ES2355065T3 - Concentración y lisis de células infectadas por adenovirus en una sola operación unitaria. - Google Patents

Abstract

Un método para liberar virus de células animales que contienen dichos virus, que comprende someter las células a centrifugación continua en condiciones eficaces para concentrar las células en un pelet de células, y expulsar de la centrífuga las células reducidas a un pelet por aberturas de salida de expulsión a un receptáculo de recogida, en condiciones tales que las células se someten a fuerzas eficaces para lisar dichas células, en el cual no se realiza paso adicional alguno eficaz para llevar a cabo la lisis celular.

Description

Concentración y lisis de células infectadas por adenovirus en una sola operación unitaria.

Campo de la invención

Esta invención describe, v.g. un método para preparar virus (v.g., Adenovirus) u otros organismos intracelulares.

Descripción de la invención

Esta invención describe, v.g. un método para liberar (preparar) entidades biológicas intracelulares (v.g., organismos, tales como, v.g., virus o partículas de virus, particularmente Adenovirus; orgánulos; o moléculas biológicas), que comprende someter células que contienen dichas entidades biológicas a un procedimiento continuo de centrifugación tal que, después de la concentración de las células a un sedimento de células y expulsión subsiguiente de la centrífuga, las células están lisadas suficientemente para permitir la preparación de un alto rendimiento (por célula del material de entrada) de las entidades biológicas. No se realiza ningún paso adicional eficaz para conseguir la lisis celular (v.g., un paso de congelación-descongelación o microfluidización) después de la expulsión del sedimento de células de la centrífuga. En una realización preferida, los organismos así preparados retienen un alto grado de viabilidad y/o infectividad; y las entidades tales como orgánulos o moléculas biológicas están sustancialmente intactas y/o son biológicamente activas.

Una ventaja del método es que permite concentrar y lisar células en un solo paso de proceso, simplificando y reduciendo con ello el coste del aislamiento de entidades biológicas intracelulares (v.g., subcelulares) a partir de las células. Otra ventaja del método es que puede obtenerse un rendimiento de material intracelular biológicamente activo mayor que con otros métodos. Otra ventaja del método es que permite una lisis suave de las células, de tal modo que las entidades biológicas intracelulares, v.g., virus, se mantienen sustancialmente intactas y/o viables durante el procedimiento de lisis.

Una realización de la invención es un método para preparar organismos intracelulares a partir de células hospedadoras que contienen dichos organismos, que comprende someter las células a centrifugación continua en condiciones eficaces para concentrar las células en un sedimento de células; y expulsar de la centrífuga las células reducidas a un sedimento a un receptáculo de recogida, en condiciones eficaces para lisar las células; en el cual no se realiza paso alguno eficaz para conseguir la lisis celular.

Las células en el "expulsado" (las células expulsadas) están lisadas sustancialmente y/o lisadas predominantemente; al menos 50%, preferiblemente al menos 90%, de las células están lisadas; las células se lisan a medida que se expulsan; los organismos intracelulares son virus; los virus son adenovirus; los adenovirus son adenovirus recombinantes adecuados para terapia génica; el rendimiento/célula de partículas de adenovirus o adenovirus infeccioso es mayor que el que puede obtenerse cuando las células que contienen dicho adenovirus se lisan por un procedimiento de congelación-descongelación, v.g., el rendimiento/célula de partículas de adenovirus es aproximadamente 1,2 a aproximadamente 1,6 veces mayor, o el rendimiento/célula de adenovirus infeccioso es aproximadamente 1,5 a aproximadamente 1,9 veces mayor; las células son células animales, preferiblemente células de mamífero o de insecto; las células expulsadas se hallan bajo una fuerza centrífuga relativa de aproximadamente 6.500 a 10.000 g, con preferencia aproximadamente 7.000 a 9.000 g; siendo dicha fuerza centrífuga aproximadamente 7.000 u 8.000 g; las células reducidas a un sedimento se expulsan a través de una o más salidas de expulsión que tienen una forma rectangular y un área de sección transversal de aproximadamente 50 a 500 mm^{2}; las células se centrifugan en una centrífuga Westfalia, Modelo CSA-1 o CSC-6; o las fuerzas ejercidas sobre las células en el momento de la expulsión son eficaces para lisar sustancialmente las células.

Otra realización se refiere a un método de preparación de virus intracelulares a partir de células que contienen dichos virus por centrifugación continua, comprendiendo la mejora cosechar los virus a partir del sedimento de células expulsado directamente, sin realizar ningún paso adicional eficaz para conseguir la lisis celular.

Otra realización es un método para preparar un lisado de células, que comprende someter las células a centrifugación continua en condiciones eficaces para concentrar las células en un sedimento de células; y expulsar de la centrífuga las células reducidas a un sedimento enviándolas a un receptáculo de recogida, en el cual las células se encuentran en la forma de un lisado de células; en donde no se realiza paso eficaz alguno adicional para conseguir la lisis celular.

Otra realización es un método para preparar un orgánulo o molécula biológica, que comprende someter células que contienen dicho orgánulo o molécula biológica a centrifugación continua en condiciones eficaces para concentrar las células en un sedimento de células; expulsar de la centrífuga las células reducidas a un sedimento a un receptáculo de recogida, en el cual las células contenidas en el "expulsado" (las células expulsadas) están sustancialmente lisadas; en donde no se realiza paso eficaz adicional alguno para conseguir la lisis celular; y cosechar el orgánulo o la molécula biológica del expulsado.

En el método de la invención, un cultivo de células que comprende una entidad biológica (v.g., un organismo, orgánulo o material biológico) de interés se alimenta a través de una centrífuga continua. Típicamente, un "sedimento de células" concentrado (que, por supuesto, puede comprender porciones de células o residuos de células, además de células intactas) se recoge en un recipiente de centrífuga (v.g., un bol), mientras que el medio agotado se retira continuamente a través de una primera salida a un primer recipiente de recogida. A intervalos de tiempo predeterminados, se inicia opcionalmente una alimentación de tampón de lavado (cualquier tampón de lavado adecuado, v.g., tampón de congelación PBS) a fin de intercambiar cualquier sobrenadante que quede en el recipiente de centrífuga con el tampón de lavado. A continuación de este intercambio (si se emplea), la alimentación de tampón de lavado se interrumpe y las células concentradas se expulsan del recipiente de la centrífuga a través de una segunda salida a un segundo receptáculo de recogida. Dependiendo del volumen en el cual se expulsan las células, la concentración de células puede ser significativamente mayor que la concentración inicial en la alimentación (v.g., aproximadamente una concentración de 10 veces a 50 veces mayor, típicamente del orden de 30 veces).

Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se propone que las células se mantienen sustancialmente intactas cuando se centrifugan para dar el pelet de células. Es decir, una fracción suficientemente pequeña de células se lisa durante la centrifugación de tal modo que una cantidad significativa de organismos intracelulares, orgánulos, o moléculas biológicas no se libera prematuramente en el sobrenadante y se desvía al receptáculo de recogida con el medio agotado. Las condiciones de centrifugación pueden optimizarse rutinariamente para cualquier célula de interés a fin de minimizar la cantidad de lisis celular durante la centrifugación. Véanse, v.g., los Ejemplos 2 y 4 para condiciones típicas de centrifugación.

Se propone también que a medida que las células concentradas (peletizadas) son expulsadas luego de la centrífuga a través de una salida de expulsión, se ven sometidas a fuerzas (v.g., fuerzas de cizallamiento), tales que las células se lisan sustancialmente. Una diversidad de medios de expulsión por los cuales las células son expulsadas a través de una salida de expulsión están abarcados por la invención. En general, las células son forzadas fuera de (expulsadas de) la centrífuga por fuerza centrífuga a través de una salida de expulsión cuando se retira una barrera (v.g., una puerta) (v.g., se levanta o se desplaza), en un momento oportuno, dejando abierta la salida de expulsión. Tales barreras pueden ser accionadas por cualquiera de una diversidad de mecanismos, v.g., electrónicos (v.g. de solenoide), neumáticos, magnéticos o mediante un acoplamiento mecánico. En una realización preferida, una puerta es abierta por una transmisión accionada hidráulicamente, utilizando agua que no está en contacto con las células. Típicamente, el sobrenadante se descarga continuamente y por separado a través de una primera salida a un primer receptáculo de recogida, en tanto que el sedimento se descarga a través de una segunda salida a un segundo receptáculo de recogida. Sin embargo, las fracciones de sobrenadante y sedimento pueden, como alternativa, recogerse secuencialmente, a través de la misma salida.

Por "sustancialmente lisada" se entiende en esta memoria, v.g., que un número suficiente de células se lisan para permitir altos rendimientos de entidades biológicas (v.g., organismos, orgánulos, o moléculas biológicas, en el expulsado. Por ejemplo, se lisan más de aproximadamente 85%, 90% o 95% de las células. Se hace referencia algunas veces en esta memoria a las células sustancialmente lisadas como un "lisado". Las entidades biológicas en el expulsado pueden aislarse (v.g., separarse, purificarse) de material indeseable (v.g. contaminante) en el expulsado sin someterse a procedimientos ulteriores de lisis celular (procedimientos que rompen las células). Los procedimientos para separar tales entidades biológicas de los componentes subcelulares tales como, v.g., membranas celulares, no se consideran procedimientos de lisis celular, y están permitidos en el método de inventiva después del paso de expulsión.

Las células sometidas al método de la invención pueden estar "predominantemente" lisadas, v.g., más de aproximadamente 50% de las células están lisadas, v.g., más de 60%, 75%, 85%, 90% o 95% de las células están lisadas.

Las fuerzas a las que se someten las células durante la expulsión de la centrífuga son función de varios factores que incluyen, v.g., las fuerzas g ejercidas sobre las células durante la expulsión, la caída de presión a través de la o las salidas de expulsión (v.g., una o más aberturas de salida en el bol), la fuerza de cizallamiento alrededor de la o las salidas de expulsión, y la fuerza de impacto de las células que chocan contra el recipiente de recogida (v.g., la cámara exterior de la centrífuga). La fuerza g ejercida sobre las células durante la expulsión es función tanto del radio del bol de la centrífuga como de las revoluciones por minuto (rpm) a las cuales se centrifuga. Preferiblemente, las células se expulsan bajo una fuerza centrífuga relativa de aproximadamente 6.500 a 10.000 g, de modo más preferible aproximadamente 7.000 a 9.000 g, y de modo muy preferible aproximadamente 7.000 u 8.000 g. La caída de presión a través de la salida de expulsión y la fuerza de cizallamiento a medida que las células pasan a su través son función de muchos factores, que incluyen v.g., las dimensiones de la salida. En una realización, las células se expulsan a través de una pluralidad de aberturas de salida, v.g. entre aproximadamente 2 y 20 aberturas de salida, con preferencia aproximadamente 6 a 10; y cada abertura de salida tiene un área de sección transversal de aproximadamente 50 a 500 mm^{2}, con preferencia aproximadamente 100-300 mm^{2}. Las aberturas de salida pueden tener cualquier forma que proporcione fuerzas (v.g. fuerzas de cizallamiento) suficientes para lisar sustancialmente las células; en una realización preferida, las aberturas de salida tienen una configuración rectangular.

