CN108059674B - 一种规模化的卵黄抗体提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种规模化的卵黄抗体提取方法，包括如下步骤：将高免鸡蛋消毒后进行卵黄分离；将分离的卵黄搅拌成糊状后加入注射用水，卵黄与注射水的体积比为1：1.5‑1：3；再将卵黄液体的PH值调整为5.0‑5.2；再加入浓度为1.5‑3％的辛酸溶液，搅拌均匀后静止2‑3h将卵黄液体进行过滤，当80％的下层清液过滤完毕后，将剩余的液体进行均匀搅拌后继续进行过滤，收集滤液；再加入适量的注射用水对滤液进行稀释得到清液，再将清液的PH值调整为6.0‑7.0，再加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，将清液进行再次过滤，收集滤液进行分装后进行检验，检验合格之后贴标转入成品库。本发明使得卵黄抗体的生产周期明显缩短、生产成本降低、产品的纯度更高和延长的产品的保质期。
Description
技术领域
本发明涉及卵黄抗体提取领域，尤其是涉及一种规模化的卵黄抗体提取方法。
背景技术
卵黄抗体(yolk antibody,IgY)是产蛋鸡受到抗原刺激后B细胞分化成浆细胞、分泌特异性抗体进入血液循环并在卵黄中积聚而成，提取的卵黄抗体可用于相应疾病的预防和治疗。
现在卵黄抗体的提取有如下几种方法：1、氯仿抽提法，由于该方法的氯仿用量极大，不仅导致卵黄抗体提取的成本高，并且得到的卵黄抗体产品的纯度低，并且氯仿具有较强的毒性；2、酸化水提取法，该方法产品的杂质多、性能极不稳定、应激性大，需要进行进一步浓缩操作才能使用，并且给动物注射后容易产生过敏反应，会导致动物出现病症，产品的安全性差；3、聚乙二醇法，聚乙二醇的用量大，使得卵黄抗体的提取成本高；提取的卵黄抗体产品的纯度也较低；因此上述三种方法只能在实验室中使用，无法采用上述方法对卵黄抗体进行大规模提取。现在卵黄抗体大规模提取的方法都是采用国家标准工艺进行提取，虽然国家标准提取工艺能够获得形状较为稳定的卵黄抗体产品，产品的安全性得到提高，但是采用国家标准工艺提取卵黄抗体的生产周期较长、生产成本高，并且现在的卵黄抗体产品还含有较多的杂蛋白，纯度不高，另外现在的卵黄抗体产品的保质期为18个月，相较而言，保质期的时间较短。
发明内容
针对现有技术中的上述问题，本发明提出了一种规模化的卵黄抗体提取方法，解决了现有的卵黄提取方法获得的卵黄抗体产品的生产周期较长、生产成本高、产品中含有较多杂蛋白使得产品的纯度不高以及产品的保质期较短等技术问题。
本发明的技术方案为：一种规模化的卵黄抗体提取方法，包括如下步骤：
1)将高免鸡蛋用0.1％的新洁尔灭消毒液浸泡消毒15min，再用甲醛熏蒸消毒30min；
2)将消毒后的高免鸡蛋进行手工或者机械打蛋操作，将卵黄进行分离；
3)将步骤2)中分离得到的卵黄转入搅拌罐中，将卵黄搅拌成糊状，再向搅拌罐中加入注射用水，卵黄与注射水的体积比为1：1.5-1：3；继续搅拌25-35min，搅拌速度为450-550r/min，搅拌完毕之后；再向卵黄中逐步滴加适量的醋酸-醋酸钠缓冲液至PH值为5.0-5.2时，停止滴加；
4)向步骤3)中得到的卵黄中加入适量浓度为1.5-3％的辛酸溶液，添加完毕后进行搅拌，搅拌速度为280-320r/min，在室温条件下静止2-3h将卵黄液体进行分层，即上层为卵黄脂蛋白固态物，下层为含有卵黄抗体的清液；
