CN117777277A - 一种犬细小与犬冠状病毒二联卵黄抗体的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种犬细小与犬冠状病毒的二联卵黄抗体的制备方法及其应用。首先利用犬细小颗粒病毒抗原以及犬冠状病毒抗原免疫蛋鸡，而后，从卵黄液中提取抗体原液，经纯化浓缩，制备得到所述犬细小与犬冠状病毒的二联卵黄抗体。该制备方法得到的犬细小、冠状病毒的二联卵黄抗体中犬细小病毒的中和抗体效价结果为1:8192，犬冠状病毒中和抗体效价为1:2048，保护率可达到80％以上。综上，本发明的方法，产量大、保护率高，提取方便、化学性质稳定、副反应小、制备成本低、满足动物福利要求等优点，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及兽药技术领域，尤其涉及一种犬细小与犬冠状病毒的二联卵黄抗体的制备方法及其应用。
背景技术
犬细小病毒性肠炎(Canine parvovirl us enteritis)以及犬冠状病毒(CanineCoronavirus,CCV)感染是危害我国犬业和宠物业的重要疫病。其中，犬细小病毒性肠炎是由犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的在犬科动物中广泛传播和流行的一种高度接触性传染病，患病犬主要表现为剧烈呕吐、腹泻、出血性肠炎和非化脓农性心肌炎。犬冠状病毒为单股正链RNA病毒，使犬发生程度不同的胃肠炎症状，特征有频繁呕吐、腹泻、沉郁、厌食等症状。本病一年四季均可发生，以冬季多发，病犬是主要的传染原，犬可通过呼吸道、消化道、粪便及污染物传染。
在宠物临床医学中，主要采用疫苗预防犬细小、犬冠状病毒病，而注射疫苗为主动免疫，需要刺激机体产生抗体才能起到保护作用，所需时间较长。对于未免疫群居犬发生疾病，通过注射疫苗产生抗体已来不及对犬提供有效的保护，此时只能采用被动免疫对未患病犬提供紧急保护。被动免疫可采用抗血清和单克隆抗体，但此类产品制备成本高，来源有限，无法满足临床的使用。因此，卵黄抗体通过免疫接种产蛋母鸡，即可由其生产的蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗，具有较为明显的优势。
例如，CN112079916A中研究了一种犬细小病毒卵黄抗体及其制备方法，该发明中基于一株致病性较强、具有良好免疫性能的强度毒株CPV-HuN1703株制备得到卵黄抗体，该卵黄抗体中和效价高，对于犬细小病毒病具有良好的防治作用，优于其他分离毒株所制备得到的卵黄抗体。卵黄抗体对动物没有毒副作用，用卵黄抗体治疗动物疾病不但避免了血清价格昂贵、产量低的缺点，而且可以避免血清在治疗过程中引起的副作用。
然而，在犬发病的过程中，犬细小病毒病与冠状病毒常混合感染，且混合感染很难控制，死亡率最高，严重威胁犬的健康。目前尚无可用的、适用于犬细小、冠状病毒病二联卵黄抗体类产品，因此，本领域亟需开发一种可用的犬细小与犬冠状病毒二联卵黄抗体。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种犬细小、冠状病毒病二联卵黄抗体及其制备方法，该抗体具有产量大、提取方便、化学性质稳定、副反应小、制备成本低、满足动物福利要求等优点，具有广泛的应用前景。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种犬细小、冠状病毒二联卵黄抗体的制备方法，利用犬细小颗粒病毒抗原以及犬冠状病毒抗原免疫蛋鸡，而后，从卵黄液中提取抗体原液，经纯化浓缩，制备得到所述犬细小与犬冠状病毒的二联卵黄抗体。
作为本发明优选的技术方案，所述犬细小颗粒病毒抗原利用重组杆状病毒CPV-2b-VP2株制备得到。