Cualquier centrífuga continua, v.g. una centrífuga de pila de discos o centrífuga abierta de bol, puede utilizarse en el método de la invención, con tal que pueda obtenerse un rendimiento alto de entidades biológicas intracelulares (v.g., Adenovirus), después de la expulsión del sedimento de células a un receptáculo de recogida y la cosecha de las entidades biológicas del expulsado. Entre las propiedades deseables de una centrífuga de este tipo se encuentran que las células no se ven sometidas a fuerzas significativas (v.g. fuerzas de cizallamiento o fuerzas centrípetas) cuando entran en el recipiente (bol) o cuando son centrifugadas para dar un sedimento de células. En una realización preferida, la centrífuga tiene cualquiera de una diversidad de configuraciones de entrada convencionales de fuerza de cizallamiento bajo. Por ejemplo, la misma puede utilizar un sistema de alimentación hermético al agua (HHFS), en el cual la corriente de producto/corriente de alimentación es acelerada por el producto propiamente dicho en el recipiente lleno. centrífugas adecuadas incluyen, v.g., la centrífuga Westfalia continua CSA-1 con HHFS, que tiene una capacidad de bol de 0,6 l, un volumen de retención del sedimento de 0,25 l, una capacidad de caudal máximo de aproximadamente 300 l/h, una velocidad máxima de 10.000 rpm, y una contrapresión ajustable del medio de desecho; la centrífuga Westfalia continua CSC-6 con HHFS, que tiene una capacidad de bol de 1,8 l, un volumen de retención de sedimento de 0,7 l, una capacidad de caudal máximo de aproximadamente 300 l/h, una velocidad máxima de 12.000 rpm, y una contrapresión ajustable del medio de desecho; o la centrífuga continua Alfa-Laval BTPX205, que tiene una capacidad de 1200 l/h y una velocidad máxima de bol de 9650 rpm. El ajuste para la contrapresión del medio de desecho puede optimizarse empíricamente. En una realización preferida, la contrapresión se ajusta a 20-30 psig (137,9-206,8 kPa), con una diana de 25 psig (172,4 kPa) para la operación. Una persona con experiencia en la técnica puede diseñar y/u optimizar fácilmente las características de las centrífugas de tal modo que las mismas sean funcionalmente equivalentes a los modelos representativos expuestos en esta memoria, v.g., con respecto a las células que queden sustancialmente intactas durante la centrifugación, y que tenga lugar lisis celular durante el proceso de expulsión.

Las condiciones de centrifugación y expulsión, así como los parámetros relevantes de la centrífuga utilizada, pueden optimizarse por métodos convencionales a fin de conseguir condiciones que permitan una lisis sustancial de las células, así como un deterioro mínimo de las entidades biológicas intracelulares que se liberan durante el procedimiento de lisis. Entre las condiciones de centrifugación que pueden modificarse para optimizar los rendimientos de las entidades biológicas intracelulares se encuentran, v.g. la velocidad de centrifugación y la temperatura durante la centrifugación, así como otros parámetros expuestos en otro lugar de esta memoria.

Cualquier tipo de organismo intracelular puede prepararse utilizando el método de la invención, con tal que el organismo sea suficientemente robusto para mantenerse en una forma sustancialmente intacta y/o, preferiblemente, viable y/o infecciosa después del procedimiento de preparación. Por "sustancialmente intacto" se entiende en esta memoria que tenga una estructura física suficiente para ser útil para un propósito dado. Por ejemplo, un organismo que pierde algunos de sus componentes estructurales durante la preparación, pero que conserva actividad antigénica, puede utilizarse como fuente para la preparación de, v.g., una vacuna. Una ventaja del método de la invención es que el mismo permite un rendimiento mayor de organismos intracelulares viables y/o infecciosos por célula hospedadora que otros métodos. El método de inventiva es particularmente adecuado para organismos que retienen un alto grado de viabilidad y/o infectividad después del procedimiento de preparación. Los métodos para medir la viabilidad y/o infectividad son rutinarios y convencionales. Para Adenovirus, por ejemplo, pueden medirse las partículas infecciosas con CPE, dilución en el punto final, o un ensayo de formación de calvas, o puede utilizarse análisis FACS, v.g., en asociación con anticuerpo anti-pentona (proteína de la cubierta) marcado con FITC. Véase, v.g., Ayala et al. (2000), "A flow cytometry method for determining Adenoviral infectivity and for directly monitoring Adenovirus infections of suspension cultures," ACS National Meeting, March 2000, San Francisco. Un grado (rendimiento) "alto" de viabilidad o infectividad (v.g., por cantidad inicial de células hospedadoras) es, por supuesto, un término relativo. El mismo puede determinarse para cada tipo de organismo individualmente, teniendo en cuenta el estado de la técnica de purificación de dicho organismo particular. Véase, v.g., el Ejemplo 4, que ilustra que pueden obtenerse Adenovirus infecciosos por rendimientos sustancialmente mayores por células hospedadora (en este caso, una recuperación incrementada aproximadamente 1,5 a 1,9 veces) cuando se preparan por el método de la invención, que cuando se preparan por otros procedimientos.

Los organismos preparados por el método de la invención pueden ser patógenos o no patógenos. Entre los tipos de organismos que pueden prepararse de este modo se encuentran cualquiera de una diversidad de parásitos, v.g., protozoos, que pueden residir en el interior de una célula hospedadora y que se mantienen intactos (y/o, preferiblemente, viables y/o infecciosos) después de la preparación de acuerdo con el método de la invención. Tales organismos serán evidentes para una persona con experiencia en la técnica que incluyen, v.g. organismos del paludismo (v.g., Plasmodium falciparum, malaria, vivax u oval), Trypanosoma, Leishmania, Onchocerca, Schistosoma, Entomoeba, Cryptosporidia, Giardia, Trichomonas, Toxoplasma, o Pneumocyctis. En una realización preferida, se preparan virus por el método de la invención. Puede prepararse cualquiera de una diversidad de dichos virus, con inclusión, v.g. de virus de DNA o RNA, tales como los comprendidos dentro de las familias siguientes: Parvovirus, Adenovirus, Herpesvirus, Poxvirus, virus afines a la Hepatitis-B, Picornavirus, Calcivirus, Astrovirus, Togavirus, Flavivirus, Coronavirus, Paramyxovirus, Rhabdovirus, Filovirus, virus de la gripe, Arenavirus, Bunyavirus, Reovirus, Retrovirus y otros que serán evidentes para un experto en la técnica. Son muy preferidos Adenovirus, v.g. Adenovirus de ave o de mamífero, de cualquiera de los serotipos que han sido identificados. En una realización muy preferida, se utilizan virus recombinantes, tales como, v.g., Adenovirus recombinantes o virus Adeno-asociados que son adecuados para terapia génica. Una diversidad de vectores virales han sido descritos, con inclusión de Adenovirus y Virus Adeno-asociados deficientes en genes apropiados (v.g., Adenovirus deficientes en el gen E1), que son adecuados para aplicaciones de terapia génica. Cualquiera de una diversidad de genes puede servir como, v.g., marcadores o como agentes terapéuticos, y pueden clonarse en tales vectores bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas e introducirse luego en pacientes en métodos de, v.g., terapia génica. La selección de vectores y genes adecuados que pueden expresarse en ellos, y métodos para producir tales constructos y para utilizar los mismos para métodos de terapia génica, in vitro o ex vivo, son convencionales y bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, v.g., Sambrook, J. et al (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Genes que pueden utilizarse en el método de la invención incluyen, v.g., genes que codifican polipéptidos tales como enzimas, hormonas, citoquinas, factores de crecimiento, etc. asimismo, pueden expresarse genes marcadores tales como, v.g., lacZ o la Proteína Verde Fluorescente. Otros tipos de organismos que pueden prepararse por el método de la invención incluyen, v.g., agentes infecciosos tales como, v.g., priones. Por ejemplo, mutantes o formas variantes de cualquiera de los organismos anteriores, con inclusión de virus, pueden prepararse por el método de la invención, al igual que formas recombinantes, híbridas, quiméricas, etc, de tales organismos. Gran parte de la exposición de esta memoria está dirigida a la preparación de Adenovirus. Sin embargo, una persona con experiencia en la técnica reconocerá que puede prepararse cualquier organismo, orgánulo o molécula biológica apropiado(a) por los métodos descritos en esta memoria.

