CN113185607B - 一种多价禽腺病毒卵黄抗体的制备方法 - Google Patents

一种多价禽腺病毒卵黄抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种多价禽腺病毒卵黄抗体的制备方法，括以下步骤：S1.分离病毒株；S2.制备灭活疫苗；S3.制备免疫鸡蛋，收集蛋黄；S4.加入6倍体积的盐酸溶液，调节pH，放置在2～5℃温度下静置12～24h；S5.将步骤S4中静置之后的溶液，得到上清液，在上清液中加入硫酸钠固体，充分溶解之后，静置1～8h，保留沉淀物；再溶解后用硫酸钠固体再次沉淀。本发明提取的方法，更加安全，更易获取的材料，能节约生产的成本，保证产品无毒害作用，不会造成环境的污染。同时相比水稀释等简易方案，最终获得的成品卵黄抗体的效价高，易于保存，这些为实现工业化生产提供了可能。

Description

一种多价禽腺病毒卵黄抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种多价禽腺病毒卵黄抗体的制备方法。
背景技术
I群禽腺病毒属于腺病毒科禽腺病毒属，根据限制性酶切片段图谱和抗原抗体中和反应，可将病毒分为5个种(A～E)以及12种血清型(1～8a，8b～11)。I群禽腺病毒主要引起的疾病包括有心包积液综合征(HHS)，包涵体肝炎(IBH)，肌胃糜烂(AGE)。其中HHS主要是由血清4型导致的，IBH能由所有血清型导致，AGE主要由血清1型导致。I群禽腺病毒的传播方式包括有水平传播和垂直传播，水平传播包括有通过污染的空气，水，粪便等进行传播，垂直传播包括通过下蛋将病毒带到子代体内。这些使得I群禽腺病毒给养殖业带来了巨大的经济损失。I群禽腺病毒在世界范围内流行，其中北美和欧洲主要流行血清型2，8b和11，南非主要流行血清型2，8b，而亚洲主要流行血清1,2,4,8b。我国主要流行的毒株包括有血清型2，4,8a，8b，其中4型能导致3～5周龄的鸡产生30％～80％的死亡率，血清8a，8b能导致1～3周龄的鸡产生10％～30％的死亡率，是主要的致死性毒株。
用来预防疾病的常见方式为接种疫苗，国外如印度，荷兰等都有批准的I群禽腺病毒的疫苗，但国内没有商品化的疫苗，使得I群禽腺病毒的防控变得严峻。卵黄抗体IgY是一种结构和功能上与哺乳动物抗体IgG类似的免疫球蛋白，相比于疫苗具有以下优点：1. 卵黄抗体是一种蛋白，不会导致疾病的再次传播，同时蛋白的结构稳定，易于存储，存储时间长，在4℃条件下能存放几年。2.卵黄抗体不会激发机体内补体系统，即指所有的正常动物都能摄入卵黄抗体，不会引发副反应。3.卵黄抗体的制备量大，成本低，具有工业化生产的潜力。
目前已经存在针对单一禽腺病毒的卵黄抗体，由于多重抗体制备、提取难度大，现在仍缺乏针对多种禽腺病毒的卵黄抗体。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中问题，提供一种多价禽腺病毒卵黄抗体的制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种多价禽腺病毒卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1.分离病毒株，得到4型禽腺病毒、8a型禽腺病毒和8b型禽腺病毒；
S2.将步骤S1得到的三种病毒按照4型禽腺病毒、8a型禽腺病毒和8b型禽腺病毒的效价比为(105～107):(105～107):(105～107)制成灭活疫苗；
S3.利用步骤S2得到的疫苗免疫蛋鸡，获得免疫鸡蛋，经消毒后，分离蛋白，收集卵黄；
S4.加入6倍体积的pH为3.0～4.0的盐酸溶液，调节pH为4.5～5.2，放置在2～5℃温度下静置4～8h；
S5.将步骤S4中静置之后的溶液，以10000～15000rpm的转速离心10～50min，得到上清液，在上清液中加入硫酸钠固体使其变为100％的饱和硫酸钠溶液，充分溶解之后，静置1～8h，再以10000～15000rpm的转速离心10～50min，保留沉淀物；将沉淀物再次用蒸馏水溶解至原体积，再加入硫酸钠固体充分溶解后使其变为60％～80％的饱和硫酸钠溶液，静置2～4h，再以10000～15000rpm的转速离心10～50min得到抗体沉淀。
优选地，所述步骤S2中，4型禽腺病毒、8a型禽腺病毒和8b型禽腺病毒的效价比为10:1:1。更优选地，4,8啊，8b毒株以病毒效价分别为107,106,106。
由不同病毒免疫得到不同类型的卵黄抗体。不同的卵黄抗体有不同的理化性质，现有的提取方法通常采用氯仿法、PEG6000提取法或水稀释法，但其中氯仿和PEG2000具有安全隐患，水稀释法提取纯度低。本发明上述步骤中采用硫酸钠溶液进行多次沉淀提取，不仅安全而且明显提升了抗体的纯度。
