CN113293147A - 一种新型冠状病毒的规模化纯化方法 - Google Patents

一种新型冠状病毒的规模化纯化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113293147A
CN113293147A CN202110119010.7A CN202110119010A CN113293147A CN 113293147 A CN113293147 A CN 113293147A CN 202110119010 A CN202110119010 A CN 202110119010A CN 113293147 A CN113293147 A CN 113293147A
Authority
CN
China
Prior art keywords
novel coronavirus
sucrose
coronavirus
gradient
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110119010.7A
Other languages
English (en)
Inventor
安祺
田大勇
刘珍珍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Saierfusen Biotechnology Co ltd
Shanghai Qingsai Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Beijing Saierfusen Biotechnology Co ltd
Shanghai Qingsai Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Saierfusen Biotechnology Co ltd, Shanghai Qingsai Biotechnology Co ltd filed Critical Beijing Saierfusen Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110119010.7A priority Critical patent/CN113293147A/zh
Publication of CN113293147A publication Critical patent/CN113293147A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20051—Methods of production or purification of viral material

Abstract

本发明提供了一种新型冠状病毒纯化方法与应用。本发明采用蔗糖密度梯度离心技术可在密度梯度离心纯化前不经浓缩直接进行密度梯度离心纯化，因此，纯化方法步骤少，适应范围也广，剪切力小，易收集完整的病毒颗粒，且纯化批次间差异小，稳定性高，适合规模纯化新型冠状病毒。

Description

一种新型冠状病毒的规模化纯化方法
技术领域
本发明涉及病毒纯化领域，具体地涉及一种新型冠状病毒的规模化纯化方法。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是目前已知的第七种可感染人类的冠状病毒。相较于SARS病毒和流行性流感病毒，新冠病毒的人际传播速度更快(R0＝2.5)、潜伏期更长(4-12)、上呼吸道病毒载量高导致患者发病后即有最强传染性。临床症状主要以发热、干咳、乏力为主；重症多发生呼吸困难，快速进展为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，甚至出现代谢性酸中毒和出凝血功能障碍等，严重危害人体健康。
新冠病毒的主要包括4个结构蛋白：囊膜M蛋白(membrance，M)、刺突S蛋白(spike，S)、包膜E蛋白(envelope，E)、核壳体N蛋白(nucleocapsid，N)。其中刺突S蛋白为新冠病毒的主要抗原，其感染细胞主要依赖其刺突S蛋白与膜受体结合，它是以3聚体形式存在的，有2个亚基S1和S2组成。研究显示S1亚基上的受体结合区域(receptor binding domain,RBD)可以与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)识别结合，从而使病毒进入宿主细胞。S2则使宿主细胞和病毒膜融合人所必须的成份。核壳体N蛋白是RNA合成所必需的，在病毒出芽过程中起重要作用可作为诊断抗原。S蛋白三聚体以棘突的形式突出于病毒粒子表面大约20nm；已受剪切力等的影响造成棘突脱落；棘突的脱落将严重影响病毒粒子的免疫原性。