Los organismos intracelulares contenidos en una célula hospedadora pueden introducirse en dicho hospedador por cualquiera de una diversidad de procedimientos. En una realización, los organismos infectan las células hospedadoras y, a medida que crecen y/o se replican, dañan las células hospedadoras (v.g. las lisan o las destruyen de cualquier otro modo). En tal caso, una persona con experiencia en la técnica puede determinar fácilmente las condiciones óptimas de infección, y los tiempos óptimos al cabo de los cuales se coseche el organismo intracelular a fin de maximizar el rendimiento. El Ejemplo 3 ilustra condiciones típicas para infección de células de mamífero con Adenovirus. No es necesario utilizar un organismo intacto para infectar el hospedador. Por ejemplo, ácido nucleico existente naturalmente o recombinante, opcionalmente en presencia de organismos adyuvantes o ácido nucleico adyuvante, puede introducirse en una célula (v.g., transfectarse en ella), utilizando métodos convencionales reconocidos en la técnica. Pueden utilizarse también células de empaquetamiento apropiadas. En otra realización, están presentes en las células hospedadoras organismos intracelulares sustancialmente a todo lo largo del ciclo celular, v.g., permanecen en estado durmiente, no metabolizante, sin crecimiento o no replicante, o se desarrollan y/o se replican a una tasa o de una manera que no afecta negativamente a la viabilidad de la célula hospedadora. El método es útil también para preparar lisados de células que no contienen necesariamente tales organismos, y/o para preparar entidades biológicas intracelulares (v.g., subcelulares) presentes en tales lisados. Por "entidades biológicas" se entienden en esta memoria, v.g. organismos, tales como los arriba descritos; orgánulos celulares (v.g., mitocondrias o cloroplastos), u organismos que residen en el interior de dichos orgánulos; o moléculas biológicas (v.g., macromoléculas tales como, v.g., proteínas recombinantes o no recombinantes (v.g., citoquinas o quimioquinas, receptores, o factores de transcripción), ácidos nucleicos, etc., o moléculas más pequeñas tales como, v.g., ligandos, nucleósidos, nucleótidos, u oligonucleótidos). El término "moléculas biológicas" abarca también estructuras macromoleculares tales como, v.g., receptores; complejos que comprenden proteínas, lípidos, y/o ácidos nucleicos; o análogos. El procedimiento de lisis del método de inventiva puede permitir estructuras más intactas y/o actividad biológica incrementada de las entidades biológicas así obtenidas comparadas con las obtenidas utilizando procedimientos de lisis diferentes. Por ejemplo, complejos proteínicos, complejos de ácido nucleico y proteína, complejos de receptores, moléculas grandes de DNA, o moléculas de cromatina aisladas por el método pueden mantenerse más intactos que cuando se preparan por utilización de otros procedimientos de lisis.

Las entidades biológicas intracelulares pueden residir en cualquier compartimiento de la célula hospedadora (v.g., el núcleo, el citoplasma, un orgánulo celular, o asociadas con una membrana intracelular o celular), con la condición de que, después de la expulsión de las células de la centrífuga, las entidades biológicas intracelulares pueden recuperarse del expulsado sin ser sometidas a un paso adicional eficaz para conseguir la lisis celular. Como se ha indicado arriba, los procedimientos para separar tales entidades biológicas de componentes subcelulares, tales como, v.g., membranas celulares, no se consideran procedimientos de lisis celular y están permitidos en el método de inventiva después del paso de expulsión.

Muchos tipos de células (v.g., células hospedadoras) pueden utilizarse en la invención, y serán evidentes para una persona con experiencia en la técnica. Preferiblemente, las células son suficientemente resistentes para soportar las fuerzas encontradas durante el proceso de centrifugación (v.g., fuerzas centrífugas, fuerzas de cizallamiento), de tal modo que las mismas no se lisan sustancialmente antes de ser expulsadas de la centrífuga, pero son suficientemente frágiles para ser lisadas durante el método (v.g. durante el paso de expulsión). Dichas células incluyen, v.g., células animales, con inclusión de células de insecto, células de anfibio, células de mamífero (v.g., células de mono, ratón o humanas tales como, v.g., células HEK-293), y análogas. Un tipo preferido de célula hospedadora es una que soporta la replicación de Adenovirus, v.g., Adenovirus deficientes, permitiendo que los mismos alcancen títulos elevados. Por ejemplo, en una realización pueden utilizarse líneas de células de empaquetamiento que contienen un gen adyuvante tal como, v.g., un gen E1 de Adenovirus, v.g., uno de Adeno tipo 5.

Por supuesto, no se requiere que la célula se mantenga intacta durante el procedimiento de centrifugación. Por ejemplo, una entidad biológica de interés puede mantenerse unida a o asociada de otro modo con una porción subcelular de una célula no intacta (v.g., con un orgánulo celular, una fracción de membrana celular, una pieza de residuos celulares, o análogos) que forma parte del "sedimento de células" después de la centrifugación, y puede recuperarse después de la expulsión de dicho material de la centrífuga en un receptáculo de recogida.

Pasos adicionales, todos los cuales son convencionales, pueden emplearse antes o después del método de preparación de entidades biológicas intracelulares de la invención.

