CN112585257A - 用于细胞自动培养的系统、方法及装置 - Google Patents

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埃里克·杰维斯
马丁·奥基恩
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Abstract

本发明公开了用于细胞的自动化培养的系统和方法，以及用于解离一种细胞培养物中的一个或多个集落的装置和方法。所述自动化系统至少包括一个成像模块、一个移液器模块、一个处理模块以及可选的一个载物台模块。通过至少一个处理器实现前述模块的协调操作，该协调操作是基于从在一个第一时间点和一个或多个后续时间点采集的一张或多张图像计算出的所述细胞培养物的一个或多个特征。所述装置包括一个安装表面，其具有一个或多个冲击缓冲器，其被连接至一个可旋转驱动器；一个平台，该平台可依赖于或不依赖于所述驱动器而旋转；以及一个或多个冲击托架，该冲击托架连接至所述平台并可与所述一个或多个冲击缓冲器碰撞，以将解离力传递到所述平台上的一个细胞培养容器中的一种细胞培养物上。

Description

用于细胞自动培养的系统、方法及装置
相关申请的交叉引用
本申请主张享有于2018年6月19日提交的美国临时专利申请号62/686,962的优先权，其全部内容通过引用合并于此。
技术领域
本申请涉及细胞的培养，具体涉及细胞的自动培养。
背景技术
除其他事项外，维持细胞培养物可能涉及培养基的频繁更换、细胞密度的监测、便下游应用的传代或继代培养，例如维持或扩增、以及为下游应用而收获培养的细胞。
根据实验室中细胞培养的规模，细胞的日常维护可能会对研究人员或技术人员造成不适当的时间负担。此外，细胞培养在实际操作中的不一致，无论是单个研究者或技术人员本身的不一致，还是团队成员之间的不一致，都可能导致次优的细胞特征，例如但不限于存活率、生长速度、表型、代谢等方面。此外，常规细胞培养可能会导致相关研究人员或技术人员的重复性劳损。
在实验室的细胞培养规模不一定很大的情况下，培养的细胞的下游应用也可能决定了某些细胞培养的实际操作方法。例如，如果培养的细胞将用于临床应用，则可能需要一定程度的合规性，以最大程度地减少人与细胞培养物的接触。或者，规定或指南可能需要对细胞培养物进行空间和时间上一致的培养/继代培养。
事实上，细胞的自动培养可以解决上述一些问题，同时也可提供其他潜在益处。
细胞(包括但不限于干细胞)培养的自动化途径的一个方面尚未得到现有技术的解决，即涉及从一次传代到另一次传代的一致性培养/继代培养。培养/继代培养细胞的一个不同或相关的挑战，可以是由一个细胞培养容器的不同孔或者不同细胞培养容器中细胞的不同生长动态所引起的。当培养敏感的细胞类型时(例如原代细胞或干细胞时)，这些和其他挑战就会加剧。敏感干细胞的具体例子可包括间充质干细胞(MSC)、上皮干细胞、神经干细胞、胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPSC)。除其他多能细胞类型外，胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(IPSC)可广泛称为多能干细胞(PSC)。
多能干细胞(PSC)倾向于作为密集的粘附的集落或多达数千个细胞的聚集体来生长。基于某些可见的、形态的或表型的线索，研究人员或技术人员将会希望继代培养多能干细胞(PSC)培养物的细胞。事实上，小鼠的多能干细胞(PSC)在完全解离为单个多能干细胞(PSC)或簇后，可进行继代培养，对于在后续培养物中形成新集落的影响很小或没有影响。相反，人类的多能干细胞(PSC)在完全解离成单个多能干细胞(PSC)时，由于例如核型不稳定等原因，在后续培养物中往往表现不佳。但是，当人类的多能干细胞(PSC)在继代培养之前被解离成少量(约5个或更多)的簇时，则往往表现的更好。
众所周知，培养条件(例如传代时间)会影响细胞培养物的性质，从而影响其在下游应用中的效用。上述情况强调了一致性的细胞培养实际操作的重要性，以便对于下游应用结果的重现性具有信心。因此，重要的是细胞培养物的传代在最佳时间点进行，而不是在研究者或技术人员最方便的时间点进行。鉴于培养/继代培养细胞(包括但不限于干细胞，如多能干细胞(PSC))的复杂性，其中几个已经在前面描述过，因此需要一种可以自适应地培养并传代细胞的自动化细胞培养系统，以便在后续传代中获得一致性的后代培养物。
发明内容
本发明公开了用于培养一种细胞培养物的系统和方法。在一个具体实施方式中，所述细胞培养物可以是多能干细胞，且可选的可以是人类的多能干细胞。在一个更具体的实施方式中，所述细胞培养物(如人类的多能干细胞)可以作为(粘附的)细胞培养物进行培养。本发明还描述了用于传代或扩增一种细胞培养物的系统和方法，例如多能干细胞。在一些实施方式中，所述系统和方法是自动化的。
在一个广泛的方面，本发明描述了用于一个细胞培养容器内的一个细胞培养基中的一种细胞培养物的自适应传代的一种自动化系统。所述自动化系统包括一个成像模块(其用于在一个第一时间点和一个或多个后续时间点采集所述细胞培养物的一张或多张图像)、一个移液器模块(其具有一个或多个移液器，用于通过与所述一个或多个移液器的末端相配合的一个移液器吸头从所述细胞培养容器中抽取液体)、一个液体分配器模块(其与所述移液器模块间隔开，与一个以上储液器呈流体连通)、一个处理模块(其具有一对相对的臂，用于夹持和运送所述自动化系统内的细胞培养容器或其盖子或子代细胞培养容器或其盖子)以及至少一个处理器(其与所述成像模块、移液器模块、液体分配器模块以及处理模块联通)。所述处理器被配置为接收来自于所述成像模块的一张或多张图像，基于从成像模块接收到的一张或多张图像，计算所述细胞培养物的一个或多个特征，并执行一个自动传代实验计划以传代所述细胞培养物，所述实验计划包括所述移液器模块、液体分配器模块和成像模块的操作协调，该操作协调是基于将计算出的所述细胞培养物的所述一个或多个特征与所述一个或多个特征的一个已知阈值水平或一个输入阈值水平进行对比。
在一些实施方式中，所述一个或多个特征包括：所述细胞培养物的融合度的度量；所述细胞培养物的细胞或集落的形态的度量；所述细胞培养物的细胞或集落的分化的度量；所述细胞培养的集落大小分布的度量；a)、b)、c)或d)从所述第一时间点到所述一个或多个后续时间点的变化的度量；或a)相对于b)、c)或d)的度量，b)相对于a)、c)或d)的度量，c)相对于a)、b)或d)的度量，或d)相对于a)、b)或c)的度量。
在一些实施方式中，所述已知的或输入的阈值水平是：对于a)，细胞或集落融合度大约在30-90％之间；对于b)，大约在一种对照培养物的±30％之间；对于c)，大约在维持实验计划中的对照培养物的0-30％或分化实验计划中的对照培养物的50％-100％；或对于d)，大约在一种对照培养物的一个平均集落大小分布的15％以内或其子分数以内。
在一些实施方式中，在所述第一时间点或一个或多个后续时间点，计算出的关于与所述细胞培养容器中的所述细胞培养物所述一个或多个特征，与一个第二细胞培养容器中的所述第二细胞培养物是不同的，并且所述一个或多个特征在一个随后传代过程中变得更加一致。
在一些实施方式中，所述成像模块包括能够一台照相机，能够分辨所述培养容器中的单个细胞。
在一些实施方式中，所述系统还包括一个载物台模块，用于支撑所述细胞培养容器。
在一些实施方式中，所述载物台模块在一个第一平面内沿一条第一轴线或一条第二轴线或沿二者是可移动的。
在一些实施方式中，所述载物台模块或其子部件绕其边缘沿一条第三轴线枢转。
在一些实施方式，所述一个或多个移液器被附接到一个滑架上。
在一些实施方式中，所述液体分配器模块包括一根以上的导管，且每根导管与一个以上储液器中的单独一个呈流体连通。
在一些实施方式中，所述液体分配器模块包括一根第一导管(与一种第一溶液的一个储存器呈流体连通)以及一根第二导管(与一种第二溶液的一个储存器呈流体连通)，并且所述第一溶液和所述第二溶液同时被分配到一个子代细胞培养容器中。
在一些实施方式中，每根导管是可重复使用或可更换的。
在一些实施方式中，所述系统还包括一个壳体，所述壳体至少要容纳所述像模块、移液器模块、液体分配器模块、载物台模块和处理模块。
在一些实施方式中，所述壳体是无菌的。
在一些实施方式中，所述系统还包括一个制冷模块，用于存放所述一个以上储液器中的一个或多个以及一个储水器，其中所述一个以上储液器、所述制冷模块以及所述废料储存器位于所述壳体的外部。
在一些实施方式中，所述废料储存器与所述壳体内的一个废料槽呈流体连通。
在一些实施方式中，所述废料槽涂覆有一疏水涂层。
在一些实施方式中，所述系统还包括一个或多个传感器，其中所述一个或多个传感器被配置为检测并报告所述成像模块上、所述载物台模块上或在所述一个以上储液器中的负载质量，以便于检测所述成像模块上、所述载物台模块上或所述一个以上储液器中的负载质量；并在所述负载质量不同于预期时触发一个警报。
在一些实施方式中，该系统还包括一个封闭传送机模块，其连接至所述壳体和一个培养箱模块，并用于将所述细胞培养容器从所述培养箱模块传送到所述处理模块的附近。
在一些实施方式中，所述培养箱模块维持用于所述细胞培养物的允许环境条件。
在一些实施方式中，所述系统还包括一个图形用户界面。
在一些实施方式中，所述图形用户界面就所述一个以上储液器中的每一个显示一个液位报告。
在另一个广泛的方面，本发明描述了用于一个细胞培养容器内的一个细胞培养基中的一个多能干(粘附的)细胞培养物的适应性地传代培养的一种自动化系统。所述自动化系统包括一个成像模块，用于在一个第一时间点以及一个或多个后续时间点采集所述多能干细胞培养物的一张或多张图像；一个移液器模块，其具有一个或多个移液器，以用于通过与所述一个或多个移液器的端部相配合的一个移液器吸头从所述细胞培养容器中吸取液体；一个液体分配器模块，其与所述移液器模块间隔开，且所述液体分配器模块与一个以上储液器呈流体连通；一个处理模块，其具有一对相对的臂，用于在所述自动化系统内夹持和运送所述细胞培养容器或其盖子或是一个子代细胞培养容器或其盖子的；以及至少一个处理器，其与所述成像模块、所述移液器模块、所述液体分配器模块以及处理模块相连通。所述处理器被配置为：接收来自于所述成像模块的一张或多张图像；基于从所述成像模块接收到的所述一张或多张图像，计算所述细胞培养物的一个或多个特征，并执行自动传代实验计划以传代细胞培养物，该实验计划包括所述移液器模块、液体分配器模块和成像模块的操作协调，该协调基于将计算出的所述细胞培养物的所述一个或多个特征与所述一个或多个特征的一个已知阈值水平或是一个输入阈值水平进行比较。
在另一方面，本发明描述了用于适应性地传代一种细胞培养物的一种自动化方法。该方法包括：在一个细胞培养容器内的一个细胞培养基中提供所述细胞培养物；通过一个成像模块在一个第一时间点和随后的一个或多个时间点采集所述细胞培养物的一张或多张图像；基于所述一张或多张图像，通过与所述成像模块通信耦合的至少一个处理器来计算所述细胞培养物的一个或多个特征；以及通过所述至少一个处理器执行一个自动传代实验计划，该执行基于将计算出的所述细胞培养物的所述一个或多个特征与所述一个或多个特征的一个已知阈值水平或是一个预定阈值水平进行比较。
