JP2023552470A - アデノウイルスの精製方法 - Google Patents

Abstract

大規模に実施することができるアデノウイルスの精製方法。本方法は、宿主細胞集団を含む、又は宿主細胞集団に由来するアデノウイルス含有サンプルから、サンプルを清澄化することによって、アデノウイルスを精製するものであり、清澄化は、深層濾過、それに続く精密濾過を含み；清澄化サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーによって処理し；接線流濾過（ＴＦＦ）によって陰イオン交換生成物を処理して、ＴＦＦ生成物が得られる。

Description

本発明は、アデノウイルスを精製する方法に関する。より詳細には、本発明は、大規模に実施することができるアデノウイルスを精製する方法に関する。

アデノウイルスは、約２６～４６ｋｂのゲノムを有する二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノウイルスは種特異的であり、様々な血清型が様々な哺乳動物種から単離されている。ヒトアデノウイルスは遍在的であり、ほとんどの人々は１つ以上の血清型に感染しており、生涯にわたる免疫をもたらす。

改変アデノウイルスを、外来抗原をコードするＤＮＡを送達するためのベクターとして使用することができる。複製欠損アデノウイルスベクターは、ベクターによってコードされる異種遺伝子に対する強い体液性及びＴ細胞応答を誘導するので、ワクチンに広く使用されている。

アデノウイルスベクターの産生プロセスは、宿主細胞にアデノウイルスを感染させること、及び宿主細胞を培養してウイルス力価を増加させることを含む。次いで、下流精製処理の前に細胞を溶解して、細胞及び細胞残屑を含む不純物を除去する。

アデノウイルスの現在の精製方法は不経済であり、スケーラビリティに欠ける。したがって、宿主細胞培養系内で生成されたアデノウイルスを精製するための大規模プロセスの開発が必要とされている。

本発明は、少なくとも部分的には、宿主細胞培養物からアデノウイルスを効果的に精製し、代替的な精製方法と比較して処理時間が短縮された、改善されたアデノウイルス精製方法の開発に関する。本発明の精製方法はまた、代替の精製方法と比較して、供給が不足し得る特定の原料への依存を低減することができる。したがって、本発明の方法は、流行性疾患及びパンデミック疾患のためのアデノウイルスに基づくワクチンの提供等のために、大量のアデノウイルスベクターが必要とされる場合に特に有用であり得る。

したがって、一態様において、アデノウイルスを、少なくとも約４×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度を有する宿主細胞集団を含むアデノウイルス含有サンプル又は宿主細胞集団に由来するアデノウイルス含有サンプルから精製する方法であって、
（ａ）前記サンプルを清澄化して清澄化されたサンプルを提供することであって、清澄化が深層濾過とそれに続く精密濾過とを含む提供すること；
（ｂ）陰イオン交換クロマトグラフィーによって清澄化されたサンプルを処理して陰イオン交換生成物を得ること；及び
接線流濾過（ＴＦＦ）によって前記陰イオン交換生成物を処理して、ＴＦＦ生成物を得ることであって、ＴＦＦが限外濾過及び透析濾過を含む、生成物を得ることを含む方法が提供される。

さらなる態様では、図２に記載のアデノウイルスを精製する方法が提供される。

なおさらなる態様では、実施例２に記載されるアデノウイルスを精製する方法が提供される。

なおさらなる態様では、本発明の方法によって得ることができる、又は本発明の方法によって得られる精製アデノウイルスが提供される。

なおさらなる態様では、本発明の方法によって得ることができる、又は本発明の方法によって得られる原薬が提供される。

本発明の態様及び実施形態は、添付の請求項において述べられる。本発明のこれら及び他の態様及び実施形態はまた、本明細書においても記載される。

図１は、バイオリアクター生成物の細胞溶解及びヌクレアーゼ消化、清澄化、第１の接線流濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、第２の接線流濾過及び滅菌濾過の工程を含む例示的なアデノウイルス精製プロセスを示す。 図２は、出発物質の細胞溶解及びヌクレアーゼ消化、清澄化、陰イオン交換クロマトグラフィー、接線流濾過、製剤化及び滅菌濾過の工程を含む例示的なアデノウイルス精製プロセスを示す。 図３は、混合モードサイズ排除クロマトグラフィーのさらなる工程を含む本発明による例示的なアデノウイルス精製プロセスの変形例を示す。

配列表の簡単な説明

アデノウイルス含有サンプル
本発明の方法は、アデノウイルス含有サンプルからアデノウイルスを大規模に精製することができる。例えば、本発明の方法は、最大約５０００リットル、例えば約３リットル～約３０００リットル、好ましくは約２００リットル～約２０００リットルの範囲の体積を処理することが可能であり得る。

アデノウイルス含有サンプルは、少なくとも１つの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含み得る。本明細書で使用される場合、「ＨＣＰ」という用語は、宿主細胞集団によって産生される又はコードされるタンパク質を指す。

アデノウイルス含有サンプルは、少なくとも約２０，０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３０，０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４０，０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５０，０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約６０，０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約７０，０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約８０，０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約９０，０００ｎｇ／ｍＬ又は少なくとも約１００，０００ｎｇ／ｍＬのＨＣＰ濃度を有し得る。好ましい実施形態では、アデノウイルス含有サンプルは、少なくとも約５０，０００ｎｇ／ｍＬのＨＣＰ濃度を有する。

アデノウイルス含有サンプルは、最大約１００，０００ｎｇ／ｍＬ、最大約９０，０００ｎｇ／ｍＬ、最大約８０，０００ｎｇ／ｍＬ、最大約７０，０００ｎｇ／ｍＬ、最大約６０，０００ｎｇ／ｍＬ、最大約５０，０００ｎｇ／ｍＬ、最大約４０，０００ｎｇ／ｍＬ、最大約３０，０００ｎｇ／ｍＬ、又は最大約２０，０００ｎｇ／ｍＬのＨＣＰ濃度を有し得る。

アデノウイルス含有サンプルは、約２０，０００ｎｇ／ｍＬ～約１００，０００ｎｇ／ｍＬ、約３０，０００ｎｇ／ｍＬ～約９０，０００ｎｇ／ｍＬ又は約５０，０００ｎｇ／ｍＬ～約８０，０００ｎｇ／ｍＬのＨＣＰ濃度を有し得る。

宿主細胞（例えば哺乳動物宿主細胞）の大規模細胞培養に適合させることができる当技術分野で公知の任意の上流ウイルス産生プロセスを利用して、本発明の方法のための出発材料を生成することができる。

好ましい実施形態において、アデノウイルス含有サンプルは、宿主細胞集団を含むか、又は宿主細胞集団からなる。宿主細胞集団は、細胞培養容器内で培養し得る。本明細書で使用される場合、「細胞培養容器」は、細胞を培養するのに適した容器を指す。好ましくは、細胞培養容器はバイオリアクターである。本明細書で使用される場合、「バイオリアクター」は、大規模プロセスに適合した細胞培養容器を意味する。例えば、いくつかの実施形態において、バイオリアクターは、少なくとも約１Ｌ、好ましくは少なくとも約１．２Ｌ、約３Ｌ、約５０Ｌ、約１０００Ｌ、約２０００Ｌ、約３０００Ｌ、又は約５０００Ｌ、最も好ましくは少なくとも約２０００Ｌの容量を有する。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも約７×１０^９個の生存Ｔ－ＲＥｘ（商標）細胞、好ましくは少なくとも約２．１×１０^１０個の生存Ｔ－ＲＥｘ（商標）細胞、少なくとも約３．５×１０^１１個の生存Ｔ－ＲＥｘ（商標）細胞、少なくとも約５×１０^１２個の生存Ｔ－ＲＥｘ（商標）細胞又は少なくとも約３×１０^１３個の生存Ｔ－ＲＥｘ（商標）細胞、最も好ましくは少なくとも約５×１０^１２個の生存Ｔ－ＲＥｘ（商標）細胞の容量を有する。

宿主細胞集団は、回収時に少なくとも少なくとも約５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約７×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約９×１０^６細胞／ｍＬ又は少なくとも約１×１０^７細胞／ｍＬの細胞密度（例えば、生存細胞密度）を有し得る。好ましい実施形態では、宿主細胞集団は、回収時に少なくとも約４×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度（例えば、生存細胞密度）を有する。

宿主細胞集団は、回収時に最大約１×１０^９細胞／ｍＬ、最大約１×１０^８細胞／ｍＬ、最大約８×１０^７細胞／ｍＬ、最大約６×１０^７細胞／ｍＬ、最大約４×１０^７細胞／ｍＬ、最大約２×１０^７細胞／ｍＬ、最大約１×１０^７細胞／ｍＬ、最大約８×１０^６細胞／ｍＬ、又は最大約６×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度（例えば、生存細胞密度）を有し得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞集団は、回収時に最大約８×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度（例えば、生存細胞密度）を有する。好ましい実施形態では、宿主細胞集団は、回収時に最大約１×１０^７細胞／ｍＬの細胞密度（例えば、生存細胞密度）を有する。

宿主細胞集団は、回収時に約４×１０^６細胞／ｍＬ～約１×１０^９細胞／ｍＬ、約４×１０^６細胞／ｍＬ～約１×１０^８細胞／ｍＬ又は約４×１０^６細胞／ｍＬ～約１×１０^７細胞／ｍＬの細胞密度（例えば、生存細胞密度）を有し得る。

好ましい実施形態において、本発明の方法は、本明細書に開示される宿主細胞培養体積、すなわち２００リットル（例えば約２０００リットル）を超える宿主細胞培養体積を処理することができ、本明細書に開示される回収時に（例えば、少なくとも約４×１０^６細胞／ｍＬ）の細胞密度（例えば、生存細胞密度）を有することができる。

好ましい実施形態において、本発明の方法は、上記の回収時の細胞密度（例えば、生存細胞密度）及び上記のＨＣＰ濃度を有する宿主細胞集団を処理することができる。例えば、宿主細胞集団は、少なくとも約４×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度及び少なくとも約５０，０００ｎｇ／ｍＬのＨＣＰ濃度を有し得る。

細胞溶解及びヌクレアーゼ処理
アデノウイルス含有宿主細胞集団の培養後、宿主細胞を溶解して細胞内アデノウイルスを放出する。溶解工程はまた、細胞培養物を低レベルで仮想的に汚染する可能性がある潜在的な外来性因子（特に、ヘルペスウイルス又はレトロウイルス等のエンベロープウイルス）を不活性化する可能性を提供し得る。

したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、細胞溶解工程を含む。細胞溶解に使用することができる方法は当技術分野で公知であり、非機械的溶解方法（界面活性剤溶解、酵素処理、高張性及び／又は低張性溶解等）及び機械的方法（凍結融解、固体剪断、液体剪断、超音波処理及び高圧押出等）の両方を含む。

好ましい実施形態において、宿主細胞は、細胞溶解剤（例えば、洗剤）を使用して溶解される。細胞溶解のための界面活性剤の使用は、実施が容易であり、容易に拡張可能であるという利点を有する。細胞溶解に使用することができる界面活性剤は、当技術分野で公知である。本発明の方法において細胞溶解に使用される界面活性剤としては、陽イオン性、陰イオン性、双性イオン性及び非イオン性の界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。適切な非イオン性界面活性剤の例としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート－２０又はポリソルベート－８０）及びＴｒｉｔｏｎ（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）が挙げられる。一実施形態において、非イオン性界面活性剤はポリソルベート－２０である。宿主細胞集団を溶解するために使用される非イオン性界面活性剤の最適濃度は、例えば、約０．００５～０．０２５ｋｇ界面活性剤／ｋｇ容器、約０．０１～０．０２ｋｇ界面活性剤／ｋｇ細胞培養容器、又は約０．０１１～０．０１６ｋｇ界面活性剤／ｋｇ細胞培養容器の範囲内で変動し得る。本明細書で使用される場合、「ｋｇ細胞培養容器」は、細胞培養容器内の宿主細胞集団及び細胞培養培地の総質量を意味する。好ましい実施形態において、宿主細胞集団を溶解するために使用される非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート－２０）の濃度は、約０．０１３ｋｇ界面活性剤／ｋｇ細胞培養容器である。宿主細胞は、宿主細胞集団中の全て又は実質的に全ての細胞が溶解されるのに十分な時間、非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート－２０）と共にインキュベートされ得る。実施形態において、宿主細胞は非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート－２０）と共に、ヌクレアーゼ処理工程の前に少なくとも約１５分間インキュベートされる。実施形態において、宿主細胞は非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート－２０）と共に、ヌクレアーゼ処理工程の前に最長３０分間インキュベートされる。実施形態において、宿主細胞は非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート－２０）と共に、ヌクレアーゼ処理工程の前に３０分間を超えてインキュベートされない。