Por ejemplo, pueden prepararse cultivos de las células a centrifugar por una diversidad de procedimientos, en pequeñas cantidades o en grandes cantidades (v.g., en reactores de fermentación de gran volumen). Las condiciones para infección de las células, propagación de las mismas (v.g., selección de medios de cultivo apropiados, y monitorización de condiciones tales como densidad de células, pH, utilización de oxígeno, temperatura, etc.) y recogida de las mismas (v.g., selección de los tiempos óptimos después de infección para la cosecha de las células) son convencionales y se optimizan fácilmente. Para condiciones de cultivo de Adenovirus, véase, v.g., Schoofs et al., (1998). "A high-yielding serum-free, suspension cell culture process to manufacture recombinant adenoviral vectors for gene therapy", Cytotechnology 28, 81-89 y Monica et al. (2000). ``Monitoring Adenovirus infections with on-fine and off-line methods, Biotechnology Progress 16, 866-871.

Las células se introducen en la centrífuga a un caudal de alimentación que se selecciona de tal modo que optimice el rendimiento de entidades biológicas en ella. Es decir, la tasa es lo suficientemente lenta para permitir una peletización eficiente de las células (a fin de minimizar la pérdida de células en la corriente sobrenadante), pero lo bastante rápida para proporcionar una capacidad de producción eficiente. Por ejemplo, en un procedimiento típico que utiliza una centrífuga Westfalia CSA-1, la tasa de alimentación es aproximadamente 1-3 l/min, y la velocidad del bol es aproximadamente 6-12.000 rpm, preferiblemente 10.000 rpm.

Después de la expulsión de las células de la centrífuga en un receptáculo de recogida, las células o los lisados de células se "cosechan". La cosecha de las células puede significar meramente la recogida del lisado de células bruto en el receptáculo de recogida, u, opcionalmente, la realización de pasos adicionales para aislar (v.g., purificar, separar) las entidades biológicas de contaminantes indeseables, tales como componentes celulares, en el expulsado. Entre los procedimientos convencionales para purificar Adenovirus se encuentran, por ejemplo, centrifugación o cromatografía de adsorción en lecho expandido a fin de eliminar los residuos celulares y/o concentrar el virus, cromatografía de exclusión de tamaños, cromatografía de intercambio iónico (v.g., DEAE), ultracentrifugación, ultrafiltración,
etc.

La cromatografía de Adsorción en Lecho Expandido (denominado también Lecho Fluidizado) es una técnica utilizada en la purificación de proteínas y virus. Esta técnica está basada en la fluidización de resinas cromatográficas a una expresión mínima de dos veces la altura del lecho sedimentado. Por expansión del lecho de resina, esta técnica combina varias operaciones unitarias en un solo paso. La cromatografía de Adsorción en Lecho Expandido (EBA) elimina la necesidad de un paso de centrifugación para separar los residuos celulares que están presentes en las cosechas brutas. Adicionalmente, el uso de resinas cromatográficas para este paso proporciona un paso inicial de purificación y concentración para cualquier proceso.

Con objeto de alcanzar el grado de expansión del lecho, el fluido fluye desde el fondo de la columna a la parte superior de la columna con una velocidad lineal constante. Una vez que el lisado bruto se carga en la columna y que todos los residuos celulares se han eliminado, la columna se compacta con un flujo descendente como el utilizado en las técnicas cromatográficas convencionales. La proteína o producto viral diana se eluye utilizando métodos cromatográficos estándar.

El material de partida para la EBA es la cosecha bruta derivada de una centrífuga continua (v.g., una centrífuga Westfalia), microfluidizada, o congelada-descongelada. La cosecha se carga directamente en la columna con resina Fractogel TMAE o Streamline QXL en modo expandido. La columna se equilibra con tampón de equilibración antes de la carga, y el grado de expansión se mantiene a todo lo largo del proceso hasta que la columna ha alcanzado una línea base UV estable después de la carga. Una vez completada la carga de la columna, se invierte el flujo y la columna se compacta hidráulicamente con un lecho descendente. Una vez compactada adecuadamente la columna, el lecho de resina se lava con 5 volúmenes de columna (CV) de equilibración antes de iniciar el gradiente de elución. El material eluido se recoge y se analiza por AIEX-HPLC, RP-HPLC, Pico Green, QIA, y transferencia de mancha. Pueden emplearse también otros ensayos no enumerados.

El conjunto de material eluido se procesa ulteriormente de modo opcional por Cromatografía de Exclusión de Tamaños (SEC) o por ultrafiltración. En el caso de la ultrafiltración, el material eluido de la columna se diluye como 1:100 con tampón y el volumen se reduce a aproximadamente 300 ml (con inclusión de los lavados del sistema). El concentrado recogido se formula con 2% de sacarosa y se congela a -70ºC. Una vez más, se toman muestras para diversos análisis a fin de asegurar la calidad y pureza del producto.

Si se utiliza SEC, una columna SEC de tamaño apropiado se compacta con resina Tosohaas HW-65F y la columna se carga con 10% en volumen de la columna del material eluido del paso EBA. El virus se eluye en el volumen excluido y las fracciones se recogen y se agrupan de acuerdo con la traza UV. El material resultante de la elución se reúne y se formula con 2% de sacarosa. El todo formulado se congela a -70ºC hasta que se descongela para su envasado en viales. Se toman muestras del material reunido para diversos análisis a fin de asegurar la calidad y pureza del
producto.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una ilustración esquemática de un procedimiento de test que utiliza una centrífuga continua.

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Ejemplos Ejemplo 1 Procedimientos de test que utilizan una centrífuga continua (véase la Figura 1)

Un cultivo de células (infectadas o no infectadas) se alimenta al bol de la centrífuga de una centrífuga continua (v.g., una centrífuga continua Westfalia CSA-1) durante un intervalo de tiempo predeterminado, durante el cual el medio se descarga continuamente (paso 1 en la Figura 1). A la conclusión de este intervalo, se interrumpe la alimentación del cultivo de células y se alimenta una solución tampón al bol a través de una segunda tubería de lavado para un intercambio de medio por tampón (v.g., un tampón de congelación). Después del cese del lavado, el contenido del bol (pelet de células concentrado en tampón) se expulsa luego hidráulicamente de la centrífuga por agua de operación aislada. La alimentación del cultivo de células se reinicia luego y se continúa el proceso hasta que se completa la cosecha.

