアーゼＨによるＲＮＡ鎖の除去
は、この酵素が高価であること、ならびにｃ Ｉ） Ｎ
ＡとハイブリダイズしていないＲＮＡは切れないので
別にこれを除かなければらないこと、という問題がある
。
リボヌクレアーゼ１」によって酵素的に行なうこともで
きる。リボヌクレアーゼＨは市販されているのでぞれを
利用するのが便利であるが、リボヌクレアーゼ日活性は
前工程で使用した逆転写酵素によって供給することもで
きる。なお、リボヌクレアーゼＨによるＲＮＡ鎖の除去
は、この酵素が高価であること、ならびにｃ Ｉ） Ｎ
ＡとハイブリダイズしていないＲＮＡは切れないので
別にこれを除かなければらないこと、という問題がある
。
（ニ） ｃＤＮＡの二本鎖化
所与のＲＮＡの他端、すなわち前記工程（ロ）で相補性
オリゴＤＮＡを合成したＲＮＡ端と反対側の端部（５′
一端）、の適当長さくたとえば、１５〜２０塩基対程
度）と同じ配列を持ったオリゴＤＮＡ （鎖長は、した
がって１５〜２０塩基対程度）を合成しくおよび好まし
くは精製しくたとえば、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動による））、これをプライマーとしてＤＮＡポリメラ
ーゼおよびその基質としての４種のデオキシヌクレオシ
ド三リン酸により二本鎖（ｄＳ）ｃＤＮＡを合成する。
オリゴＤＮＡを合成したＲＮＡ端と反対側の端部（５′
一端）、の適当長さくたとえば、１５〜２０塩基対程
度）と同じ配列を持ったオリゴＤＮＡ （鎖長は、した
がって１５〜２０塩基対程度）を合成しくおよび好まし
くは精製しくたとえば、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動による））、これをプライマーとしてＤＮＡポリメラ
ーゼおよびその基質としての４種のデオキシヌクレオシ
ド三リン酸により二本鎖（ｄＳ）ｃＤＮＡを合成する。
いずれの方法によったにゼよ、生成産物はたとえばアガ
ロースゲル電気泳動に付して、ｄｓｃＤＮＡ （所与の
ＴＭＶ−ＲＮＡの全長に対応するＤＮＡ）を精製標品と
して得ることが好ましい。
ロースゲル電気泳動に付して、ｄｓｃＤＮＡ （所与の
ＴＭＶ−ＲＮＡの全長に対応するＤＮＡ）を精製標品と
して得ることが好ましい。
（ボ） フローシート
第１図は、上記の工程を図で示したものである。
ｃＤＮＡの有用性
本発明によるＴＭＶ弱毒株ＲＮＡのｃＤＮＡは、このＲ
ＮＡをイン・ビトロで合成するのに有用なものである。
ＮＡをイン・ビトロで合成するのに有用なものである。
一般に、ｃＤＮＡから対応ＲＮＡをイン・ビトロで合成
することは遺伝子工学において確立された技術である。
することは遺伝子工学において確立された技術である。
この技術は、所与のｃＤＮＡの５′ 一端にプロモータ
ーを結合させ、これを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼに
よる転写反応を行なわせて、転写産物としてのＲＮＡを
回収Ｊ°る、ということからなる。
ーを結合させ、これを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼに
よる転写反応を行なわせて、転写産物としてのＲＮＡを
回収Ｊ°る、ということからなる。
本発明によるｃＤＮＡも適当なプロモーターを選択使用
することによって当然にこの技術にＪ：つて転写産物と
してのＲＮＡ、すなわちＴＭＶ弱ｉカ株ＲＮＡ、を与え
る。
することによって当然にこの技術にＪ：つて転写産物と
してのＲＮＡ、すなわちＴＭＶ弱ｉカ株ＲＮＡ、を与え
る。
第３図は、このイン・ビトロ転写反応を示すものである
。第２図に示した従来のＴＭＶｃＤＮＡの転写の場合と
異なって、ＴＭＶｃＤＮＡのくＧ・Ｃ）テイル山来のＧ
ディルを持たないＲＮＡが転写産物として得られる。
。第２図に示した従来のＴＭＶｃＤＮＡの転写の場合と
異なって、ＴＭＶｃＤＮＡのくＧ・Ｃ）テイル山来のＧ
ディルを持たないＲＮＡが転写産物として得られる。
実 験 例
まず、既知のＴＭＶＬ ＲＮＡの塩基配列１Ａ
より、常法にしたがって、ＲＮ Ａの３′ 一端に相補
性な塩基配列を持つオリゴＤＮＡ （１８ｍｅｒ 。
性な塩基配列を持つオリゴＤＮＡ （１８ｍｅｒ 。
以下ブライマーＡという）およびＲＮＡの５′端と同じ
