JPH0242973A - 酵素循環利用による目的物質の製造方法とその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は酵素と基質の反応を利用して目的物質を得るも
のであって、酵素を失活させることなく長期間循環利用
できる酵素循環利用による目的物質の製造方法とその装
置に関するものである。

（従来の技術） 従来、酵素を利用した目的物質の生産方法は、酵素をそ
のままかもしくは固定化担体に付着させて基質と反応さ
せ、反応後加熱等による酵素失活と殺菌を行なったのち
、製品化されるが酵素を遠心分離させる等して除去後製
品を得ていた。

製品形態は液状、粉末等種々存在するが、上記従来方法
による酵素は、製品中に失活されて残留するかもしくは
固定化されたものは分離されて再洗浄後使用される。

回収利用可能な酵素を得る方法として、従来時開昭和５
２−１０５２８１号及び特開昭５９−１４７９１号等が
知られており、これらの方法によれば酵素を長期にわた
って活性を失うことなく反復利用できることが知られて
いる。このような、反復利用のための具体的な装置に関
する従来技術は、例えば特開昭６０−２７３８０号の如
く、反応器における酵素と基質を分離する膜を設けたも
のがある。

この他に一般文献には酵素を分離する方法として、遠心
分離するものや膜分離するものの記載がある。

（発明が解決しようとする課題） 以上従来技術において、酵素は１回使用かぎりとなるか
、又は再利用されるにしても汚染に注意しなければなら
ない等の問題があった。

又、酵素反応物の汚染を防止するためには、大量の酵素
を使用して反応を短時間とする方法があるがコストが畜
く、他の方法として基質のＰＨをアルカリ側か酸側にし
て反応させる方法もあるが、使用する酵素が限定されて
目的物質が得られないこともある。

更にフィルターを利用して目的物質を透過し酵素を再利
用する方法として「バイオリアクターの合理的設計と最
適操作」■技術情報センター発行、山根恒夫著１１２頁
〜１２７頁に記載されているが、再利用する過程におい
て基質の組成を変化させる物質の含量が増すという問題
があった。

これは反応後の酵素反応物の中に不溶解物が生じるため
であり、とくに蛋白質を加水分解する酵素で反応させる
ペプチド生産ではチロシン含１ｋが増し、チロシンの溶
解度が小さいことから沈澱物質が増えてフィルターの目
詰まりとなるという問題も前記問題と同時に生じる。

更に基質及び酵素は共に無菌状態ではないため、雑菌増
殖を防止することは目的物質生産において一つの課題で
あった。

雑菌に対する対策として基質や酵素を除菌フィルターを
介して滅菌密封された反応槽内に投入するという方法が
あるが、該装置系は高価となり、食品素材利用物質の生
産等においては開放系の装置で生産されているのが一般
的である。

したがって、本発明は酵素を失活させることなく長期的
に循環利用できる目的物質の製造方法とその装置を提供
することを目的とするものである。

（課題を解決するための手段） 以上のような目的を達成するため、本発明では目的物質
の製造方法とその装置として次のような方法と装置を提
案するものである。

すなわち、酵素と基質溶液とを反応槽で反応させたのち
、その酵素反応液から第一段目の濾過膜で不溶解物及び
雑菌などを除去し、さらに第二段目の濾過膜で酵素反応
生成物を通過後酵素を反応槽へ戻して、また基質を入れ
反応させることを特徴とする酵素循環利用による目的物
質の製造方法である。そして、水溶性高分子に酵素を固
定化した固定化酵素を基質と反応槽で反応させるもので
あり、酵素もしくは固定化酵素の分子量が１０．０００
〜１，０００，０００のものを使用するものである。以
上の方法では基質が蛋白であり、目的物質として遊離ア
ミノ酸を含むペプチド混合物等を生産するものである。

又装置としては次のようなものを使用する。

すなわち、酵素及び／又は固定化酵素と基質溶液とを反
応させる反応槽と、該反応槽と連通ずるバランスタンク
との間に反応液の循環路を形成する第一段目の濾過膜と
該第一段目の濾過膜を透過した液から酵素反応生成物を
透過する第二段目の濾過膜と、第二段目の濾過膜で透過
されなかった酵素及び／又は固定化酵素の含有残液を前
記反応槽に戻す流路上で構成した目的物質の製造装置で
ある。そして第一段目の濾過膜が０．１μｍ　＝０．４
５μｍのフィルターであり第二段目の濾過膜が分画分子
ｆｆｉ　１，０００〜５００，０００の膜を使用するも
のである。