En los procedimientos de test, se someten luego porciones del cultivo de células concentrado a un paso de lisis adicional, a fin de determinar, v.g., si un procedimiento de lisis adicional da como resultado una lisis ulterior de las células en el expulsado. En una serie de experimentos (paso 2 en la Figura 1), el expulsado se somete a tratamiento en un Microfluidizador Microfluidics HC-2000, que utiliza bombas intensificadoras neumáticas para suministrar una presión deseada a una tasa constante a la corriente de producto. La bomba impulsa el producto a través de microcanales de geometría fijada en el interior de una cámara de interacción. Como resultado, la corriente de producto, v.g., células de mamífero, se acelera a altas velocidades, creando fuerzas de cizallamiento en el interior de la corriente de producto, que producen una disgregación alta de las células producidas. Después del tratamiento en el Microfluidizador la muestra puede clarificarse por centrifugación a velocidad baja, y el sobrenadante puede examinarse respecto a la presencia de entidades biológicas intracelulares. En otra serie de experimentos (paso 3 en la Figura 1), el expulsado se somete a un procedimiento de congelación-descongelación, en el cual el expulsado se somete a tres ciclos alternantes de congelación y descongelación. Después del procedimiento de congelación-descongelación, la muestra puede clarificarse por centrifugación a velocidad baja, y el sobrenadante puede examinarse en cuanto a la presencia de entidades biológicas intracelulares. En la descripción hecha en esta memoria de ensayos de muestras de los pasos anteriores, v.g., en las Tablas 1-4 del Ejemplo 4, las muestras de los diversos pasos se consignan como sigue: el medio que se descarga continuamente es "Medio de Crecimiento Desechado"; el expulsado de la centrífuga es "Expulsado-Pélet de Células Concentrado"; una porción del expulsado que se somete al procedimiento de congelación-descongelación y se clarifica por centrifugación a baja velocidad es "Sobrenadante Procesado Final de Congelación-Descongelación"; y una porción del expulsado que se somete a tratamiento con un Microfluidizador y se clarifica por centrifugación a baja velocidad es "Sobrenadante Procesado Final del Microfluidizador".

Para comparación, una porción del cultivo de células se procesa, no en una centrífuga continua, si no por un proceso de "control" (paso 5 en la Figura 1). Las células se someten a centrifugación por lotes a fin de concentrar el pelet de células del medio acondicionado, y el sobrenadante se retira y se reemplaza por un pequeño volumen de un tampón (v.g., un tampón de congelación), típicamente en un volumen que alcanza aproximadamente una reducción de 30X en volumen. Las células se resuspenden y se someten a 3 ciclos alternantes de congelación y descongelación. En la descripción realizada en esta memoria de los ensayos de muestras procedentes de los pasos anteriores, v.g., en las Tablas 1-4 del Ejemplo 4, se hace referencia a las muestras de los diversos pasos como sigue: el sobrenadante (después de la concentración) es "Medio de Crecimiento Desechado"; y el pelet resuspendido que se somete al procedimiento de congelación-descongelación y se clarifica por centrifugación a baja velocidad es "Sobrenadante Procesado Final de Congelación-Descongelación".

Las muestras se analizan utilizando cromatografía analítica AIEX-HPLC para recuento de partículas totales; Tinción con Azul Tripán para inspección visual; y el Coulter Multisizer para tamaño medio de partícula. Los sobrenadantes virales brutos finales (sin purificar) de la centrífuga, y las Corrientes del Microfluidizador y de Control se analizan también utilizando el Ensayo de Infectividad Rápido (QIA) a fin de determinar los títulos infecciosos. El QIA es un ensayo colorimétrico basado en ensayos convencionales de efecto citotóxico para el cálculo de los títulos de virus infecciosos.

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Ejemplo 2 Test de una centrífuga Continua Westfalia con Células no Infectadas

La centrífuga Continua Westfalia CSA-1 se testa con células de mamífero no infectadas cultivadas en medio de cultivo de células + 1% suero en un reactor de 50 l. El volumen práctico del reactor es 43 l. Las células se cultivan hasta una densidad de 1 x 10^{6} células/ml con una viabilidad mayor que 90%. Para éste y todos los restantes experimentos descritos en estos ejemplos, la tasa de alimentación a la Westfalia se mantiene en 1,5 l/min, y el bol se hace funcionar a aproximadamente 9.000 rpm.

Para determinar si se produce lisis en la corriente de células concentradas, pero no en la corriente de alimentación, se mide la concentración de lactato-deshidrogenasa (LDH), una enzima citosólica estable liberada después de la lisis celular, en todas las corrientes utilizando el Ensayo Reactivo Colorimétrico No Radiactivo CytoTox 96 (Promega Corporation).

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Se utiliza un control positivo de LDH para construir una curva estándar de concentración en una placa de 96 pocillos. Se prepara una muestra de concentración mínima de LDH que representa la centrifugación de control por centrifugación de una muestra de cultivo durante 15 minutos a 1000 rpm y utilización del sobrenadante del cultivo como la concentración basal de LDH. La muestra de concentración de LDH de las células lisadas se crea mediante 3 ciclos de congelación-descongelación de cultivo de células seguidos por una centrifugación durante 15 minutos a 1000 rpm que representa la concentración máxima de LDH procedente del medio.

Se utilizan recuentos visuales de hemocitómetro y distribución de tamaños de partícula para analizar las muestras de la corriente de alimentación inicial, la corriente de células concentrada (el "expulsado"), y la corriente de sobrenadante de desechos. Las distribuciones de tamaños de partícula reflejan, v.g., la acumulación de residuos celulares así como células enteras, y son por consiguiente una indicación de lisis celular.

Las muestras para el ensayo LDH se toman de la corriente sobrenadante a intervalos de 5 minutos durante la separación de 20 minutos.

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Aunque con la aparición de más residuos celulares durante la tinción, las medidas del contador Coulter demuestran una reducción en el tamaño de partícula durante el procesamiento. Esto demuestra que las células en el expulsado están sucesivamente lisadas.