塩基配列を持つオリゴＤＮＡ （１９１ｅｒ 。
塩基配列を持つオリゴＤＮＡ （１９１ｅｒ 。
以下ブライマーＢという）を合成し、尿素の入ったポリ
アクリルアミド電気泳動により精製した。
アクリルアミド電気泳動により精製した。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，９／４２℃）
、０．３Ｍ ＫＣｌ２０μｍ中にＴＭＶ−ＲＮＡ２０
μｊと過剰量のブライマーＡを溶かして極細のガラス管
に封入し、これを９０℃に加熱したのち徐冷することに
より、ＲＮＡとブライマーＡを会合させた。この溶液を
最終（ｆｉ２００μｉ中、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ５５ｍ
Ｍ。
、０．３Ｍ ＫＣｌ２０μｍ中にＴＭＶ−ＲＮＡ２０
μｊと過剰量のブライマーＡを溶かして極細のガラス管
に封入し、これを９０℃に加熱したのち徐冷することに
より、ＲＮＡとブライマーＡを会合させた。この溶液を
最終（ｆｉ２００μｉ中、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ５５ｍ
Ｍ。
Ｍ（Ｉｃ１ １０ｍＭ、ＤＴ７１０ｍＭ、ＫＣＩ３０
ｍＭ、ＴＭＶ−ＲＮＡ １００μｇ／ｍｌとなるよう
にしたのら、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸を１
ｍＭになるように加え、５０ユニツトの逆転写酵素を加
えて４２℃／９０分の反応を行なって、ｃＤＮＡを合成
した。フェノール抽出により酵素を除いて反応を止め、
エタノール沈澱により核酸を回収したのら、ＮａＯＨを
０．１Ｎとなるよう加え、３７℃に１晩保ってＲＮＡを
分解した。この溶液を、アルカリ−ショ糖密度勾配遠心
あるいは尿素−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
、はぼ全長ＲＮＡに相当する良さのｃＤＮＡを分取した
。ｃＤＮＡの合成効率は約３０％であり、そのうちの約
５％が全ｆｆ１ｃＤＮΔフラクシヨンに回収された。
ｍＭ、ＴＭＶ−ＲＮＡ １００μｇ／ｍｌとなるよう
にしたのら、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸を１
ｍＭになるように加え、５０ユニツトの逆転写酵素を加
えて４２℃／９０分の反応を行なって、ｃＤＮＡを合成
した。フェノール抽出により酵素を除いて反応を止め、
エタノール沈澱により核酸を回収したのら、ＮａＯＨを
０．１Ｎとなるよう加え、３７℃に１晩保ってＲＮＡを
分解した。この溶液を、アルカリ−ショ糖密度勾配遠心
あるいは尿素−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
、はぼ全長ＲＮＡに相当する良さのｃＤＮＡを分取した
。ｃＤＮＡの合成効率は約３０％であり、そのうちの約
５％が全ｆｆ１ｃＤＮΔフラクシヨンに回収された。
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，５／２５℃
）、１０ｍＭ ＭＯＣＩ ５０ｍＭ２・ ＮａＣｌ ２０１中に、上記ｃＤＮＡ全艮フラグショ
ンを、全長ｃＤＮＡが約１ｏｏｎｑとなるように溶かし
、過剰量のブライマーＢを加えて、エッペンドルフの遠
心管中で流動パラフィンを単層して９０℃で５分加熱し
たのち、徐冷して、ｃＤＮＡとブライマーＢとを会合さ
せた。この溶液を、最終４０μｍ中、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
１０ｍＭ５ ＭＯＣＩ １０ｍＭ、ＮａＣ
１２５ｍＭＳＤＴＴ ５ｍＭとなるようにしたのち、
４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を０．２ｍＭ
になるように加え、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■ラージ
フラグメント１０ユニットを加えて２１℃で３時間の反
応を行なって、ｃＤＮＡをｄｓｃＤＮＡに変換した。ｄ
ｓ ｃＤＮＡの変換効率は約５０％であり、このうち
約１％が全長ｄｓｃＤＮＡになっていた。