在一些实施方式中，提供所述细胞培养物包括从所述培养箱转移所述细胞培养物。
在一些实施方式中，所述方法还包括将所述细胞培养容器放置在一个载物台模块上。
在一些实施方式中，所述方法还包括从所述细胞培养物中获得一细胞悬液，并将所述细胞悬液的部分或全部接种到一个子代细胞培养容器中。
在一些实施方式中，在接种到所述子代细胞培养容器中之前，将所述细胞悬液通过一个第一移液器吸头传递，从而将所述细胞培养物解离成一个单细胞悬液或是多个簇(其平均直径不超过所述第一移液器吸头的孔直径)。
在一些实施方式中，所述细胞悬液的获得包括从所述细胞培养容器中吸出所述细胞培养基，并使所述细胞培养容器中的所述细胞培养物与一种分离液相接触。
在一些实施方式中，所述分离液是一种解离溶液，并且所述解离溶液选择性地从所述细胞培养容器的壁上剥离出一个第一组分化细胞或一个第二组未分化细胞。
在一些实施方式中，该方法还包括在接种所述细胞悬液之前，将一种第一溶液和一种第二溶液同时分配到所述子代细胞培养容器中。
在一些实施方式中，所述第一溶液是所述细胞培养基，所述第二溶液是一种溶解的细胞外基质。
在一些实施方式中，所述细胞培养物是多能干细胞。
在一些实施方式中，所述多能干细胞是人类的多能干细胞。
在一些实施方式中，所述多能干细胞以簇传代。
在另一方面，本发明描述了用于适应性地传代一种多能(粘附的)细胞培养物的一种自动化方法。所述法包括：在一个细胞培养容器内的一个细胞培养基中提供所述细胞培养物；通过一个成像模块在一个第一时间点和随后的一个或多个时间点采集所述细胞培养物的一张或多张图像；基于所述一张或多张图像，通过与所述成像模块通信耦合的至少一个处理器来计算所述细胞培养物的一个或多个特征；以及所述至少一个处理器执行一个自动传代实验计划，该执行基于将计算出的所述细胞培养物的所述一个或多个特征与所述一个或多个特征的一个已知阈值水平或是一个预定阈值水平进行比较。
在一些实施方式中，该方法还包括从所述细胞培养容器中吸出所述细胞培养基，并使所述细胞培养容器中的所述多能干(粘附的)细胞培养物与一种分离液接触以产生一细胞悬液。
在一些实施方式中，所述分离液是一种解离溶液，其从所述细胞培养容器壁上产生所述细胞悬液(作为选择性解离的一个第一组分化细胞或一个第二组未分化细胞)。
在一些实施方式中，所述细胞悬液包括多能干细胞簇(其平均直径不超过能使所述细胞悬液通过的一个第一移液器吸头的孔径)。
在一些实施方式中，所述方法还包括将所述细胞悬液接种到一个子代培养容器中。
在一些实施方式中，所述方法还包括在接种所述细胞悬液之前将一种第一溶液和一种第二溶液同时分配到所述子代培养容器中。
在一些实施方式中，所述第一溶液是所述细胞培养基，所述第二溶液是一种溶解的细胞外基质。
在另一个广泛的方面，提供了用于在一种细胞培养物中分离一个或多个集落的方法。该方法包括：提供根据本发明的一个装置；将含有已暴露于一种分离液的所述培养细胞的一个或多个集落的一个细胞培养容器设置在所述装置的一个平台上；在驱动器的影响下旋转该平台；以及将该装置的一个或多个冲击托架与该装置的一个或多个冲击缓冲器反复碰撞，所述一个或多个冲击托架耦合到该平台以传递力到平台上以及其上的所述细胞培养容器，以解离所述细胞培养物中的所述一个或多个集落。
在一些实施方式中，所述方法还包括将所述细胞培养物固定在所述平台上。
在一些实施方式中，可以沿顺时针方向旋转所述平台。在一些实施方式中，可沿逆时针方向旋转所述平台。
在一些实施方式中，所述方法还可括使所述驱动器在顺时针方向和逆时针方向之间规则变换旋转。在具体实施方式中，规则变换可包括在顺时针方向和逆时针方向旋转之间的小于5秒的延迟。在更具体的实施方式中，规则变换可包括在顺时针方向和逆时针方向旋转之间的小于1秒的延迟。在更具体的实施方式中，规则变换可包括在顺时针方向和逆时针方向旋转之间的约0.5毫秒或更短的延迟。
在一些实施方式中，细胞培养物的一个或多个集落可以直接或间接粘附至所述细胞培养容器的一个孔底。
在一些实施方式中，所述细胞培养物的一个或多个集落可以是一种多能干细胞培养物中的一个或多个未分化集落。
在另一个广泛方面，提供了用于传代多能干细胞的一种自动化系统。该系统包括：一个载物台模块，用于支撑一个或多个细胞培养容器；一个细胞培养容器处理模块；一个移液器模块；一个液体分配器模块，所述液体分配器模块与所述移液器模块间是隔开的，所述液体分配器模块与多个储液器呈流体连通；根据权利要求1-14中任意一项的所述装置的一个解离模块；一个废料储存器；以及一个控制器，用于所述自动化系统的每个所述模块的操作协调。
在一些实施方式中，所述载物台模块可以包括一个平台，并且该平台或其子部件是可移动的。在一些实施方式中，所述平台或其子部件可以是在第一平面中可移动的。在一些实施方式中，所述平台或其子部件在沿一条第一轴线和一条第二轴线的路径中是可移动的。在一些实施方式中，所述平台或其子部件也可以在沿一条第三轴线的路径中移动。
在一些实施方式中，所述处理模块可以包括一对相对的臂。
在一些实施方式中，所述移液器模块可包括一个以上的移液器，并且每个移液器的端部可与一个一次性移液器吸头配合。
在一些实施方式中，所述移液器模块和所述处理模块都包括在一个可移动单元中。
在一些实施方式中，所述液体分配模块可包括一根以上的管线，并且每根管线可与一个以上储液器中的单独一个呈流体连通。在一些实施方式中，一根以上的管线中的每根管线是可重复使用的。在一些实施方式中，一根以上的管线中的每根管线是可更换的。
在一些实施方式中，所述系统还包括一个成像模块，其中所述成像模块包括能够一台照相机，该照相机能够分辨一个或多个培养容器的孔中的单个细胞。在一些实施方式中，所述成像模块可以包括一个图像处理器，以查询所述一个或多个培养容器的所述孔中的一种多能干细胞培养物的一个特征。
在一些实施方式中，所述系统还包括一个培养箱模块，其中该培养箱模块维持用于所述多能干细胞培养物的允许环境条件。
在一些实施方式中，所述系统还包括一个传送机模块，以将所述一个或多个细胞培养容器从所述培养箱输送到所述处理模块的附近。
在一些实施方式中，所述系统还包括一个制冷模块，以存放所述一个以上储液器中的一个或多个。
在一些实施方式中，所述系统还包括一个壳体，用于至少容纳所述载物台模块、处理模块、移液器模块和涡旋模块。
在一些实施方式中，所述一个以上储液器、所述制冷模块和所述废液储液器位于所述壳体的外部。
在一些实施方式中，所述系统还包括一个图形用户界面。在一些实施方式中，所述图形用户界面可以显示所述一个以上储液器中的每一个的液位报告。
在另一个广泛方面，提供了用于细胞自动传代的方法。该方法包括：提供如本发明所公开的一个系统；使用所述处理模块，将细胞的一个第一细胞培养容器放置在一个载物台模块上；使用所述移液器模块，从所述第一细胞培养容器的一个孔中吸出培养基；使用所述液体分配模块，将一种解离溶液分配到所述第一细胞培养容器的所述孔中；使用所述解离模块，将一个细胞集落从所述第一细胞培养容器的所述孔的底部剥离；将被剥离的细胞集落解离成一细胞悬液；使用所述移液器模块，将一定体积的所述细胞悬液接种到一个第二细胞培养容器的一个孔中。
在一些实施方式中，所述方法还包括在所述放置步骤之前，使用所述传送机模块，从所述培养箱模块运送所述第一细胞培养容器。
在一些实施方式中，所述方法还包括在所述吸出步骤之前，使用所述载物台模块，使所述第一细胞培养容器倾斜。
在一些实施方式中，所述方法还包括在所述吸出步骤之后，使用所述液体分配模块，通过分配的洗涤缓冲液来洗涤所述第一细胞培养容器的所述孔。
在一些实施方式中，所述方法还包括在所述分配步骤之后，在所述培养箱模块中温育所述第一细胞培养容器。
在一些实施方式中，所述方法还包括将所述剥离的细胞集落粉碎成一细胞悬液。
在一些实施方式中，所述方法还包括在所述接种步骤之前，使用所述处理模块，将一个第二细胞培养容器放置在一个载物台模块上。
在一些实施方式中，所述方法还包括使用传送机模块将所述第二细胞培养容器传送至所述培养箱模块。
从以下详细描述，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解的是，代表本发明的优选实施方式的详细描述以及具体示例仅仅是通过说明性的方式给出的，因为从该详细描述，在本发明的原理和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
附图说明
为了更好地理解本发明所描述的各实施方式，以及为了更清楚地示出此处的各种实施方式是如何实现的，以示例性的方式示出了至少一个实施方式的附图作为参考，并且现在将对这些附图进行描述。附图并非旨在限制本文所描述的技术教导的范围。
图1示出了用于传代一种细胞培养物的一种自动化系统的一个实施方式的一个俯视图。可选部件以虚线示出。
图2示出了本文中描述的所述自动化系统中使用的一个成像模块的一个实施方式的一个侧视图。
图3示出了本文中描述的所述自动化系统中使用的一个滑架的一个实施方式的一个正视图(A)以及本文中描述的所述自动化系统的一个实施方式的一个侧视图(B)。
图4示出了使用所述成像模块在不同时间点所采集的(A)一种活细胞培养物的代表性图像，以及在A中(以灰色显示细胞区域)示出的所述活细胞图像的(B)相应转化图样。示出的图像分别为第2天，第3天，第4天，第5天，第6天和第7天，如所注释的。
图5示出了可以确定细胞培养物的融合度，该确定基于所述成像模块采集的所述一张或多张图像。一种活细胞成像的细胞培养物(使用所述上载成像模块)与一种染色细胞培养物的所述相应转化图样(使用Hoechst染色并利用荧光显微镜成像(Hoechst 33258，352nm激发，461nm发射))的融合度的(A)视觉对比。对融合度％进行的(B)回归分析，由对于194种细胞培养物进行的活细胞成像(通过使用成像模块孔)或者对于相同的194种细胞进行Hoechst染色所决定。每个点代表一个细胞培养容器(即，一个6孔板的孔)。(C)一个图表，该图表总结多个连续传代中在各种指明条件下培养的各种指明细胞类型中的一个孔的融合度％。各种指明条件包括温和的细胞解离试剂(Gentle Cell Dissociation Reagent，GCDRTM)(干细胞技术公司)或ReLeSRTM(干细胞技术公司)(基于团生成)、TeSR-E8TM(干细胞技术公司)或mTeSR1TM(干细胞技术公司)维持介质、iPS或ES细胞系以及各种细胞系。
图6示出了可以在一个以上时间点确定融合度％的各种方法。(A)示出了一图表，其中6种细胞培养物(即6孔板的每个孔)的融合度％拟合一个指数增长模型。(B)示出了一个直方图，其中融合度％以及所述指数拟合可用于计算162个F016细胞培养物的倍增时间(平均＝33.1小时，标准差±7.2小时)。(C)示出了一个直方图，其中融合度％和指数拟合可用于计算186个H9细胞培养物的倍增时间(平均＝37.9小时，标准差±14.9小时)。(D)示出了预测的第7天融合度和实际的第7天融合度的回归分析(R2＝0.95)。预测的第7天融合度是通过将第2天到第6天的融合度％数据拟合到如(A)所示的指数增长模型来确定的。