実施形態において、界面活性剤（例えばポリソルベート－２０）は、溶解緩衝剤の一部を形成する。したがって、いくつかの実施形態において、宿主細胞は、少なくとも１つの界面活性剤（例えばポリソルベート－２０）を含む溶解緩衝剤を用いて溶解される。本発明の方法において使用され得る例示的な溶解緩衝剤は、約５００ｍＭのトリス、約２０ｍＭのＭｇＣｌ_２、約５０％（ｗ／ｖ）のスクロース及び約１０％（ｖ／ｖ）のポリソルベート２０を含み、約８のｐＨを有する。細胞集団を溶解するために使用される溶解緩衝剤の最適濃度は、例えば、約０．０５～０．２５ｋｇ溶解緩衝剤／ｋｇ細胞培養容器、約０．１０～０．２０ｋｇ溶解緩衝剤／ｋｇ細胞培養容器、又は約０．１１～０．１６ｋｇ界面活性剤／ｋｇ細胞培養容器の範囲内で変動し得る。好ましい実施形態において、溶解緩衝剤の濃度は、約０．１３ｋｇ溶解緩衝剤／ｋｇ細胞培養容器である。

宿主細胞におけるアデノウイルスによる感染宿主細胞の自己消化はまた、細胞内アデノウイルスの実質的な放出をもたらし得、本発明の方法において使用され得る。

細胞溶解工程は、宿主細胞集団からのアデノウイルスの収率を有意に増加させるが、細胞内タンパク質及び細胞ゲノム核酸等の汚染物質の放出ももたらす。ＤＮＡはウイルス粒子凝集を媒介することが知られているため、核酸の存在はアデノウイルスにとって特に懸念され得る。

したがって、本発明の方法は、細胞溶解後のヌクレアーゼ処理工程を含み得る。或いは、ヌクレアーゼを溶解前に細胞に添加することによって、ヌクレアーゼ工程を溶解と同時に行ってもよい。本発明の方法での使用に適したヌクレアーゼには、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ、例えば非特異的ＤＮＡ及びＲＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）が含まれる。好ましい実施形態では、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を溶解細胞に添加する。ヌクレアーゼ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））の添加は、核酸鎖長を減少させることができ、これは後の工程でのその除去を容易にし、粘度を低下させ、核酸媒介凝集の減少を助ける。ヌクレアーゼは、許容レベルのアデノウイルスの放出及び細胞ゲノム酸の十分な低減又は処理を達成する量で添加され得る。例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を溶解細胞に添加して、約５，０００ユニット／ｋｇ溶解物～２５，０００ユニット／ｋｇ溶解物、約１０，０００ユニット／ｋｇ溶解物～２０，０００ユニット／ｋｇ溶解物、又は約１５，０００ユニット／ｋｇ溶解物の最終濃度を達成することができる。好ましい実施形態では、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）の最終濃度は、約１５，０００ユニット／ｋｇ溶解物である。

細胞溶解及びヌクレアーゼ処理は、許容可能なレベルのアデノウイルスの放出及び細胞ゲノム酸の十分な減少又は処理を達成するのに十分な時間にわたって行われ得る。細胞溶解及びヌクレアーゼ処理は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、又は少なくとも５時間行われ得る。好ましい実施形態において、細胞溶解及びヌクレアーゼ処理は、少なくとも２時間行われる。

細胞溶解及びヌクレアーゼ処理のための最適温度は、当業者によって決定され得る。好ましい実施形態において、細胞溶解及びヌクレアーゼ処理は、約２７℃～約４０℃、好ましくは約３１℃～約３５℃、最も好ましくは約３３℃の温度で行われる。

細胞溶解及びヌクレアーゼ処理後に得られる生成物は、ヌクレアーゼ処理細胞溶解物である。

清澄化
本発明の方法は、清澄化工程を含む。清澄化工程は、アデノウイルス含有サンプル（例えばヌクレアーゼ処理細胞溶解物）から細胞残屑を含む不純物を除去しようとするものである。

ヌクレアーゼ処理細胞溶解物は、回収時に少なくとも約４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約７×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約９×１０^６細胞／ｍＬ又は少なくとも約１×１０^７細胞／ｍＬの細胞密度（例えば、生存細胞密度）を有する宿主細胞集団に由来していてもよい。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ処理細胞溶解物は、回収時に少なくとも約４×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度（例えば、生存細胞密度）を有する宿主細胞集団に由来していた。

ヌクレアーゼ処理細胞溶解物は、回収時に最大約１×１０^９細胞／ｍＬ、最大約１×１０^８細胞／ｍＬ、最大約８×１０^７細胞／ｍＬ、最大約６×１０^７細胞／ｍＬ、最大約４×１０^７細胞／ｍＬ、最大約２×１０^７細胞／ｍＬ、最大約１×１０^７細胞／ｍＬ、最大約８×１０^６細胞／ｍＬ又は最大約６×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度（例えば、生存細胞密度）を有する宿主細胞集団に由来していてもよい。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼ処理細胞溶解物は、回収時に少なくとも約８×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度（例えば、生存細胞密度）を有する細胞培養物に由来していた。

ヌクレアーゼ処理細胞溶解物は、回収時に約４×１０^６細胞／ｍＬ～約１×１０^９細胞／ｍＬ、約４×１０^６細胞／ｍＬ～約１×１０^８細胞／ｍＬ又は約４×１０^６細胞／ｍＬ～約１×１０^７細胞／ｍＬの細胞密度（例えば、生存細胞密度）を有する宿主細胞集団に由来していてもよい。

ヌクレアーゼ処理細胞溶解物は、少なくとも約２０，０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３０，０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４０，０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５０，０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約６０，０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約７０，０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約８０，０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約９０，０００ｎｇ／ｍＬ又は少なくとも約１００，０００ｎｇ／ｍＬのＨＣＰ濃度を有し得る。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼ処理細胞溶解物は、少なくとも約５０，０００ｎｇ／ｍＬのＨＣＰ濃度を有する。

ヌクレアーゼ処理細胞溶解物は、最大約１００，０００ｎｇ／ｍＬ、最大約９０，０００ｎｇ／ｍＬ、最大約８０，０００ｎｇ／ｍＬ、最大約７０，０００ｎｇ／ｍＬ、最大約６０，０００ｎｇ／ｍＬ、最大約５０，０００ｎｇ／ｍＬ、最大約４０，０００ｎｇ／ｍＬ、最大約３０，０００ｎｇ／ｍＬ、又は最大約２０，０００ｎｇ／ｍＬのＨＣＰ濃度を有し得る。

ヌクレアーゼ処理細胞溶解物は、約２０，０００ｎｇ／ｍＬ～約１００，０００ｎｇ／ｍＬ、約３０，０００ｎｇ／ｍＬ～約９０，０００ｎｇ／ｍＬ又は約５０，０００ｎｇ／ｍＬ～約８０，０００ｎｇ／ｍＬのＨＣＰ濃度を有し得る。

好ましい実施形態では、清澄化工程のためのインプット材料は、上記の回収時の細胞密度（例えば、生存細胞密度）を有する宿主細胞集団に由来するヌクレアーゼ処理細胞溶解物及び上記のＨＣＰ濃度を有する細胞溶解物である。例えば、ヌクレアーゼ処理細胞溶解物は、少なくとも約４×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度を有する宿主細胞集団に由来していてもよく、少なくとも約５０，０００ｎｇ／ｍＬのＨＣＰ濃度を有していてもよい。ヌクレアーゼ処理細胞溶解物は、上記の細胞溶解及びヌクレアーゼ処理の項で概説したように得られていてもよい。

清澄化工程は、アデノウイルス含有サンプル（例えばヌクレアーゼ処理細胞溶解物）を深層濾過に供して、濾過されたサンプルを提供することを含む。深層濾過は、１つ以上の深層フィルタを使用して溶液から粒子を除去する方法を指す。深層フィルタは、サンプルが通過する迷路状の経路を作成する三次元マトリクスを含む。深層フィルタの原理的な保持機構は、マトリクスの深度全体にわたるランダムな吸着及び機械的捕捉に依存する。

様々な実施形態において、深層フィルタは、巻き綿、ポリプロピレン、レーヨンセルロース、シリカ、ガラス繊維、焼結金属、磁器、珪藻土、又は他の公知の成分のフィルタ膜又はシートを含む。好ましい実施形態において、深層フィルタは、ポリプロピレン（例えば、ガラス繊維強化ポリプロピレン）及びセルロース、並びに場合により珪藻土を含む。

本発明の方法の清澄化工程に適した深層フィルタは、約９μｍ、約８μｍ、約７μｍ、約６μｍ、約５μｍ、約４μｍ、約３μｍ、約２μｍ、約１μｍ、及び／又は約０．１μｍの公称フィルタ定格を有する深層フィルタを含む。いくつかの実施形態において、深層フィルタは、約０．２μｍ～約２μｍの公称フィルタ定格を有する。いくつかの実施形態において、深層フィルタは、最大約０．１μｍの公称フィルタ定格を有する。

本発明の方法の清澄化工程に適した深層フィルタには、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｃ０ＳＰ媒体、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｘ０ＨＣ媒体及びＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｘ０ＳＰ媒体（全てＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）が含まれる。

清澄化工程は、例えば異なる公称フィルタ定格を有する複数の異なる種類の深層フィルタの使用を含むことができる。いくつかの実施形態において、２つ以上の異なる種類の深層フィルタが使用される。いくつかの実施形態において、３つ以上の異なる種類の深層フィルタが使用される。深層フィルタは、直列又は並列に、好ましくは直列に配置されてもよい。

本発明者らは、直列の２つの異なる種類の深層フィルタ（例えば、約０．２μｍ～約２μｍの公称フィルタ定格を有する深層フィルタ、例えばＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｃ０ＳＰ媒体、続いて最大約０．１μｍの公称フィルタ定格を有する深層フィルタ、例えばＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｘ０ＨＣ媒体又はＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｘ０ＳＰ媒体）の使用が、不純物の捕捉を助け、それによって後続の精密濾過工程において膜を汚染からより良好に保護することができることを観察した。直列の２つの異なる深層フィルタの使用はまた、単一の種類の深層フィルタのみが使用される場合（例えば、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ Ｃ０ＳＰフィルタ）と比較して、必要な第１の深層フィルタ（例えば、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ Ｃ０ＳＰフィルタ）の量を減らすのに役立つことができる。

好ましい実施形態において、清澄化工程は、直列に配置された２つの異なる種類の深層フィルタ（例えば、異なる公称フィルタ定格を有する深度フィルタ）の使用を含む。２つの異なる種類の深層フィルタは、以下の深層フィルタの任意の組み合わせであってもよい：Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｃ０ＳＰ媒体；Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ポッド深層フィルタ、Ｘ０ＨＣ媒体；及びＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｘ０ＳＰ媒体。２つの異なる種類の深層フィルタは、それらの公称フィルタ定格にしたがって、例えば、約０．２μｍ～約２μｍの公称フィルタ定格を有する深層フィルタに続いて、最大約０．１μｍの公称フィルタ定格を有する深層フィルタを配置してもよい。いくつかの実施形態では、２つの異なる種類の深度フィルタは、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深度フィルタ、Ｃ０ＳＰ媒体、及びＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深度フィルタ、Ｘ０ＳＰ媒体である。いくつかの実施形態では、２つの異なる種類の深度フィルタは、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ Ｃ０ＳＰフィルタ、及びＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄ Ｘ０ＨＣフィルタである。特に好ましい実施形態では、清澄化工程は、直列に接続されたＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ Ｃ０ＳＰフィルタ及びＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標） Ｐｏｄ Ｘ０ＨＣフィルタの使用を含む。清澄化工程が直列に配置された２つの異なる種類の深層フィルタの使用を含む実施形態において、深層フィルタは、３つの第１の深層フィルタの比率で負荷されてもよい：１秒間の深層フィルタ、例えば３つのＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ Ｃ０ＳＰフィルタ：１ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄ Ｘ０ＨＣフィルタ。

或いは、清澄化工程は、単一の種類の深層フィルタの使用を含んでいてもよい。単一の種類の深層フィルタが使用される実施形態において、深層フィルタは、約０．２μｍ～約２μｍの公称フィルタ定格、例えば、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｃ０ＳＰ媒体を有することができる。