）、１０ｍＭ ＭＯＣＩ ５０ｍＭ２・ ＮａＣｌ ２０１中に、上記ｃＤＮＡ全艮フラグショ
ンを、全長ｃＤＮＡが約１ｏｏｎｑとなるように溶かし
、過剰量のブライマーＢを加えて、エッペンドルフの遠
心管中で流動パラフィンを単層して９０℃で５分加熱し
たのち、徐冷して、ｃＤＮＡとブライマーＢとを会合さ
せた。この溶液を、最終４０μｍ中、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
１０ｍＭ５ ＭＯＣＩ １０ｍＭ、ＮａＣ
１２５ｍＭＳＤＴＴ ５ｍＭとなるようにしたのち、
４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を０．２ｍＭ
になるように加え、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■ラージ
フラグメント１０ユニットを加えて２１℃で３時間の反
応を行なって、ｃＤＮＡをｄｓｃＤＮＡに変換した。ｄ
ｓ ｃＤＮＡの変換効率は約５０％であり、このうち
約１％が全長ｄｓｃＤＮＡになっていた。
第１図は、本発明によるｃＤＮＡの製造を示ずフローシ
ートである。 第２図は、公知のＴＭＶｃＤＮＡから転写によるＲＮＡ
の生成を示す説明図である。 第３図は、本発明によるＴＭＶｃＤＮＡから転写による
ＲＮＡの生成を示す説明図である。
ートである。 第２図は、公知のＴＭＶｃＤＮＡから転写によるＲＮＡ
の生成を示す説明図である。 第３図は、本発明によるＴＭＶｃＤＮＡから転写による
ＲＮＡの生成を示す説明図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、５′−端に（Ｇ・Ｃ）テイルがついていないことを
特徴とする、タバコモザイクウィルス弱毒株ＲＮＡのｃ
ＤＮＡ。 ２、タバコモザイクウィルス弱毒株がトマト系タバコモ
ザイクウィルス弱毒株である、特許請求の範囲第１項の
ｃＤＮＡ。 ３、トマト系タバコモザイクウィルス弱毒株がタバコモ
ザイクウィルスＬ＿１＿１＿Ａ株である、特許請求の範
囲第２項のｃＤＮＡ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60171317A JPS6232886A (ja) | 1985-08-03 | 1985-08-03 | タバコモザイクウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60171317A JPS6232886A (ja) | 1985-08-03 | 1985-08-03 | タバコモザイクウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6232886A true JPS6232886A (ja) | 1987-02-12 |
Family
ID=15921006
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60171317A Pending JPS6232886A (ja) | 1985-08-03 | 1985-08-03 | タバコモザイクウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6232886A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8044532B2 (en) | 2007-05-30 | 2011-10-25 | Yamaha Hatsudoki Kabushiki Kaisha | Wiring arrangement for a vehicle |
-
1985
- 1985-08-03 JP JP60171317A patent/JPS6232886A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8044532B2 (en) | 2007-05-30 | 2011-10-25 | Yamaha Hatsudoki Kabushiki Kaisha | Wiring arrangement for a vehicle |
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