图7示出了可以从喷雾传代细胞和单细胞传代细胞的一幅或多幅图像来计算出融合度％。(A)示出了喷雾传代H9细胞的6孔培养板的每个孔的代表性图像。(B)示出了(A)中每个孔的相应掩蔽区域。(C)示出了对(B)中的掩蔽区域进行图像分析后得到的相应融合度％值。(D)示出了单细胞传代M001细胞的6孔培养板的每个孔的代表性图像。(E)示出了(D)中每个孔的相应掩蔽区域。(F)示出了对(E)中的掩蔽区域进行图像分析之后得出的相应融合度％值。
图8示出了24个孔(即一个6孔板的每个孔)的细胞培养物的平均集落面积的一个回归分析，其计算基于由所述成像模块采集的一个或图像，以及用Hoechst染色法确定的相同细胞培养物的平均集落面积的(R2＝0.86，p＝0.94)；
图9示出了在24种细胞培养物内的总强度(任意单位)的回归分析，其计算基于由成像模块采集的一张或多张图像以及相同的细胞培养物内的实际细胞数(R2＝0.94，p<0.0001)。总强度定义为图像掩蔽区域内每个像素的强度之和。为了产生实际的细胞计数，从培养容器中收获所有细胞并用于产生单细胞悬液，然后将其取样以进行计数。
图10示出了将机器学习算法应用到由所述成像模块采集的一组图像的结果。(A)示出了由成像模块采集的细胞培养物在裁剪后的代表性图像。(B)示出了(A)中所示代表性图像的背景(最暗)、分化(最亮)以及未分化(中间)的自动分类区域的叠加。(C)示出了三种不同分类模型的结果。模型3将所有像素归类为最常见的类别，即未分化，并被列为一个对照。
图11示出了使用ReLeSRTM(干细胞技术公司)的一个自动传代实验计划后，在3种不同细胞系的培养物中剩余的分化区域百分比。对于每种细胞系，对6个不同的孔进行了神经集落、成纤维细胞样集落、完全分化集落(整个)和复杂分化集落的评估。
图12示出了一个曲线图，其中对于在一个以上较早时间点的一种细胞培养物的融合度％的计算，可用来预测所述细胞培养物将达到期望的融合度％(具有较高时间分辨率)的时间。每条线对应于一种不同的细胞培养容器(即，一个6孔板的孔)；
图13示出了对于3次连续传代的1C细胞，在第7天的融合度％的一个6孔板的所述6个孔内的变异系数的一个点图。基于计算出的融合度％的自适应传代，可以导致细胞培养物在一个后续时间点的融合度％更加一致。基于配对样品的Wicoxon符号秩检验，与P1和P2之间相比，没有观察到P0和P2之间的变异系数存在显着差异。在P0，给定板的所有孔均接种相同的材积。在P1处，使用从1:25至1：200的稀释液对孔进行传代，从而得到提高的协方差(COV)。在P2处，将一个回归模型用于自适应传代，为每个孔选择分流比，以便使所述孔会恢复到具有相似的融合度。
图14示出了在本发明的所述自动化系统中使用的一个废料槽的一个实施方式的一个透视图(A)和一个横截面透视图(B)；
图15示出了用于传代一种细胞培养物的一种方法的一个实施方式的一个流程图；
图16示出了用于解离一种细胞培养物中存在的一个或多个集落的所述装置的一个透视图；
图17示出了用于解离一种细胞培养物中存在的一个或多个集落的所述装置的一个前视图；
图18示出了用于解离一种细胞培养物中存在的一个或多个集落的所述装置的一个侧视图；
图19示出了用于解离一种细胞培养物中存在的一个或多个集落的所述装置的一个顶视图。为了说明性之目的，未示出所述载物台，但示出了通常与其连接的所述冲击托架。
具体实施方式
下文描述了各种系统、装置和方法，以提供所要求保护的主题的至少一个实施方式的一个示例。下文所描述的任何实施方式都不限制任何所要求保护的主题，并且任何所要求保护的主题可涵盖不同于下文的系统、装置和方法。所要求保护的主题不限于具有以下所述任何一个系统、装置或方法的所有特征的系统、装置和方法，也不限于具有下文所述的多个或所有系统、装置和方法的共同特征的系统、装置和方法。所要求保护的主题可以存在于本文的任何部分(包括其权利要求和附图)中所公开的部件或处理步骤的任何组合或子组合。因此，本领域技术人员应理解的是，本文所公开的一个系统、装置或方法，结合此处的教导，可以体现本文所包含的任何一个或多个特征，并且这些特征可以使用于任何特定组合或子组合(在物理上可行且可实现其预期目的之组合或子组合)。
进一步地，下文描述的系统、装置或方法，可能不是任何所要求保护的主题的实施方式。在本文所描述的系统、装置或方法中所公开的但在本文中未要求保护的任何主题可以是另外一个保护性文件的主题，例如，一项连续专利申请，并且申请人、发明人和/或所有者不打算通过在本文中将其公开而放弃任何此类发明、或不主张权利或将其贡献给公众。
还应当理解的是，为了简化和清晰说明之目的，在认为适当的情况下，附图中重复的附图标记表示相同或相似的部件。另外还阐述了许多具体细节，以便提供对本文所描述的示例性实施方式的透彻理解。但是，本领域技术人员应理解的是，可以在没有这些具体细节的情况下实践本文所描述的示例性实施方式。在其他情况下，为不模糊本文描述的示例性实施方式，并未详细描述众所周知的方法、过程以及组件。此外，该描述不应视为是对本文所描述的示例性实施方式的范围限制。
应当注意的是，本文所使用例如，“基本上”、“大约”以及“近似”等程度术语，意味着修正后的术语具有合理的偏离量，并且其结果不会发生明显改变。这些程度术语应被解释为包括修正后术语的偏差，例如，1％、2％、5％或10％，如果该偏差不会否定它所修正的术语的含义。
此外，本文的端点所给出的任何数值范围应包括该范围内的所有数字和分数小数(例如，1至5包括1、1.4、2、2.72、3、3.90、4以及5)。还应理解的是，所有数字和分数小数均被假定为由术语“约”修饰，这表示直至所提到的数字的一定数量的变化，例如，1％、2％、5％或10％，如果最终结果没有明显变化的话。
还应注意的是，如本文所使用的，“和/或”一词旨在表示包含性的“或”。即，“X和/或Y”旨在表示X或Y或两者兼而有之。作为另一示例，“X，Y和/或Z”旨在表示X或Y或Z或其任何组合。
本发明描述了用于在一种细胞培养物中培养或解离一个或多个集落的系统、装置和方法。在一个具体实施方式中，所述细胞培养物是多能干细胞，并且可选地是人类的多能干细胞。在一个更具体的实施方式中，所述细胞培养物(如人类的多能干细胞)包括将一个或多个集落解离为人类的多能干细胞的团或簇。本发明还描述了将所述装置和/或方法整合到用于传代或扩增一种细胞培养物的系统和方法中。在一个特定实施方式中，所述系统和方法是自动化的。
如在本文中使用，“传代”是指细胞培养的活动，直到一种细胞培养物可以传代或继代的一个时间点，以及与传代或继代培养一种细胞培养物有关的活动，包括将一些或全部细胞培养物以新鲜的培养基接种到一个或多个子代细胞培养容器中。因此，术语“传代”包括性地指向与细胞常规培养有关的活动，例如所述细胞培养物的继代培养，同时也涉及旨在扩增、收获(例如冷冻保存)或分化一种细胞培养物或上载一种新派生的细胞系的工作流程。在一个实施方式中，可以将来自一个第一细胞培养容器的一定体积的一细胞悬液仅接种在一个子代细胞培养容器中(即1:1传代)。在一个实施方式中，可以将来自一个第一细胞培养容器的一定体积的一细胞悬液接种到多个子代细胞培养容器中(即1:n+1传代，这可以认为是扩增的形式)。
如在本文中使用，“细胞培养物”是指可在一个细胞培养容器中培养、传代、扩增或分化的任何类型的细胞。在一个实施方式中，所述细胞是锚定的独立细胞，例如造血干细胞或其祖细胞。在一个实施方式中，所述细胞是锚定依赖性细胞，例如那些在一个单层中培养的或一种(粘附的)细胞培养物。在一个实施方式中，所述锚定依赖性细胞是间充质干细胞。在一个实施方式中，所述锚定依赖性细胞是多能干细胞(PSC)。该多能干细胞(PSC)可以是胚胎干细胞、幼稚干细胞、扩增多能干细胞或诱导多能干细胞。
如在本文中使用，“细胞培养容器”或“子代细胞培养容器”是指可用于支持细胞培养的一个容器。一个细胞培养容器可以是一单个烧瓶或皿，例如一个圆形皿，或者可以是多孔培养板。当所述细胞培养容器对应于一个多孔培养板时，其每个孔、一些孔或其所有孔都可以被认为是一个细胞培养容器。具体地，在开展传代方法后和一经将细胞培养物接种到新的细胞培养容器中之后，该等新细胞培养容器在本文中被称为子代细胞培养容器。
系统
在本发明的一个方面，描述了用于传代一种细胞培养物的系统。在一个实施方式中，所述细胞是多能干细胞(PSC)，甚至更具体地，所述细胞可以是人类的多能干细胞(PSC)。在一个实施方式中，多能干细胞(PSC)，无论是人类的或其他的，都可以作为一种(粘附的)细胞培养物进行培养或传代。由于在许多应用中都希望将诸如人类的多能干细胞(PSC)的细胞作为团或簇传代，所以用于传代该等细胞的所述自动化系统和方法可适合于其的所述团传代。
在一个实施方式中，一种用于传代一种细胞培养物(例如人类的多能干细胞)的一种自动化系统1包括各种模块，其包括：一个成像模块100、一个移液器模块200、一个液体分配器模块300、一个以上的储液器350(例如，350a，350b，350c等)、一个处理模块400、可选的一个载物台模块500、以及一个处理器600(用于协调所述自动化系统的各模块的操作)(参见图1和3)。
成像模块100包括一台照相机105，在一个实施方式中，照相机105可以放置在一个载物台110(图2)的上方。在一个实施方式中，照相机105可以是固定在载物台110的上方或在其上方是可移动的。在一个实施方式中，照相机105可以是在固定在载物台110下方或在其下方是可移动的。当将一个细胞培养容器放置在载物台110上时，照相机105可以在第一时间点和在一个或多个后续时间点以适当的尺度和分辨率来采集所述细胞培养容器中的所述细胞培养物的一张或多张图像。
在一个实施方式中，照相机105的镜头(未示出的)基本上指向相对于载物台110的所在平面的水平方向，所述细胞培养物的一张或多张图像依靠一个反射镜120来采集(参见图2)。反射镜120放置在与照相机105的镜头相距适当的距离，并且其角度足以将一个物体平面(即，所述细胞培养容器内的所述细胞培养物)反射到照相机105的一个焦平面。在一个实施方式中，反射镜120的角度125约为45°。
照相机105与足够的计算机可读存储器相联，以存储可能是在数十个时间点上采集的数千个细胞培养容器的一张或多张图像。可以将计算机可读存储器本地化到照相机105和/或可以将计算机可读存储器远程存储，例如存储到个人计算机设备上或在云上(即，在远程服务器上)。
在一个实施方式中，照相机105采集移动或静止图像。在一个实施方式中，照相机105采集黑白(或灰度)或彩色静止图像。在一个实施方式中，使用暗场技术采集一张或多张图像，其中所述细胞培养物周围的视野通常是暗的，而所细胞培养物提供样本对比。
在一个实施方式中，照相机105能够对用于培养细胞的一个细胞培养容器的一块区域成像。在这样的实施方式中，所述细胞培养容器可以是一个35mm皿或100mm皿。同样在这样的实施方式中，所述细胞培养容器可以是一个6孔板，并且照相机105可以采集包括其6孔中的每一个的细胞培养区域的单个图像。这样的图像可以原样存储，或者例如，可以与6个相关文件一起存储，作为对应于其每个孔的裁剪图像的子集。在一个实施方式中，可以采集对应于6孔板每个孔的6个单独图像。技术人员应理解的是，所述细胞培养容器可以是任何形式，例如但不限于12孔、24孔、96孔或384孔板，并且在任何情况下照相机105可以采集一张或多张包括其每个孔(或期望的子集)的图像或其每个孔(或期望的子集)的单独图像。