优选地，所述犬冠状病毒抗原利用犬冠状病毒CCV2015株制备得到，其中，犬冠状病毒CCV2015株的M基因序列包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.1：
TCCAGATATGTAATGTTCGGCTTTAGTGTTGCAGGTGCAATTGTTACATTTATACTTTGGATTATGTATTTTATTAGATCCATTCAGTTATACAGAAGGACTAAGCTTGGTGGTCTTTCAACCCTGAAACTAACGCAATTCTTTGCGTTAGTCATTAGGAAGAAGCTACGTGCTTCCTCTTGAAGGTGTGCCAACTGGTGTCACTCTAACATTGCTCTCAGGGAATTTGTATGCTGAAGGGTTCAAAATTGCAGGTGGTATGAACATCGACAATTTACCAAAATACGTAATGGTTGCATTACCTAGCAGGACCATTGTCTACACACTTGTTGGCAAGAAATTGAAAGCAAGTAGTGCGACAGGATGGGCTTACTATGTAAAATCTAAAGCTGGTGATTACTCAACAGA。
作为本发明优选的技术方案，所述制备方法包括以下步骤：
(1)采用犬细小颗粒病毒CPV-2b-VP2株以及犬冠状病毒CCV2015株制备得到犬细小颗粒病毒抗原和犬冠状病毒抗原；
(2)利用步骤(1)所述犬细小颗粒病毒抗原和犬冠状病毒抗原免疫蛋鸡，得到免疫鸡蛋；
(3)从步骤(2)所述的免疫鸡蛋中收集卵黄液后，提取抗体原液，经纯化浓缩，制备得到犬细小与犬冠状病毒二联卵黄抗体。
作为本发明优选的技术方案，所述制备方法还包括HI抗原效价测定与抗原含量测定。
作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述制备犬细小颗粒病毒抗原的方法包括如下步骤：
将序列为SEQ ID NO.2的VP2序列优化后，克隆到载体上获得重组载体，以两对引物扩增后获得片段1和片段2；而后分别将所述片段1和片段2连接到载体上，获得重组转移载体；利用所述重组转移载体转染Sf9细胞，获得的细胞感染物即为重组杆状病毒CPV-2b-VP2株；
经浓缩、灭活后得到犬细小颗粒病毒CPV-2b-VP2株疫苗原液；将所述疫苗原液与白油佐剂混合均匀，得到所述犬细小颗粒病毒抗原。
具体地，所述制备犬细小颗粒病毒抗原的方法如下步骤：
(1)将序列为SEQ ID NO.2的VP2序列进行优化，将优化后的VP2序列(SEQ IDNO.3)克隆到载体pUC57上获得重组载体；
(2)以步骤(1)获得重组载体为模板，利用VP2-P10F(SEQ ID NO.4)和VP2-P10R(SEQ ID NO.5)进行PCR扩增，获得片段1；
(3)以步骤(1)获得重组载体为模板，利用VP2-PHF(SEQ ID NO.6)和VP2-PHR(SEQID NO.7)进行PCR扩增，获得片段2；
(3)将片段1和片段2分别连接到pFastBacDual载体上，获得重组转移载体；
(4)重组转移载体转染Sf9细胞，细胞数量达到6.0×106～8.0×106个/ml时，按MOI为0.1～1.0接种生产用重组杆状病毒CPV-2b-VP2毒株，在27℃、100～110r/min、DO50％的条件下继续培养，接毒后96～120小时收获重组犬细小病毒CPV-2b-VP2株的细胞培养物为犬细小病毒VP2蛋白原液；
(5)将犬细小病毒CPV-2b-VP2株疫苗原液加入50％的白油佐剂在无菌环境中搅拌混合均匀，即制得所述犬细小颗粒病毒抗原。
作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述制备犬冠状病毒抗原的方法包括如下步骤：