目前关于新型冠状病毒无特效药，快速开发高效的针对于新冠病毒的疫苗将对此次新冠异性的控制起到至关重要的作用。
目前，全球正在研发的新冠疫苗的路线主要有灭活疫苗、mRNA疫苗、活载体疫苗、重组蛋白疫苗、DNA疫苗等。其中，灭活疫苗因其研发周期短，安全性高且针对性强的特点，在诸多研发思路的实践方面走在了前列，多个产品已经处于III期临床阶段。
针对于全病毒灭活疫苗，其纯化工艺是核心工艺技术环节。因此，迫切需要开发规模化的新型冠状病毒的纯化方法。目前层析技术为新冠病毒常用的纯化方法，但是层析技术纯化病毒所受剪切力大，S蛋白容易丢失，影响免疫原性；并且层析柱的上样量有限，过载后影响纯化效果；此外，层析柱的柱效易受使用次数的影响，导致纯化的批次间差异。因此，开发新的新型冠状病毒的纯化方法很有必要。
发明内容
本发明目的是提供一种新型冠状病毒的规模化纯化方法，本发明方法工艺步骤少，处理量大，剪切力小，易收集完整的病毒颗粒，能够尽可能的保证病毒的完整性，且纯化批次间差异小，稳定性高，非常适合新冠病毒的规模化纯化。
本发明的第一方面，提供一种新型冠状病毒密度梯度离心纯化方法，其中，所述方法包括步骤：
(1)提供一离心转子，所述离心转子被配置为围绕所述离心转子的中心轴旋转离心，并且所述离心转子设有用于容纳物料的内腔，所述内腔的体积为V0，在底部设有物料入口，顶部设有物料出口；
(2)通过所述物料入口，在所述离心转子的内腔中注入缓冲液，然后注入体积V1的60％(wt％)蔗糖溶液；
(3)对所述离心转子以T1进行离心，从而在所述离心转子的内腔形成蔗糖梯度溶液；其中，T1为3000-7000rpm；
(4)以T2离心条件下，以流速F1，将含新型冠状病毒的物料从所述物料入口注入内腔，其中，F1为120-300ml/min；其中，T2为30000-40000rpm；
(5)当含新型冠状病毒的物料注入操作结束后，在离心条件下，以流速F2，将缓冲液从所述物料入口注入内腔，从而使得新型冠状病毒富集于所述蔗糖梯度溶液中，形成富含新型冠状病毒的梯度离心层；
其中，F2为120-300ml/min，且F2/F1＝0.9-1.1；
(6)对所述离心转子的离心速度进行降速，从而使得转速为0rpm；
(7)从所述离心转子的底部入口，收集所述富含新型冠状病毒的梯度离心层，从而获得纯化的新型冠状病毒；
其中，所述V1/V0＝0.4-0.6。
在另一优选例中，所述缓冲液为PBS溶液或者与其相似性质的的缓冲液，其pH为7.2-7.4。
在另一优选例中，所述的离心转子为圆柱体形。
在另一优选例中，所述的物料入口设置于底部的中心区域。
在另一优选例中，所述的物料出口设置于顶部的中心区域。
在另一优选例中，所述的离心转子的V0为3.2L。
在另一优选例中，在步骤(2)中，注入的缓冲液(如PBS溶液)体积为V0的0.8-1.2倍。
在另一优选例中，在步骤(3)中，离心的转速T1为4000-6000rpm，优选地为5000rpm。
在另一优选例中，在步骤(4)中，F1为150-200ml/min。
在另一优选例中，在步骤(4)中，离心的转速T2为33000-37000rpm。
在另一优选例中，所述步骤(4)中，离心的转速T2为34000-36000rpm。
在另一优选例中，所述步骤(4)中，上样结束后，以T2继续离心30-90min，优选60min；其中，T2为30000-40000rpm，优选地为350000rpm。
在另一优选例中，在步骤(4)中，所述的含新型冠状病毒的物料的体积Vx为V0的0.25-62.5倍。
在另一优选例中，所述步骤(5)中，从所述物料入口将缓冲液(如PBS溶液)持续注入内腔。
在另一优选例中，步骤(5)的操作时间为60min。
在另一优选例中，在步骤(6)中，在40-60min内，将转速降为0rmp。
在另一优选例中，在步骤(6)中，降速条件为35000rpm降速至0rpm共计50min。
在另一优选例中，在步骤(7)中，还包括步骤：对收集的经离心的物料，进行紫外吸光值检测，从而确定所述的富含新型冠状病毒的梯度离心层(即病毒梯度液)。
在另一优选例中，所述的含新型冠状病毒的物料是用包括以下步骤的方法制备的：