在某些实施方式中，照相机105能够分辨所述细胞培养容器或其孔中的单个细胞。在此类实施方式或在不同的实施方式中，照相机105能够分辨所述细胞培养容器或其孔中的一种细胞培养物的单个集落。由于照相机105能够采集整个细胞培养容器(或其孔)的一张图像，因此照相机105也能够分辨出一个细胞培养容器内一种细胞培养物的所述单个细胞或集落的每一个。
在一些实施方式中，成像模块100包括一个图像处理器，以查询所述细胞培养容器中的一种细胞培养物(例如多能干细胞(PSC))的一个或多个特征。通过查询所述一个或多个特征，系统1可以执行一个适当的操作，诸如一个培养基变化实验计划、一个传代实验计划、一个扩增实验计划、一个分化实验计划或一个培养终止实验计划。在其他实施方式中，用于查询一个或多个特征的处理器不包括在成像模块100内，而是可以单独地包括在例如集中式处理器模块内(集中式处理器模块可包括在计算机设备内)。因此，系统1可包括至少一个处理器(详见下文所述)。
在一个实施方式中，载物台110包括一个或多个称重传感器，以检测并报告在其上面的一个细胞培养容器的存在和重量。因此，所述一个或多个称重传感器可以向系统1提供关于是否开始操作的反馈。例如，如果载物台110不存在细胞培养容器，这可意味着不能进行成像操作。在一个实施方式中，一个或多个称重传感器验证是否已经向/或从一个细胞培养容器中添加或去除了适当体积的溶液。在一个实施方式中，一个或多个称重传感器的灵敏度足以验证盖子是否已从一个细胞培养容器上移除。
在一个实施方式中，载物台110与载物台模块500是相分离的。在一个实施方式中，载物台110是载物台模块500的子部件。在一个实施方式中，载物台110和载物台模块500是同一物品。
系统1还包括一个移液器模块200。移液器模块200包括一个或多个移液器，以用于通过与该一个或多个移液器的端部配合的一个移液器吸头从所述细胞培养容器中抽出流体，例如一种细胞培养基。移液器模块200还包括，与所述一个或多个移液器中的每一个呈流体连通的，一个产生必要的吸力以从细胞培养容器中吸取液体的装置。
在一个实施方式中，移液器模块200的一个或多个移液器可以降低或升高，以使附接到其上的一个移液器吸头与一个细胞培养容器中的流体接触或不接触。在一个实施方式中，可以升高或降低所述细胞培养容器，以使其中的流体与所述一个或多个移液器的一个移液器吸头接触或不接触。
无论一个或多个移液器是否可以在所述垂直平面升高或降低，移液器模块200及其一个或多个移液器在系统1中相对于载物台110沿x轴或y轴或两者移动也是可取的。在这样的实施方式中，移液器模块200可以被包括在一个可移动单元220(或滑架)中，例如通过将所述移液器模块200附接到所述可移动单元220(或滑架)(图3)。在一个实施方式中，滑架220可以沿着系统1内的轨道移动，该轨道可以被悬挂在系统1的平台227之上或植根于系统1的平台227。在一个实施方式中，滑架220可沿平台的一侧或两侧的长度方向或大致沿其长度方向延伸。此类滑架在本领域中是已知的，并且示例性滑架包括NimbusTM(汉密尔顿公司)系统。
在一个实施方式中，所述移液器吸头是一次性的，因此所述一个或多个移液器还可包括一个移液器脱离机构。移液器脱离机构的一个示例包括一个套环，该套环在所述一个或多个移液器的一个管状体上滑动，并且当所述套环的一个边缘接触所述移液器吸头时，使所述移液器吸头与所述管状体脱离。
使用移液器模块200的示例性实例，可以包括但不限于：粉碎一细胞悬液；从一个细胞培养容器中抽出作为废料的液体；或将一个细胞培养容器的一些或全部液体转移到一个子代细胞培养容器，例如在一个自动传代实验计划期间，将细胞接种到一个子代细胞培养容器之时。
系统1还可包括用于移液器吸头的多个吸头架的暂存区域。系统1可容纳不止一个使用中的吸头架，且可容纳一个以上的备用吸头架。在一个实施方式中，移液器吸头架225可对应于一个使用中的移液器吸头架，而移液器吸头架230a、230b、230c和230d可对应于备用吸头架。一旦移液器吸头架225内的移液器吸头用尽后，可以使用一个备用吸头架(230a，230b，230c或230d)来代替用尽的吸头架。当系统1内的所有移液器吸头都用完时，系统1的用户可以在暂存区域加载新的移液器吸头架。暂存区域(与移液器吸头架225串联的盒子)也可用于存放细胞培养容器或其盖子(这些细胞培养容器或其盖子应是可以触及的到但当前并不靠近载物台110或载物台模块500)。
为了尽量减少不必要地污染系统1或其任何部件的可能性，系统1的移液器吸头从一个或多个移液器的端部脱离的所在区域是一个重要的考虑因素。具体地，该区域应当远离系统1的任何部件(如果该部件与一个细胞培养容器、所述移液器吸头架放置区域以及所述使用中的吸头架相接触)。在一个实施方式中，移液器吸头从所述一个或多个移液器脱离进入一个废物容器250。在一个实施方式中，废物容器250可包括在一个可滑动的抽屉中，以便于将其内容物从系统1中移除，同时还尽量减少用户与系统1组件(例如成像模块100、移液器模块200，移液器吸头架225和230以及下文描述的其他模块)的接触。在一个实施方式中，例如，一个传感器检测并报告废物容器250的放置，例如为了避免阻碍滑架220的移动。
系统1还包括一个液体分配模块300。液体分配模块300可与移液器模块200间隔开。为了清楚起见，间隔开表示这些是系统1的不同部件，并且可能在系统1的不同位置。液体分配模块300被使用于将一种溶液批量分配到一个细胞培养容器中，而移液器模块200则用于从一个细胞培养容器中吸取部分或全部液体。使用液体分配模块300的示例性实例可以包括：在使用一细胞悬液接种之前或之后，将一种细胞培养物或分化培养基分配到一个细胞培养容器或一个子代细胞培养容器中；在一个细胞培养容器内的一种细胞培养物的一个自动传代实验计划期间，将一种洗涤缓冲液或细胞分离液分配至一个细胞培养容器；或分配一种细胞培养基质溶液(例如，一种溶解的细胞外基质)。
液体分配模块300包括一根以上的导管325(与一个以上储液器350呈流体连通)(例如，参见图1)。储液器350包含用于进行细胞(如多能干细胞)的自动培养或传代的各种溶液。储液器350中包含的溶液的实例包括但不限于：一种细胞培养基、一种细胞分化培养基、一种细胞培养基质溶液(例如，溶解的细胞外基质)、一种细胞洗涤缓冲液、以及一种细胞分离液或一种细胞解离溶液。
储液器350的所述容物可取决于系统1的用户所采用的工作流程，并且可以根据用户的要求进行更换。工作流程的非限制性示例可以包括：接种细胞、传代细胞、扩增细胞、上载细胞、衍生细胞克隆群，或分化细胞。对于关注多能干细胞培养自动化方面的用户，这样的工作流程特别常见。
储液器350可以容纳在系统1的用户采用的工作流程中使用的任何合理体积的溶液。例如，储液器350可对应于通常用于容纳细胞培养液的500mL瓶。或者，储液器350可以对应于更大的瓶或袋，例如一加仑或10升的广口玻璃瓶。在一些实施方式中，储液器350可以容纳不同体积的溶液。例如，相对较大的储液器中可以提供较大体积的溶液，而相对较小的储液器中可以提供较小体积的溶液。
如上所述，储液器350与液体分配模块300的一根以上的导管325呈流体连通。所述一根以上的导管可以采用任何形式，只要能够通过其传输溶液即可。在一个实施方式中，所述一根以上的导管中的每一根对应于挠性管。为了通过所述一根以上的导管中的每一根传送溶液，储液器350以及所述一根以上的导管可与一个泵相联。在一个实施方式中，所述泵是一个蠕动泵。在一个实施方式中，该泵可以类似于一个排水泵来操作，其通过一根导管从储液器中抽取溶液。
液体分配模块300可以包括一根以上的导管，并且每根导管可以与所述一个以上储液器350中的单独一个呈流体连通，例如，第一导管325a与第一储液器350a呈流体连通，等等(未示出)。在液体分配模块300包括一根以上导管并且每根导管与所述一个以上储液器350中的单独一个呈流体连通的实施方式中，每根导管可以是可重复使用的和/或可更换的。
在一个实施方式中，液体分配模块300可以包括一根第一导管(与一种第一溶液的一个储存器呈流体连通)及与一根第二导管(与一种第二溶液的一个储存器呈流体连通)，并且所述第一溶液和所述第二溶液在不同的时间分配。例如，所述第一溶液可以是一种洗涤缓冲液，所述第二溶液可以是一种细胞分离液或细胞解离溶液。相应地，可以将适当体积的所述第一溶液分配到一个细胞培养容器中(其中可包括或不包括一种细胞培养物)，并且在去除所述第一溶液之后(例如通过使用移液器模块200)，可以将适当体积的所述第二溶液分配到所述细胞培养容器中。或者，所述第一溶液可以对应于所述细胞分离液或细胞解离溶液，而所述第二溶液可以对应于一种细胞培养基。或者，所述第一溶液可以对应于一种细胞培养基质，而所述第二溶液可以对应于一种细胞培养基。
在一个实施方式中，液体分配模块300可包括一根第一导管(与一种第一溶液的一个储存器呈流体连通)以及一根第二导管(与一种第二溶液的一个储存器呈流体连通)，并且所述第一溶液和所述第二溶液同时分配。例如，所述第一溶液可以是一种细胞培养基质溶液，而所述第二溶液可以是一种细胞培养基。因此，可以将适当体积的所述第一溶液分配到一个细胞培养容器中(其中可包括或不包括细胞培养物)，并且在不去除所述第一溶液的情况下，也可以将适当体积的所述第二溶液分配到所述细胞培养容器中。
系统1还包括一个细胞培养容器处理模块400(见图3)。处理模块400可包括一对相对的臂，其用于抓取和运送在自动系统1内的细胞培养容器或其盖子，或子代细胞培养容器或其盖子。抓取细胞培养容器或其盖子的处理模块400可将容器或盖子运送至系统1的另一站(即模块)。
处理模块400还可在系统1内来回移动移液器吸头架。在一个实施方式中，处理模块400可将移液器吸头用尽的移液器吸头架从使用位置运送到废物容器250或运送到用于用尽移液器吸头架的暂存区。然后，处理模块400可将备用移液器吸头架230运送到使用位置。在一个替代实施方式中，用户可以在系统1内来回移动移液器吸头架。
处理模块400也可以与移液器模块200一起包括在滑架220中(图3A)。在一个实施方式中，处理模块400是一个不同于滑架220的移液器模块200的元件。在一个实施方式中，移液器模块200还可执行处理模块400的功能。例如，一对桨叶可以与两个移液器的端部配合(而不是移液器吸头)，并且这对桨叶可以用于在系统1内抓取和运送细胞培养容器或其盖子。在一个实施方式中，处理模块400和移液器模块200都可以作为不同的元件被包括在滑架220中，并且移液器模块200还可以提供抓取功能(通过使两个移液器的端部与一对桨板配合)。
系统1还可以包括一个载物台模块500，用于支撑位于其上的一个或多个细胞培养容器。载物台模块500可以至少部分地位于液体分配器模块300的下方，并且还可以至少部分地位于成像模块100的下方(图1)。