La concentración media de LDH para la corriente sobrenadante de salida de la Westfalia es sólo 3,3% mayor que el valor de fondo del sobrenadante de control del cultivo de células. La expulsión del pelet de células del bol lisa la fracción de células pero parece que no tiene lugar lisis adicional alguna cuando las células entran en la cámara de la centrífuga.

Si se desea, las entidades biológicas presentes en el expulsado (v.g. orgánulos o moléculas biológicas como se definen en esta memoria) pueden aislarse ulteriormente (v.g. someterse a pasos de purificación).

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Ejemplo 3 Preparación de Células Infectadas

Por regla general, las células de mamífero, que han crecido en un medio de cultivo de células, se infectan con una densidad de células entre aproximadamente 0,5 x 10^{6} células/ml y aproximadamente 1 x 10^{6} células/ml con Adenovirus que contiene un transgén terapéutico o un transgén marcador (v.g., lacZ), con una multiplicidad de infección comprendida entre aproximadamente 15 y 50 partículas infecciosas/célula. Los cultivos se cosechan aproximadamente 48 horas después de la infección.

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Ejemplo 4 Test de una centrífuga Continua Westfalia con Células Infectadas

Se utiliza la centrífuga Continua Westfalia para procesar 4 preparaciones de reactor adicionales de células infectadas con Adenovirus.

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Experimento #1

Las células que pueden servir como líneas de células de empaquetamiento se dejan crecer en el medio de cultivo de células + 2% suero. Las células se infectan con Adenovirus recombinante que contiene un transgén en un volumen práctico de 42 l. En el momento de la cosecha, la densidad de células es 0,56 x 10^{6} células/ml con 66,1% de viabilidad.

Las muestras de los diversos pasos se examinan utilizando tinción de células, distribución de tamaño de partículas por el contador Coulter, cromatografía AIEX-HPLC, y ensayos de infectividad.

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La reducción de volumen para el proceso de control es 28X, mientras que el procesamiento con la Westfalia da como resultado una reducción del volumen de aproximadamente 18X.

2

Salida de células lisadas del Microfluidizador, 0,17 x 10^{6} células/ml, 5,9% de viabilidad, en su mayoría residuos uniformes de pequeño tamaño.

El contador Coulter se utiliza para obtener comparaciones de tamaño medio de partícula entre el control y los procesos de aumento de escala para cada operación unitaria.

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Recuperación de Virus

Las partículas totales de virus se determinan utilizando cromatografía de intercambio aniónico, y las concentraciones de partículas infecciosas se calculan utilizando el QIA (véase la Tabla 1). Se analizan muestras del Proceso de Control (Medio de Crecimiento Desechado; Sobrenadante Procesado Final) y del Proceso de la Centrífuga Westfalia (Medio de Cultivo de Crecimiento Desechado; expulsado subsiguiente al procedimiento de congelación-descongelación; y expulsado después del tratamiento con el Microfluidizador), y los resultados de los ensayos se muestran en la Tabla 1. Para un sumario de cada uno de estos pasos, y de los términos de la Tabla, véase el Ejemplo 1.

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TABLA 1 Títulos Totales e Infecciosos de Virus del Experimento #1

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Las células de acuerdo con el experimento #1 se dejan crecer en medio de cultivo de células + 5% suero. Las células se infectan con Adenovirus recombinante que contiene un gen marcador, en medio de cultivo de células + 2% suero (42 l de volumen práctico). En el momento de la cosecha, la densidad de células es 1,46 x 10^{6} células/ml con 75% de viabilidad.

La reducción de volumen para el proceso de control es 28X, mientras que el procesamiento con la Westfalia da como resultado una reducción de volumen de aproximadamente 23X.

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Salida de células lisadas del Microfluidizador: ausencia de células enteras, distribución uniforme de los residuos.

El contador Coulter se utiliza para obtener comparaciones de tamaño medio de partícula entre el control y los procesos de aumento de escala para cada operación unitaria.

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Recuperación de virus

Se determinan las partículas totales de virus utilizando cromatografía de intercambio aniónico y las concentraciones de partículas infecciosas se calculan utilizando el QIA (Tabla 2). Las muestras se testan como en el experimento anterior con la adición de la toma de muestras de la corriente de pelet de células concentrado de la Westfalia antes de procesamiento ulterior ("Pélet de Células Concentrado").

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TABLA 2 Títulos de Virus Totales e Infecciosos del Experimento #2

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Experimento #3

Las células de acuerdo con el Experimento #1 se dejan crecer bajo perfusión en un reactor de siembra de 10 l en medio de cultivo de células exento de suero, se transfieren y se infectan en 28 l de volumen práctico. Las células se infectan con Adenovirus recombinante que contiene un gen marcador. En el momento de la cosecha, la densidad de células es 0,64 x 10^{6} células/ml con 80,4% de viabilidad.

La reducción de volumen para el proceso de control es 20X, mientras que el procesamiento con la Westfalia da como resultado una reducción de volumen de aproximadamente 26X.

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El contador Coulter se utiliza para obtener comparaciones de tamaño medio de partícula entre el control y los procesos de aumento de escala para cada operación unitaria.

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Recuperación de virus

Las partículas totales de virus se determinan utilizando cromatografía de intercambio aniónico y las concentraciones de partículas infecciosas se calculan utilizando el QIA (Tabla 3).

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TABLA 3 Títulos de Virus Totales e Infecciosos del Experimento #3

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Experimento #4

Las células de acuerdo con el experimento #1 se dejan crecer bajo perfusión en un reactor de siembra de 10 l en medio de cultivo de células exento de suero, se transfieren y se infectan en un volumen práctico de 45 l. Las células se infectan con un Adenovirus recombinante que contiene un transgén. En el momento de la cosecha, la densidad de células es 0,45 x 10^{6} células/ml con 74,2% de viabilidad.

La reducción en volumen para el proceso de control es 20X, mientras que el procesamiento con la Westfalia da como resultado una reducción de volumen de aproximadamente 24X.

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El contador Coulter se utiliza para obtener comparaciones de tamaño medio de partícula entre el control y los procesos de aumento de escala para cada operación unitaria.