5)在容器的顶面上设置有过滤装置，过滤装置的透气量为17-19L/m2·s，搅拌罐底部出口处连接有管道至容器上方，打开搅拌罐底部阀门，同时对搅拌罐进行加压至压力为0.05-0.1MPa，下层清液在过滤装置中过滤，当80％的下层清液过滤完毕之后，将搅拌罐底部的阀门关闭，同时开启搅拌电机将搅拌罐内的卵黄脂蛋白固态物和剩余20％的下层清液搅拌进行均匀混合；关闭搅拌电机，再向搅拌罐加压使罐内压力维持在0.1-0.15MPa之间，再打开阀门，将搅拌罐内的卵黄液体全部进行过滤，收集滤液；
6)将步骤5)中得到的滤液转入配液罐中，加入适量的注射用水对滤液进行稀释，边搅拌边滴加2M的氢氧化钠溶液直至滤液的PH值为6.0-7.0时，停止滴加，然后再加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，搅拌至均匀；
7)将配液罐中的清液通过灭菌板框过滤器进行再次过滤，在配液罐中加压至压力为0.15-0.2MPa，收集滤液进行分装后得到半成品，将半成品进行检验，检验合格之后贴标转入成品库，即得到卵黄抗体成品。
进一步地，步骤3)中所述卵黄与注射水的体积比为1：2。
进一步地，步骤4)中卵黄中加入的辛酸溶液浓度为2％-2.5％。
进一步地，步骤5)中所述过滤装置包括过滤筛和铺设在过滤筛上的滤布，所述过滤装置的透气量为18L/m2·s。
进一步地，所述滤布的厚度为1.0mm，经向密度为156根/10cm，纬向密度：106根/10cm。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
①本发明使得卵黄抗体的生产周期明显缩短，按照8小时/工作日，本发明只需要两个工作日就能完成卵黄抗体成品的制备，而按照现在卵黄抗体的国家标准工艺需要2.5个工作日和1个夜班工作日才能制得卵黄抗体成品，本发明将卵黄抗体的生产周期缩短了1.5个工作日。
②本发明使得卵黄抗体的生产成本显著降低，本发明的生产周期缩短，一方面使得人力成本大幅度的缩小，本发明中试剂(辛酸)的用量减少，使得卵黄抗体的原料成本降低，最后就是本发明中工艺流程简化，使得降低了设备成本、设备的折旧成本以及能源成本；经过实验和对成本进行计算发现，本发明制备1吨卵黄抗体成品的成本为3514元，而按照卵黄抗体国家标准工艺制备1吨卵黄抗体成品的成本为6139.32元，本发明将卵黄抗体的成本降低了42.8％。
③本发明制得的卵黄抗体产品的纯度更高，例如在小鹅瘟琼扩抗体效价均为1:16条件下，用蛋白质含量检测仪检测采用本发明和国家标准工艺制备的小鹅瘟卵黄抗体的总蛋白含量分别为3114μg/ml和3983μg/ml，因此，本发明制得的小鹅瘟卵黄抗体比国家标准工艺制得的小鹅瘟卵黄抗体的杂蛋白减少率达到21.8％；经实验证明，将本发明制得的小鹅瘟卵黄抗体和国家标准工艺制得的小鹅瘟卵黄抗体半成品在4℃条件下静置48个小时，本发明制备的产品几乎无沉淀，而国家标准工艺制备的产品中有明显的白色沉淀存在。
④本发明制备的卵黄抗体产品的保存期延长，经过实验证明，在相同的保存条件下(2-8℃)，本发明制备的卵黄抗体成品的保存期为24个月，通过国家标准工艺生产的卵黄抗体成品的保存期为18个月，因此，本发明制备的卵黄抗体产品的保存期比国家标准工艺生产的卵黄抗体产品的保存期延长了6个月。
附图说明
图1为本发明实施例2中得到的小鹅瘟卵黄抗体在4℃下静置48小时后的SDS-PAGE检测图。
图2为本发明对比实施例1中得到的小鹅瘟卵黄抗体在4℃下静置48小时后的SDS-PAGE检测图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明中的技术方案进一步说明。
实施例1
一种规模化的卵黄抗体提取方法，包括如下步骤：