载物台模块500可以包括一个平台510，其中载物台模块500或平台510或其子组件是可移动的。载物台模块500或平台510或其子部件可以在第一水平面内移动。在载物台模块500或平台510或其子部件可在第一水平面内移动的实施方式中，其可在沿一条第一轴线(即一条x轴)的一条路径中或沿一条第二轴线(即一条y轴)的一条路径中移动，或可在上述两条路径中移动。
载物台模块500或平台510或其子组件的水平平面移动可有助于包含在细胞培养容器或其一个或多个孔中的细胞分散，例如在其中接种一定体积的细胞悬液之时。水平平面移动还有助于在细胞培养容器或其一个或多个孔中分散分配其中的溶液，例如一种细胞培养培养基、一种洗涤缓冲液、一种剥离或解离溶液、或一种细胞培养基质溶液(例如，一种溶解的细胞外基质)。
在一个实施方式中，载物台模块500或平台510或其子部件也可以沿在一条第三轴线的路径中移动。例如，载物台模块500或平台510或其子部件，可以沿载物台模块500或平台510或其子部件的边缘垂直倾斜或枢转。在一个特定实施方式中，倾斜发生在载物台模块500的子部件(例如平台510)的边缘。
载物台模块500或平台510或其子部件的倾斜移动，可有助于将可能包含在细胞培养容器中的任何溶液收集到其一个角落中，包括其一个或多个孔的每一个角落中。这种细胞培养容器内的溶液收集，可有助于移液器模块200的粉碎或抽吸操作，包括从细胞培养容器中吸取一定体积的细胞悬液以接种在子代细胞培养容器中。因此，当载物台模块500或平台510或其子部件上放置有细胞培养容器时，移液器模块200的一个以上的移液器应当可以触及载物台模块500或平台510或其子部件。
处理模块400的一个特定功能可以是在系统1执行其各种功能(例如采集一个或图像)之前，以及在执行细胞培养的自动化方法的各步骤之前，将细胞培养容器放置在载物台模块500(或平台110)上。
在一个实施方式中，载物台模块500包括一个或多个称重传感器，以检测并报告其上的细胞培养容器的存在和重量。因此，所述一个或多个称重传感器可以向系统1提供关于是否开始操作的反馈。例如，报告载物台模块500上不存在细胞培养容器，这可意味着不应执行液体分配操作，以防止不必要的溢出并防止系统1必须离线。在一个实施方式中，一个或多个称重传感器灵敏度足以验证盖子是否已从细胞培养容器上移除。在一个实施方式中，一个或多个称重传感器灵敏度足以验证已经发生的液体转移(低至约100pL)。
在一个实施中，载物台110包含在载物台模块500中。在一个实施方式中，载物台110不同于载物台模块500。
系统1还包括至少一个处理器600，其通信地耦合到至少成像模块100、移液器模块200、液体分配器模块300和处理模块400。在一个实施方式中，至少一个处理器600通信地耦合到至少成像模块100、移液器模块200、液体分配器模块300、处理模块400和载物台模块500。
对于成像模块100，至少一个处理器600可以启动命令是否要：将细胞培养容器放置在载物台110(或载物台模块500或平台510或其子部件)上或从载物台110(或载物台模块500或平台510或其子部件)上移除细胞培养容器；采集一张或多张图像；或基于一张或多张图像计算一个或多个特征。
对于移液器模块200，至少一个处理器600可以发起命令是否要：从系统1中的一个第一位置移动到系统1中的一个第二位置；从一个细胞培养容器中吸出一定体积，例如一定体积的细胞悬液；粉碎(即上下吸液)在一个细胞培养容器中的一定体积；在一个子代细胞培养容器中接种一定体积的细胞悬液；将一个移液器吸头从所述一个或多个移液器的一个端部脱离；或将抽吸的体积排入废料槽(参见下文)。
对于液体分配模块300，至少一个处理器600可以发起命令是否要：将一定量的液体分配到一个细胞培养容器中；或者指定何种溶液要被分配以及这种溶液的体积。
对于处理模块400，至少一个处理器600可以发起命令是否要：从系统1中的一个第一位置移动到系统1中的一个第二位置；将一个细胞培养容器或其盖子从系统1的一个第一位置移动到系统1的一个第二位置；移除一个细胞培养容器的一个盖子；或移动一个移液器吸头架。至少一个处理器600还可以发起命令：是否要优先于处理模块400的一对相对的臂，接合所述一对桨片。
关于载物台模块500，至少一个处理器600可以发起命令是否要：在沿着所述X轴或Y轴或两者的一条路径中移动载物台模块500或平台510或其子部件；或者沿其边缘倾斜载物台模块500或平台510或其子部件。
在一个实施方式中，系统1包括一个中央处理器600，用于协调系统1的各个模块的操作，以执行一个自动传代、培养，扩增或分化实验计划。应当注意的是，在下文或本文中的任何地方使用的术语“传代”，其意图是术语“培养”，“扩增”或“分化”或其变体可以同等适用。在这样的实施方式中，处理器600可以被包含在与系统1通信耦合的计算机设备中。
在一个实施方式中，系统1包括一个以上的处理器600，用于协调系统1的各个模块的操作，以执行一个自动传代、培养、扩增或分化实验计划。在这样的实施方式中，第一处理器可被包括在与系统1通信耦合的第一计算机设备中，而第二处理器可包括在第二计算机设备中，该第二计算机设备可以被集成在系统1的模块中(例如成像模块100的图像处理器)，并通信耦合到第一处理器和系统1。
虽然如此，至少一个处理器600被配置为从成像模块100接收一张或多张图像，并且基于从成像模块100接收到的一张或多张图像，计算所述细胞培养物的一个或多个特征。
在一个实施方式中，一个或多个特征对应于一个细胞培养容器内一种细胞培养物的融合度的一个度量。所述细胞培养物的融合度可以通过如下来计算：分析一张或多张图像，以确定被所述细胞培养物覆盖的所述细胞培养容器的所述表面积，或用于做出所述确定的所述表面积的该等其他部分，然后将该值除以所述细胞培养容器的总表面积，或用于做出所述确定的所述表面积的所述该等其他部分。在一个实施方式中，可执行一个软件脚本，以将所述一张或多张图像中的每一个转换为一个表达，其中将灰色或灰度像素分配给所述细胞培养物，对比来自白色背景的细胞培养物。在一个实施方式中，细胞可以在黑色背景下被指定为白色、灰色或灰度像素。无论如何，一个被转换的表达可以很容易地由系统1的至少一个处理器600进行分析，以确定所述细胞培养容器内的细胞培养物的融合度。
图4A示出了在一个细胞培养容器的孔内的细胞培养物每天的图像。通过外观检查图像可确认，与随后的一个或多个时间点相比，细胞培养物的融合度从一个第一(较早的)时间点开始增加，但融合度和对其改变很难有效地且可靠地量化。图4b示出了图4A中每一图片转换后的表达。基于转换后的表达，系统1的至少一个处理器600可以容易地计算在一个细胞培养容器内或在多个细胞培养容器之间的细胞培养物的融合度，无论是在一个单一时间点或跨多个时间点。
基于所述转换的表达对融合度的确定，是与使用DNA结合染料(例如Floechst染色)的经典方法确定的融合度相一致的(图5A和5B)。图5A比较了未染色的或者用Hoechst染色的同一细胞培养容器的实际图像和转换表达。图5B通过回归分析，验证了使用两种方法计算的细胞培养物融合度的一致性(R2＝0.9，标准误差＝0.04，p＝0.95)。图5C证明了可以基于不同条件下培养的各种细胞系的一张或多张图像，计算一系列时间点上的细胞培养物的融合度。
另外，基于所述转换的表达在不同时间点对融合度的确定，证实了一种细胞培养物的融合度增加大致拟合一个指数细胞生长模型(图6A)，与培养中细胞的预期生长率一致。融合度变化的确定，还可用于计算一种细胞培养物的生长速率(即倍增时间)。图6B和C示出了对于两种不同的细胞培养物(即细胞系)，计算的倍增时间与预期值一致。基于细胞培养物融合度随时间的变化所确定的指数生长模型，有可能预测在一个后续时间点的细胞培养物的融合度(图6D)。图6D证实了预测的在所述后续时间点的融合度与在相同的后续时间点的同一细胞培养物的实际融合度一致。
尽管前述内容证明了基于团传代的一种细胞培养物的一张或多张图像，可以计算融合度，也有可能计算经过喷雾传代(通过反复清洗细胞培养物上的细胞培养基来剥离的细胞，而不是机械刮擦)或作为单细胞传代的细胞培养物的融合度(图7A-F)。因此，本文公开的自动化系统和方法可适用于不一定要团传代/培养的细胞，一般而言如哺乳动物细胞，包括但不限于某些多能干细胞(PSC)系、间充质干细胞、上皮干细胞、神经干细胞、癌细胞、癌细胞系等。在以多能干细胞(PSC)作为单个细胞传代的实施方式中，可能有必要在培养基中包含促进单个多能干细胞(PSC)存活的补充剂，例如CloneRTM(干细胞技术公司)或其他可能公开和/或市售的补充剂。因此，有可能使用自动化系统1来获得细胞的克隆群。
在一个实施方式中，一个或多个特征对应于一个细胞培养容器内细胞数量的度量。在一种细胞培养物中的细胞数量，例如以集落组织的细胞，至少可能是单个细胞的面积、单个细胞被包括在内的集落面积、和/或在在所述集落内的细胞堆积程度的函数。在许多情况下可能已经知道了所关注的一个单个细胞的面积，一个单个细胞和一个细胞集落的各个面积以及所述细胞堆积的程度都可以从一张或多张图像(图像使用成像模块100采集)计算出。实际上，一个较大集落面积以及在一个细胞集落中的细胞堆积的高程度，对应于该集落中细胞数目的增加，以及相应地一种细胞培养物中细胞数目的增加。
尽管可以基于原始图像或由一张或多张图像的转换表示来计算集落面积，但是量化细胞堆积的程度具有更大的挑战。可以基于单个集落的亮度来确定细胞堆积的程度，因为随着细胞层的增加，能够穿过的光会更少，从而产生一个相对较亮的集落。在一个实施方式中，可以将转换表达以一个热图的形式呈现，从热图可以确定细胞堆积的程度。在一个实施方式中，一张或多张图像的原始图像可以提供关于集落表观亮度的足够数据。无论如何，在获得必要的值后，可以计算出细胞培养容器(或其中每个集落)中的细胞数。在特定细胞培养物不易发生细胞堆积的实施方式中，则可以在不依赖于确定细胞培养物的单个集落的亮度的情况下计算细胞数。
在图8中，示出了：基于一张或多张图像计算的平均集落尺寸(即面积)，对应于使用Hoechst染色方法测定的平均集落尺寸(即面积)(R2＝0.86，p＝0.94)。因此，可从一张或多张图像确定细胞培养物中(或多个细胞培养物之间)的集落大小分布的度量，并且该等一个或多个特征可单独地或结合任何其他一个或多个特征来影响系统1的操作。
在图9中，示出了可以基于使用成像模块100采集的一张或多张图像来计算细胞培养容器内的总细胞数，以及该计算显示了与使用手动方法获得的总细胞数的良好相关性(R2＝0.94，p＜0.0001)。基于一张或多张图像对总细胞数的确定，用原始强度密度术语来表示，其中原始强度密度值是根据细胞融合度的转换表达结合活细胞培养物的一张或多张图像(即，原始图像)来生成的。
在一个实施方式中，所述一个或多个特征可对应于细胞培养容器内细胞培养物的形态的一个度量。可以通过基于一张或多张图像，将细胞培养物的数字轮廓与已知标准进行比较，来确定细胞培养物的可接受或不可接受的形态。例如，一个多能干细胞(PSC)集落通常具有光滑边缘的半球形，表现出紧密的细胞堆积和高的核质比。相反，分化的多能干细胞(PSC)集落或正在经历分化的那些多能干细胞(PSC)集落偏离了上述特征。因此，可以基于一张或多张图像，生成细胞培养物中多能干细胞(PSC)集落的数字轮廓；并且一经与标准比较，系统1可以经由至少一个处理器执行一个适当行动方针。