(W1)提供传代培养的Vero细胞；
(W2)在所述的含新型冠状病毒的物料中接种新型冠状病毒，并进行病毒培养，从而获得含新型冠状病毒的培养物；(W3)从所述培养物中，分离获得含新型冠状病毒的上清液；
(W4)对所述病毒上清液进行灭活处理，从而获得所述的含新型冠状病毒的物料。
在另一优选例中，所述方法还包括对所述新型冠状病毒的物料的澄清离心步骤，其中所述澄清离心为使用连续流大容量离心机进行澄清离心，保留抗原的同时最大程度的去除大的细胞碎片。
在另一优选例中，所述的连续流大容量离心机转子型号为R13C。
在另一优选例中，澄清离心中，流速为500-1000ml/min，优选为600-700ml/min；离心力为6000-9000g，更优选为7500-8500g。
在另一优选例中，所述步骤(W4)中，灭活处理使用β-丙酸内酯。
在另一优选例中，在步骤(W3)中，所述分离收获上清液包括一次或多次分离收获上清液。
在另一优选例中，所述富含新型冠状病毒的梯度离心层中，蔗糖浓度为30-55wt％。
在另一优选例中，所述富含新型冠状病毒的梯度离心层中，蔗糖浓度为53％-32％。
本发明第二方面，提供一种纯化的新型冠状病毒，其中，所述的纯化的新型冠状病毒是用权利要求1-7中任一项所述的方法制备的。
在另一优选例中，所述新型冠状病毒可以是野生型、或其亚型、或其突变型或其减毒株。
本发明第三方面，提供一种疫苗组合物，其中，所述的疫苗组合物包括：(a)药学上可接受的载体；和(b)第一方面所述的纯化的新型冠状病毒。
在另一优选例中，所述的疫苗组合物还包括：(c)佐剂。
在另一优选例中，所述佐剂选自：角鲨烯、胞壁酰二肽、MF59、AS03、单磷脂酰脂质A、鞭毛蛋白、CpG-ODN、Poly(I：C)，以及铝或钙盐的小分子中的一种或多种。
本发明第四方面提供一种第二方面所述的纯化的新型冠状病毒的用途，其用于制备新型冠状病毒的疫苗。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为不同离心力澄清条件下的总蛋白量(左)和N蛋白含量(右)。
图2为超速离心后蛋白在不同蔗糖层的分布情况。
图3为不同蛋白条带的SDS-PAGE及Western-blot分析。
图4为分子筛层析纯化分析结果。
图5分子筛层析与蔗糖密度梯度离心后的Western-blot分析。
图6为不同批次的新冠病毒分布的蔗糖溶液浓度范围。
图7为不同批次纯化峰型图及蔗糖浓度梯度。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次意外地开发了一种基于连续流蔗糖密度梯度离心对生产新型冠状病毒的物料进行高效纯化的工艺方法。具有工艺步骤少，处理量大，剪切力小，易收集完整的病毒颗粒，能够尽可能的保证病毒的完整性，且纯化批次间差异小，稳定性高，非常适合新冠病毒的规模化纯化。在此基础上完成了本发明。
术语“病毒梯度液”指，含有病毒颗粒的梯度部分。
术语“收获液”指上清液。
本发明所用设备为连续流超速离心机，转子体积为3.2L。
术语“wt％”为重量百分比，如无特别说明，本发明所用浓度均为重量百分数，此外，由于实验变化性或者测量误差，本发明中重量百分比存在±2(wt％)的误差范围，优选地存在±1(wt％)的误差范围，更优选地存在±0.5(wt％)的误差范围，更优选地，存在±0.2(wt％)的误差范围，如“60％(wt％)”意在包含60％±2(wt％)的浓度范围，优选地包含60％±0.5(wt％)，更优选地包含60％±0.2(wt％)。
本发明中，上样时间与产品的上样量有关；上样量大，时间长；上样量小，时间短。例如：当上样流速为150ml/min时，样品量为15L，所需时间为100min；样品量为30L，则所需时间为200min。
本发明中，F1和F2大小不影响后续纯化。例如F1和F2可以各自为120-300ml/min，更佳地150-200ml/min，或者F2等于F1。
本发明中，所用病毒是经灭活处理的，其可用本领域通常的灭活试剂。例如甲醛、戊二醛或β-丙酸内酯等。
本发明中，优选密度梯度离心前后样品体积的比值为1-250，优选地为20-80。
同时，本领域技术人员应当理解，一旦分离数据(例如体积(包括转子体积、待分离产品的体积等)、离心力(上样离心力、上样后离心力等)以及运行时间(上样时间、上样后运行时间))证明有效后，这些参数可以完全按比例放大或缩小。不再需要进一步改变或继续测试，也无需进行再验证。
新型冠状病毒