1)将2万枚用于提取小鹅瘟卵黄抗体的高免鸡蛋用0.1％的新洁尔灭消毒液浸泡消毒15min，再用甲醛熏蒸消毒30min；
2)将消毒后的2万枚高免鸡蛋进行手工或者机械打蛋操作，将卵黄进行分离；
3)将步骤2)中分离得到的卵黄转入搅拌罐中，将卵黄搅拌成糊状，再向搅拌罐中加入注射用水，卵黄与注射水的体积比为1：1.5；继续搅拌25min，搅拌速度为450r/min，搅拌完毕之后；再向卵黄中逐步滴加适量的醋酸-醋酸钠缓冲液至PH值为5.0时，停止滴加；
4)向步骤3)中得到的卵黄中加入适量浓度为1.5％的辛酸溶液，添加完毕后进行搅拌，搅拌速度为280r/min，在室温条件下静止2h将卵黄液体进行分层，即上层为卵黄脂蛋白固态物，下层为含有卵黄抗体的清液；
5)在容器的顶面上设置有过滤装置，过滤装置的透气量为17L/m2.s，搅拌罐底部出口处连接有管道至容器上方，打开搅拌罐底部阀门，同时对搅拌罐进行加压至压力为0.05MPa，下层清液在过滤装置中过滤，当80％的下层清液过滤完毕之后，将搅拌罐底部的阀门关闭，同时开启搅拌电机将搅拌罐内的卵黄脂蛋白固态物和剩余20％的下层清液搅拌进行均匀混合；关闭搅拌电机，再向搅拌罐加压使罐内压力维持在0.1MPa，再打开阀门，将搅拌罐内的卵黄液体全部进行过滤，收集滤液；
6)将步骤5)中得到的滤液转入配液罐中，加入适量的注射用水对滤液进行稀释，边搅拌边滴加2M的氢氧化钠溶液直至滤液的PH值为6.0时，停止滴加，然后再加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，搅拌至均匀；
7)将配液罐中的清液通过灭菌板框过滤器进行再次过滤，在配液罐中加压至压力为0.15MPa，收集滤液进行分装后得到半成品，将半成品进行检验，检验合格之后贴标转入成品库，即得到小鹅瘟卵黄抗体成品。
实施例2
一种规模化的卵黄抗体提取方法，包括如下步骤：
1)将2万枚用于提取小鹅瘟卵黄抗体的高免鸡蛋用0.1％的新洁尔灭消毒液浸泡消毒15min，再用甲醛熏蒸消毒30min；
2)将消毒后2万枚的高免鸡蛋进行手工或者机械打蛋操作，将卵黄进行分离；
3)将步骤2)中分离得到的卵黄转入搅拌罐中，将卵黄搅拌成糊状，再向搅拌罐中加入注射用水，卵黄与注射水的体积比为1：2；继续搅拌27min，搅拌速度为500r/min，搅拌完毕之后；再向卵黄中逐步滴加适量的醋酸-醋酸钠缓冲液至PH值为5.1时，停止滴加；
4)向步骤3)中得到的卵黄中加入适量浓度为2.25％的辛酸溶液，添加完毕后进行搅拌，搅拌速度为300r/min，在室温条件下静止2.5h将卵黄液体进行分层，即上层为卵黄脂蛋白固态物，下层为含有卵黄抗体的清液；
5)在容器的顶面上设置有过滤装置，过滤装置的透气量为18L/m2.s，搅拌罐底部出口处连接有管道至容器上方，打开搅拌罐底部阀门，同时对搅拌罐进行加压至压力为0.075MPa，下层清液在过滤装置中过滤，当80％的下层清液过滤完毕之后，将搅拌罐底部的阀门关闭，同时开启搅拌电机将搅拌罐内的卵黄脂蛋白固态物和剩余20％的下层清液搅拌进行均匀混合；关闭搅拌电机，再向搅拌罐加压使罐内压力维持在0.125MPa之间，再打开阀门，将搅拌罐内的卵黄液体全部进行过滤，收集滤液；
6)将步骤5)中得到的滤液转入配液罐中，加入适量的注射用水对滤液进行稀释，边搅拌边滴加2M的氢氧化钠溶液直至滤液的PH值为6.5时，停止滴加，然后再加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，搅拌至均匀；
7)将配液罐中的清液通过灭菌板框过滤器进行再次过滤，在配液罐中加压至压力为0.175MPa，收集滤液进行分装后得到半成品，将半成品进行检验，检验合格之后贴标转入成品库，即得到小鹅瘟卵黄抗体成品。