在与以上段落有关的一个实施方式中，所述一个或多个特征可以对应于细胞培养容器内细胞培养物的分化程度的一个度量。基于一张或多张图像，细胞培养物形态(例如，以每个集落为基础或以平均水平为基础)与标准相比的一致性或不一致性，可预示着细胞培养物的分化状态。例如，如果正在使用自动化系统1进行分化实验计划，并且计算出的一个或多个特征确认了在特定时间点的预期细胞形态，那么可能就没有必要偏离该实验计划了。但是，如果基于计算的一个或多个特征，确定分化小于预期或没有分化，则系统1可允许试验计划继续开展以获得进一步的一张或多张图像，或者系统1可执行培养基变化以引入新的分化培养基。在另一个示例中，如果自动化系统1正在执行多能干细胞(PSC)培养的扩增实验计划或维持实验计划，则显著程度的分化可更早地触发预期的传代实验计划或终止实验计划。
在一个实施方式中，细胞培养物的分化状态(或形态变化)的确定，可依赖于一张或多张图像，以及得自使用机器学习分类器(即，受过训练的机器学习分类器)的数据得出的方程或模型。图10A和10B分别示出了由成像模块100采集的一张代表性图像和图10A中的未分化、分化(较亮)和背景(最暗)区域覆盖的一张代表性图像。图10C示出了使用三种不同分类模型的分类器的结果。使用第一种分类模型(其仅依赖于对未分化集落进行分类，而忽略了预测因子)，可以实现53.83％±0.00％的分类精度。使用第二种分类模型(其将特征分配给具有最高相关性的类别，即未分化、分化和背景)，可以达到94.93％±0.08％的分类精度。使用第三种分类模型(其基于决策树规则将特征分配给类别，即未分化、分化和背景)，可以实现99.90％±0.02％的分类精度。用于生成上述数据的分类器通过使用一组图像来训练，其中背景、未分化的多能干细胞(PSC)和分化的多能干细胞(PSC)区域在一张或多张图像的子集中手动选择。该训练图像组不包括图10中的测试图像。分类器的训练和实验使用WEKA Workbench来进行。参见，例如伊恩·H·维滕(Ian H.Witten)和易北河·弗兰克(Elbe Frank)(2005)所著的，《数据挖掘：实用的机器学习工具和技术》(Data Mining:Practical machine learning tools and techniques)，第二版，摩根考夫曼(MorganKaufmann)出版社，旧金山，2005年。
由于外胚层、内胚层和中胚层谱系细胞各自表现出独特的形态，因此受过训练的机器学习分类器也有可能基于一张或多张图像进行这种区分。
在以本文公开的用于执行多能干细胞(PSC)维持实验计划的系统或方法的实施方式中，也有可能选择性地传代未分化的多能干细胞(PSC)，从而在细胞培养容器中留下表现出较高分化程度的集落(图11)。例如，在系统1响应于至少一个处理器600发出的命令而启动传代实验计划的时候，移液器模块200可以从细胞培养容器中吸取细胞培养基(无论是否依赖载物台模块500的倾斜功能)，而液体分配器模块300可将一定量的洗涤缓冲液分配到细胞培养容器中(随后使用移液器模块200吸出该洗涤缓冲液)。可以将一种专用细胞分离液，诸如ReLeSRTM(干细胞技术公司)，分配到所述细胞培养容器中，以从细胞培养容器中选择性地剥离未分化的多能干细胞(PSC)集落。根据细胞培养物分化的度量，可以调整暴露于所述细胞分离液中的时间。例如，在评估高度分化情况下，较短的培养时间可减少变得剥离的分化集落的比例。因此，接种仅产生自未分化的多能干细胞(PSC)的剥离集落的细胞悬液，可在子代细胞培养容器中富集未分化的多能干细胞(PSC)。同样，在进行分化实验计划时，可丢弃这样的未分化多能干细胞(PSC)的剥离集落，剩余的分化集落可被解离，然后传代。
在一个实施方式中，一个或多个特征可对应于所计算的一个或多个特征从一个第一时间点相对于一个或多个后续时间点的变化度量。例如，所述一个或多个特征可以是所述细胞培养物在一个第一时间点的融合度对比所述细胞培养物在一个第二时间点的融合度的度量。
图12示出了使用自动化系统1执行一个传代实验计划时间的确定，可以基于对一种细胞培养物在一个第一时间点和一个或多个后续时间点的融合度的计算。因此，将上述数据外推至任何细胞培养物的一个最大或期望的传代融合度，可有助于安排传代实验计划，特别是当自动化系统1在任意一个时间点负责多达数百个板时。
在一个实施方式中，所述一个或多个特征可对应于所述一个或多个特征的其中一个的度量(作为所述一个或多个特征中的另一个特征的函数)。例如，所述一个或多个特征可以是细胞培养物的融合度的度量(作为细胞培养物的细胞或集落分化程度的函数)，反之亦然。所述一个或多个特征中的该等特征也可以在一个第一时间点和在一个或多个后续时间点进行评定。
基于对所有数据点(与所述一个或多个特征的计算相关)的获取和分析，系统1能够自我学习(即自我训练)，并且不需要操作员提供有关何时执行自动传代或其他实验计划的指令。因此，本发明所公开的主题可以涉及用于自适应性地传代细胞培养物的系统和方法。
本文所使用的“自适应地传代”是指一种灵活的传代实验计划，且其执行依赖于基于在一个或多个时间点采集的一张或多张图像而计算出的一个或多个特征。此外，该等传代实验计划并不必然依赖于来自系统1的操作者的提示。相反，已经处理了一张或多张图像(在一个或多个时间点采集的)并计算了一个或多个特征的系统1，可以在适当的时间以适当数量的细胞执行一个传代实验计划(或扩增实验计划或分化实验计划)，以便在后续的每一次传代中(例如但不限于在细胞培养物的常规维持培养中或在新衍生或获得的细胞系的上载操作中)获得或维持一致的细胞培养物。
在一个实施方式中，在一个第一时间点或在一个或多个后续时间点，细胞培养容器中的细胞培养物计算的一个或多个特征，与第二细胞培养容器中的第二细胞培养物是不同的，并且，基于系统1的操作，所述一个或多个特征在一个后续传代中变得更加一致。例如，如果在第一细胞培养容器或在其第一孔中的第一细胞培养物在一个第一时间点(例如，0代的第6天)的融合度为25％，以及在所述第二细胞培养容器，例如在所述第一细胞培养容器的第二孔中，第二细胞培养物在一个第一时间点的融合度为10％，则这将导致执行异步自动传代实验计划。就效率而言，执行异步自动传代实验计划可能是不可取的，但是如果例如第一细胞培养物和第二细胞培养物处于相同细胞培养容器的不同孔中，则可能会使一个细胞培养物面临不必要的风险，因为另一种细胞培养物正在传代。因此，自动化系统1可以适应性地调整第一和第二细胞培养物两者的一个随后传代的一个或多个元素，例如接种密度，以便使第一和第二细胞培养物的融合度在后续时间点(例如，第0+n代的第6天)变得更为一致。
图13示出了在多个细胞培养容器中，多个细胞培养物的融合度变化相对较大，在使用系统1进行自适应传代实验计划后，融合度变化可变得更加一致。在确定了亲代细胞培养容器的融合度与子代细胞培养容器的融合度之间的关系之后，有可能计算出到注入到一个子代或孙代细胞培养容器中的细胞悬液的适当稀释度(即接种密度)。
系统1的至少一个处理器还被配置为执行一个自动传代实验计划以传代细胞培养物，该实验计划包括协调至少成像模块100、移液器模块200、液体分配器模块300和处理模块400的操作，该协调基于计算出的所述细胞培养物的所述一个或多个特征与所述细胞培养物的所述一个或多个特征的已知或输入阈值水平的比较。
一经采集一张或多张图像，自动化系统1(其通过通信耦合到成像模块的至少一个处理器600)计算所述细胞培养物的所述一个或多个特征，该计算基于所述一张或多张图像。在一个实施方式中，可根据以上描述来完成对所述一个或多个特征的计算。具体地，所述一个或多个特征可包括：
a)所述细胞培养物的所述融合度的度量；
b)所述细胞培养物的细胞或集落的形态的度量；
c)所述细胞培养物的细胞或集落的分化的度量；
d)所述细胞培养物的所述集落的大小分布的度量；
e)a)、b)、c)或d)从所述第一时间点到所述一个或多个后续时间点的变化的度量；或
f)a)相对于b)、c)或d)的度量，b)相对于a)、c)或d)的度量，c)相对于a)、b)或d)的度量，或d)相对于a)、b)或c)的度量。
在计算了所述一个或多个特征之后，自动化系统1执行一个自动传代实验计划(通过至少一个处理器600)，该执行基于将计算出的所述细胞培养物的所述一个或多个特征与所述细胞培养物的所述一个或多个特征的一个已知或输入阈值水平进行的比较。
在一个实施方式中，关于一种细胞培养物(即，细胞或集落)的融合度的度量，所述已知或输入的阈值水平范围为约30-90％。因此，如果所述细胞培养物已达到约30-90％之间的融合度，则自动化系统1可以启动传代实验计划。在一个实施方式中，一种细胞培养物(即，细胞或集落)的融合度的度量位于约40-80％的范围之间。在一个实施方式中，一种细胞培养物(即，细胞或集落)的融合度的度量位于约50-70％的范围之间。
在一个实施方式中，关于一种细胞培养物(即，细胞或集落)的形态的度量，所述已知或输入的阈值水平大约为对照细胞培养物的±30％。因此，如果细胞培养物就其形态而言偏离了对照细胞培养物的大约±30％之间，则自动化系统1可以启动传代实验计划。在一个实施方式中，细胞培养物(即，细胞或集落)的形态的度量大约为对照细胞培养物的±20％。在一个实施方式中，细胞培养物(即细胞或集落)的形态的度量大约为对照细胞培养物的±10％。
在一个实施方式中，关于一种细胞培养物(即，细胞或集落)的分化水平的度量，所述已知或输入的阈值水平在一个维持实验计划中大约为一种对照培养物的0至30％之间或大约为有一个分化实验计划中一种未对照培养物的50％-100％之间。一方面，如果所述细胞培养物中相对于一个维持实验计划的一种对照培养物已达到约0-30％，或约10-20％，或约15％的分化水平，则可以启动自动化系统1传代实验计划。相反，如果所述细胞培养物相对于一个分化实验计划中的一种对照培养物已达到约0-30％，或约10-20％，或约15％的分化水平，则自动化系统1可能不会启动传代实验计划。相反，在这种情况下，自动化系统1可以不做任何事情，或者用新鲜的分化培养基代替失效的分化培养基。另一方面，如果细胞培养物相对分化实验计划中的对照培养物达到了约50-100％，或约60-90％，或约70-80％，或约75％的分化水平，则自动化系统1可启动传代(和/或扩增)实验计划，或收获分化的细胞用于下游应用。相反，如果细胞培养物相对于维持实验计划中的对照培养物已达到约50-100％，或约60-90％，或约70-80％，或约75％的分化水平，则自动化系统1可以启动传代实验计划，以尝试并复苏细胞培养物或终止实验计划。
在一个实施方式中，关于细胞培养物(即细胞或集落)的集落尺寸分布的度量，所述已知或输入的阈值水平为对照培养物的平均集落尺寸的约20％或约15％、或约10％或约5％或其子分数以内。因此，如果所述细胞培养物的平均集落尺寸分布达到对照培养物的平均集落尺寸分布的约20％或约15％或约10％或约5％或其子分数以内，则系统1可以启动传代实验计划。在一个实施方式中，位于对照培养物的平均集落尺寸分布的约20％或约15％、或约10％或约5％以内的阈值水平属于集落尺寸分布的子分数，例如，前10％，或前20％或前30％或前40％，或后10％，或后20％，或后30％，或后40％。