优选地，所述步骤S3中，免疫蛋鸡的制备包括以下步骤：首次每只蛋鸡注射0.3～0.6mL 灭活疫苗；10～15天之后再次注射0.6～0.9mL灭活疫苗；再过10～15天后再次注射0.05～0.2mL灭活疫苗。
优选地，所述步骤S4中，调节pH为5，放置在4℃温度下静置8h。
所述多价禽腺病毒卵黄抗体的制备方法得到的多价禽腺病毒卵黄抗体。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
本发明提供的一种多价禽腺病毒卵黄抗体的制备方法，采用流行性最常见的4,8a和8b 型作为免疫毒株得到卵黄抗体更加适用我国禽腺病毒流行的情况。采用硫酸钠溶液和水复合提取的方法，更加安全，更易获取的材料，能节约生产的成本，保证产品无毒害作用，不会造成环境的污染。同时相比水稀释等简易方案，最终获得的成品卵黄抗体的效价高，易于保存，这些为实现工业化生产提供了可能。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除特殊说明，本实施例、对比例以及实验例中所用的设备均为常规实验设备，所用的材料、试剂无特殊说明均为市售得到，无特殊说明的实验方法也为常规实验方法。
实施例1
一种多价禽腺病毒卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1.分离病毒株，得到4型禽腺病毒、8a型禽腺病毒和8b型禽腺病毒；以上毒株于2019 年自行分离I群禽腺病毒，与现有毒株相比具有基因高度相似的特点；
S2.将步骤S1得到的三种病毒按照4型禽腺病毒、8a型禽腺病毒和8b型禽腺病毒的效价分别为107,106,106制成灭活疫苗；
S3.利用步骤S2得到的疫苗免疫蛋鸡，获得免疫鸡蛋，经消毒后，分离蛋白，收集卵黄；具体步骤为：选择蛋鸡为150日龄的SPF蛋鸡，免疫程序为：首次免疫：0.5ml/只， 14天后二免疫：0.8ml/只，再14天后三免：0.1ml/只；
S4.加入6倍体积的pH为3.0～4.0的盐酸溶液，调节pH为5，放置在4℃温度下静置8h；
S5.将步骤S4中静置之后的溶液，以12000rpm的转速离心40min，得到上清液，在上清液中加入硫酸钠固体使其变为100％的饱和硫酸钠溶液，充分溶解之后，静置4h，再以12000rpm的转速离心40min，保留沉淀物；将沉淀物再次用蒸馏水溶解至原体积，再加入硫酸钠固体充分溶解后使其变为75％的博爱和硫酸钠溶液，静置3h，再以12000rpm的转速离心15min得到抗体沉淀。
对比例1
一种多价禽腺病毒卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1.分离病毒株，得到4型禽腺病毒；以上毒株于2019年自行分离I群禽腺病毒，与现有毒株相比具有基因高度相似的特点；
S2.将步骤S1得到的病毒按照效价为107制成灭活疫苗；
S3.利用步骤S2得到的疫苗免疫蛋鸡，获得免疫鸡蛋，经消毒后，分离蛋白，收集卵黄；具体步骤为：选择蛋鸡为150日龄的SPF蛋鸡，免疫程序为：首次免疫：0.5ml/只， 14天后二免疫：0.8ml/只，再14天后三免：0.1ml/只；
S4.加入6倍体积的pH为3.0～4.0的盐酸溶液，调节pH为5，放置在4℃温度下静置20h；
S5.将步骤S4中静置之后的溶液，以12000rpm的转速离心40min，得到上清液，在上清液中加入溶液体积19％的硫酸钠固体，充分溶解之后，静置4h，再以12000rpm的转速离心40min，保留沉淀物；将沉淀物再次用蒸馏水溶解至原体积，再加入溶液体积的14％的硫酸钠固体充分溶解之后，静置4h，再以12000rpm的转速离心4min得到抗体沉淀。
对比例2
一种多价禽腺病毒卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1.分离病毒株，得到8a型禽腺病毒；以上毒株于2019年自行分离I群禽腺病毒，与现有毒株相比具有基因高度相似的特点；
S2.将步骤S1得到的病毒按照效价为106制成灭活疫苗；
S3.利用步骤S2得到的疫苗免疫蛋鸡，获得免疫鸡蛋，经消毒后，分离蛋白，收集卵黄；具体步骤为：选择蛋鸡为150日龄的SPF蛋鸡，免疫程序为：首次免疫：0.5ml/只， 14天后二免疫：0.8ml/只，再14天后三免：0.1ml/只；
S4.加入6倍体积的pH为3.0～4.0的盐酸溶液，调节pH为5，放置在4℃温度下静置20h；
S5.将步骤S4中静置之后的溶液，以12000rpm的转速离心40min，得到上清液，在上清液中加入溶液体积19％的硫酸钠固体，充分溶解之后，静置4h，再以12000rpm的转速离心40min，保留沉淀物；将沉淀物再次用蒸馏水溶解至原体积，再加入溶液体积的14％的硫酸钠固体充分溶解之后，静置4h，再以12000rpm的转速离心4min得到抗体沉淀。
