CN103923883A

CN103923883A - 一种流感病毒的浓缩、纯化方法

Info

Publication number: CN103923883A
Application number: CN201310015169.XA
Authority: CN
Inventors: 周荔葆; 殷建文; 焦龙; 吴栩涛; 甄祖刚; 赵新
Original assignee: LIAONING CHENGDA BIOLOGY CO Ltd
Current assignee: LIAONING CHENGDA BIOLOGY CO Ltd
Priority date: 2013-01-16
Filing date: 2013-01-16
Publication date: 2014-07-16

Abstract

本发明涉及一种流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于：（1）应用0.8～0.65um的滤芯进行澄清；（2）750KD的中空纤维超滤浓缩；（3）Sepharose4FF层析纯化技术进行纯化。本发明采用0.65um的膜对流感病毒液进行澄清，采用中空纤维750k超滤膜进行浓缩，分子筛层析技术进行纯化彻底解决了目标蛋白纯度低，杂蛋白高、DNA残留量高、抗原回收率低的问题。对于提供疫苗质量，降低副反应提供了很好的技术手段，有利于生产出高品质、安全性好的高质量疫苗。

Description

一种流感病毒的浓缩、纯化方法

技术领域

本发明涉及一种病毒的纯化方法，特别是涉及一种流感病毒的浓缩、纯化方法，属于生物技术领域。

背景技术

对于流感病毒的浓缩方法比较常用的有红细胞吸附释放法、膜包法、中空纤维法。红细胞吸附释放法是浓缩和纯化流感病毒的方法中比较简便、快速而又不造成病毒颗粒蛋白结构改变的一种方法,但它易受毒株种类的影响。病毒超滤浓缩通常使用 100-300k膜包，膜包筛网剪切力易造成病毒颗粒聚集和表面蛋白的脱落，从而影响病毒活性收率，因此对操作要求极高；此外，膜包筛网剪切力还容易加速杂蛋白的聚集（如牛血清白蛋白，卵清蛋白等），而100-300k较小的膜包孔径不利于浓缩过程中杂蛋白透过，因此浓缩液杂蛋白含量在浓缩过程中不断增加，蛋白凝胶层显著影响浓缩处理速度，较高的黏度也不利于后期分离纯化和填料寿命。中空纤维750k超滤膜采用先进的膜加工制造工艺，具有均一的孔径分布，有效截留病毒的同时避免病毒在膜上的沉积，速度快、收率高，同时较大的孔径使得DNA和杂蛋白等杂质透过而加以去除，降低浓缩后的料液黏度，提高产品质量。

目前，国内外大部分生产流感疫苗的企业主要是采用鸡胚作为流感病毒增殖基质进行流感疫苗生产，这种生产方式有很大的局限性：均存在对SPF鸡胚的依赖性，质量难于控制；方法难于标准化。

常用于疫苗生产的病毒纯化方法有蔗糖密度梯度离心法和凝胶层析法,这两种方法在杂蛋白去除率、抗原回收率等方面均可取得较好的效果。对于纯化产物而言，层析法的纯度、及杂蛋白去除率略高于蔗糖密度梯度离心法,而蔗糖密度梯度离心法的病毒回收率优于层析法。鉴于各地药审部门近年要求提高疫苗的安全性, 以降低副作用, 纷纷强制改进病毒疫苗的生产和纯化方法。流感病毒疫苗的生产正开始用VERO 细胞取代鸡胚培养。纯化方法已放弃蔗糖密度梯度离心这类传统方法，而走向自动化程度更高、更易于在位清洗的超滤和分子筛层析技术。

2007年世界首个细胞流感疫苗 Optaflu(诺华)经欧盟批准已经成功上市，除了诺华以外，Baxter的Celvapan是另外一个被欧盟批准采用细胞培养制备的流感疫苗，该公司用Vero细胞非洲绿猴的肾上皮细胞模拟制备流感疫苗，取得成功。细胞类流感疫苗在浓缩、纯化等方面采用了自动化程度更高、更易于在位清洗的超滤和分子筛层析技术。