冠状病毒(Coronavirus，CoV)属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)，是一种有包膜的正链RNA病毒，其亚科包含α、β、δ及γ四属。
目前已知的感染人的冠状病毒中，HCoV-229E和HCoV-NL63属于α属冠状病毒，HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2均为β属冠状病毒。其中SARS-CoV-2也被称为2019-nCov。
2003年和2012年分别爆发的高致病性冠状病毒“非典”SARS-CoV和“中东呼吸综合征”MERS-CoV均属于β属冠状病毒。2019年年底爆发的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)与SARS-CoV有约80％相似性、与MERS-CoV有40％的相似性，也属于β属冠状病毒。
该类病毒的基因组是一条单股正链RNA，是基因组最大的RNA病毒之一，编码包括复制酶、刺突蛋白、囊膜蛋白、包膜蛋白和核壳蛋白等。在病毒复制的初始阶段，基因组被翻译成两条长达几千个氨基酸的肽链即前体多聚蛋白(Polyprotein)，随后前体蛋白被蛋白酶切割生成非结构蛋白(如RNA聚合酶和解旋酶)和结构蛋白(如刺突蛋白)及辅助蛋白。
3CL蛋白酶(3Chymotrypsin-like protease,3CLpro)是冠状病毒中负责切割前体蛋白的主蛋白酶(所以又称为Mpro)，对病毒的复制不可或缺。
3CLpro属于半胱氨酸水解酶，在各类冠状病毒中高度保守，与小RNA病毒中的3C蛋白酶也比较相似，而人体中却没有与其相似的蛋白酶，因而是研发广谱抗单正链RNA病毒药物的理想靶点。
本发明中，新型冠状病毒可以来自于任何来源，只要它在对新型冠状病毒敏感的细胞中繁殖。本发明中，新型冠状病毒可以是野生型、或其亚型、或其突变型或其减毒株等，例如B.1.1.7突变株。
纯化方法
1.制备新型冠状病毒收获液；
2.收集并澄清离心新型冠状病毒收获液，收集上清液，去除较大的杂质；
3.密度梯度离心的介质为蔗糖及初始浓度为60％(wt％)；
4.静止条件下，在转子中，铺垫浓度为60％(wt％)的蔗糖溶液，蔗糖溶液的量为转子体积的一半；
5.设置缓慢升速(T1)，在离心力的作用下，蔗糖梯度从横向的梯度，变成较为稳定的纵向梯度；
6.设置目标上样转速(T2)，当转速达到上样转速时，调节样品流速F1为180-240ml/min，开始上样；
7.上样结束后，按照上样转速(T2)离心60min，稳定各组分在梯度带中的位置；
8.降速至0rpm，在重力的作用，按照紫外吸光值收集病毒。
制备新型冠状病毒收获液
本发明中新型冠状病毒收获液可采用本领域技术人员熟知的常规方法和常规操作来进行，具体地，本发明可采用如下方法制备病毒收获液：
1、病毒培养：
传代培养Vero细胞：传代的Vero细胞(如2天)，废弃原细胞培养液，加入吸附液并以吸附的方式接种新冠病毒(MOI通常为0.1:1-100:1)，至37℃培养箱吸附一段时间(如90分钟)，吸附结束补足维持液，置于37℃细胞培养箱培养一段时间(如3天)收获，得到病毒收获液(病毒浓度＞105.5个/ml)。
2、灭活：上述病毒收获液中按照一定的比例(如1：4000)使用灭活剂(如β-丙内酯)4℃灭活24小时。
纯化的新型冠状病毒以及疫苗组合物
本发明还提供了用本发明方法制备的高纯度的新型冠状病毒以及含有所述新型冠状病毒的疫苗组合物。
经测定，本发明制备的新型冠状病毒的纯度高，杂蛋白去除率远大于90％，故杂蛋白的残留量远小于10％，更佳地≤5％。
本发明制备的新型冠状病毒(灭活)可作为免疫原，用于激发动物产生针对新型冠状病毒的免疫反应，从而保护动物(人)免新型冠状病毒的感染。
一种优选的组合物是预防性的疫苗组合物。本发明的疫苗组合物可以是单价的或多价的疫苗组合物。
这些疫苗包含本发明制备的高纯度新型冠状病毒，并通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。
增强组合物效果的较佳的佐剂包括但不局限于：角鲨烯、胞壁酰二肽、MF59、AS03、单磷脂酰脂质A、鞭毛蛋白、CpG-ODN、Poly(I：C)，以及铝或钙盐的小分子中的一种或多种。
本发明的疫苗组合物(包括新型冠状病毒，药学上可接受的载体和/或佐剂)，通常含有稀释剂，如水、盐水、甘油、乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。