本発明者らは、３つの：Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ Ｃ０ＳＰフィルタ、続いて精密濾過；Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ Ｃ０ＳＰフィルタ、続いてＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｘ０ＳＰ培地、続いて精密濾過；及びＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ Ｃ０ＳＰフィルタ、続いてＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄ Ｘ０ＨＣフィルタ、続いて精密濾過のフィルタトレイン系列が、後続の陰イオン交換工程から得られた生成物の収率及び品質に関して同等の性能を有することを示した。

アデノウイルス含有サンプル（例えばヌクレアーゼ処理細胞溶解物）を負荷する前に、深層フィルタを平衡化緩衝液で平衡化してもよい。本発明の方法において使用され得る例示的な平衡化緩衝剤は、約５０ｍＭのトリス、約２ｍＭのＭｇＣｌ_２、約５％（ｗ／ｖ）のスクロース及び約１％（ｖ／ｖ）のポリソルベート２０を含み、約８のｐＨを有する。

平衡化工程中の最適な体積スループットは、少なくとも約１５Ｌ／ｍ^２、好ましくは少なくとも約２０Ｌ／ｍ^２、少なくとも約２５Ｌ／ｍ^２又は少なくとも約３０Ｌ／ｍ^２、最も好ましくは少なくとも約２５Ｌ／ｍ^２であり得る。

深層濾過後、濾過したサンプルを精密濾過する。精密濾過の間、濾過したサンプルは精密濾過膜を通過する。選択された特定の精密濾過膜は、アデノウイルスが通過するのに十分大きいが、不純物（例えば、部分的に溶解した細胞、細胞残渣及び／又は凝集体）を除去するのに十分小さいサイズの孔を有する。いくつかの実施形態において、精密濾過膜は、約１μｍ未満、約０．７５μｍ未満、約０．５μｍ未満、又は約０．２５μｍ未満の膜孔径を有する。好ましい実施形態において、精密濾過膜は約０．２μｍの孔径を有する。

精密濾過に適した膜材料には、再生セルロース、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、又はその誘導体、好ましくはポリエーテルスルホンが含まれ得る。好ましい実施形態において、精密濾過膜はポリエーテルスルホンを含み、約０．２μｍの孔径を有する。本発明の方法で使用するのに適した精密濾過膜は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＳＨＣ ０．５／０．２μｍフィルタである。

濾過したサンプルを負荷した後、チェイス緩衝剤を精密濾過膜に添加してもよい。本発明の方法において使用し得る例示的なチェイス緩衝剤は、約５０ｍＭのトリス、約２ｍＭのＭｇＣｌ_２、約５％（ｗ／ｖ）のスクロース及び約１％（ｖ／ｖ）のポリソルベート２０を含み、約８のｐＨを有する。

チェイス工程中の最適な体積スループットは、約１５Ｌ／ｍ^２～約４０Ｌ／ｍ^２、好ましくは約２０Ｌ／ｍ^２～約４０Ｌ／ｍ^２、少なくとも約２５Ｌ／ｍ^２～約４０Ｌ／ｍ^２、又は少なくとも約３０Ｌ／ｍ^２～約４０Ｌ／ｍ^２、最も好ましくは少なくとも約２５Ｌ／ｍ^２～約４０Ｌ／ｍ^２であり得る。

清澄化工程のための最適温度は、当技術分野の当業者によって決定され得る。好ましい実施形態において、清澄化工程は、約１５℃～約３５℃、より好ましくは約１５℃～約２７℃の温度で行われる。

清澄化後、サンプルを様々なパラメータについて試験することができる。例えば、いくつかの実施形態では、清澄化されたサンプルは、約７～約９、好ましくは約７．５～約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、清澄化されたサンプルは、２５℃で約３５ｍＳ／ｃｍ未満、約３０ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは約２５ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する。したがって、いくつかの実施形態において、清澄化されたサンプルは、２５℃で約７．５～約８．５のｐＨ及び約２５ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する。

陰イオン交換クロマトグラフィー
清澄化後、本発明の方法は、清澄化されたサンプル（例えば清澄化溶解物）からプロセス関連不純物を除去するための陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含む。陰イオン交換クロマトグラフィー工程の間、アデノウイルス粒子は、正に帯電した材料、例えば膜、カートリッジ又はカラムに結合し、その後の溶出により、アデノウイルス粒子を不純物から分離することが可能になる。

当技術分野で公知の精製方法は、バルク体積を減少させ、ウイルスと相互作用する低分子タンパク質等の小分子を除去するために、清澄化後、及び陰イオン交換クロマトグラフィーの前に濃縮工程（例えば、接線流濾過、ＴＦＦ）を含み得る（Ｊｏｒｔ Ｖｅｌｌｉｎｇａ，Ｊ．Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓｍｉｔｈ， Ａｇｎｉｅｓｚｋａ Ｌｉｐｉｅｃ，Ｄｒａｇｏｍｉｒａ Ｍａｊｈｅｎ， Ａｎｇｅｌｉｑｕｅ Ｌｅｍｃｋｅｒｔ， Ｍａｒｋ ｖａｎ Ｏｏｉｊ，Ｐａｕｌ Ｉｖｅｓ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｙａｌｌｏｐ，Ｊｅｒｏｍｅ Ｃｕｓｔｅｒｓ，ａｎｄ Ｍｅｎｚｏ Ｈａｖｅｎｇａ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｐｒ ２０１４．３１８－３２７）。

本発明の方法は、清澄化されたサンプル（例えば清澄化溶解物）が、ＴＦＦ等のいかなる濃縮工程も介在させずに陰イオン交換クロマトグラフィーによって処理されることを特徴とする。介在する濃縮工程（例えば、ＴＦＦ）を排除することにより、プロセスが大幅に単純化され、原料消費が低減され、大量の廃棄物流が排除される。清澄化と陰イオン交換クロマトグラフィーとの間の介在濃度工程（例えば、ＴＦＦ）の排除により、処理時間を大幅に短縮することができ；本発明の方法において、この工程を除去することにより、処理時間が１日短縮された。したがって、本発明の方法は、改善されたスケーラビリティ及びスループットを有するが、依然として許容可能な製品品質を提供する（実施例３に示す）。

クロマトグラフィー用の陰イオン性支持体を形成するために、陰イオン交換置換基をマトリクスに結合させてもよい。本発明の方法において使用し得る陰イオン交換置換基の非限定的な例としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）及び第四級アンモニウム（Ｑ）基が挙げられる。好ましくは、陰イオン交換材料は、ＤＥＡＥ又はＱ陰イオン交換置換基を含む。

好ましい実施形態では、陰イオン交換材料は陰イオン交換膜を含む。陰イオン交換膜は、膜を通って移動する液相内で接触している少なくとも１つの物質と相互作用することができる陰イオン交換置換基を有する薄い合成膜である。膜は、典型的には、同様の出力を有するカラムよりもはるかに小さい設置面積を生成するために、比較的小さいカートリッジ内で５層～１５層深く積層される。

好ましくは、陰イオン交換材料は陰イオン交換膜である。陰イオン交換膜は、微孔質又はマクロ多孔質であり得る。いくつかの実施形態では、陰イオン交換膜は、マクロ多孔質であり、場合により、少なくとも約１μｍ、少なくとも約２μｍ、又は少なくとも約３μｍ、又は少なくとも約４μｍの公称孔径を有する。好ましい実施形態において、陰イオン交換膜は、少なくとも約３μｍの公称孔径を有する。

好ましい実施形態において、陰イオン交換膜は、好ましくは少なくとも約３μｍの公称孔径を有する第四級アンモニウム（Ｑ）基を含む。Ｐａｌｌ（例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）シリーズ）及びＳａｒｔｏｒｉｕｓ（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）シリーズ）によって生成されるもの等の陰イオン交換膜クロマトグラフィー生成物は、本発明の方法における使用に適し得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法の陰イオン交換工程は、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）又はＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）陰イオン交換膜を使用することを含む。特に、本発明者らは、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ膜（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ、例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ ４ｍｍ又は８ｍｍ）が、代替的な陰イオン交換膜（例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑ）よりも改善されたスケーラビリティを提供し得ることを認識した。

本発明の方法での使用に適し得る他の陰イオン膜吸収剤及び樹脂としては、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ及びＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑ（Ｃｙｔｉｖａ）、Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ（Ｃｙｔｉｖａ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＭＡＥ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ａｄｓｅｐｔ Ｑ（登録商標）（Ｎａｔｒｉｘ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）、並びにＣＩＭ（登録商標）ＱＡ（ＢＩＡ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ） Ｎａｔｒｉｘ Ｑ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＰＯＲＯＳ ＸＱ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｎｕｖｉａ Ｑ（ＢｉｏＲａｄ）、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ ＨｉｇｈＱ（ＢｉｏＲａｄ）、ＧｉｇａＣａｐＱ ６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ）及びＣａｐｔｏ Ｑ（Ｃｙｔｉｖａ）が挙げられるが、これらに限定されない。

清澄化サンプル（例えば清澄化溶解物）を陰イオン交換クロマトグラフィー材料、例えば陰イオン交換膜に負荷する。驚くべきことに、本発明者らは、体積負荷を従来技術のアデノウイルス精製方法と比較して減少させることができることを見出した。したがって、陰イオン交換クロマトグラフィー材料が膜（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ膜）である実施形態において、清澄化サンプル（例えば清澄化溶解物）は、最大約７０Ｌの清澄化サンプル／Ｌ陰イオン交換膜、最大約６５Ｌの清澄化サンプル／Ｌ陰イオン交換膜、最大約６０Ｌの清澄化サンプル／Ｌ陰イオン交換膜、最大約５５Ｌの清澄化サンプル／Ｌ陰イオン交換膜、最大約５０Ｌの清澄化サンプル／Ｌ陰イオン交換膜、最大約４５Ｌの清澄化サンプル／Ｌ陰イオン交換膜、又は最大約４０Ｌの清澄化サンプル／Ｌ陰イオン交換膜の負荷で負荷され得る。好ましい実施形態において、清澄化サンプル（例えば清澄化溶解物）は、約５０Ｌの清澄化サンプル／Ｌ陰イオン交換膜の負荷で負荷される。

陰イオン交換クロマトグラフィー材料が膜（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ膜）であるいくつかの実施形態において、清澄化サンプル（例えば清澄化溶解物）は、約１０～約７５Ｌの清澄化サンプル／Ｌ陰イオン交換膜、約２０～約７０Ｌの清澄化サンプル／Ｌ陰イオン交換膜、又は約５０～約６０の清澄化サンプル／Ｌ陰イオン交換膜の負荷で負荷され得る。

いくつかの実施形態において、清澄化サンプル（例えば清澄化溶解物）は、約１０膜体積／分以下、好ましくは約７膜体積／分以下、最も好ましくは約５．５膜体積／分以下の流量を有するように設定される。好ましい実施形態において、清澄化サンプル（例えば清澄化溶解物）は、約５膜体積／分の流量を有するように設定される。

負荷の前に、清澄化サンプル（例えば清澄化溶解物）を、例えば５Ｍ ＮａＣｌ等のＮａＣｌを用いて、負荷の導電率を増加させるように調整することができる。負荷中の導電率を増加させると、ＨＣＰ等のプロセス関連不純物の陰イオン交換材料への結合が減少し、結合容量が改善され得る。いくつかの実施形態において、調整された清澄サンプル（例えば、調整された清澄化溶解物）は、２５℃で約１５～約３０ｍＳ／ｃｍ、例えば約１５～約２６ｍＳ／ｃｍ、好ましくは約１５～約２５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、清澄化サンプル（例えば清澄化溶解物）は、約０．０２０～約０．０４０ｋｇ ５Ｍ ＮａＣｌ／ｋｇ清澄化サンプル、好ましくは約０．０２７～約０．０３３ｋｇ ５Ｍ ＮａＣｌ／ｋｇ清澄化サンプル、最も好ましくは約０．０３０ｋｇ ５Ｍ ＮａＣｌ／ｋｇ清澄化サンプルで調整される。

場合により、陰イオン交換工程は、清澄化サンプル（例えば清澄化溶解物）を陰イオン交換クロマトグラフィー膜に負荷する前に精密濾過に供する負荷フィルタ工程を含み得る。そのような精密濾過は、陰イオン交換膜上の高圧を緩和するのに役立ち得る。選択された特定の精密濾過膜は、アデノウイルスが通過するのに十分大きいが、不純物を有効に除去するのに十分小さいサイズの孔を有する。いくつかの実施形態において、精密濾過膜は、約１μｍ未満、約０．７５μｍ未満、約０．５μｍ未満、又は約０．２５μｍ未満の孔径を有する。好ましい実施形態において、精密濾過膜孔径は約０．２μｍである。精密濾過に適した膜材料には、再生セルロース、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、又はその誘導体、好ましくはポリエーテルスルホンが含まれ得る。好ましい実施形態において、精密濾過膜はポリエーテルスルホンを含み、約０．２μｍの孔径を有する。本発明の方法で使用するのに適した精密濾過膜は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＳＨＣ ０．５／０．２μｍフィルタである。