实施例3
一种规模化的卵黄抗体提取方法，包括如下步骤：
1)将2万枚用于提取小鹅瘟卵黄抗体的高免鸡蛋用0.1％的新洁尔灭消毒液浸泡消毒15min，再用甲醛熏蒸消毒30min；
2)将消毒后2万枚的高免鸡蛋进行手工或者机械打蛋操作，将卵黄进行分离；
3)将步骤2)中分离得到的卵黄转入搅拌罐中，将卵黄搅拌成糊状，再向搅拌罐中加入注射用水，卵黄与注射水的体积比为1：3；继续搅拌35min，搅拌速度为550r/min，搅拌完毕之后；再向卵黄中逐步滴加适量的醋酸-醋酸钠缓冲液至PH值为5.2时，停止滴加；
4)向步骤3)中得到的卵黄中加入适量浓度为3％的辛酸溶液，添加完毕后进行搅拌，搅拌速度为320r/min，在室温条件下静止3h将卵黄液体进行分层，即上层为卵黄脂蛋白固态物，下层为含有卵黄抗体的清液；
5)在容器的顶面上设置有过滤装置，过滤装置的透气量为19L/m2.s，搅拌罐底部出口处连接有管道至容器上方，打开搅拌罐底部阀门，同时对搅拌罐进行加压至压力为0.1MPa，下层清液在过滤装置中过滤，当80％的下层清液过滤完毕之后，将搅拌罐底部的阀门关闭，同时开启搅拌电机将搅拌罐内的卵黄脂蛋白固态物和剩余20％的下层清液搅拌进行均匀混合；关闭搅拌电机，再向搅拌罐加压使罐内压力维持在0.15MPa之间，再打开阀门，将搅拌罐内的卵黄液体全部进行过滤，收集滤液；
6)将步骤5)中得到的滤液转入配液罐中，加入适量的注射用水对滤液进行稀释，边搅拌边滴加2M的氢氧化钠溶液直至滤液的PH值为7.0时，停止滴加，然后再加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，搅拌至均匀；
7)将配液罐中的清液通过灭菌板框过滤器进行再次过滤，在配液罐中加压至压力为0.2MPa，收集滤液进行分装后得到半成品，将半成品进行检验，检验合格之后贴标转入成品库，即得到小鹅瘟卵黄抗体成品。
对比实施例1
用国家标准提取工艺对2万枚小鹅瘟高免鸡蛋进行卵黄抗体提取，得到小鹅瘟卵黄抗体成品。
结果分析：
对实施例1-3和对比实施例1中的得到小鹅瘟卵黄抗体成品的各项性能指标进行检测，得到表1。
表1为实施例1-3与对比实施例1中得到的小鹅瘟卵黄抗体成品各项性能指标的对比表
从上表可以看出：将实施例1-3和对比实施例1中得到的小鹅瘟卵黄抗体成品在4℃的条件下静置48个小时后进行观察，实施例1-3得到的小鹅瘟卵黄抗体成品中几乎无沉淀，而对比文件1得到的小鹅瘟卵黄抗体成品中可明显见到白色沉淀物；然后再将实施例2和对比实施例1静置后的小鹅瘟卵黄抗体成品分成3组后，再通过DS-PAGE进行检测，分别得到图1和图2，从图1中可以看出，实施例2中的小鹅瘟卵黄抗体成品几乎无杂蛋白条带，从图2中可以看出，对比实施例1中的小鹅瘟卵黄抗体成品中有明显的杂蛋白条带，因此本发明中得到的小鹅瘟卵黄抗体成品的纯度比国家标准工艺提取的小鹅瘟卵黄抗体成品的纯度更好。
通过将实施例1-3和对比实施例1中得到的小鹅瘟卵黄抗体成品分别在蛋白质含量检测仪中检测，分别得到实施例1中小鹅瘟卵黄抗体成品中的蛋白质含量3261μg/ml；实施例2中小鹅瘟卵黄抗体成品中的蛋白质含量3114μg/ml；实施例3中小鹅瘟卵黄抗体成品中的蛋白质含量3185μg/ml；对比实施例1中小鹅瘟卵黄抗体成品中的蛋白质含量3983μg/ml。
从表1中可以看出：将实施例1-3和对比实施例1中得到的小鹅瘟卵黄抗体成品在相同的条件下保存，实施例1-3中小鹅瘟卵黄抗体成品的保存期为24个月，而对比实施例1中小鹅瘟卵黄抗体成品的保存期是18个月。