系统1还可包括一个壳体700，以至少容纳移液器模块200、液体分配器模块300、处理模块400和载物台模块500、移液器吸头支架225和230以及滑架220(在包括这些的实施方式中)。成像模块100和照相机105也可以被容纳在壳体700(图3B)中，但是也可以被包括在其他地方，诸如在一个培养箱模块(在下文中描述)中。
在一个实施方式中，壳体700保持无菌的内部环境。在一个实施方式中，壳体700可对应于一个无菌室。在这样的实施方式中，本发明所公开的系统1的所有模块可以被包括在所述无菌室中。在一个实施方式中，壳体700可对应于一个生物安全柜。在这样一个实施方式中，由于空间限制，位于其中的模块应限于执行所述自动传代(或其他)实验计划的模块。
在一个实施方式中，一个以上储液器350、一个制冷模块800和一个废料储存器900位于壳体700的外部。
系统1还可包括一个制冷模块800，以存放所述一个以上储液器350中的一个或多个。制冷模块800用于在一个理想温度下存储所述一个以上储液器350中的一个或多个。例如，一个细胞培养基应在4℃左右储存，以限制其内容物的降解。类似地，细胞分离液、洗涤缓冲液，以及某些细胞培养基质溶液也需要在4℃左右储存。
制冷模块800可包括一个或多个传感器。在一个实施方式中，一个第一传感器检测和报告(向至少一个处理器600)关于所述以上储液器350中的每一个的质量。因此，所述第一传感器向系统1提供关于一适当体积的溶液已经从所述第一储液器中分配的实时反馈。如果没有该反馈的话，则系统1可以决定要从第一储液器分配的一校正体积的溶液。在所述相同或一个不同的实施方式中，一个第二传感器检测并报告(向至少一个处理器600)制冷模块800内的温度。因此，所述第二传感器向系统1提供有关制冷模块800保持在适当温度的实时反馈。
系统1还可以包括废料储存器900(见图1)。废料储存器900可以与位于壳体700内的废料槽925呈流体连通。为了尽量减少对系统1内的细胞培养物或其他成分污染的可能性(无论是通关过不想要的溶液还是微生物)，废料槽的设计和位置是重要的考虑因素。图14A和14B示出了废料槽925的一种实施方式。
在一个实施方式中，所述废料槽925可以是远离成像模块100、液体分配模块300和载物台模块500。在一个实施方式中，所述废料槽925可位于液体分配器模块300下方，以简化在启动操作期间从液体分配器模块300的一个或多根导管中去除细胞培养溶液的过程(即，从所述导管中清除旧的或室温的溶液)。
废料槽925包括一个通道930，用于将一种溶液输送到废料储存器900中。在一个实施方式中，废料槽包括一个第一槽935和一个第二槽937，所述第一槽和第二槽均与通道930呈流体连通。所述第一槽935可接收来自移液器模块200的排放物，所述第二槽可接收来自液体分配器模块300的排放物，更具体地说，可接收来自与其相关联的所述一根以上导管的排放物。
在一个实施方式中，第一槽935还包括一个冲洗入口938，用于提供一种溶液(例如一种消毒溶液)。本领域技术人员应知晓在细胞培养过程中有用的合适消毒溶液。例如，所述消毒溶液可以是稀释的漂白剂。或者，所述消毒溶液可以是一种醇(例如一种异丙醇)。
在一个实施方式中，废料槽925可以包括一个几何形状，该几何形状最小化在其中排出的溶液的汇集池。在一个实施方式中，废料槽925的一个接收表面940可以是朝着通道930向下倾斜的，从而促使排放溶液通过通道930。在一个实施方式中，接收表面940还可以包括一对倾斜的壁，所述倾斜的壁汇聚到形成在接收表面940上的一个点或基本上一个点。在这样的实施方式中，该对汇聚壁与所述向下的斜面配合，促使排放溶液朝着并通过通道930。
在一个实施方式中，废料槽925还包括一个液位传感器945，以检测并报告(向至少一个处理器600)关于废料储存器900的累积或通道930的堵塞。
在一个实施方式中，废料槽925可以涂覆有一疏水涂层或一超疏水涂层。在一个实施方式中，所述涂层可以是基于二氧化硅纳米颗粒。本领域技术人员应意识到其他合适的疏水或超疏水涂层，例如硅氧烷或全氟碳基涂层等。
在一个实施方式中，废料槽925可占据相对较小的立足面，以尽量减小残留溶液(诸如细胞培养基之类)可能聚集并产生潜在的污染问题的较大开放区域。在一个实施方式中，废料槽925还包括一个盖950，以进一步减小开放区域而又不减小其容量。
系统1还可包括一个培养箱模块1000，其中，该培养箱模块维持用于培养诸如多能干细胞的细胞的允许环境条件。培养箱器模块是本领域已知的，并且可以购买(例如从Liconic公司)。在一个实施方式中，培养箱模块1000可包括用于多个细胞培养容器的架子。在一个实施方式中，培养箱模块1000还包括一个处理装置，用于选择性地从架子上抽出一个细胞培养容器，并且这种处理装置对于所述细胞培养容器的选择性抽出，是基于与所述细胞培养容器相关联的唯一标识符(即，条形码和条形码代码阅读器)。
在一个实施方式中，培养箱模块1000包括一个或多个传感器以检测并报告(向至少一个处理器600)关于其中的温度或诸如湿度以及诸如CO2％之类的其他大气条件。
如果系统1包括一个培养箱模块1000，则理想的是包括一个传送机模块1150，以连接壳体700和培养箱模块1000，并用于将所述细胞培养容器从培养箱模块1000传送到处理模块400的附近(图1)。在一个实施方式中，传送机模块1150可以关闭以防止所述细胞培养容器暴露于一个非无菌环境。
培养箱模块1000和传送机1150两者都通信耦合到至少一个处理器600。对于培养箱模块1000而言，至少一个处理器600可以发起命令是否要：接合所述处理装置以选择性地从所述架子中抽出其中的一个细胞培养容器或替换其中的一个细胞培养容器；或者调整其中的大气条件。关于传送机模块1150，至少一个处理器600可以发起命令是否要：将一个细胞培养容器从培养箱模块1000中运出；或者将一个细胞培养容器从例如壳体700运送到培养箱模块中。
系统1还可以可选地包括一个控制器700，以用于协调自动化系统的每个模块的操作。控制器700包括软件(软件可以包括在个人计算机中)。控制器700中的所述软件能够执行协调自动化系统的每个模块的操作所需的命令。
系统1还可以包括一个图形用户界面1200(其通信耦合到至少一个处理器)。图形用户界面1200优选地位于壳体700的外部。在一个实施方式中，图形用户界面1200是与系统1集成的个人计算机的显示器。在一个实施方式中，图形用户界面1200是与系统1无线连接的个人计算机的显示器。图形用户界面1200可以向系统1的用户提供必要的控制以指导系统1的操作，例如调度自动细胞培养过程，查看由系统1执行的所述自动细胞培养过程，查看由照相机105采集的所述一张或多张图像，接收来自集成到系统1中的所述传感器的每一个的通知或状态，以及观察针对所述一个以上储液器350中的每一个储液器的一份液位报告。
系统1还可包括根据下文所述的用于一种细胞培养物中解离一个或多个集落的一个装置的一个解离模块1300。可使用处理模块300将细胞培养容器运输至所述解离模块1300。
使用所述系统的方法
在本发明的另一个方面，自动化系统1可以用于执行传代一种细胞培养物的自动化方法(图15)。在一个实施方式中，自动化系统1可以用于执行自适应地传代一种细胞培养物的自动化方法。在特定的实施方式中，所述细胞可以是多能干细胞，甚至更具体地，所述细胞可以是人类的多能干细胞。由于在许多应用中将人类的多能干细胞以团或簇的形式传代是可取的，所以传代人类的多能干细胞培养物的自动化方法可适合于其簇传代。
本发明公开的方法可以用于传代一种细胞培养物，但是它们并不受此限制。作为一个日常维护实验计划的部分，所述方法的各种变体可以用来进行培养基交换。或者，所述方法可以用来执行一个细胞扩增实验计划，其中所述细胞培养物可以被连续培养，进入更大的培养容器或进入更多数量的孔中。或者，所述方法可以被用来执行一种新细胞系(例如一种新衍生或获得的多能干细胞(PSC)细胞系)的一个上载实验计划，其中在早期传代的数据的采集和分析(即所述一个或多个特征)可以告知有关用于执行后续传代的最佳条件。或者，所述方法可以用来执行一个细胞分化实验计划，其中一个起始细胞群体被暴露于分化条件(例如一个分化培养基)，以将所述起始细胞群体转化为一个衍生的细胞谱系。多能干细胞的具体示例，包括一经将该等细胞暴露于一种合适的培养基后，将这些细胞分化成为外胚层状或外胚层细胞、成为内胚层状或内胚层细胞、或中胚层状或中胚层细胞。
用于传代一种细胞培养物的所述自动化方法包括在一个细胞培养容器内的一个细胞培养基中提供所述细胞培养物。在一个实施方式中，提供所述细胞培养物包括从一个培养箱中转移所述细胞培养物。可以使用一个传送机装置(诸如上述传送机模块)来完成所述细胞培养容器的传送。在一个实施方式中，提供所述细胞培养容器(以及其中的所述细胞培养物)可以通过使用一个细胞培养容器处理器(例如上文所描述的所述处理模块)来完成。
在一个实施方式中，所述自动化方法，更具体地说，提供所述细胞培养容器(以及其中的所述细胞培养物)的所述自动化方法，还可以包括将所述培养容器放置在一个载物台上(例如上文所描述的所述载物台模块)。在一个实施方式中，可以使用所述细胞培养容器处理器(即，所述处理模块)来完成所述细胞培养容器的放置。
所述自动化方法还包括通过一个成像模块在一个第一时间点和在一个或多个后续时间点采集所述细胞培养物的一张或多张图像。在一个实施方式中，所述成像模块基本上如上文所述。
一经采集一张或多张图像，所述自动化方法还包括由通信耦合至所述成像模块的至少一个处理器来计算所述细胞培养物的一个或多个特征，该计算基于所述一张或多张图像。在一个实施方式中，可根据上文的描述来完成所述一个或多个特征的计算。具体地，所述一个或多个特征可包括：
a)所述细胞培养物的融合度的度量；
b)所述细胞培养物的细胞或集落的形态的度量；
c)所述细胞培养物的细胞或集落的分化的度量；
d)所述细胞培养物的集落大小分布的度量；
e)a)、b)、c)或d)从所述第一时间点到所述一个或多个后续时间点的变化的度量；或
f)a)相对于b)、c)或d)的度量，b)相对于a)、c)或d)的度量，c)相对于a)、b)或d)的度量，或d)相对于a)、b)或c)的度量。
在计算了所述一个或多个特征之后，所述自动化方法还包括由所述一个或多个处理器执行一个自动传代实验计划，该执行基于将计算出的所述细胞培养物的所述一个或多个特征与所述细胞培养物的所述一个或多个特征的一个已知或输入阈值水平进行的比较。
在一个实施方式中，关于一种细胞培养物(即，细胞或集落)的融合度而言，所述已知或输入的阈值水平范围大约在30-90％之间。因此，如果所述细胞培养物已达到大约30-90％之间的融合度，则自动化系统1可以启动一个传代实验计划。在一个实施方式中，一种细胞培养物(即，细胞或集落)的融合度的度量大约为40-80％之间。在一个实施方式中，一种细胞培养物(即，细胞或集落)的融合度的度量大约为50-70％之间。