清澄化サンプル（例えば清澄化溶解物）を負荷した後、陰イオン交換材料を１つ以上の緩衝液で洗浄してもよい。いくつかの実施形態において、陰イオン交換材料を緩衝剤、例えば平衡化緩衝剤とそれに続く洗浄緩衝剤の組合せで洗浄する。

平衡化緩衝剤及び洗浄緩衝剤のｐＨは、アデノウイルスが結合するのに十分高く（約６．５より大きい）、ウイルス不安定性を回避するのに十分低いことは理解されよう。使用可能な正確な最大ｐＨは、アデノウイルス血清型及び緩衝剤成分の特定の安定性プロファイルに依存し得る。例えば、チンパンジーアデノウイルスのｐＨは、約６～１０、好ましくは約６．５～９、より好ましくは約７．５～８．５、例えば約８の範囲であり得る。

２５℃での平衡化緩衝剤の導電率は、約１．５～３．５ｍＳ／ｃｍ、約２～３．２ｍＳ／ｃｍ、又は約２．１～３．１ｍＳ／ｃｍの範囲であり得る。好ましい実施形態において、２５℃での平衡化緩衝剤の導電率は、約２．１～３．１ｍＳ／ｃｍの範囲である。したがって、好ましい実施形態において、平衡化緩衝剤は、約８のｐＨ及び約２．１～３．１ｍＳ／ｃｍの範囲の２５℃での導電率を有する。特に好ましい実施形態において、平衡化緩衝剤は、約５０ｍＭのトリス、約１ｍＭのＭｇＣｌ_２及び約５％（ｗ／ｖ）のスクロースを含み、約８のｐＨを有する。

２５℃での洗浄緩衝剤の導電率は、約１５～３０ｍＳ／ｃｍ、約１８～２７ｍＳ／ｃｍ、又は約２０～２４ｍＳ／ｃｍの範囲であり得る。好ましい実施形態において、２５℃での洗浄緩衝剤の導電率は、約２０～２４ｍＳ／ｃｍの範囲である。陰イオン交換材料からの未結合材料の除去は、ＮａＣｌ又はＫＣｌ、好ましくはＮａＣｌの使用によって補助され得る。したがって、好ましい実施形態において、洗浄緩衝剤は、ｐＨ８で最大約１００ｍＭ、最大約１５０ｍＭ、最大約２００ｍＭ、最大約２５０ｍＭ、又は最大約３００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む。最も好ましくは、洗浄緩衝剤は、ｐＨ８で最大約２２２ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む。したがって、好ましい実施形態において、洗浄緩衝剤は、約２２２ｍＭのＮａＣｌを含み、約８のｐＨ及び約２０～２４ｍＳ／ｃｍの範囲の２５℃での導電率を有する。特に好ましい実施形態において、洗浄緩衝剤は、約５０ｍＭのトリス、約２２２ｍＭのＮａＣｌ、約１ｍＭのＭｇＣｌ_２及び約５％（ｗ／ｖ）のスクロースを含み、約８のｐＨを有する。

結合した生成物は、溶出緩衝剤で溶出し得る。２５℃での溶出緩衝剤の導電率は、約２５～５０ｍＳ／ｃｍ、約３０～４５ｍＳ／ｃｍ、又は約３５～４３ｍＳ／ｃｍの範囲であり得る。好ましい実施形態において、２５℃での溶出緩衝剤の導電率は、約３５～４３ｍＳ／ｃｍの範囲である。溶出緩衝剤は、ｐＨ８で最大約３００ｍＭ、最大約３５０ｍＭ、最大約４００ｍＭ、最大約４５０ｍＭ、又は最大約５００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含み得る。最も好ましくは、溶出緩衝剤は、ｐＨ８で最大約４４４ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む。したがって、好ましい実施形態において、溶出緩衝剤は、約４４４ｍＭのＮａＣｌを含み、約８のｐＨ及び約３５～４３ｍＳ／ｃｍの範囲の２５℃での導電率を有する。特に好ましい実施形態において、溶出緩衝剤は、約５０ｍＭのトリス、約４４４ｍＭのＮａＣｌ、約１ｍＭのＭｇＣｌ_２及び約５％（ｗ／ｖ）のスクロースを含み、約８のｐＨを有する。

溶出緩衝剤は、約１０膜体積／分未満、好ましくは約７膜体積／分以下、最も好ましくは約５．５膜体積／分以下の流量を有するように設定される。好ましい実施形態において、溶出緩衝剤は、約５膜体積／分の流量を有するように設定される。

溶出後、溶出した生成物を希釈緩衝剤で希釈してもよい。好ましい実施形態において、希釈緩衝剤は、約３５ｍＭ ＮａＣｌ、約１０ｍＭヒスチジン／ヒスチジン－ＨＣｌ、約１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、約０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、約７．５％（ｗ／ｖ）スクロース及び約０．５％（ｖ／ｖ）エタノールを含み、約６．６のｐＨを有する。希釈緩衝剤は、１：１の希釈比で溶出生成物に添加することができる。

溶出緩衝剤の体積は、溶出された生成物、したがって陰イオン交換工程からの生成物の体積に直接影響することは理解されよう。本発明の方法では、約４．５～約５．５膜体積、好ましくは約５膜体積の溶出緩衝剤が使用され得る。いくつかの実施形態において、約３膜体積～約７膜体積、好ましくは約３．５膜体積～約５．５膜体積、好ましくは約５膜体積の希釈緩衝剤体積が使用される。好ましい実施形態において、５膜体積の溶出緩衝剤体積及び５膜体積の希釈緩衝剤体積が使用される。そのような体積を使用することにより、本方法は、陰イオン交換生成物の体積の減少及びより濃縮されたプロセス流を提供することができる。これによって、後続のＴＦＦ処理工程に必要とされる膜表面積の減少が可能になり、それによって原料の消費が低減され、大量の廃棄物流を排除し、処理時間を短縮する。

陰イオン交換クロマトグラフィー工程から得られた材料は陰イオン交換生成物である。

陰イオン交換生成物は、７～約９、好ましくは約７．５～約８．５のｐＨを有し得る。いくつかの実施形態において、陰イオン交換生成物は、２５℃で約５ｍＳ／ｃｍ～約３５ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは約１５ｍＳ／ｃｍ～約２５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。したがって、いくつかの実施形態では、陰イオン交換生成物は、約７．５～約８．５のｐＨ及び約１５ｍＳ／ｃｍ～約２５ｍＳ／ｃｍの２５℃での導電率を有する。

陰イオン交換生成物は、場合により、微生物制御のために精密濾過を受けてもよい。選択された特定の精密濾過膜は、アデノウイルスが通過するのに十分大きいが、不純物を有効に除去するのに十分小さいサイズの孔を有する。いくつかの実施形態において、精密濾過膜は、約１μｍ未満、約０．７５μｍ未満、約０．５μｍ未満、又は約０．２５μｍ未満の孔径を有する。好ましい実施形態において、精密濾過膜孔径は約０．２μｍである。精密濾過に適した膜材料には、再生セルロース、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、又はその誘導体、好ましくはポリエーテルスルホンが含まれ得る。好ましい実施形態において、精密濾過膜はポリエーテルスルホンを含み、約０．２μｍの孔径を有する。本発明の方法で使用するのに適した精密濾過膜は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＳＨＣ ０．５／０．２μｍフィルタである。

好ましい工程において、本発明の方法は、混合モードサイズ排除クロマトグラフィーによる陰イオン交換後にさらなる処理工程を含み、混合モードサイズ排除生成物を提供する。混合モードサイズ排除クロマトグラフィーは、Ｃａｐｔｏ Ｃｏｒｅ ７００（Ｃｙｔｉｖａ）、Ｃａｐｔｏ Ｃｏｒｅ ４００（Ｃｙｔｉｖａ）及びＭｏｎｏｍｉｘ Ｃｏｒｅ ６０（Ｓｅｐａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むがこれらに限定されない混合モードサイズ排除樹脂を用いて行うことができる。

接線流濾過
陰イオン交換又は混合モードサイズ排除クロマトグラフィーの後、本発明の方法は、接線流濾過（ＴＦＦ）工程を含む。ＴＦＦ工程は、陰イオン交換生成物を濃縮するため、及び緩衝剤を導入するために限外濾過及び透析濾過をそれぞれ含む。したがって、本発明の方法において、ＴＦＦ生成物の体積が減少し、ＴＦＦ工程の負荷と比較してより高いアデノウイルス濃度を有する。最適な供給流は、当技術分野の当業者によって決定され得る。好ましい実施形態において、供給流は、約１～約１５リットル／ｍ^２／分（ＬＭＭ）、好ましくは約２～約１０ＬＭＭ、最も好ましくは約３～約７ＬＭＭ、例えば５ＬＭＭに設定される。

ＴＦＦ工程の負荷は、陰イオン交換生成物又は混合モードサイズ排除生成物である。場合により、陰イオン交換生成物は、ＴＦＦの前に深層濾過によって処理される。そのような深層濾過工程は、ＨＣＰの減少及び膜寿命の改善に関して利点を提供し得る。適切な深度フィルタには、上記の明確化のセクションで説明したものが含まれる。好ましい実施形態では、０μｍより大きく最大約０．１μｍの公称フィルタ定格を有する深層フィルタ、例えば、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｘ０ＨＣ媒体又はＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｘ０ＳＰ媒体が使用される。特に好ましい実施形態において、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄ Ｘ０ＨＣ深層フィルタが使用される。

製造業者及び膜種類に応じて、限外濾過膜の公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）は、１００ｋＤａ～１０００ｋＤａであり得る。膜組成物は、再生セルロース、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、又はその誘導体であってもよいが、これらに限定されない。これらの膜は、平坦なシート又は中空繊維であり得る。乱流促進スクリーンはまた、不純物クリアランスを最適化するのに有用であり得る。いくつかの実施形態において、乱流促進スクリーン（例えば、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）２膜、３００ｋＤａ ＭＷＣＯ、Ｃスクリーン）を備えた３００ｋＤａ又は５００ｋＤａのＮＭＷＣＯポリエーテルスルホンフラットシート膜が使用される。接線流濾過は、クロスフロー及び透過流束の両方を設定し、膜貫通圧力を固定圧力限界以下に維持することによって制御することができる。

膜体積負荷は、当技術分野の当業者によって決定され得る。好ましい実施形態において、膜体積負荷は、約１００Ｌ／ｍ^２未満である。

限外濾過は、陰イオン交換生成物又は混合モードサイズ排除生成物を濃縮し得る。例えば、本発明の方法のいくつかの実施形態において、限外濾過は、陰イオン交換生成物又は混合モードサイズ排除生成物を、約０．０３～約０．３Ｌ／Ｌヌクレアーゼ処理溶解物、好ましくは約０．０５Ｌ／Ｌヌクレアーゼ処理溶解物の体積に濃縮する。いくつかの実施形態において、濃縮工程中、透過液流は、約１．００ＬＭＭ未満、好ましくは約０．９０ＬＭＭ未満、最も好ましくは約０．８０ＬＭＭ未満に設定される。特に好ましい実施形態において、透過流は、濃縮工程中に約０．６７ＬＭＭに設定される。

次いで、濃縮された陰イオン交換又は混合モードサイズ排除生成物を透析濾過緩衝剤で透析濾過する。透析濾過は、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、又は少なくとも１２透析体積の透析濾過緩衝剤を使用して操作することができる。好ましい実施形態において、透析濾過は、少なくとも１０透析体積の透析濾過緩衝剤を使用して操作される。０．６７ＬＭＭ等の０．８０ＬＭＭ未満の透過流を使用することができる。透析濾過緩衝剤のｐＨは、約６～８、好ましくは約６～７、より好ましくは約６．５～６．７の範囲であり得る。透析濾過緩衝剤の２５℃における導電率は、約１～８ｍＳ／ｃｍ、好ましくは約２～６ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは約３～４．６ｍＳ／ｃｍの範囲であり得る。したがって、好ましい実施形態において、透析濾過緩衝剤は、約６．５～６．７のｐＨ及び約３～４．６ｍＳ／ｃｍの範囲の２５℃での導電率を有する。いくつかの実施形態において、透析濾過緩衝剤はポリソルベート－８０を含まない。好ましい実施形態において、透析濾過緩衝液は、約３５ｍＭ ＮａＣｌ、約１０ｍＭヒスチジン／ヒスチジン－ＨＣｌ、約１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、約０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、約７．５％（ｗ／ｖ）スクロース及び約０．５％（ｖ／ｖ）エタノールを含み、約６．６のｐＨを有する。