更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫有效量的新型冠状病毒，以及上述其它所需的组分。“免疫有效量”指以单剂或连续剂给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据动物(如人)的生理状况、免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度及其它的相关因素而定。
在本发明中，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或乳化液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，在上述药学上可接受的载体下增强佐剂效果。
常规方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。适合其它给药方式的其它配方包括口服和透皮应用等。治疗剂量可以是单剂方案或多剂方案。疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予。
本发明主要优点包括：
1.本发明纯化方法可以用于新冠病毒灭活疫苗的工业级纯化；
2.本发明纯化方法抗原回收高；
3.本发明纯化方法对病毒的破坏小，病毒粒子结构完整性更好；
4.本发明纯化方法制得的病毒批间差小，不受纯化介质的影响。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1制备新型冠状病毒收获液
1、病毒培养的流程：
传代培养Vero细胞：传代2天的Vero细胞，废弃原细胞培养液，加入吸附液并以吸附的方式接种新冠病毒，至37℃培养箱吸附90分钟，吸附结束补足维持液，置于37℃细胞培养箱培养3天收获，得到病毒收获液。经测定，病毒收获液中，病毒浓度约为106个/ml。
2、灭活：上述病毒收获液中按照1：4000的比例使用β-丙内酯4℃灭活24小时。
实施例2新冠病毒澄清离心参数的确定
由于新冠病毒S蛋白容易受剪切力而脱落，因此，采用离心法去除病毒液中的颗粒物，即所谓的澄清。
使用大容量高速离心机(选取转子R13C)，固定流速700ml/min，分别选取0g、4000g、6000g、8000g和10000g的离心力，进行连续流离心；通过比较不同离心力的作用下病毒颗粒的回收情况，确认最适澄清离心力。
结果如图1(右)，离心力在8000g及以下的时候，N蛋白含量变化不大，但当离心力达到10000g时，N蛋白的条带显著变浅；病毒液中N蛋白主要存在于病毒粒子中，因此说明病毒颗粒的损失趋于明显。因此，以700ml/min的流速下，8000g作为澄清离心的最适离心力。
实施例3新冠病毒在蔗糖溶液中分布的浓度范围
将实施例1中灭活后的新冠病毒液500ml浓缩100倍，通过蔗糖密度梯度超速离心技术确定病毒粒子的主要富集区域。
分别在每支超速离心管中依次加入1.5ml 60％、2ml 50％、3ml 40％和5ml30％的四层蔗糖溶液，保持各个浓度蔗糖溶液的界限清晰。在每支超速离心管最上层加入浓缩后的新冠病毒液2ml。30000rpm离心120分钟后，在不同浓度蔗糖交界面处分布不同的蛋白带，分别通过SDS-PAGE和WB确定病毒粒子的分布位置。
结果如图2所示，蛋白主要富集在病毒浓缩液与30％蔗糖分界面、30％与40％蔗糖溶液分界面、40％与50％蔗糖溶液分界面以及50％与60％蔗糖溶液分界面。上述结果表明不同分子量的蛋白均可被有效的分离开来。分别将上述不同蔗糖溶液交界面的蛋白带分离出来，并通过SDS-PAGE初步分析蛋白的性质。
结果如图3所示，绝大多数的蛋白处于病毒浓缩液与30％蔗糖分界面，且蛋白的分子量处于40-75kD之间，这些蛋白主要以宿主蛋白为主；30％与40％蔗糖溶液分界面以及40％与50％蔗糖溶液分界面蛋白含量较少，但可以看到蛋白条带清晰可见，且分布于各个分子量区间，说明这些蛋白有可能来自一个大的蛋白颗粒；而50％与60％蔗糖溶液分界面的蛋白含量极少。
根据蔗糖密度梯度离心的原理，分子量越大的蛋白，其离心是收到的离心力越大，分布的蔗糖溶液的浓度也越大。新冠病毒的粒子直径约100-120nm，那么，在30％-60％分布的可能性大。为了进一步确认，需要用特异性Western-Blot方法验证。分别用S蛋白和N蛋白特异性抗体开展Western-Blot.