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Recuperación de virus

Las partículas totales de virus se determinan utilizando cromatografía de intercambio aniónico y las concentraciones de partículas infecciosas se calculan utilizando el QIA (Tabla 4).

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TABLA 4 Títulos de Virus Totales e Infecciosos del Experimento #4

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El examen de los recuentos de virus totales e infecciosos demuestra que las concentraciones de virus directamente de la Westfalia satisfacen o superan las concentraciones de otros procedimientos. Los resultados de los experimentos de cosecha revelan también una ventaja inestimable de la utilización de este proceso de cosecha. Después de la expulsión del pelet de células de la unidad, las células están significativamente lisadas, pero la lisis ocurre sustancialmente por completo en la corriente de producto, segregada de cualesquiera corrientes residuales. Los números de virus totales e infecciosos demuestran que la concentración de Adenovirus no se deteriora durante esta lisis. El análisis ulterior de los tamaños medios de partícula del procedimiento congelación-descongelación ("Procedimiento de control") comparados con el procedimiento Westfalia/Microfluidizador, demuestran que el proceso Westfalia no sólo lisa las células, si no que resulta más eficaz que el procedimiento de congelación-descongelación (control). Durante los 3 ciclos de congelación-descongelación (proceso de control), las células se lisan; sin embargo, el análisis del tamaño de partícula indica que el grado de lisis es menor que el obtenido por el procedimiento Westfalia. Esto se confirma por observaciones visuales. Existe también una reducción relativamente pequeña de diámetro medio del procesamiento ulterior del material de Westfalia con el Microfluidizador en el proceso de aumento de escala. El rendimiento por célula de partículas de virus o unidades infecciosas no aumenta si los materiales expulsados recogidos directamente de la Westfalia se someten a procedimientos ulteriores de "lisis", tales como 3 ciclos de congelación-descongelación o tratamiento con un Microfluidizador, ni aumenta el grado de lisis celular.

Como puede verse por las Tablas, el rendimiento/célula de partículas de Adenovirus está comprendido en un intervalo de aproximadamente 1,2 a aproximadamente 1,6 veces mayor cuando se obtiene por centrifugación y expulsión en la Westfalia que cuando se obtiene por centrifugación por lotes seguida por 3 ciclos de congelación-descongelación. El rendimiento de Adenovirus infeccioso está comprendido en un intervalo de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 1,9 veces mayor. En otras combinaciones de Adenovirus y células, el aumento en rendimiento/célula puede ser mayor. Los rendimientos pueden determinarse con métodos convencionales, v.g., como se describe en otro lugar de esta memoria.

Claims (17)

1. Un método para liberar virus de células animales que contienen dichos virus, que comprende

someter las células a centrifugación continua en condiciones eficaces para concentrar las células en un pelet de células, y

expulsar de la centrífuga las células reducidas a un pelet por aberturas de salida de expulsión a un receptáculo de recogida, en condiciones tales que las células se someten a fuerzas eficaces para lisar dichas células, en el cual no se realiza paso adicional alguno eficaz para llevar a cabo la lisis celular.

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2. El método de la reivindicación 1, en el cual más del 85% de las células se lisan.

3. El método de la reivindicación 1, en el cual más del 50% de las células se lisan.

4. El método de la reivindicación 1, en el cual los virus son Adenovirus.

5. El método de la reivindicación 4, en el cual los Adenovirus son Adenovirus recombinantes adecuados para terapia génica.

6. El método de la reivindicación 4, en el cual el rendimiento/célula de partículas de Adenovirus o Adenovirus infecciosos es mayor que el que puede obtenerse cuando las células que contienen dicho Adenovirus se lisan por un procedimiento de congelación-descongelación.

7. El método de la reivindicación 6, en el cual el rendimiento/célula de partículas de Adenovirus es 1,2 a 1,6 veces mayor que el obtenible cuando las células que contienen dicho Adenovirus se lisan por un procedimiento de congelación-descongelación.

8. El método de la reivindicación 6, en el cual el rendimiento/célula de Adenovirus infecciosos es 1,5 a 1,9 veces mayor que el obtenible cuando las células que contienen dicho Adenovirus se lisan por un procedimiento de congelación-descongelación.

9. El método de la reivindicación 1, en el cual las células son células de mamífero o de insecto.

10. El método de la reivindicación 1, en el cual las células que se expulsan se someten a una fuerza centrífuga relativa de 6.500 a 7.500 g.

11. El método de la reivindicación 10, en el cual dicha fuerza centrífuga es 7.000 g.

12. El método de la reivindicación 1 ó 10, en el cual las células reducidas a un pelet se expulsan a través de una o más salidas de expulsión que tienen una forma rectangular y un área de sección transversal de 50 a 500 mm^{2}.

13. El método de la reivindicación 1, en el cual las células se centrifugan en una centrífuga Westfalia, modelo CSA-1 o CSC-6.

14. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente someter las células expulsadas a cromatografía en lecho expandido.

15. Un método para preparar un lisado de células, que comprende

someter células animales a centrifugación continua en condiciones eficaces para completar las células en un pelet de células, y

expulsar de la centrífuga las células reducidas a un pelet a través de aberturas de salida de expulsión a un receptáculo de recogida, en condiciones tales que las células se someten a fuerzas eficaces para lisar dichas células, en el cual no se realiza paso adicional alguno eficaz para llevar a cabo la lisis celular.

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16. El método de la reivindicación 15, que consiste en

someter células animales a centrifugación continua a fin de formar un pelet de células, y expulsar de la centrífuga dichas células reducidas a un pelet a través de aberturas de salida de expulsión a un receptáculo de recogida en condiciones tales que las células se someten a fuerzas eficaces para lisar dichas células.

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17. Un método para preparar un organismo intracelular, o un orgánulo intracelular o molécula biológica, a partir de células hospedadoras animales que contienen dicho organismo, orgánulo o molécula, que comprende

someter las células a centrifugación continua en condiciones eficaces para concentrar las células en un pelet de células, y

expulsar de la centrífuga las células reducidas a un pelet a través de aberturas de salida de expulsión a un receptáculo de recogida, en condiciones tales que las células se someten a fuerzas eficaces para lisar dichas células, en el cual no se realiza paso adicional alguno eficaz para llevar a cabo la lisis celular.