美国默克公司将中空纤维过滤膜用于多种疫苗的生产，如使用300k中空纤维膜进行重组酵母乙肝疫苗的浓缩和洗滤，使用0.65μm 中空纤维膜澄清酵母裂解液，生产HPV疫苗等。 Bernd Kalbfuss 等人将750k中空纤维膜用于MDCK细胞流感病毒培养液的浓缩，发现中空纤维750k超滤膜可以有效去除宿主DNA等杂质。C. Peixoto 等使用中空纤维750k超滤膜浓缩轮状病毒的昆虫细胞培养液，优化后的浓缩收率达86%，浓缩的同时去除97%的DNA。最终得到高纯度的轮状病毒VLP类病毒颗粒, 工艺总收率37%。

分子筛层析或凝胶过滤，具有分子筛的作用，可以分级分离各种抗原与抗体，去掉复合物中的小分子物质。凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术存在的上述问题，给出新的一种流感病毒的浓缩、纯化方法。本发明采用层析技术纯化流感病毒，分子筛层析介质为 Sepharose-4FF。Sepharose-4FF是由4%高度交联琼脂糖（成球后）制备而成。琼脂糖本身有少量硫酸根和羧基，可能导致在低离子强度的情况下碱性蛋白的吸附。具有清洗、消毒方便、分辨率高、介质稳定、可重复使用、易保存等优点。

鉴于流感病毒属于正粘病毒科，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，流感病毒呈球形，新分离的毒株则多呈丝状，其直径在80至120纳米之间，丝状流感病毒的长度可达400纳米。应用Sepharose-4FF介质纯化可以更有效的完成目标蛋白和杂蛋白的分离，提高抗原纯度和抗原回收率，并能很好的去除杂蛋白和Vero细胞残留DNA 、宿主蛋白，达到一个很好的分离效果。

本发明给出的技术方案是：这种流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于有以下步骤。

（1）应用0.8～0.65um的滤芯进行澄清。

（2）750KD的中空纤维超滤浓缩。

（3）Sepharose 4FF层析纯化技术进行纯化。

所述步骤（1）应用0.8～0.65um的滤芯进行澄清，采取如下措施：应用0.8－0.65um的滤芯进行澄清，首先用L-15液体平衡滤芯，之后对病毒液进行澄清。

所述步骤（2）应用750KD的中空纤维超滤浓缩，采取如下措施：应用0.5N NaOH对750KD的中空纤维超滤浓缩设备进行在线消毒清洗，用L-15液体平衡设备。浓缩20～30倍数，之后用L－15冲洗设备。定容到预定体积。超滤浓缩结束后，应用0.5N NaOH对超滤设备进行在线清洗，清洗后应用0.1N NaOH保存。

所述步骤（3）应用Sepharose 4FF层析纯化技术进行纯化，采取如下措施：应用0.5N NaOH液在线清洗纯化系统，纯化应用Sepharose 4FF 基质。应用0.01N PBS缓存液平衡，上样体积为层析柱凝胶体积的5％。收取第一峰。

上述技术方案中提及的L－15是指：Leibovitz L-15培养基，是为无CO₂缓冲条件下细胞培养而设计。配方中加有碳酸氢钠缓冲体系。L-15培养基的缓冲体系由盐、自由基氨基酸以及半乳糖构成，因此可以用于无CO₂条件下的细胞培养及病毒培养。采用L-15液平衡滤芯、冲洗设备主要作用是润湿滤芯，并且使滤芯里面的液体和病毒培养收获的液体尽可能保持一致，并利用L-15液中的缓冲盐体系达到平衡及保护病毒抗原的作用。