利用病犬粪便样品制备得到病毒液，浓缩、灭活后得到犬冠状病毒CCV2015株疫苗原液株疫苗原液；将所述疫苗原液与白油佐剂混合均匀，得到所述犬冠状病毒抗原。
进一步地，制备犬冠状病毒抗原可采用如下制备方法：
(1)按照常规方法培养猫肾传代细胞，长成良好单层细胞时，取病犬粪便样品加入MEM细胞培养液混匀研磨，离心取上清后，每10ml病毒提取液加入1ml氯仿，4℃过夜，离心取上清，得到分离病毒用的接种物；
(2)将处理好的样品按照培养液体积1/9同步接种于刚分化的猫肾传代细胞，37℃静置培养4～5天，收获细胞培养物反复冻融3次后取上清，收获病毒液；
(3)制备得到的病毒液经浓缩后，加入终浓度为1:4000的β-丙内酯2～8℃灭活48小时，37℃水解2小时得到犬冠状病毒CCV2015株疫苗原液；
(4)将犬冠状病毒CCV2015株疫苗原液加入50％的白油佐剂在无菌环境中搅拌混合均匀，即制得所述犬冠状病毒抗原。
(5)鉴定：犬冠状病毒：参照病毒RNA提取试剂盒说明书提取病毒RNA并进行反转录，PCR反应体系总体积50μl；反应条件95℃预变性10min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存，目的片段约为408bp，产物经1％琼脂糖凝胶电泳，PCR产物送库美生物科技有限公司完成测序，应用GenBanks分子生物学软件进行比对分析。
犬冠状病毒CCV2015毒株扩增序列408bp的基因核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，与GenBanks发表的CCV M基因序列基本一致。
作为本发明优选的技术方案，完成步骤(1)所述抗原的制备后，还包括检测犬细小病毒HA抗体效价和犬冠状病毒抗原含量的操作。
进一步地，所述HA抗体效价测定可采用如下步骤：
(1)取猪红细胞于阿氏液中保存，用PBS(0.015mol/L，pH6.5)洗涤红细胞三次，最后将红细胞用PBS配成1％悬液，再加入0.5％兔血清；
(2)在V形板的每孔加入灭菌的PBS25μl；用微量移液器取待测样品25μl加入第1孔内，混匀后，吸取25μl后加入到第二孔中，如此连续稀释至第23孔，第23孔吸取25μl液体弃掉；第24孔为PBS对照，阴性细胞培养物按相同方法稀释；
(3)每孔补加25μl PBS和50μl 1％猪红细胞悬液，混匀后，4℃下反应60分钟，待对照的红细胞完全沉积后观察结果。
进一步地，所述抗原含量测定可采用如下步骤：
用MEM维持液将毒种作10倍系列稀释，取10-4～10-9共6个稀释度,分别接种96孔细胞培养板，每个稀释度接种6孔，每孔100μl，同时设细胞阴性对照孔6孔，每孔接种MEM维持液100μl，向所有孔中加入F81细胞悬液100μl，37℃、5％CO2培养48小时，弃细胞上清，每孔加入80％冷丙酮100μl，2～8℃固定30分钟，弃丙酮液，PBST洗涤3次，每孔加入犬冠状荧光抗体50μl进行染色，37℃孵育1小时后弃荧光抗体，PBST洗涤3次，荧光显微镜下观察，记录出现特异性荧光细胞孔数，按Reed-Muench法计算TCID50。
进一步地，犬细小颗粒病毒CPV-2b-VP2株病毒的HA抗原效价为1:8192～1:16384。
进一步地，犬冠状病毒CCV2015株病毒含量为(105.0-105.8)TCID50/0.1ml。
作为本发明优选的技术方案，所述免疫蛋鸡并收集抗体原液的方法是：
犬细小病毒抗原、犬冠状病毒抗原按1:1混合，免疫接种90～110日龄产蛋母鸡，经四次免疫后收集鸡蛋；
测定鸡蛋卵黄液中犬细小病毒以及犬冠状病毒特异抗体效价，收集抗体效价为1:256以上的卵黄液；
用乙酸-乙酸钠溶液稀释所述卵黄液后，沉淀取上清，加入固体硫酸铵纯化，调节pH后，浓缩纯化得到卵黄抗体。
进一步地，所述免疫蛋鸡并收集抗体原液的方法可采用如下步骤：