（作　用） 酵素と基質を反応槽で反応させ、目的物質を分解生成さ
せる。この時、分解物質の一部は不溶解物で構成されて
いる。

反応終了後、反応槽からポンプを介してバランスタンク
へ送りバランスタンクから更にポンプを介して第一段目
の濾過膜に送り、ここで分解物中の目的物質と固定化酵
−素もしくは高分子の酵素は透過されて第二段目の濾過
膜へ送られる。

又、第一段目の濾過膜では、不溶解物や雑菌が透過され
ずにバランスタンクへ戻り廃棄される。

第二段目の濾過膜では目的物質を透過し、製品となり、
残りの酵素及び／又は固定化酵素含有残液は反応槽へ戻
される。

反応槽へ戻された酵素及び／又は固定化酵素は、これに
基質が加えられて再反応に使用される。

（実施例） 以下、図面に示す実施例に・ついて説明する。

一般に酵素の分子量は数万〜数十万であるが、これを水
溶性高分子に固定化させて分子量１０．０００〜１，０
００，０００とし、第一段目の濾過膜を透過するが第二
段目の濾過膜を透過しないものとする。

また固定化しないものは、高分子の酵素で分子量１０，
０００〜１，０００，０００のものを使用する。

かかる酵素と基質は反応槽（１）内で反応させられ、目
的物質を生成させる。

この時、酵素反応液の一部は不溶解物で構成されている
。

反応終了後、反応槽（１）から酵素反応液は、ポンプ（
２）を介してパイプ（マ）でバランスタンク（３）へ送
り、更にバランスタンク（３）からポンプ（５）を介し
てパイプ（８）で第一段目の濾過膜（４）に送られる。

第一段目の濾過膜（４）を透過した酵素反応液中の目的
物質と固定化酵素は透過されて、パイプ（１０）からポ
ンプ（１１）を介して第二段目の濾過膜（１２）に送ら
れる。

第一段目の濾過膜（４）では、不溶解物や雑菌が透過さ
れず、パイプ（６）を通じてバランスタンク（３）へ戻
り反応槽内が空になるまで循環透過されるが、最終的に
バランスタンク（３）内に残留する不溶解物や雑菌はパ
イプ（９）を通じて廃棄される。

第一段目の濾過膜は０．１μｍ〜０．４５μｍのフィル
ターが用いられるが、−船釣には０．２２μｍ〜０．４
５μｍのものが除菌用として用いられており、不溶解物
の除去効率を考えると前記範囲のものがよい。

このフィルターでは、目的物質と固定化酵素が透過する
。

第二段目の濾過膜（１２）では目的物質をパイプ（１３
）から透過して製品とし、残りの固定化酵素含有残液は
パイプ（１４）を通じて反応槽（１）へ送られる。

第二段目の濾過膜では、第一段目の濾過膜で不溶解物や
雑菌が除去された目的物質を透過するため反応槽（１）
へ戻される固定化酵素含有残液は、除菌されていると共
に清浄化されている。

第二段目の濾過膜は分画分子ｌ　１，０００〜５００、
０００の膜を使用し、酵素及び／又は固定化酵素溶液は
透過せず回収可能となる。又、第二段目の濾過膜前の第
一段目の濾過膜で不溶解物と雑菌の除去がされているの
で、第二段目の濾過膜の負荷が軽減され目詰まりも少な
い。

反応槽（１）に戻された固定化酵素は、これに基質が加
えられて再反応に使用され長期間循環利用が可能である
。

なお、反応槽（１）に投入する基質は、除菌フィルター
を介して投入することが雑菌増殖の防止上効果的である
。

以上のような、本発明の方法と装置を利用して遊離アミ
ノ酸を含むペプチド混合物を生産する場合について次に
説明する。

水溶性の高分子固定化担体、例えばアミノエチル化ヒド
ロキシエチルセルローズやデキストラン等にプロテアー
ゼ活性を有する酵素もしくは、ベクチダーゼ活性を有す
る酵素を付着させ、基質を酸カゼインや大豆蛋白等、蛋
白組成物として反応槽内で分解反応を行わせる。