与蔗糖密度梯度离心法相比，本发明的有益效果是：本发明采用层析技术纯化流感病毒，分子筛层析介质为 Sepharose-4FF，该介质是由4%高度交联琼脂糖（成球后）制备而成，琼脂糖是由D-半乳糖和3，6位脱水的L-半乳糖连接构成的多糖链，在温度100℃时呈液态，当下降至45℃以下时，它们之间相互连接成线性双链单环的琼脂糖；再凝聚即呈琼脂糖凝胶。与1，3-二溴异丙醇在强碱条件下反应，即生成CL型交联琼脂糖，其热稳定性和化学稳定性均有所提高，可在广泛pH值溶液(pH3～14)中使用。该介质在重新组装和填充层析柱前对其灭菌，121℃ 高压灭菌20min。填充层析柱后在线消毒灭菌。停用后若需要长期保存，4~25℃，勿冷冻。使用后若需要短期保存，4~8℃ pH值6~8 加入抑菌剂（如：20%乙醇，0.04%叠氮化钠）。可重复使用。该凝胶介质具有清洗、消毒方便、分辨率高、介质稳定、可重复使用、易保存等优点。

具体实施方式

实施例1 。

应用0.8－0.65um的滤芯进行澄清，首先用L-15液体平衡滤芯，之后对病毒液进行澄清，病毒液澄清后要用L-15液体进行冲洗，冲洗滤芯上的抗原残留。

实施例2。

首先对750KD的中空纤维超滤浓缩设备进行在线消毒清洗，应用的液体为0.5N NaOH。在线清洗后用无菌注射用水冲洗设备，用L-15液体平衡设备，平衡后对澄清液进行浓缩，浓缩20～30倍，用L－15冲洗设备。超滤浓缩结束后，应用0.5N NaOH对超滤设备进行在线清洗，清洗后应用0.1N NaOH保存。

实施例3。

应用0.5N NaOH液在线清洗纯化系统，纯化应用Sepharose 4FF 基质。清洗体积为层析柱的1个体积。应用0.01N PBS缓存液平衡，平衡体积为层析柱的一个体积。上样品，上样体积为层析柱凝胶体积的5％。在规定的压力下应用0.01N PBS缓存液进行凝胶层析，收取第一峰，为抗原峰，以后各峰为杂蛋白峰。收取第一峰后，更换液体，应用0.5N NaOH液在线清洗纯化系统，清洗体积为层析柱的1个体积。在线清洗后应用0.01N PBS缓存液平衡，平衡体积为层析柱的一个体积。平衡后用20％乙醇溶液保存层析凝胶。纯化后样品的抗原回收率能达到80％以上，杂蛋白去除率能达到98％以上。以下为相关试验数据。

通过以上相关数据表明Sepharose 4FF凝胶介质分辨率好，完全可以将病毒抗原与杂蛋白分开，在重复使用的情况下杂蛋白去除率和抗原回收率均能达到一个很好的效果。

Claims

1.一种流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于有以下步骤：

（1）应用0.8～0.65um的滤芯进行澄清；

（2）750KD的中空纤维超滤浓缩；

（3）Sepharose 4FF层析纯化技术进行纯化。

2.根据权利要求1所述的流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于：步骤（1）应用0.8～0.65um的滤芯进行澄清是指：首先用L-15液体平衡滤芯，之后对病毒液进行澄清。

3.根据权利要求1所述的流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于：步骤（2）750KD的中空纤维超滤浓缩是指：应用0.5N NaOH对750KD的中空纤维超滤浓缩设备进行在线消毒清洗，用L-15液体平衡设备，浓缩20～30倍数，之后用L－15冲洗设备,定容到预订体积，超滤浓缩结束后，应用0.5N NaOH对超滤设备进行在线清洗，清洗后应用0.1N NaOH保存。

4.根据权利要求1所述的流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于：步骤（3）Sepharose 4FF层析纯化技术进行纯化是指：应用0.5N NaOH液在线清洗纯化系统，纯化应用Sepharose 4FF 基质，，应用0.01N PBS缓存液平衡，上样体积为层析柱凝胶体积的5％，收取第一峰。