(1)采用犬细小病毒抗原、犬冠状病毒抗原按1:1混合，免疫接种90～110日龄产蛋母鸡，首次免疫剂量为1ml/只；
(2)首次免疫后2周、4周、6周进行第二次免疫、第三次免疫、第四次免疫，免疫剂量分别为1.5ml/只、2ml/只、2ml/只；
(3)第四次免疫后第14天开始收集鸡蛋，测定鸡蛋卵黄液中犬细小病毒以及犬冠状病毒特异抗体效价；
(4)收集抗体效价为1:256以上的卵黄原液，用于犬细小、冠状病毒二联特异抗体卵黄抗体的制备；
(5)卵黄原液用乙酸-乙酸钠溶液(0.05mol/L，pH 5.0)稀释10倍，沉淀12小时后取上清；
(6)加固体硫酸铵饱和度达到33％，对其进行3次纯化；
(7)用1mol/L氢氧化钠调pH至6.9～7.1，经0.45μm滤芯过滤后，最后使用30KD膜包超滤浓缩除盐4次，获得抗体原液，即为纯化的卵黄抗体。
第三方面，本发明还提供一种犬细小病毒、犬冠状病毒二联卵黄抗体，采用第二方面所述的制备方法制备得到。
第四方面，如第三方面所述的犬细小病毒、犬冠状病毒二联卵黄抗体在制备用于治疗犬细小病毒、犬冠状病毒感染导致的疾病的药物中的应用。
第五方面，一种药物组合物，包含如第三方面所述的犬细小病毒、犬冠状病毒二联卵黄抗体和药学上可接受的载体。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种犬细小与犬冠状病毒的二联卵黄抗体的制备方法及其应用，首先通过制备犬细小颗粒病毒抗原以及犬冠状病毒抗原，犬细小颗粒病毒(CPV-2b-VP2)HI抗原效价结果为1:16384，犬冠状病毒CCV2015株抗原含量为105.0TCID50/0.1ml；
而后，免疫蛋鸡，而后从免疫鸡蛋中制备抗体原液，犬细小、冠状病毒二联特异抗体卵黄抗体的犬细小病毒HI抗体效价为1:8192，犬冠状病毒中和抗体效价为1:2048，保护率可达到80％以上。综上，本发明的方法，产量大、保护率高，提取方便、化学性质稳定、副反应小、制备成本低、满足动物福利要求等优点，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为犬冠状病毒CCV2015毒株核酸电泳图，其中，M：DL2000 Marker；1：ddH2O；2：犬冠状病毒CCV2015毒株。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
实施例1制备犬细小、犬冠状病毒抗原
制备犬细小颗粒病毒抗原，具体步骤如下：
(1)以犬细小病毒CPV SD15株(参考文献：犬细小病毒CPV SD15株记载在赵健,姜旭,倪婷婷,等.犬细小病毒人工感染模型的建立[J].中国兽医学报,2020,40(5):4)VP2序列(SEQ ID NO.2)为基础，在不改变氨基酸序列的前提下，根据Sf9昆虫细胞密码子偏爱性对CPV-SD15 VP2原始基因进行优化；
(2)将优化后的序列CPV 2b VP2 opti(SEQ ID NO.3)合成到载体pUC57上，命名为pUC CPV 2b VP2 opti。
(3)以合成的pUC CPV 2b VP2 opti质粒为模板，通过VP2 P10F(SEQ ID NO.4)引物和VP2 P10R(SEQ ID NO.5)引物，进行PCR扩增获得PCR产物即片段1；
(4)以合成的pUC CPV 2b VP2 opti质粒为模板，通过VP2 PHF(SEQ ID NO.6)引物和VP2 PHR(SEQ ID NO.7)引物，进行PCR扩增获得PCR产物即片段2。
(5)反应体系为50μl，组成为：5×HF缓冲液10μl，2.5mmol/L dNTP 4μl，上游引物(20μmol/L)1.25μl，下游引物(20μmol/L)1.25μl，模板1μl，高保真DNA聚合酶(2U/μl)0.5μl，补加ddH2O至50μl。反应程序为：98℃预变性30秒，98℃变性7秒，55℃复性30秒，72℃延伸1分30秒，35个循环，最后72℃延伸10分钟，扩增产物使用1.0％凝胶进行电泳分析。