结果如图3所示，30％与40％蔗糖溶液分界面的蛋白泳道中含有大量新冠病毒的S蛋白和N蛋白。由上述实验结果可以说明，新冠病毒颗粒主要集中在质量浓度30％与40％蔗糖溶液分界面。具体的分布区间需要通过连续蔗糖密度梯度超速离心实验确定(见图6)。
实施例4新冠病毒在蔗糖溶液中分布的精确浓度范围
(1)使用实施例1中的方法制备新型冠状病毒收获液60L并灭活水解。
(2)使用大容量高速离心机(选取转子R13C)，以流速为700ml/min，离心力为8000g，进行连续流离心澄清新型冠状病毒灭活液,收集上清液60L。
(3)开启连续流蔗糖密度梯度离心机，制备蔗糖密度梯度。
(4)0rpm时，从下端进液，低密度溶液即PBS，充满转子，开始以100ml/min再进高密度溶液即60％(wt％)蔗糖1600ml(转子体积的1/2)。
(5)设置目标转速5000rpm，设置缓慢升速，在离心力的作用下，蔗糖梯度从横向的梯度，变成较为稳定的纵向梯度。
(6)设置目标转速35000rpm，此时，以200ml/min流速进液PBS至上样转速35000rpm，切换进样口，开始进样。待进样完毕。
(7)以200ml/min流速进样PBS，60min，稳定各组分在蔗糖层中的分布。
(8)开始降速，待转速为0rpm，从底端用蠕动泵泵出收集液，按50ml/支分管收集，在开始收集的同时在线检测蔗糖浓度。通过对每管样品SDS-PAGE和Western-blot(N蛋白含量)的检测及对应的蔗糖浓度，确定新冠病毒在蔗糖溶液中的精确的分布范围。
按照上述步骤进行3个批次实验。
结果如图6所示。通过综合分析，病毒粒子主要集中在53％-32％蔗糖浓度范围(表1)。
表1新冠病毒粒子集中的蔗糖浓度范围
批号 糖浓度范围
001 52.27％-30.34％
002 52.49％-31.43％
003 52.23％-33.59％
实施例5规模化蔗糖密度梯度超速离心纯化新冠病毒的工艺
(1)使用实施例1中的方法制备新型冠状病毒收获液60L并灭活水解。
(2)使用大容量高速离心机(选取转子R13C)，以流速为700ml/min，离心力为8000g，进行连续流离心澄清新型冠状病毒灭活液,收集上清液60L。
(3)开启连续流蔗糖密度梯度离心机，制备蔗糖密度梯度。
(4)0rpm时，从下端进液，低密度溶液即PBS，充满转子，开始以100ml/min再进高密度溶液即60％(wt％)蔗糖1600ml(转子体积的1/2)。
(5)设置目标转速5000rpm，设置缓慢升速，在离心力的作用下，蔗糖梯度从横向的梯度，变成较为稳定的纵向梯度。
(6)设置目标转速35000rpm，此时，以200ml/min流速进液PBS至上样转速35000rpm，切换进样口，开始进样。待进样完毕。
(7)以200ml/min流速进样PBS，60min，稳定各组分在蔗糖层中的分布。
(8)开始降速，待转速为0rpm，从底端用蠕动泵泵出收集液，收集53％-32％蔗糖浓度范围内的样品，然后通过100kD的膜包脱糖，制备成纯化后的病毒液。
计算抗原回收率和杂质去除率(包括宿主DNA、牛血清、抗生素、胰酶和宿主蛋白)结果如表2所示。
表2蔗糖密度梯度离心纯化对杂质的去除分析
Figure BDA0002921772200000101
Figure BDA0002921772200000111
结果表明，使用连续流密度梯度离心的方法纯化新冠病毒，其牛血清、抗生素和宿主蛋白的去除率均高达99％以上；胰酶的去除率均达到95％以上，宿主DNA的去除率也高达92％。
实施例6分子筛层析技术和蔗糖密度梯度离心技术纯化等量的新冠病毒，比较二者在抗原回收和病毒完整性方面的差异
取500ml实施例1中的方法制备的新冠病毒收获液，100倍浓缩后，分别取2ml进行分子筛层析技术和蔗糖密度梯度离心技术纯化。
对于分子筛层析纯化，根据蛋白含量峰型图以及SDS-PAGE结果可知，病毒主要分布于21-33管收获液中(图4)；对于蔗糖密度梯度离心纯化，根据SDS-PAGE结果可知病毒主要分布于30％与40％蔗糖溶液分界面以及40％与50％蔗糖溶液分界面(图3)。
通过检测样品中S蛋白和N蛋白的相对比值，来确定两种纯化方法纯化所得的新冠病毒的粒子完整性；然后通过定量ELISA方法确定两种方法纯化的样品中的S蛋白的绝对抗原含量。
结果如图5所示，蔗糖密度梯度离心纯化的样品的S/N的值显著高于分子筛层析纯化的样品，ELISA结果表明(表3)。
表3两种纯化方法的S蛋白绝对回收量
Figure BDA0002921772200000112
实验结果表明：蔗糖密度梯度离心纯化的样品中S蛋白的绝对含量显著高于分子筛层析纯化的样品。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒密度梯度离心纯化方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)提供一离心转子，所述离心转子被配置为围绕所述离心转子的中心轴旋转离心，并且所述离心转子设有用于容纳物料的内腔，所述内腔的体积为V0，在底部设有物料入口，顶部设有物料出口；
(2)通过所述物料入口，在所述离心转子的内腔中注入缓冲液，然后注入体积V1的60％(wt％)蔗糖溶液；
(3)对所述离心转子以T1进行离心，从而在所述离心转子的内腔形成蔗糖梯度溶液；其中，T1为3000-7000rpm；
(4)以T2离心条件下，以流速F1，将含新型冠状病毒的物料从所述物料入口注入内腔，其中，F1为120-300ml/min；其中，T2为30000-40000rpm；
(5)当含新型冠状病毒的物料注入操作结束后，在离心条件下，以流速F2，将缓冲液从所述物料入口注入内腔，从而使得新型冠状病毒富集于所述蔗糖梯度溶液中，形成富含新型冠状病毒的梯度离心层；