透析濾過された生成物は、ＴＦＦシステムから回収される。透析濾過された生成物は、一定体積の透析濾過緩衝剤（例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５つのシステム保持体積の透析濾過緩衝剤）でフラッシュすることによって回収することができる。好ましい実施形態において、透析濾過された生成物は、３つのシステム保持体積の透析濾過緩衝剤でフラッシュすることによって回収される。好ましくは、透析濾過工程と同じ透析濾過緩衝剤が使用される。

ＴＦＦ工程から得られた材料は、ＴＦＦ生成物である。ＴＦＦ生成物は、表１に示される特性の１つ以上、好ましくは全てを有し得る。

製剤
ＴＦＦ生成物は、製剤化された生成物を提供するために製剤化され得る。いくつかの実施形態において、製剤化工程は、ポリソルベート－８０をＴＦＦ生成物に添加することを含む。いくつかの実施形態において、製剤化された製品中で約０．１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート－８０の濃度を達成するためにポリソルベート－８０が添加される。好ましい実施形態において、製剤化された製品は以下の組成を有する：約３５ｍＭ ＮａＣｌ、約１０ｍＭ ヒスチジン／ヒスチジン－ＨＣｌ、約１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、約０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、約７．５％（ｗ／ｖ）スクロース、約０．１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート－８０及び約０．５％（ｖ／ｖ）エタノールを含み、約６．６のｐＨを有する。

滅菌濾過
製剤化された製品は、滅菌濾過を受けることができる。滅菌濾過工程は、微生物を保持するのに十分に小さく、アデノウイルスを通過させるのに十分に小さいサイズの孔径を有するフィルタを用いて行ってもよい。好ましい実施形態において、フィルタは約０．２μｍの孔径を有する。フィルタは、ポリエーテルスルホン、ＰＶＤＦ、ポリプロピレン、セルロース、セルロースエステル、ナイロン、又は低製品結合と一致する任意の他の材料等、当技術分野で周知の材料で構成することができる。好ましい実施形態において、フィルタは親水性ポリエーテルスルホンを含む。特に好ましい実施形態において、フィルタは、０．２μｍ（例えば、Ｐａｌｌ Ｓｕｐｏｒ（登録商標）ＥＫＶ、０．２μｍ）の孔径を有する親水性ポリエーテルスルホン膜を含む。

フィルタから回収された生成物は原薬である。原薬は製剤緩衝剤中で製剤化され得る。好ましい実施形態において、透析濾過緩衝剤は、約３５ｍＭ ＮａＣｌ、約１０ｍＭヒスチジン／ヒスチジン－ＨＣｌ、約１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、約０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、約７．５％（ｗ／ｖ）スクロース、約０．１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート－８０及び約０．５％（ｖ／ｖ）エタノールを含み、約６．６のｐＨを有する。これは、濾過前にフィルタを製剤緩衝剤で平衡化し、濾過後に製剤緩衝剤でチェイスすることによって達成され得る。

原薬
本発明の方法は、原薬の製造をもたらし得る。

本発明の方法は、代替アデノウイルス精製方法（例えば、実施例１の方法）と比較してアデノウイルスの濃度が増加した（例えば、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍高いアデノウイルス濃度）原薬を提供し得る。より濃縮された原薬を有することの利点は、それがそれほど多くの貯蔵空間を必要としないことであり、これは－８０℃で貯蔵した場合に特に有利であり得る。いくつかの実施形態では、原薬は、少なくとも約０．８×１０^１１ｖｐ／ｍＬ、少なくとも約１×１０^１１ｖｐ／ｍＬ、少なくとも約１．２×１０^１１ｖｐ／ｍＬ、少なくとも約１．４×１０^１１ｖｐ／ｍＬ、少なくとも約１．６×１０^１１ｖｐ／ｍＬ、少なくとも約１．８×１０^１１ｖｐ／ｍＬ、少なくとも約２×１０^１１ｖｐ／ｍＬ、少なくとも約２．２×１０^１１ｖｐ／ｍＬ、少なくとも約２．４×１０^１１ｖｐ／ｍＬ又は少なくとも約２．６×１０^１１ｖｐ／ｍＬのアデノウイルスウイルス粒子（本明細書では「ウイルス粒子」とも呼ばれる）濃度を有する。

いくつかの実施形態では、原薬は、以下の特性の１つ以上、好ましくは全てを有する：ヌクレアーゼ処理溶解物中のＨＣＰレベルと比較して減少したＨＣＰレベル；約６．１～７．１のｐＨ；約２６５ｍＯｓｍ／Ｋｇを超えるモル浸透圧濃度；約２．４×１０^９ｉｆｕ／ｍＬ以上の感染力；約０．８×１０^１１ｖｐ／ｍＬを超えるウイルス粒子濃度；約１．１～１．６のＤＮＡ：タンパク質比；約５００：１ｖｐ／ｉｆｕ以下のウイルス粒子：感染力価比；約１０ｎｇ／用量未満の宿主細胞ＤＮＡ；約２００ｎｇ／用量未満のＨＣＰ；約２０ｎｇ／ｍＬ未満のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）；約１０ＥＵ／ｍＬ未満のエンドトキシン；約５ＣＦＵ／１０ｍＬ未満のバイオバーデン。本明細書で使用される場合、原薬の用量は約５×１０^１０のウイルス粒子を含む。

いくつかの実施形態において、原薬は、表２に示される特性の１つ以上、好ましくは全てを有する。例えば、いくつかの実施形態では、原薬は、約２．４×１０^９ｉｆｕ／ｍＬ以上の感染力及び／又は少なくとも約０．８×１０^１１ｖｐ／ｍＬのウイルス粒子濃度、例えば少なくとも約２×１０^１１ｖｐ／ｍＬのウイルス粒子濃度を有する。好ましい実施形態では、原薬は、約２．４×１０^９ｉｆｕ／ｍＬ以上の感染力及び少なくとも約０．８×１０^１１ｖｐ／ｍＬのウイルス粒子濃度、例えば少なくとも約２×１０^１１ｖｐ／ｍＬのウイルス粒子濃度を有する。

本発明の方法は、低レベルのＨＣＰを含有する原薬をもたらす。いくつかの実施形態において、原薬は、用量当たり２０００ｎｇ以下、例えば用量当たり１０００ｎｇ以下、用量当たり５００ｎｇ以下、用量当たり２００ｎｇ以下、用量当たり１００ｎｇ以下、又は用量当たり５０ｎｇ以下の濃度でＨＣＰを含む。好ましい実施形態では、原薬は、ＨＣＰを用量あたり１０００ｎｇ以下の濃度で含む。いくつかの実施形態では、原薬は、用量あたり１００ｎｇ以下、例えば用量あたり５０ｎｇ以下、用量あたり２５ｎｇ以下、用量あたり１０ｎｇ以下又は用量あたり５ｎｇ以下の濃度で宿主細胞ＤＮＡを含む。好ましい実施形態では、原薬は、宿主細胞ＤＮＡを用量あたり１０ｎｇ以下の濃度で含む。

原薬は、場合によって２～８℃保持で、約－９０～－５５℃で最大５日間保存した後凍結してもよい。

いくつかの実施形態では、原薬を滅菌濾過し、約２０倍に希釈して製剤を形成する。有利には、製剤は、２～８℃で長期間、例えば少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約１ヶ月間、又は少なくとも約１年間保存され得る。

アデノウイルスベクター
本発明の方法の好ましい実施形態では、アデノウイルスはアデノウイルスベクターである。本明細書で使用される場合、「アデノウイルスベクター」は、異種遺伝子をコードするヌクレオチド配列を真核細胞に挿入するために改変されたアデノウイルスの形態を意味する。本明細書で使用される場合、「異種遺伝子」は、それが比較されている実体の残りのものとは遺伝子型的に異なる実体に由来する遺伝子を意味する。したがって、異種遺伝子は、アデノウイルスの天然に存在する遺伝子から単離されていない、それに由来していない、又はそれに基づいていない任意の遺伝子を指す。本明細書で使用される場合、「天然に存在する」とは、天然に見出され、合成的に調製又は改変されていないことを意味する。

本発明の方法の好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターは、目的のタンパク質、例えば治療用タンパク質又は免疫原性タンパク質をコードする異種遺伝子を含む。或いは、異種遺伝子は、発現時に検出可能なシグナルを生成するレポーター遺伝子を含み得る。そのようなレポーター遺伝子としては、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリンホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８を含む膜結合タンパク質、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質、及びそれらに対する高親和性抗体が存在するか又は従来の手段によって産生され得る他の当技術分野で周知のもの、並びにとりわけヘマグルチニン又はＭｙｃ由来の抗原タグドメインに適切に融合された膜結合タンパク質を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。これらのコード配列は、それらの発現を駆動する調節エレメントと会合すると、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び免疫組織化学を含む、酵素、放射線、比色、蛍光又は他の分光アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ及び免疫学的アッセイを含む従来の手段によって検出可能なシグナルを提供する。

好ましい実施形態では、異種遺伝子は、治療用遺伝子又は免疫原性遺伝子等の生物学及び医学に有用なタンパク質、ＲＮＡ、酵素又は触媒ＲＮＡ等の生成物をコードする配列である。異種遺伝子は、例えば遺伝子欠損の治療のために、癌治療薬として、ワクチンとして、免疫応答の誘導のために、及び／又は予防目的のために使用され得る。

好ましい実施形態において、異種遺伝子は、外来抗原、例えば天然に存在する形態の外来抗原、又はその改変形態をコードする。本明細書で使用される場合、「外来抗原」は、宿主免疫応答を誘導し、それが免疫応答を誘導する宿主のものとは遺伝子型的に異なる実体に由来する抗原を意味する。本明細書で使用される場合、外来抗原の改変形態は、天然に存在する抗原に対する宿主免疫応答を誘導し、天然に存在する抗原に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する外来抗原の形態を意味する。本明細書で使用される場合、免疫応答の誘導は、タンパク質がタンパク質に対するＴ細胞及び／又は体液性免疫応答を誘導する能力を指す。外来抗原の天然に存在する形態又はその改変形態に対する宿主免疫応答の決定は、Ｊｅｙａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．２０２０；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＣＯＶＩＤ－１９ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ；Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０，６１５－６３２及びＡｌｂｅｒｔ－Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．２０１８；Ｉｍｍｕｎｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｓｓａｙｓ， Ｆｒｏｍ Ｃｕｓｔｏｍ ｔｏ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９：２３６７に記載されているような任意の適切な方法によって評価することができる。いくつかの実施形態では、天然に存在する抗原の改変形態は、天然に存在する抗原によって誘導されるよりも強力な宿主免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態において、天然に存在する抗原の改変形態は、天然に存在する抗原によって誘導されるよりも弱い宿主免疫応答を誘導する。

いくつかの実施形態において、外来抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のスパイクタンパク質に由来する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２は、重度の急性呼吸器疾患であるＣＯＶＩＤ－１９を引き起こす、新しく出現したコロナウイルスである。これまでのところ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染を予防するためのワクチンは世界規模で利用可能ではなかった。このウイルスは、標的細胞への侵入のために細胞受容体ＡＣＥ ２及びセリンプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２との相互作用のためにそのスパイク糖タンパク質を使用するため、このスパイクタンパク質はワクチン治療のための魅力的な標的である。したがって、好ましい実施形態において、異種遺伝子は、天然に存在する形態のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質又はその改変バージョンをコードする。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質のＲＮＡ、ＤＮＡ及びアミノ酸配列は当技術分野の当業者に公知であり、多くのデータベースにおいて、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のデータベースにおいて見出すことができ、ＮＣ＿０４５５１２．２の受託番号を有する。例えば、いくつかの実施形態では、異種遺伝子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＳＡＲ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質をコードする。他の例示的な実施形態において、異種遺伝子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質の改変形態をコードする。容易に理解されるように、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端にヒト組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子（ｔＰＡ）のシグナルペプチドを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質アミノ酸配列を含む。Ｎ末端ｔＰＡ配列の存在は、ＳＡＲ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質の免疫原性を増強し得る。