(6)通过上述方法确认得到片段1与片段2之后进行测序，将片段1和片段2分别连接到pFastBacDual载体上，获得重组转移载体。
(7)重组转移载体转染Sf9细胞，细胞数量达到6.0×106～8.0×106个/ml时，按MOI为0.1～1.0接种生产用重组杆状病毒CPV-2b-VP2毒株，在27℃、100～110r/min、DO50％的条件下继续培养，接毒后96小时收获重组犬细小病毒CPV-2b-VP2株的细胞培养物为犬细小病毒VP2蛋白原液；
(8)将犬细小病毒CPV-2b-VP2株疫苗原液加入50％的白油佐剂在无菌环境中搅拌混合均匀，即制得所述犬细小颗粒病毒抗原。
制备犬冠状病毒抗原，具体步骤如下：
(1)按照常规方法培养猫肾传代细胞F81，长成良好单层细胞时，取病犬粪便样品加入10倍MEM细胞培养液混匀研磨，5000转离心10分钟取上清，每10ml病毒提取液加入1ml氯仿，4℃过夜，3000转离心15分钟，取上清为分离病毒用的接种物；
(2)将处理好的样品按照MOI＝0.1接种于F81单层细胞，加细胞维持液，35℃、5％CO2静置培养84小时；收获细胞培养物反复冻融3次后取上清，收获病毒液；
(3)制备得到的病毒液经浓缩后，加入终浓度为1:4000的β-丙内酯4℃灭活48小时，37℃水解2小时得到犬冠状病毒CCV2015株疫苗原液；
(4)将犬冠状病毒CCV2015株疫苗原液加入50％的白油佐剂在无菌环境中搅拌混合均匀，即制得所述犬冠状病毒抗原。
实施例2抗原检测
1、HA抗体效价测定：
(1)取猪红细胞于阿氏液中保存，用PBS(0.015mol/L，pH6.5)洗涤红细胞三次，最后将红细胞用PBS配成1％悬液，再加入0.5％兔血清；
(2)在V形板的每孔加入灭菌的PBS25μl；用微量移液器取待测样品25μl加入第1孔内，混匀后，吸取25μl后加入到第二孔中，如此连续稀释至第23孔，第23孔吸取25μl液体弃掉；第24孔为PBS对照，阴性细胞培养物按相同方法稀释；
(3)每孔补加25μl PBS和50μl 1％猪红细胞悬液，混匀后，4℃下反应60分钟，待对照的红细胞完全沉积后观察结果。
结果显示，收获的重组杆状病毒细胞培养物血凝效价可达：1:216，将收获的细胞用NaHCO3处理后离心，收获的上清血凝效价可达到1:214(1:16384)。而哺乳动物细胞培养获得的抗原HA效价为1:210，表明制备的重组细小颗粒病毒CPV-2b-VP2病毒样颗粒，保持了凝集猪红血球的血凝特性，并且表达量远大于哺乳动物细胞培养收获的抗原量。
2、抗原含量测定
用MEM维持液将毒种作10倍系列稀释，取10-4～10-9共6个稀释度，分别接种96孔细胞培养板，每个稀释度接种6孔，每孔100μl，同时设细胞阴性对照孔6孔，每孔接种MEM维持液100μl,向所有孔中加入F81细胞悬液100μl，37℃、5％CO2培养48小时，弃细胞上清；
每孔加入80％冷丙酮100μl，2～8℃固定30分钟，弃丙酮液，PBST洗涤3次，每孔加入犬细小荧光抗体50μl进行染色，37℃孵育1小时弃荧光抗体，PBST洗涤3次，荧光显微镜下观察，记录出现特异性荧光细胞孔数，按Reed-Muench法计算TCID50。
依照上述方法检测得到，犬冠状病毒CCV2015株抗原含量为105.0TCID50/0.1ml。
3、分子生物学鉴定
(1)犬细小颗粒病毒的鉴定：以犬细小病毒CPV SD15株为基础，在此基础上构建得到的重组犬细小病毒CPV-2b-VP2株，在制备阶段已进行了片段测序，确认为重组犬细小病毒。
(2)犬冠状病毒CCV2015毒株的鉴定：
参照病毒RNA提取试剂盒说明书提取病毒RNA并进行反转录。