对比例3
一种多价禽腺病毒卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1.分离病毒株，得到8b型禽腺病毒；以上毒株于2019年自行分离I群禽腺病毒，与现有毒株相比具有基因高度相似的特点；
S2.将步骤S1得到的病毒按照效价为106制成灭活疫苗；
S3.利用步骤S2得到的疫苗免疫蛋鸡，获得免疫鸡蛋，经消毒后，分离蛋白，收集卵黄；具体步骤为：选择蛋鸡为150日龄的SPF蛋鸡，免疫程序为：首次免疫：0.5ml/只， 14天后二免疫：0.8ml/只，再14天后三免：0.1ml/只；
S4.加入6倍体积的pH为3.0～4.0的盐酸溶液，调节pH为5，放置在4℃温度下静置20h；
S5.将步骤S4中静置之后的溶液，以12000rpm的转速离心40min，得到上清液，在上清液中加入溶液体积19％的硫酸钠固体，充分溶解之后，静置4h，再以12000rpm的转速离心40min，保留沉淀物；将沉淀物再次用蒸馏水溶解至原体积，再加入溶液体积的14％的硫酸钠固体充分溶解之后，静置4h，再以12000rpm的转速离心4min得到抗体沉淀。
对比例4
将本实验以储存的三种毒株的血清抗体进行简单混合。
实验例1
利用琼脂扩散的方式，测定实施例和各对比例获得的卵黄抗体的最高抗体效价(log2)，以及达到最高抗体效价需要的天数。将各实施例和对比例的卵黄抗体用20mL蒸馏水溶解，结果如表1所示，可以发现对比例1组的4型在35d时抗体效价为27。对比例2组的8a型在28d时抗体效价为26。对比例3组8b型在28d时效价为26。对比例4组，简单混合血清抗体中4型，8a型，8b型的效价分别为23，23，23。实施例组得到的卵黄抗体中4型， 8a型，8b型分组在42d，35d，42d效价为26，26，25。说明利用实施例方法获得的卵黄抗体，比简单混合卵黄抗体具有更高的效价，更有利于预防I群禽腺病毒。
表1各组获得的卵黄/血清抗体效价
Figure RE-GDA0003103119570000061
实验例2
利用实施例和各对比例得到的卵黄抗体处理相同数量的1日龄鸡。然后将上述1日龄鸡在106TCID50效价的病毒液(包含有4型，8a型，8b型)的攻毒作用下，比较各组鸡的存活率。结果如表2所示。结果表明实施例组获得的多价抗体具有更好的预防作用。
表2鸡的存活率
实施例1 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4
70％ 40％ 40％ 100％ 90％
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种多价禽腺病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.分离病毒株，得到4型禽腺病毒、8a型禽腺病毒和8b型禽腺病毒；
S2. 将步骤S1得到的三种病毒按照4型禽腺病毒、8a型禽腺病毒和8b型禽腺病毒的效价比为107:106:106制成灭活疫苗；
S3. 利用步骤S2得到的疫苗免疫蛋鸡，获得免疫鸡蛋，经消毒后，分离蛋白，收集卵黄；
S4. 加入6倍体积的pH为3.0~4.0的盐酸溶液，调节pH为4.5~5.2，放置在2~5℃温度下静置4~8h；
S5. 将步骤S4中静置之后的溶液，以10000~15000rpm的转速离心10~50min，得到上清液，在上清液中加入硫酸钠固体使其变为100%的饱和硫酸钠溶液，充分溶解之后，静置1~8h，再以10000~15000rpm的转速离心10~50min，保留沉淀物；将沉淀物再次用蒸馏水溶解至原体积，再加入的硫酸钠固体充分溶解后使其变为60%~80%的饱和硫酸钠溶液，静置2~4h，再以10000~15000rpm的转速离心10~50min得到抗体沉淀，
所述步骤S3中，免疫蛋鸡的制备包括以下步骤：首次每只蛋鸡注射0.3~0.6mL灭活疫苗；10~15天之后再次注射0.6~0.9mL灭活疫苗；再过10~15天后再次注射0.05~0.2mL灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述多价禽腺病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，调节pH为5，放置在4℃温度下静置8h。
3.权利要求1或2所述多价禽腺病毒卵黄抗体的制备方法得到的多价禽腺病毒卵黄抗体。
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