異種遺伝子に加えて、ベクターはまた、アデノウイルスに感染した細胞におけるその転写、翻訳及び／又は発現を可能にするように異種遺伝子に作動可能に連結された従来の制御エレメントを含み得る。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」は、目的の遺伝子と隣接する発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するためにトランスで又は一定距離で作用する発現制御配列の両方を含む。

発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナル等の効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；翻訳効率を高める配列；タンパク質安定性を高める配列；必要に応じて、コードされた生成物の分泌を増強する配列を含み得る。本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を可能にし、遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列である。内部、天然、構成的、誘導性及び／又は組織特異的であるプロモーターを含む多数の発現制御配列が当技術分野で公知であり、利用され得る。

アデノウイルスベクターは、哺乳動物アデノウイルスに由来し得る。本発明の方法のいくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターはヒトアデノウイルスに由来する。いくつかの実施形態において、ヒトアデノウイルスは、血清型５のヒトアデノウイルスである。いくつかの実施形態において、ヒトアデノウイルスは、血清型５のヒトアデノウイルスではない。

好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターはヒトアデノウイルスに由来しない。したがって、アデノウイルスベクターは、非ヒトアデノウイルス、例えば、チンパンジーアデノウイルスに由来し得る。特に好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、チンパンジーのアデノウイルス、例えばＣｈＡｄＯｘ１（Ａｎｔｒｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２（３）：６６８－６７４）、ＣｈＡｄＯｘ２（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｆｕｔｕｒｅ Ｖｉｒｏｌ．１１（９）：６４９－６５９）、ＣｈＡｄ３又はＣｈＡｄ６３に由来する。特に好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターはＣｈＡｄＯｘ１に由来する。

本発明の方法のいくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、ワクチンで使用するためのものであり、ワクチンが標的とする種と同じ種に由来する。例えば、いくつかの実施形態において、ワクチンはヒトに見られる疾患を標的とし、アデノウイルスベクターはヒトアデノウイルスに由来する。しかしながら、好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、ワクチンに使用するためのものであり、ワクチンが標的化される種とは異なる種に由来する。例えば、いくつかの実施形態において、ワクチンはヒトに見られる疾患を標的とし、アデノウイルスベクターは非ヒトアデノウイルス、例えばチンパンジーアデノウイルスに由来する。ワクチンが標的化される種とは異なる種に由来するアデノウイルスベクターの使用は、投与された場合、既存の抗アデノウイルス免疫の発生率がより低い改善されたワクチンを提供し得ると考えられる。

アデノウイルスベクターは、宿主への投与後に複製することができないように操作され得る。したがって、本発明の方法のいくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターは複製欠損アデノウイルスベクター（例えば、チンパンジーアデノウイルス由来の複製欠損アデノウイルスベクター）である。本明細書中で使用される場合、「複製欠損アデノウイルスベクター」は、１つ以上のアデノウイルス複製遺伝子を欠く宿主細胞において複製することができないアデノウイルスベクターを意味する。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターはＥ１Ａ遺伝子を欠く。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、宿主免疫系によるアデノウイルスベクターに感染した細胞の排除を防ぐように改変されている。例えば、いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ｅ１Ｂ遺伝子及び／又はＥ３遺伝子を欠く。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターはＥ１Ｂ遺伝子を欠く。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターはＥ３遺伝子を欠く。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターはＥ１Ｂ遺伝子及びＥ３遺伝子を欠く。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、複製起点（ｏｒｉ）及びパッケージング配列を含む最小アデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、最小アデノウイルスベクターは、目的のタンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含む。

宿主細胞集団
本発明の方法の好ましい実施形態では、宿主細胞集団は、細胞集団に添加されたアデノウイルスに相補的である。本明細書で使用される場合、「産生されるアデノウイルスに相補的な宿主細胞集団」は、産生されるアデノウイルスによって発現されないアデノウイルス因子を発現するように操作された宿主細胞集団である。例えば、いくつかの実施形態では、アデノウイルスはアデノウイルスＤＮＡ複製因子を発現せず、宿主細胞集団はアデノウイルスＤＮＡ複製因子を発現する。本明細書で使用される場合、「アデノウイルスＤＮＡ複製因子」は、天然ではアデノウイルスＤＮＡの一部を形成し、アデノウイルスが宿主細胞内で複製するために必要とされる因子である。したがって、いくつかの実施形態では、アデノウイルスは、Ｅ１Ａタンパク質、Ｅ１Ｂタンパク質及び／又はＥ４タンパク質を発現せず、細胞集団は、Ｅ１Ａタンパク質、Ｅ１Ｂタンパク質及び／又はＥ４タンパク質を発現する。

宿主細胞集団は、懸濁液中の細胞を含み得る。

宿主細胞集団は、組織から新たに単離された初代細胞集団であり得る。いくつかの実施形態において、組織は哺乳動物組織である。

或いは、宿主細胞集団は、培養に適合した細胞株に由来し得る。いくつかの実施形態において、細胞株は不死化細胞株である。いくつかの実施形態において、細胞株は哺乳動物細胞株である。いくつかの実施形態において、宿主細胞集団は哺乳動物細胞を含む。例えば、いくつかの実施形態では、宿主細胞集団は、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞を含むか、又はＨＥＫ細胞株である。哺乳動物細胞は、アデノウイルス複製因子を発現し得る。例えば、いくつかの実施形態では、宿主細胞集団は、Ｅ１Ａタンパク質、Ｅ１Ｂタンパク質、及び／又はＥ４タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、宿主細胞集団は、テトラサイクリンリプレッサータンパク質を発現する。好ましい実施形態において、宿主細胞集団はＴ－ＲＥｘ（商標）細胞を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞集団はＴ－ＲＥｘ（商標）細胞からなる。

別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同様の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，２０ ＥＤ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）及びＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。

本開示は、本明細書中で開示される例示的な方法及び材料によって限定されず、本明細書中に記載のものと類似又は同等の任意の方法及び材料を、本開示の実施形態の実施又は試験において使用することができる。

別段示されない限り、それぞれ、いずれかの核酸配列は５’から３’方向に左から右に書かれ、アミノ酸配列はアミノからカルボキシ方向に左から右に書かれる。

本明細書中で提供される見出しは、本開示の種々の態様又は実施形態を限定するものではない。さらに、本明細書に記載された実施形態のいずれも、本明細書に記載された態様のいずれにも適用可能であることは理解されよう。

濃度、量、容量、パーセンテージ、及び他の数値は、範囲形式で本明細書において示されてもよい。数値範囲には、当該範囲を定義する数が含まれる。値の範囲が与えられる場合、文脈上別途明確に示されない限り、その範囲の上限値と下限値との間の、下限値の１０分の１の単位までの各介在値もまた、具体的に開示されると理解される。記載された範囲内の記載されたいずれかの値又は介在値と、その記載された範囲内の記載された他のいずれかの値又は介在値との間の、より小さな範囲のそれぞれは、本開示内に包含される。これらのより小さな範囲の上限値及び下限値は、独立してその範囲に含まれても又は除外されてもよく、また、記載された範囲におけるいずれかの具体的に除外された限界値に従って、より小さな範囲にいずれかの限界値が含まれるか、どちらも含まれないか、又は両方とも含まれるそれぞれの範囲もまた、本開示内に包含される。記載された範囲が一方又は両方の限界値を含む場合、含まれる限界値の一方又は両方を除外する範囲もまた、本開示に含まれる。そのような範囲形式は、単に便宜及び簡潔さのために使用され、範囲の限界として明示的に詳述される数値だけでなく、あたかもそれぞれの数値及び部分範囲が明示的に詳述されるかのように、その範囲内に包含される個々の数値又は部分範囲のすべてを含むことが柔軟に解釈されるべきであることもまた、理解されるべきである。

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈上別途明確に示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「薬剤（ａｎ ａｇｅｎｔ）」への言及は、複数のそのような薬剤を含み、「薬剤（ｔｈｅ ａｇｅｎｔ）」への言及は、１つ以上の薬剤及び当業者にとって公知のその同等物などへの言及を含む。

「約」は、一般的に、測定法の性質又は精度を考慮すれば、測定される数量について許容される程度の誤差を意味してもよい。誤差の例示的な程度は、与えられた値又は値の範囲の２０パーセント（％）以内、典型的には１０％以内、より典型的には５％以内である。好ましくは、「約」という用語は、本明細書では、使用されている数の数値の±（±）５％、好ましくは±４％、±３％、±２％、±１％、±０．５％、±０．１％として理解されるものとする。

１つ以上の特徴を「含む」として本明細書に記載される実施形態はまた、そのような特徴「から本質的になる」又はそのような特徴「からなる」対応する実施形態の開示と見なされ得る。

上記の実施形態は、例示的な例として理解されるべきである。さらなる実施形態が想定される。任意の１つの実施形態に関して記載されるいかなる特徴も、単独で又は記載される他の特徴と組み合わせて使用されてもよく、また、任意の他の実施形態又は任意の他の実施形態の任意の組み合わせの１つ以上の特徴と組み合わせて使用されてもよいことが理解されるべきである。さらに、上記に記載されない等価物及び変更もまた、添付の請求項において定義される本発明の範囲から逸脱することなく用いられてもよい。

本明細書において引用される全ての文献は、引用される文献において示されるデータ、表、図、及び原文を全て含め、それぞれ、参照によって本明細書に完全に組み込まれる。

実施例１：プロセスＡを使用するアデノウイルス精製
プロセスＡを用いたアデノウイルス精製を図１に示す。さらなる詳細を以下に提供する。

細胞溶解及びＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）消化
１０×溶解緩衝剤（５００ｍＭトリス、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０％（ｗ／ｖ）スクロース、１０％（ｖ／ｖ）ポリソルベート（ＰＳ）２０、ｐＨ８．０）をバイオリアクターに最終濃度１×溶解緩衝剤まで添加して、培養物中の細胞を溶解した。細胞溶解の３０分以内に、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ストック溶液を細胞培養培地と混合し、最終濃度が溶解物１５単位／ｍＬになるようにバイオリアクターに添加した。細胞溶解及びＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）処理を回収開始前に最低２時間継続した。

３７℃のバイオリアクター温度及び６０ＲＰＭの撹拌速度を、ｐＨ制御及び溶存酸素をオフにしながら、この単位操作の期間にわたってバイオリアクターの細胞培養段階から維持した。

清澄化
Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）で処理した溶解物をバイオリアクターから回収し、深層濾過を使用して清澄化した。

深層フィルタ（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｃ０ＳＰ媒体）を最初に注射用水でフラッシュし、次いで、最初の負荷の前に平衡化緩衝剤（５０ｍＭトリス、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｖ／ｖ）ＰＳ２０、ｐＨ８．０）で平衡化した。次いで、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）処理した溶解物を深層フィルタに負荷した。負荷後、チェイス緩衝剤（５０ｍＭトリス、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｖ／ｖ）ＰＳ ２０、ｐＨ８．０）を深層フィルタに添加した。生成物の収集は、生成物の希釈を減らすためにフィルタ保持体積の７５％を廃棄物に転用した後に開始し、チェイスの完了時に終了した。

バイオリアクターの撹拌速度は、温度制御をオフにしながら、この単位操作の間、溶解及びＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）消化工程から維持した。

接線流濾過及びバイオバーデン除去濾過１
陰イオン交換クロマトグラフィーの前に、清澄化された溶解物を接線流濾過に供し、続いて０．２μｍ濾過して不純物を除去した。清澄化された溶解物を、最初に、３００ ｋＤａの限外濾過膜（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ２ ＰＥＳ膜、３００ｋＤａ ＭＷＣＯ、Ｃ Ｓｃｒｅｅｎ）を使用する限外濾過によって濃縮した。次いで、濃縮生成物を透析濾過緩衝剤（５９ｍＭビス－トリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１％（ｖ／ｖ）ＰＳ ２０、ｐＨ７．０）で透析濾過した後、透析濾過緩衝剤でさらなる濃縮工程及び透析濾過工程に供した。

接線流濾過１生成物を平衡化緩衝剤（５９ｍＭビス－トリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１％（ｖ／ｖ）ＰＳ ２０、ｐＨ７．０）で平衡化した。次いで、平衡化した生成物を濾過し（Ｐａｌｌ Ｓｕｐｏｒ ＥＫＶ、０．２μｍを使用）、チェイス緩衝剤（５９ｍＭビス－トリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１％（ｖ／ｖ）ＰＳ ２０、ｐＨ７．０）を使用して中間保持容器中にチェイスした。