PCR反应体系总体积50μl；反应条件95℃预变性10min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。目的片段约为408bp，产物经1％琼脂糖凝胶电泳(如图1所示)，PCR产物送库美生物科技有限公司完成测序，应用GenBanks分子生物学软件进行比对分析。
犬冠状病毒CCV2015毒株扩增序列408bp的基因核苷酸序列，与GenBanks发表的CCV M基因序列(如：犬冠状病毒M1毒株，AY704916.1；冠状病毒M2毒株，AY704917.1；犬冠状病毒M3毒株，KP981644.1；犬冠状病毒M4毒株，LC190907.1)基本一致。
实施例3免疫蛋鸡
(1)采用犬细小病毒抗原、犬冠状病毒抗原按1:1混合，免疫接种6只90～110日龄产蛋母鸡，并设置对照组2只(注射用水)；
(2)首次免疫剂量为1ml/只；首次免疫后2周、4周、6周进行第二次免疫、第三次免疫、第四次免疫，免疫剂量分别为1.5ml/只、2ml/只、2ml/只，肌肉注射。
免疫程序见表1。
表1
(3)第四次免疫后，第14天开始收集鸡蛋，测定鸡蛋卵黄液中犬细小病毒以及犬冠状病毒特异抗体效价，收集抗体效价为1:256以上的卵黄液，用于犬细小、冠状病毒二联特异抗体卵黄抗体的制备。
(4)卵黄原液用乙酸-乙酸钠溶液(0.05mol/L，pH 5.0)稀释10倍，沉淀12小时后取上清，加固体硫酸铵饱和度达到33％，对其进行3次纯化，用1mol/L氢氧化钠调pH至7.0，经0.45μm滤芯过滤后，最后使用30KD膜包超滤浓缩除盐4次。获得抗体原液，即为纯化的卵黄抗体。
实施例4检测抗体效价
1、犬细小病毒的中和抗体效价
取猪红细胞于阿氏液中保存，用PBS(0.015mol/L，pH6.5)洗涤红细胞三次，最后将红细胞用PBS配成1％悬液。在V形板的每孔加入25μl灭菌的PBS(0.015mol/L，pH值6.5)。
用微量移液器取犬细小、冠状病毒二联特异抗体卵黄抗体25μl加入第1孔内，混匀后，取25μl后加入到第二孔中，如此连续稀释至第11孔，第11孔吸取25μl液体弃掉；
第12孔为PBS对照，阴性细胞培养物按相同方法稀释。每孔补加25μlPBS和25μl1％猪红细胞悬液，混匀后，4℃下反应60分钟，待对照的红细胞完全沉积后观察结果，结果为犬细小病毒中和抗体效价为1:8192。
2、检测犬冠状病毒的中和抗体效价
将犬细小、冠状病毒二联特异抗体卵黄抗体在96孔板中做2倍系列稀释，每个稀释度做4孔重复，稀释后每孔加入100个TCID50白病毒稀释液0.05ml，置37℃5％CO2恒温培养箱中作用1小时；
每孔再加入0.1ml F81细胞悬液(细胞浓度2×105～3×105个/ml)，轻轻混匀后放入37℃5％CO2恒温培养箱中，4日后判定结果，结果为犬冠状病毒中和抗体效价为1:2048。
实施例5预防效果评价
取2～6月龄健康易感中华田园犬10只(犬细小及犬冠状抗体效价不高于1:8)，随机分为卵黄抗体组和发病对照组，每组5只。
卵黄抗体组分点颈背部皮下注射犬细小、冠状病毒二联特异抗体卵黄抗体，剂量为2.0ml/kg，每点最大接种量不超过2.0ml；
发病对照组分点颈背部皮下注射0.9％氯化钠注射液，剂量为2.0ml/kg，每点最大接种量不超过2.00ml。
注射后72小时(3日)，每只试验犬通过口服接种犬细小颗粒病毒(CPV-2b-VP2株)、犬冠状病毒(CCV2015株)，1.5ml/只，攻毒后隔离饲养。
攻毒后连续14日肛拭子检测犬冠状及犬细小病毒，确认是否发病(表2)。
表2攻毒后发病情况