反応終了後は、第一段目の濾過膜でチロシンを主成分と
する不溶解物と雑菌を除去廃棄し、第二段目の濾過膜で
遊離アミノ酸を含むペプチド混合物を透過して酵素及び
／又は固定化酵素は反応槽へ戻り循環利用される。

反応槽自体はバッチ生産であるが、反応時間とフィルタ
ーの処理能力によっては、反応槽とフィルターの組み合
わせから連続生産を可能とすることもできる。

得られた遊離アミノ酸を含むペプチド混合物は呈味剤、
経腸栄養剤、牛乳アレルギー防止蛋白剤として使用され
る等の利用法がある。

又酵素反応生成物は乾燥して粉末化すること等も、従来
のものと同様に対応できる。

又、酵素の分子量と第二段目の濾過膜の分画分子量は、
得ようとする目的物質によって、次表のごとく関係づけ
られる。

これらのどの関係においても、第一段目の濾過膜は、０
．１　μｍ−０，４５μｍの範囲の精密濾過膜が使用さ
れれば良い。

（発明の効果） 本発明によれば、次のような効果を奏する。

（１）　　酵素を無菌的に循環使用できるので高価な酵
素を有効に利用できる。

（２）基質も除菌フィルターを介して投入すれば無菌条
件がそろい、反応槽をとくに高価な無菌設備としなくて
も雑菌増殖は抑制され、短時間反応等への操作を必要と
しない。

（３）雑菌増殖を抑制するためにＰＨ副調整の操作が必
要でなく、使用酵素に制限されることはない。

（４）フィルターを２段階とし、不溶解物と雑菌除去を
行ったのち目的物質を透過するため第二段目の濾過膜負
荷が軽減され、確実に目的物質を生産できる。　　。

一般に、第二段目の濾過膜のみで酵素反応生成物を透過
しようとすると、チロシン等の不溶解物によって、膜の
目詰まりが生じ、長期の運転ができない。

なお、請求項３の酵素を使用すると、第一段目の濾過膜
は透過するが、第二段目の濾過膜は透過しない。

又、請求項６のフィルターを使用すると、第一段目の濾
過膜では目的物質と固定化酵素が透過し、第二段目の濾
過膜では目的物質を透過し、酵素及び／又は固定化酵素
含有残液は透過せず回収可能となる。

【図面の簡単な説明】

図面は、本発明方法と装置を示すフローシートー ・反応槽 ・バランスタンク ・第一段目の濾過膜 ・第二段目の濾過膜

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵素と基質溶液とを反応槽で反応させたのち、そ
   の酵素反応液から第一段目の濾過膜で不溶解物及び雑菌
   などを除去し、さらに第二段目の濾過膜で酵素反応生成
   物を透過後、酵素を反応槽へ戻して、また基質を入れ反
   応させることを特徴とする酵素循環利用による目的物質
   の製造方法。
2. （２）水溶性高分子に酵素を固定化した固定化酵素を基
   質と反応させることを特徴とする請求項１に記載の酵素
   循環利用による目的物質の製造方法。
3. （３）酵素もしくは固定化酵素の分子量が１０，０００
   〜１，０００，０００のものを使用することを特徴とす
   る請求項１及び２に記載の酵素循環利用による目的物質
   の製造方法。
4. （４）基質が蛋白であり、目的物質として遊離アミノ酸
   又はペプチド又は遊離アミノ酸を含むペプチド混合物を
   生産する請求項１、２、３記載の酵素循環利用による目
   的物質の製造方法。
5. （５）酵素及び／又は固定化酵素と基質溶液とを反応さ
   せる反応槽と、該反応槽と連通するバランスタンクとの
   間に反応液の循環路を形成する第一段目の濾過膜と該第
   一段目の濾過膜を透過した液から酵素反応生成物を透過
   する第二段目の濾過膜と、第二段目の濾過膜で透過され
   なかった酵素及び／又は固定化酵素の含有残液を前記反
   応槽に戻す流路とで構成されたことを特徴とする酵素循
   環利用による目的物質の製造装置。
6. （６）第一段目の濾過膜が０．１μｍ〜０．４５μｍの
   フィルターであり、第二段目の濾過膜が分画分子量１，
   ０００〜５００，０００の膜を使用することを特徴とす
   る請求項５記載の酵素循環利用による目的物質の製造装
   置。