其中，F2为120-300ml/min，且F2/F1＝0.9-1.1；
(6)对所述离心转子的离心速度进行降速，从而使得转速为0rpm；
(7)从所述离心转子的底部入口，收集所述富含新型冠状病毒的梯度离心层，从而获得纯化的新型冠状病毒；
其中，所述V1/V0＝0.4-0.6。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离心转子的V0为3.2L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，F1为150-200ml/min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，离心的转速T2为33000-37000rpm。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(7)中，还包括步骤：对收集的经离心的物料，进行紫外吸光值检测，从而确定所述的富含新型冠状病毒的梯度离心层(即病毒梯度液)。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含新型冠状病毒的物料是用包括以下步骤的方法制备的：
(W1)提供传代培养的Vero细胞；
(W2)在所述的含新型冠状病毒的物料中接种新型冠状病毒，并进行病毒培养，从而获得含新型冠状病毒的培养物；(W3)从所述培养物中，分离获得含新型冠状病毒的上清液；
(W4)对所述病毒上清液进行灭活处理，从而获得所述的含新型冠状病毒的物料。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述富含新型冠状病毒的梯度离心层中，蔗糖浓度为30-55wt％。
8.一种纯化的新型冠状病毒，其特征在于，所述的纯化的新型冠状病毒是用权利要求1-7中任一项所述的方法制备的。
9.一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括：(a)药学上可接受的载体；和(b)权利要求1-7中任一项所述的纯化的新型冠状病毒。
10.一种权利要求8所述的纯化的新型冠状病毒的用途，其特征在于，用于制备新型冠状病毒的疫苗。
CN202110119010.7A 2021-01-28 2021-01-28 一种新型冠状病毒的规模化纯化方法 Pending CN113293147A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110119010.7A CN113293147A (zh) 2021-01-28 2021-01-28 一种新型冠状病毒的规模化纯化方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110119010.7A CN113293147A (zh) 2021-01-28 2021-01-28 一种新型冠状病毒的规模化纯化方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113293147A true CN113293147A (zh) 2021-08-24

Family

ID=77318872

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110119010.7A Pending CN113293147A (zh) 2021-01-28 2021-01-28 一种新型冠状病毒的规模化纯化方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113293147A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108676780A (zh) * 2018-07-24 2018-10-19 华中农业大学 一种高效分离猪肠道冠状病毒的方法
CN111676248A (zh) * 2020-07-02 2020-09-18 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 表达新型冠状病毒S基因与流感M1基因嵌合SARS-CoV-2 VLP的构建
WO2020251405A1 (ru) * 2019-06-14 2020-12-17 Федеральное Государственное Унитарное Предприятие "Санкт-Петербургский Научно-Исследовательский Институт Вакцин И Сывороток И Предприятие По Производству Бактерийных Препаратов" Федерального Медико- Биологического Агентства Получение антигена или антигенов для противогриппозной вакцины
CN212247001U (zh) * 2020-04-30 2020-12-29 上海青赛生物科技有限公司 一种病毒密度梯度离心纯化装置
CN113025584A (zh) * 2019-12-09 2021-06-25 上海青赛生物科技有限公司 狂犬病毒纯化方法与应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108676780A (zh) * 2018-07-24 2018-10-19 华中农业大学 一种高效分离猪肠道冠状病毒的方法