经过实验证明和计算：实施例1-3中从2万枚高免鸡蛋中提取小鹅瘟卵黄抗体耗时2个工作日(每个工作日以8小时计算)，而对比实施例1中采用国家标准工艺从2万枚高免鸡蛋中提取小鹅瘟卵黄抗体耗时2.5个白天工作日和1个夜班工作日；综上，同样从2万枚高免鸡蛋中提取小鹅瘟卵黄抗体，本发明工艺流程比国家标准工艺流程将卵黄抗体的生产周期缩短了1.5个工作日。
将实施例2与对比实施例1中小鹅瘟卵黄抗体提取的成本进行计算，得到如下表2。
表2为实施例2与对比实施例1中小鹅瘟卵黄抗体提取成本对比表
本发明在不计算使用的相同原材料的成本的情况下，如高免鸡蛋和包装材料等，从上表中可以看出本发明使得小鹅瘟卵黄抗体的提取成本降低了近43％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种规模化的卵黄抗体提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将高免鸡蛋用0.1％的新洁尔灭消毒液浸泡消毒15min，再用甲醛熏蒸消毒30min；
2)将消毒后的高免鸡蛋进行手工或者机械打蛋操作，将卵黄进行分离；
3)将步骤2)中分离得到的卵黄转入搅拌罐中，将卵黄搅拌成糊状，再向搅拌罐中加入注射用水，卵黄与注射水的体积比为1：1.5-1：3；继续搅拌25-35min，搅拌速度为450-550r/min，搅拌完毕之后；再向卵黄中逐步滴加适量的醋酸-醋酸钠缓冲液至PH值为5.0-5.2时，停止滴加；
4)向步骤3)中得到的卵黄中加入适量浓度为1.5-3％的辛酸溶液，添加完毕后进行搅拌，搅拌速度为280-320r/min，在室温条件下静止2-3h将卵黄液体进行分层，即上层为卵黄脂蛋白固态物，下层为含有卵黄抗体的清液；
5)在容器的顶面上设置有过滤装置，过滤装置的透气量为17-19L/m2.s，搅拌罐底部出口处连接有管道至容器上方，打开搅拌罐底部阀门，同时对搅拌罐进行加压至压力为0.05-0.1MPa，下层清液在过滤装置中过滤，当80％的下层清液过滤完毕之后，将搅拌罐底部的阀门关闭，同时开启搅拌电机将搅拌罐内的卵黄脂蛋白固态物和剩余20％的下层清液搅拌进行均匀混合；关闭搅拌电机，再向搅拌罐加压使罐内压力维持在0.1-0.15MPa之间，再打开阀门，将搅拌罐内的卵黄液体全部进行过滤，收集滤液；
6)将步骤5)中得到的滤液转入配液罐中，加入适量的注射用水对滤液进行稀释，边搅拌边滴加2M的氢氧化钠溶液直至滤液的PH值为6.0-7.0时，停止滴加，然后再加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，搅拌至均匀；
7)将配液罐中的清液通过灭菌板框过滤器进行再次过滤，在配液罐中加压至压力为0.15-0.2MPa，收集滤液进行分装后进行检验，检验合格之后贴标转入成品库，即得到卵黄抗体成品。
2.如权利要求1所述的一种规模化的卵黄抗体提取方法，其特征在于：步骤3)中所述卵黄与注射水的体积比为1：2。
3.如权利要求1所述的一种规模化的卵黄抗体提取方法，其特征在于：步骤4)中卵黄中加入的辛酸溶液浓度为2％-2.5％。
4.如权利要求1所述的一种规模化的卵黄抗体提取方法，其特征在于：步骤5)中所述过滤装置包括过滤筛和铺设在过滤筛上的滤布，所述过滤装置的透气量为18L/m2.s。
5.如权利要求4所述的一种规模化的卵黄抗体提取方法，其特征在于：所述滤布的厚度为1.0mm，经向密度为156根/10cm，纬向密度：106根/10cm。
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