陰イオン交換クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、生成物を結合し、プロセス関連不純物を除去するように設計されている。陰イオン交換クロマトグラフィーは、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑシステムを用いて行った。したがって、陰イオン交換クロマトグラフィー膜（Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ（登録商標））を最初に１Ｍ ＮａＣｌでフラッシュした後、２０膜体積の消毒緩衝剤（１Ｎ ＮａＯＨ）で消毒し、次いでコンディショニング緩衝剤（１Ｍ ＮａＯＨ）でコンディショニングした。

陰イオン交換クロマトグラフィー膜を予備平衡化緩衝剤（５０ｍＭビス－トリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１％（ｖ／ｖ）ＰＳ ２０、ｐＨ７．０）で予備平衡化した後、３０膜体積の活性化緩衝剤（５９ｍＭビス－トリス、４４４ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％（ｗ／ｖ）スクロース、ｐＨ７．０）で活性化し、４０膜体積の平衡化緩衝剤（５９ｍＭビス－トリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１％（ｖ／ｖ）ＰＳ ２０、ｐＨ７．０）で平衡化した後、負荷を開始した。

接線流濾過及びバイオバーデン除去濾過１工程からの濾過生成物を陰イオン交換クロマトグラフィー膜に負荷した。負荷後、陰イオン交換クロマトグラフィー膜を４０膜体積の洗浄緩衝剤（５９ｍＭビス－トリス、２２２ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％（ｗ／ｖ）スクロース、ｐＨ７．０）で洗浄した。生成物を２５膜体積の溶出緩衝剤（５９ｍＭビス－トリス、４４４ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％（ｗ／ｖ）スクロース、ｐＨ７．０）で陰イオン交換クロマトグラフィー膜から溶出し、直ちにＡＥＸ希釈緩衝剤（３５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭヒスチジン、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、７．５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１％（ｖ／ｖ）ＰＳ ８０、０．５％（ｖ／ｖ）エタノール、ｐＨ６．６）で初期細胞溶解物体積の約半分（約２５膜体積以上に相当）に希釈した。

接線流濾過及びバイオバーデン除去濾過２
３００ｋＤａ限外濾過膜（Ｏｍｅｇａ ＰＥＳ膜、３００ｋＤａ）を用いた限外濾過により、陰イオン交換生成物を濃縮した。次いで、濃縮された生成物を透析濾過緩衝剤（３５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭヒスチジン、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、７．５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１％（ｖ／ｖ）ＰＳ ８０、０．５％（ｖ／ｖ）エタノール、ｐＨ６．６）で透析濾過した。透析濾過された生成物は、透析濾過緩衝液でフラッシュすることによってＴＦＦシステムから回収される。

バイオバーデン還元フィルタ（Ｐａｌｌ Ｓｕｐｏｒ ＥＫＶ、０．２μｍ）を平衡化緩衝剤（３５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭヒスチジン、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、７．５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１％（ｗ／ｖ）ＰＳ ８０、０．５％（ｖ／ｖ）エタノール、ｐＨ ６．６）で平衡化した。次いで、透析濾過された生成物を濾過し（Ｐａｌｌ Ｓｕｐｏｒ ＥＫＶ、０．２μｍ）、チェイス緩衝剤（３５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭヒスチジン、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、７．５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１％（ｗ／ｖ）ＰＳ ８０、０．５％（ｖ／ｖ）エタノール、ｐＨ６．６）を用いて中間保持容器にチェイスし、その後、２～８℃で最大７日間貯蔵した後、－６５℃以下で凍結させてもよい。

実施例２：プロセスＢを使用するアデノウイルス精製
プロセスＢを用いたアデノウイルス精製を図２に示す。さらなる詳細を以下に提供する。

細胞溶解及びＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）消化
出発材料は、少なくとも４×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度のＴ－ＲＥｘ細胞であった。溶解緩衝剤（５００ｍＭトリス、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０％（ｗ／ｖ）スクロース、１０％（ｖ／ｖ）ポリソルベート（ＰＳ）２０、ｐＨ８．０）をバイオリアクターに最終濃度１×溶解緩衝剤まで添加して、培養物中の細胞を溶解した。細胞溶解の３０分以内に、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ストック溶液を細胞培養培地と混合し、１５，０００単位／ｋｇ溶解物の最終濃度を達成するようにバイオリアクターに添加した。細胞溶解及びＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）処理を回収開始前に最低２時間継続した。

３３℃のバイオリアクター温度及び１５～７０Ｗ／ｍ^３の撹拌速度を、ｐＨ制御及び溶存酸素をオフにしながら、この単位操作の期間にわたってバイオリアクターの細胞培養段階から維持した。

清澄化
Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）処理した溶解物をバイオリアクターから回収し、深層濾過を使用して清澄化し、続いて０．２μｍ濾過を連続して行った。深層フィルタ（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｃ０ＳＰ媒体）を最初に注射用水でフラッシュし、次いで、最初の負荷の前に平衡化緩衝剤（５０ｍＭトリス、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｖ／ｖ）ＰＳ２０、ｐＨ８．０）で平衡化した。深層濾過後、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）処理した溶解物を０．２μｍ濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＳＨＣ ０．２μｍフィルタ）に負荷した。負荷後、チェイス緩衝剤（５０ｍＭトリス、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｖ／ｖ）ＰＳ ２０、ｐＨ８．０）を０．２μｍ濾過膜に添加した。生成物の収集は、生成物の希釈を減らすためにフィルタ保持体積の７５％を廃棄物に転用した後に開始し、チェイスの完了時に終了した。

バイオリアクターの撹拌速度及び重層を、ｐＨ制御及び溶存酸素をオフにしながら、この単位操作の間、溶解及びＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）消化工程から維持した。清澄化を開始する前に温度制御設定点を２０℃に下げたが、単位操作は１５～３５℃の負荷材料で行った。

陰イオン交換クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、生成物を結合し、プロセス関連不純物を除去するように設計されている。この工程には、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ陰イオン交換クロマトグラフィーシステムを使用した。陰イオン交換クロマトグラフィー膜（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ（登録商標）、８ｍｍ）を最初に３０膜体積の消毒緩衝剤（１Ｎ ＮａＯＨ又は０．５Ｎ ＮａＯＨ）で消毒し、次いで１０膜体積の活性化緩衝剤（１Ｍ ＮａＯＨ）で活性化した。

次に、負荷を開始する前に、陰イオン交換クロマトグラフィー膜を２０膜体積の平衡化緩衝剤（５０ｍＭトリス、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％（ｗ／ｖ）スクロース）で平衡化した。清澄化された溶解物を５Ｍ ＮａＣｌで調整し、次いで、５０Ｌ清澄化された溶解物／Ｌ膜で膜に負荷した。負荷後、膜を最初に１０膜体積の平衡化緩衝剤（５０ｍＭトリス、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％（ｗ／ｖ）スクロース）で洗浄し、続いて３０膜体積の洗浄緩衝剤（５０ｍＭトリス、２２２ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％（ｗ／ｖ）スクロース）、ｐＨ８．０）で洗浄した。

生成物を５膜体積の溶出緩衝剤（５０ｍＭトリス、４４４ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％（ｗ／ｖ）スクロース、ｐＨ８．０）で陰イオン交換クロマトグラフィー膜から溶出し、直ちに５膜体積のＡＥＸ希釈緩衝剤（３５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭヒスチジン／ヒスチジン－ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、７．５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．５％（ｖ／ｖ）エタノール、ｐＨ ６．６）で１：１の希釈比で希釈した。これらの体積の溶出緩衝剤及び希釈緩衝剤を使用することによって、陰イオン交換生成物の体積は、プロセスＡと比較して約５倍以上低下する。陰イオン交換生成物の体積の低下は、後続のＴＦＦ処理工程に必要な膜表面積の減少を可能にし、それによって原材料の消費を低減し、大量の廃棄物流を排除し、処理時間を短縮する。

生成物収集後、膜を活性化及び衛生化緩衝剤でフラッシュした。

接線流濾過
陰イオン交換生成物を、限外濾過膜（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ２ ＰＥＳ膜、３００ｋＤａ ＭＷＣＯ、Ｃ Ｓｃｒｅｅｎ）を使用する限外濾過によって、０．０３～０．３Ｌ／Ｌのヌクレアーゼ処理溶解物である最終体積まで濃縮した。次いで、濃縮生成物を１０透析体積の透析濾過緩衝剤（３５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭヒスチジン／ヒスチジン－ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、７．５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．５％（ｖ／ｖ）エタノール、ｐＨ６．６）で透析濾過した。透析濾過生成物を、３つのシステム保持体積の透析濾過緩衝剤でフラッシュすることによってＴＦＦシステムから回収した。

製剤
ＴＦＦ生成物を、最終ＰＳ ８０濃度０．１％（ｗ／ｖ）に達するように１０％（ｗ／ｖ）ＰＳ－８０の添加によって製剤化した。

０．２ミクロンバルク濾過
最終０．２μｍの原薬フィルタ（Ｐａｌｌ Ｓｕｐｏｒ ＥＫＶ、０．２μｍ）を製剤緩衝剤（３５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭヒスチジン／ヒスチジン－ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、７．５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１％（ｗ／ｖ）ＰＳ ８０、０．５％（ｖ／ｖ）エタノール、ｐＨ６．６）で平衡化した。次いで、製剤化されたバルクを濾過し、チェイス緩衝剤（３５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭヒスチジン／ヒスチジン－ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、７．５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１％（ｗ／ｖ）ＰＳ ８０、０．５％（ｖ／ｖ）エタノール、ｐＨ６．６）を使用して中間保持容器にチェイスした後、ＣｒｙｏＶａｕｌｔ容器又はＡｌｌｅｇｒｏバッグに２～８℃で保存した後凍結した。

最終貯蔵容器に充填された材料は、原薬と呼ばれる。

凍結
凍結工程は、－９０℃～－５５℃で長期保存する前に原薬を凍結するために使用される。長期保存範囲（－５５℃）の上端は、生成物のガラス転移温度が約－４３℃になることを回避するように設定されており、範囲（－９０℃）の下端は、冷凍庫の変動に対応するように設定されている。凍結工程は、ＣｒｙｏＶａｕｌｔ容器又はＡｌｌｅｇｒｏバッグ最終貯蔵容器のいずれかで行った。

ＣｒｙｏＶａｕｌｔ容器を、Ｆａｒｒａｒ Ｂｌａｓｔ Ｆｒｅｅｚｅｒ又はＫｌｉｎｇｅ Ｆｒｅｅｚｅｒを使用して制御された方法で凍結した。Ｆａｒｒａｒ Ｂｌａｓｔ Ｆｒｅｅｚｅｒの場合、温度を－８０℃に設定し、容器を少なくとも１４時間凍結する。Ｋｌｉｎｇｅ Ｆｒｅｅｚｅｒの場合、温度を－６５℃に設定し、容器を少なくとも２０時間凍結する。或いは、ＣｒｙｏＶａｕｌｔ容器の凍結は、少なくとも２０時間、－６５℃以下に設定された一般的な実験室用冷凍庫を使用して受動的に行うことができる。ＲｏＳＳユニットを備えたＡｌｌｅｇｒｏバッグを、－８０℃に設定したＲｏＳＳ．ｐＦＴＵ装置を使用して制御された方法で少なくとも１２時間凍結した。

１０００Ｌで実行したプロセスＢについて得られた収率を表３に示し、１０００Ｌで実行したプロセスＢについて得られた品質測定値を表４に示す。

実施例３：プロセスＡとプロセスＢの比較
表５に示すように、プロセスＢの使用は、プロセスＡと比較して約３倍の収率改善及び同等の生成物品質をもたらした。さらに、容易に理解されるように、プロセスＢは、例えば接線流濾過及びバイオバーデン除去１工程の除去のために、必要な原材料がより少ない。さらに、サイクル数がプロセス３よりもプロセス４について２倍高い場合でも、プロセス３及びプロセス４について同等の溶液体積が使用される。

実施例４：アデノウイルス精製－プロセスＢの清澄化工程
０．２μｍの濾過工程の前に、プロセスＢの清澄化工程中に２回の深層濾過トレインを利用することができる。主な方法は、Ｃ０ＳＰ媒体を有するＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深層フィルタ（「Ｃ０ＳＰフィルタ」）のみの使用であり、実施例２で上述した通りである。第２の方法は、Ｃ０ＳＰフィルタの使用に続いて、Ｘ０ＨＣ媒体を有するＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄ深層フィルタ（「Ｘ０ＨＣフィルタ」）又はＸ０ＳＰ媒体を有するＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深層フィルタ（「Ｘ０ＳＰフィルタ」）を直列に使用することである。