当发病对照组发病率不低于80％，卵黄抗体组保护率不低于80％时，可判定紧急预防有效。结果：发病对照组发病率100％，卵黄抗体组保护率80％。由此可见，犬细小、冠状病毒二联特异抗体卵黄抗体具有良好的紧急预防免疫效力。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种犬细小与犬冠状病毒的二联卵黄抗体的制备方法，其特征在于，利用犬细小颗粒病毒抗原以及犬冠状病毒抗原免疫蛋鸡；而后，从卵黄液中提取抗体原液，经纯化浓缩，制备得到所述犬细小与犬冠状病毒的二联卵黄抗体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述犬细小颗粒病毒抗原利用重组杆状病毒CPV-2b-VP2株制备得到；
所述犬冠状病毒抗原利用犬冠状病毒CCV2015株制备得到，其中，犬冠状病毒CCV2015株的M基因序列包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)采用犬细小颗粒病毒CPV-2b-VP2株以及犬冠状病毒CCV2015株制备得到犬细小颗粒病毒抗原和犬冠状病毒抗原；
(2)利用步骤(1)所述犬细小颗粒病毒抗原和犬冠状病毒抗原免疫蛋鸡，得到免疫鸡蛋；
(3)从步骤(2)所述的免疫鸡蛋中收集卵黄液后，提取抗体原液，经纯化浓缩，制备得到犬细小与犬冠状病毒的二联卵黄抗体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述制备犬细小颗粒病毒抗原的方法包括如下步骤：
将序列为SEQ ID NO.2的VP2序列优化后，克隆到载体上获得重组载体，以两对引物扩增后获得片段1和片段2；而后分别将所述片段1和片段2连接到载体上，获得重组转移载体；利用所述重组转移载体转染Sf9细胞，获得的细胞感染物即为重组杆状病毒CPV-2b-VP2株；
经浓缩、灭活后得到犬细小颗粒病毒CPV-2b-VP2株疫苗原液；将所述疫苗原液与白油佐剂混合均匀，得到所述犬细小颗粒病毒抗原。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述制备犬冠状病毒抗原的方法包括如下步骤：
利用病犬粪便样品制备得到病毒液，浓缩、灭活后得到犬冠状病毒CCV2015株疫苗原液株疫苗原液；将所述疫苗原液与白油佐剂混合均匀，得到所述犬冠状病毒抗原。
6.根据权利要求3～5任一项所述的制备方法，其特征在于，完成步骤(1)所述抗原的制备后，还包括检测犬细小颗粒病毒的HA抗原效价和犬冠状病毒抗原含量的操作；
所述犬细小颗粒病毒CPV-2b-VP2株的HA抗原效价为1:8192～1:16384；
所述犬冠状病毒CCV2015株抗原含量为(105.0-105.8)TCID50/0.1ml；
步骤(3)所述卵黄液中的抗体效价为1:256以上；
完成步骤(3)所述抗原的制备后，还包括检测所述犬细小与犬冠状病毒的二联卵黄抗体的效价的操作。
7.根据权利要求3～6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)的操作方法包括如下步骤：
将犬细小病毒抗原以及犬冠状病毒抗原按1:1混合，免疫接种90～110日龄产蛋母鸡，经四次免疫后收集鸡蛋；
测定鸡蛋卵黄液中犬细小病毒以及犬冠状病毒特异抗体效价，收集抗体效价为1:256以上的卵黄液；
用乙酸-乙酸钠溶液稀释所述卵黄液后，沉淀取上清，加入固体硫酸铵纯化，调节pH后，浓缩纯化得到卵黄抗体。
8.一种犬细小与犬冠状病毒的二联卵黄抗体，其特征在于，采用权利要求1～7任一项所述的制备方法制备得到。
9.如权利要求8所述的犬细小与犬冠状病毒的二联卵黄抗体在制备用于治疗犬细小病毒与犬冠状病毒感染导致的疾病的药物中的应用。
10.一种药物组合物，其特征在于，包含如权利要求8所述的犬细小与犬冠状病毒的二联卵黄抗体和药学上可接受的载体。
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