WO2020251405A1 (ru) * 2019-06-14 2020-12-17 Федеральное Государственное Унитарное Предприятие "Санкт-Петербургский Научно-Исследовательский Институт Вакцин И Сывороток И Предприятие По Производству Бактерийных Препаратов" Федерального Медико- Биологического Агентства Получение антигена или антигенов для противогриппозной вакцины
CN113025584A (zh) * 2019-12-09 2021-06-25 上海青赛生物科技有限公司 狂犬病毒纯化方法与应用
CN212247001U (zh) * 2020-04-30 2020-12-29 上海青赛生物科技有限公司 一种病毒密度梯度离心纯化装置
CN111676248A (zh) * 2020-07-02 2020-09-18 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 表达新型冠状病毒S基因与流感M1基因嵌合SARS-CoV-2 VLP的构建

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MASATAKA MORITA: "Continuous Flow Ultracentrifuge System for Production of Infection Prevention Vaccines", 《HITACHI REVIEW》 *
刘珍珍: "狂犬病疫苗蔗糖密度梯度离心纯化工艺开发", 《中国生物工程杂志》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11207397B2 (en) Virus purification
US9844588B2 (en) Inactivated chikungunya viruses (CHIKV) comprising an E1-K211E mutation
JP2019504030A5 (zh)
GB2592769A (en) CpG-adjuvanted SARS-CoV-2 virus vaccine
CA2553805C (en) Improved inactivated feline calicivirus vaccines
ES2893542T3 (es) Vacuna
CN113025584A (zh) 狂犬病毒纯化方法与应用
CN113293147A (zh) 一种新型冠状病毒的规模化纯化方法
CN212247001U (zh) 一种病毒密度梯度离心纯化装置
CN107304230A (zh) 一种抗犬细小病毒精制抗体及其制备方法
CN116286679B (zh) 一株经分离得到的猪流行性腹泻病毒变异株及其应用
RU2810131C1 (ru) Вакцина против ящура генотипа O/ME-SA/PanAsia2ANT-10 из штамма "О N2356/Пакистан/2018" культуральная инактивированная сорбированная
RU2809219C1 (ru) Вакцина против ящура генотипа SAT-1/NWZ культуральная инактивированная сорбированная
RU2804875C1 (ru) Вакцина против ящура генотипа SAT-2/VII из штамма "SAT-2/Eritrea/1998" культуральная инактивированная сорбированная
RU2423995C1 (ru) Способ производства вакцины против гриппа
RU2817031C1 (ru) Штамм "О N 2222/Тайвань/1/2012" вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура
RU2817381C1 (ru) Вакцина против ящура из штамма "A/Египет/EURO-SA/2022" культуральная инактивированная сорбированная
RU2817257C1 (ru) Штамм "SAT-2/XIV/2023" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-2/XIV для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура
CN113583801A (zh) 一种病毒密度梯度离心纯化装置
WO2012088763A1 (zh) 甲型肝炎病毒株sh及其二倍体细胞适应方法
CN117778473A (zh) 抗原性多肽及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210824

RJ01 Rejection of invention patent application after publication