第２の方法について、深層フィルタを最初に注射用水でフラッシュし、次いで、最初の負荷の前に平衡化緩衝剤（５０ｍＭトリス、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｖ／ｖ）ＰＳ２０、ｐＨ８．０）で平衡化した。次いで、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）処理した溶解物を深層フィルタに負荷した。３Ｃ０ＳＰを対象とした負荷：最適な負荷分布のための１ Ｘ０ＨＣ又はＸ０ＳＰ比。負荷後、チェイス緩衝剤（５０ｍＭトリス、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｖ／ｖ）ＰＳ ２０、ｐＨ ８．０）を膜に添加した。生成物の収集は、生成物の希釈を減らすためにフィルタ保持体積の７５％を廃棄物に転用した後に開始し、チェイスの完了時に終了した。

表６に示すように、異なる濾過工程の使用は、同等の濾液力価及び同等の宿主細胞タンパク質クリアランスをもたらす。

実施例５混合モードサイズ排除クロマトグラフィー工程の追加－プロセスＢの変形
混合モードサイズ排除工程は、生成物をカラムに流しながらプロセス関連不純物を結合させるように設計される。負荷を開始する前に、混合モードサイズ排除カラムを最初に３カラム体積の平衡化緩衝剤（５０ｍＭトリス、２２２ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％（ｗ／ｖ）スクロース）、ｐＨ８．０で平衡化した。調整されたＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑプールは、４分以上の目標滞留時間で６０Ｌ以上のＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑプール／Ｌ樹脂の目標負荷量でカラムに直接負荷される。負荷後、カラムを３カラム体積の平衡化緩衝剤５０ｍＭトリス、２２２ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％（ｗ／ｖ）スクロース）、ｐＨ８．０で平衡化する。カラムを３カラム体積のストリップ緩衝剤（１Ｍ ＮａＯＨ、３０％イソプロピルアルコール）で再生する。最後に、３カラム体積の０．１Ｎ ＮａＯＨ又は２０％エタノールのいずれかで洗浄することによってカラムを保存する。混合モードサイズ排除クロマトグラフィー工程（Ｃａｐｔｏ Ｃｏｒｅ ７００）の使用により、宿主細胞タンパク質濃度が１００ｎｇ／用量超から２０ｎｇ／用量未満に減少した。混合モードサイズ排除クロマトグラフィーは、接線流濾過性能を改善し、透過流束減衰を少なくとも２９％、膜汚染を６２％減少させた。

Claims (66)

1. アデノウイルスを、少なくとも約４×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度を有する宿主細胞集団を含むアデノウイルス含有サンプル又は宿主細胞集団に由来するアデノウイルス含有サンプルから精製する方法であって：
   （ａ）前記サンプルを清澄化して清澄化されたサンプルを提供することであって、清澄化が深層濾過とそれに続く精密濾過とを含む提供すること；
   （ｂ）陰イオン交換クロマトグラフィーによって前記清澄化されたサンプルを処理して陰イオン交換生成物を得ること；及び
   （ｃ）接線流濾過（ＴＦＦ）によって前記陰イオン交換生成物を処理して、ＴＦＦ生成物を得ることであって、ＴＦＦが限外濾過及び透析濾過を含む、こと、
   を含む、方法。
2. 前記陰イオン交換生成物が、混合モードサイズ排除クロマトグラフィーによってさらなる工程で処理されて、混合モードサイズ排除生成物が得られ、前記混合モード排除生成物が、工程（ｃ）のＴＦＦによって処理される、請求項１に記載の方法。
3. 前記アデノウイルス含有サンプルが宿主細胞集団を含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記宿主細胞集団が、少なくとも約６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約８×１０^６細胞／ｍＬ又は少なくとも約１×１０^７細胞／ｍＬの細胞密度を有する、請求項２に記載の方法。
5. 工程（ａ）の前に前記宿主細胞集団を溶解して細胞溶解物を提供することを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記宿主細胞集団を細胞溶解剤で溶解することを含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記溶解剤が非イオン性界面活性剤を含み、場合により前記非イオン性界面活性剤がポリソルベート－２０である、請求項６に記載の方法。
8. 前記細胞溶解物が、少なくとも約５０，０００ｎｇ／ｍＬの濃度で宿主細胞タンパク質を含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 工程（ａ）の前又は工程（ａ）の間に、前記細胞溶解物をヌクレアーゼで処理することを含む、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記ヌクレアーゼがＤＮａｓｅ及び／又はＲＮａｓｅである、請求項９に記載の方法。
11. 前記ヌクレアーゼがＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）である、請求項９又は１０に記載の方法。
12. 前記アデノウイルス含有サンプルが細胞溶解物を含む、請求項１又は２に記載の方法。
13. 前記細胞溶解物が、少なくとも約６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約８×１０^６細胞／ｍＬ又は少なくとも約１×１０^７細胞／ｍＬの細胞密度を有する宿主細胞集団に細胞溶解剤を添加することによって得られる、請求項１２に記載の方法。
14. 前記細胞溶解剤が非イオン性界面活性剤を含み、場合により前記非イオン性界面活性剤がポリソルベート－２０である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記細胞溶解物が、少なくとも約５０，０００ｎｇ／ｍＬの濃度で宿主細胞タンパク質を含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記細胞溶解物がヌクレアーゼで処理されている、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記ヌクレアーゼがＤＮａｓｅ及び／又はＲＮａｓｅである、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ヌクレアーゼがＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）である、請求項９又は１０に記載の方法。
19. 工程（ａ）における前記深層濾過が、単一の種類の深層フィルタを使用することを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記深層フィルタが、約０．２μｍ～約２μｍの公称フィルタ定格を有し、場合により、前記深層フィルタが、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｃ０ＳＰ媒体である、請求項１９に記載の方法。
21. 工程（ａ）における前記深層濾過が、少なくとも２つの異なる深層フィルタを直列で使用することを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
22. 工程（ａ）における前記深層濾過が、約０．２μｍ及び約２μｍの公称フィルタ定格を有する深層フィルタ、並びに０μｍより大きく最大約０．１μｍの公称フィルタ定格を有する深層フィルタを使用することを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記少なくとも２つの異なる深層フィルタが：Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｃ０ＳＰ媒体；Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ポッド深層フィルタ、Ｘ０ＨＣ媒体；及びＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｘ０ＳＰ媒体から選択される、請求項２１又は２２に記載の方法。
24. 前記少なくとも２つの異なる深層フィルタが：Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｃ０ＳＰ媒体及びＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｘ０ＳＰ媒体；又は、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ Ｃ０ＳＰフィルタ及びＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄ Ｘ０ＨＣフィルタである、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記精密濾過膜が約０．２μｍの膜孔径を有する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記精密濾過膜がＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＳＨＣ ０．５／０．２μｍ濾過膜である、請求項２４又は２５に記載の方法。
27. 工程（ｂ）における前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、前記清澄化サンプルを陰イオン交換膜に適用することを含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記陰イオン交換膜が、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）又は第四級アンモニウム（Ｑ）置換基を含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記陰イオン交換膜が第四級アンモニウム（Ｑ）置換基を含む、請求項２８に記載の方法。
30. 前記陰イオン交換膜が、少なくとも約３μｍの公称孔径を有する、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記陰イオン交換膜が、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ膜である、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 工程（ｂ）が、陰イオン交換クロマトグラフィーの前に精密濾過によって前記清澄化サンプルを処理することを含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 工程（ｂ）が、精密濾過によって前記陰イオン交換生成物を処理することを含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 陰イオン交換クロマトグラフィーの前の精密濾過又は前記陰イオン交換生成物の精密濾過が、約０．２μｍの膜孔径を有する精密濾過膜を使用することを含む、請求項３２又は３３に記載の方法。
35. 前記精密濾過膜がＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＳＨＣ ０．５／０．２μｍ濾過膜である、請求項３４に記載の方法。
36. 工程（ｃ）が、工程（ｂ）からの前記生成物を深層濾過によって処理することを含み、場合により、前記深層フィルタが、最大約０．１μｍの公称フィルタ定格を有する、例えば、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｘ０ＨＣ媒体又はＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｐｏｄ深層フィルタ、Ｘ０ＳＰ媒体である、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 工程（ｃ）の前記限外濾過が、約１００ｋＤａ～１０００ｋＤａ、約２００ｋＤａ～７００ｋＤａ又は約３００ｋＤａ～５００ｋＤａの公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有する限外濾過膜を使用することを含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記限外濾過膜が３００ｋＤａのＮＭＷＣＯを有する、請求項３７に記載の方法。
39. 前記限外濾過膜が、３００ｋＤａのＮＭＷＣＯを有するＰｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）２膜である、請求項３７又は３８に記載の方法。
40. 工程（ｃ）における前記透析濾過が、透析濾過緩衝剤を用いた透析濾過を含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記透析濾過工程が、少なくとも９透析体積の透析濾過緩衝剤を使用することを含む、請求項４０に記載の方法。
42. 前記ＴＦＦ生成物が、０．５×１０^１１アデノウイルス粒子あたり２００ｎｇ以下の濃度で宿主細胞タンパク質を含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 前記ＴＦＦ生成物が、０．５×１０^１１アデノウイルス粒子あたり１０ｎｇ以下の濃度で宿主細胞ＤＮＡを含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 前記ＴＦＦ生成物が、約２．４×１０^６ｉｆｕ／ｍＬ以上の感染力を有する、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記ＴＦＦ生成物を製剤化して製剤化生成物を提供することをさらに含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記ＴＦＦ生成物又は製剤化生成物を滅菌濾過に供して原薬を提供することをさらに含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
47. 滅菌濾過が、約０．２μｍの孔径を有する滅菌フィルタを使用することを含む、請求項４６に記載の方法。
48. 前記滅菌フィルタが親水性ポリエーテルスルホン膜を含み、場合により前記滅菌フィルタがＰａｌｌ Ｓｕｐｏｒ（登録商標）ＥＫＶ、０．２μｍである、請求項４７に記載の方法。
49. 前記原薬が、０．５×１０^１１アデノウイルス粒子あたり２００ｎｇ以下の濃度で宿主細胞タンパク質を含む、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の方法。
50. 前記原薬が、０．５×１０^１１アデノウイルス粒子あたり１０ｎｇ以下の濃度で宿主細胞ＤＮＡを含む、請求項４６～４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 前記原薬が、少なくとも約０．８×１０^１１ｖｐ／ｍＬのアデノウイルス粒子濃度を有する、請求項４６～５０のいずれか一項に記載の方法。
52. 前記原薬が約２．４×１０^９ｉｆｕ／ｍＬ以上の感染力を有する、請求項４６～５１のいずれか一項に記載の方法。
53. 前記原薬がワクチンに使用するためのものである、請求項４６～５２のいずれか一項に記載の方法。
54. 前記宿主細胞集団が哺乳動物細胞を含む、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。
55. 前記哺乳動物細胞がアデノウイルス複製因子を発現する、請求項５４に記載の方法。
56. 前記宿主細胞集団がＨＥＫ細胞を含む、請求項１～５５のいずれか一項に記載の方法。
57. 前記宿主細胞集団がＴ－ＲＥｘ細胞を含む、請求項１～５６のいずれか一項に記載の方法。
58. 前記宿主細胞集団が哺乳動物細胞、例えばＴ－ＲＥｘ細胞からなる、請求項１～５７のいずれか一項に記載の方法。
59. 前記アデノウイルスが複製欠損アデノウイルスである、請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法。
60. 前記アデノウイルスがサルアデノウイルスである、請求項１～５９のいずれか一項に記載の方法。
61. 前記サルアデノウイルスが複製欠損サルアデノウイルスである、請求項６０に記載の方法。
62. 前記複製欠損サルアデノウイルスがＣｈＡｄＯｘ１、ＣｈＡｄＯｘ２、ＣｈＡｄＯｘ３又はＣｈＡｄ６３であり、好ましくは前記複製欠損サルアデノウイルスがＣｈＡｄＯｘ１である、請求項６１に記載の方法。
63. 前記アデノウイルスがヒトアデノウイルスではない、請求項１～６２のいずれか一項に記載の方法。
64. 前記アデノウイルスがｎＣｏｖ－１９スパイクタンパク質をコードする、請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法。
65. 請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、又は得られた精製アデノウイルス。
66. 請求項４６～５３、又は請求項４６～５３のいずれか一項に従属する場合、請求項５４～６４のいずれか一項に記載の方法によって得られるか又は得られた原薬。

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