在一个实施方式中，关于一种细胞培养物(即，细胞或集落)的形态的度量，所述已知或输入的阈值水平大约为一种对照细胞培养物的±30％之间。因此，如果所述细胞培养物就其形态而言大约偏离了一种对照细胞培养物的±30％之间，则自动化系统1可以启动一个传代实验计划。在一个实施方式中，一种细胞培养物(即，细胞或集落)的形态的度量大约为一种对照细胞培养物的±20％之间。在一个实施方式中，一种细胞培养物(即细胞或集落)的形态的度量大约是一种对照细胞培养物的±10％之间。
在一个实施方式中，关于一种细胞培养物(即，细胞或集落)的分化水平的度量，所述已知或输入的阈值水平大约为一个维持实验计划中的一种对照培养物的0-30％之间或大约为一个分化实验计划中的一种对照培养物的50％-100％之间。一方面，如果所述细胞培养物中相对于一个维持实验计划的一种对照培养物已达到约0-30％之间、或约10-20％之间、或约15％之间的一个分化水平，则自动化系统1可以启动一个传代实验计划。相反，如果所述细胞培养物相对于一个分化实验计划中的一种对照培养物已达到约0-30％之间、或约10-20％之间、或约15％的一个分化水平，则自动化系统1可能不会启动一个传代实验计划。在这种情况下，自动化系统1可不做任何事情，或者用新鲜的分化培养基代替失效的分化培养基。另一方面，如果所述细胞培养物相对一个分化实验计划中的一种对照培养物达到了约50-100％之间、或约60-90％之间、或约70-80％之间、或约75％之间的一个分化水平，则自动化系统1可启动一个传代(和/或扩增)实验计划或收获所述分化的细胞用于下游应用。相反，如果所述细胞培养物相对于一个维持实验计划中的一种对照培养物已达到约50-100％之间、或约60-90％之间、或约70-80％之间、或约75％的一个分化水平，则自动化系统1可以启动一个传代实验计划，以尝试并复苏所述细胞培养物或一个终止实验计划。
在一个实施方式中，关于一种细胞培养物(即细胞或集落)的集落尺寸分布的度量，所述已知或输入的阈值水平为一种对照培养物的平均集落尺寸的约20％或约15％、或约10％或约5％以内或其子分数以内。因此，如果所述细胞培养物的平均集落尺寸分布已经达到一种对照培养物的平均集落尺寸分布的约20％、或约15％、或约10％、或约5％以内或其子分数以内，则系统1可以启动一个传代实验计划。在一个实施方式中，位于一种对照培养物的平均集落尺寸分布的约20％、或约15％、或约10％或约5％以内的所述阈值水平，属于所述集落尺寸分布的一个子分数，例如，前10％、或前20％、或前30％或、前40％，或后10％，或后20％，或后30％，或后40％。
如在本文中使用，“一个自动传代实验计划”指的是培养活动，直到一种细胞培养物可以进行繁殖的时间点(例如通过继代培养)，以及实现一种细胞培养物的所述继代培养所必须的活动，包括将部分或全部的所述细胞培养物接种到一个或多个子代细胞培养容器中。因此，传代一词包括性地指向与细胞的常规培养有关的活动，如细胞培养物的继代培养，以及旨在扩增或分化细胞培养物的工作流程。
在一个实施方式中，一个传代实验计划的执行，可以通过从所述细胞培养物中获得一细胞悬液并将部分或全部的所述细胞悬液接种在一个子代细胞培养容器中来完成。
在一个实施方式中，获得所述细胞悬液还包括使所述细胞悬液通过一个第一移液器吸头以将所述细胞培养物解离为一个单细胞悬液或多个平均直径不超过所述第一移液器的孔径的簇。在一个实施方式中，可使用上文所描述的所述移液器模块来使所述细胞悬液通过所述第一吸头。
在获得所述细胞悬液之前，可以通过从所述细胞培养容器或其孔中吸出培养基，来去除所述第一细胞培养容器中的所述培养基。如上所述，在一个实施方式中，可以使用上文所描述的所述移液器模块来吸出所述细胞培养基。在一个实施方式中，去除(即)吸出所述细胞培养基可包括倾斜所述第一细胞培养容器，随后将与所述移液器模块的一个移液器相配的一个移液器吸头对准所述细胞培养容器的一个下角或其孔。
在吸出所述培养基后，通过将一种洗涤缓冲液分配到所述细胞培养容器或其孔中来执行一个洗涤步骤可能是可取的。在一个实施方式中，可使用上文所描述的所述液体分配模块来分配洗涤缓冲液。此后，如上所述，可以例如经由所述移液器模块吸出(即去除)所述洗涤缓冲液。
如果正在执行一个接种实验计划，则可以在将所述细胞培养容器送回一个培养箱(如上所描述的所述培养箱模块)之前，将新鲜培养基添加到所述细胞培养容器或其所有合适的孔中(在吸出用过的培养基和/或洗涤后)。
在与传代或扩增细胞的有关方法中，可将所述细胞培养容器中的所述细胞培养物(已经移除所述细胞培养基，并可选地已经经过洗涤步骤)与一种剥离/解离溶液相接触。任何合适的剥离或解离溶液，可以用来接触所述细胞培养容器或其孔中的所述细胞培养物。在一个实施方式中，所述分离液可以是ReLeSRTM(干细胞技术公司)或STEMdiffTM神经Rosette选择试剂(干细胞技术公司)。在一个实施方式中，所述解离溶液可以是GCDR(干细胞技术公司)或一些其他基于胰蛋白酶的溶液。所述细胞培养容器中的所述细胞培养物与一种剥离或解离溶液的接触，可以使用如上所描述的所述液体分配模块来开展。根据所用溶液的类型，可以将所述细胞培养物在所述剥离或解离溶液存在的情况下于37℃或室温下温育一段足够的时间。同样取决于所用溶液的类型，在温育所述细胞培养物之前，吸出所述溶液可能是可取的。此外根据所用溶液的类型和细胞类型，将所述细胞培养容器运送至所述培养箱模块可能是可取的。
在一个实施方式中，所述分离液是一种解离溶液，并且所述解离溶液选择性地从所述细胞培养容器的一个壁上分离一个第一组分化细胞或一个第二组未分化细胞。在这样的实施方式中，根据应用，可以使用ReLeSR TM(干细胞技术公司)或STEMdiff TM神经Rosette选择试剂(干细胞技术公司)。
对所述第一细胞培养容器的温育之后，该方法的后续步骤可以包括：使用所述处理模块将所述第一细胞培养容器运送至所述解离模块(如下所述)，并使用所述解离模块，从所述第一细胞培养容器的所述孔的一个底部来剥离一个细胞集落(例如但不限于一个多能干细胞集落)。
如上所述，所述一个或多个细胞集落中的一些或全部可能由于剥离/解离溶液而剥离，或者可能有必要使用所述解离模块促使所述一个或多个细胞集落中的一些或全部剥离。无论如何，激活所述解离模块还可有助于将所述剥离的细胞集落解离为一细胞悬液，并在一个实施方式中解离为一多能干细胞的簇悬液。
在一些实施方式中，在激活所述解离模块之前或之后，使用所述移液器模块对所述细胞悬液进行粉碎，可促进所述一个或多个集落被解离为一细胞悬液，例如一多能干细胞的簇悬液。
在将所述一个或多个细胞集落解离为一细胞悬液后，一定体积的所述细胞悬液(无论是一单细胞悬液还是多个簇悬液)可以被接种到一个子代细胞培养容器或其孔中，例如通过所述移液器模块。
在一个实施方式中，在将一定体积的所述细胞悬液接种到一个子代细胞培养容器之前或之后，所述自动化方法还可包括在所述子代细胞培养容器中同时或依次分配一种第一溶液和一种第二溶液。在一个实施方式中，所述第一溶液是所述细胞培养基，所述第二溶液是一种增溶的细胞外基质。
对于一个扩增实验，所述细胞悬液的部分或全部可被接种到比所述第一细胞培养容器大的一个第二培养容器中，或者接种到所述第二培养容器的多个孔中。
装置
在本发明的一个方面，提供了一种用于剥离或解离存在于一种细胞培养物中的一个或多个集落的装置(参见图16)。在整个本发明中，装置2也可称为一个解离模块。
如在本文中使用，术语“细胞”是指能够被培养的任何类型的细胞(无论是离体的还是体外的)。细胞作为粘附培养物来生长可能很重要，但是在悬液中生长的细胞也在本发明的范围之内。所述细胞的来源可以是哺乳动物，并且在某些情况下，所述细胞可以是人类细胞。所述细胞也可以是多能干细胞，并且在一些实施方式中，所述细胞可以是人类的多能干细胞。在一些实施方式中，所述细胞是多能干细胞培养物中的一个或多个未分化集落。未分化的多能干细胞可以作为一个单层或在悬液中培养，并且一经分裂，它们分别形成集落或聚集体。未分化的多能干细胞是能够自我更新并且可以分化成任何谱系的细胞。例如，一个多能干细胞可以是一个胚胎干细胞、一个诱导性多能干细胞或本领域出现的其他类型的细胞，其例子之一包括扩增的多能干细胞。许多的多能干细胞系是已知的，但是使用现有科学技术来创建新的多能干细胞系是常见的。
在用于解离一个细胞培养物中的一个或多个集落的装置2的一个实施方式中，该装置包括一个可旋转驱动器5，该可旋转驱动器5连接至一个安装表面10(参见图16)。可旋转驱动器5可以包括将电能转换成旋转运动的任何已知装置。在一个实施方式中，可旋转驱动器5包括连接至一个可旋转轴20的一个电机15(见图17)。驱动器5可以连接到安装表面10的一个顶表面，并且电机15和可旋转轴20可以从安装表面10的一个水平面向上突出。相应地，可旋转驱动器5或其可旋转轴20可绕垂直于或基本垂直于安装表面10的一条第一轴线旋转。
装置2还包括用于支撑一个细胞培养容器的一个平台25。平台25被连接至驱动器5，并且更具体地，被连接至可旋转驱动器5的端部22，并且还更具体地，被连接至可旋转轴20的端部22(见图17)。
平台25可以基本上是平面的，以支撑一个细胞培养容器的一个底表面(未示出)。平台25可以是任何尺寸，只要其可以在其顶表面上支撑至少一个细胞培养容器。许多类型的细胞培养容器是本领域已知的，并且在本发明中都考虑了所有这些。通常，所述细胞培养容器可以是能够容纳用于其培养的细胞的任何容器。作为非限制性的实例，所述细胞培养容器可以是一个微板，例如但不限于6孔板、12孔板、24孔板或96孔板。或者，所述细胞培养容器可以是一个细胞培养瓶，例如但不限于一个T烧瓶。在所述细胞培养容器是T烧瓶的一些实施方式中，所述平台的尺寸可以适当地设置以支撑例如T25烧瓶、T75烧瓶、T150烧瓶、175烧瓶或T225烧瓶。或者，所述细胞培养容器可以是一个细胞培养皿，例如但不限于皮式皿、35mm皿、10mm皿或更大的皿。
在一个实施方式中，平台25被偏置地连接至驱动器5或其端部22。例如，如前所述，驱动器5或其端部22可限定一条第一旋转轴线，并且所述平台25可绕一条第二旋转轴线旋转(穿过所述平台25的旋转中心)。在一些实施方式中，驱动器5或其端部22可以在偏离平台25的所述旋转中心的一个位置耦合到平台25。在平台25被偏置地连接至驱动器5的情况下，相对比于在驱动器5或其端部22被耦合到平台25的旋转中心的情况，平台25将具有一条绕所述第一轴线(即驱动器5或其端部22的所述旋转轴线)的一条更宽轨道。
在所述相同或不同的实施方式中，平台25也可以间接地被连接至驱动器5。在这样的实施方式中，装置1还可包括一个间隔件27，其在中间附接平台25到驱动器5。间隔件27可以是中间附接平台25到驱动器5的任何部件，同时仍然允许平台25依赖于或独立于可旋转驱动器5而旋转。在优选的实施方式中，间隔件27是一个轴承。
在平台25被间接地且偏置地连接至驱动器5的实施方式中，间隔件27在本文中可替代地被称为一个偏心间隔件。如图18所示，垫片27可以在其的一个第一位置28被连接到驱动器5，而在其的一个第二位置29被连接到平台25。在间隔件27是一个轴承的一个特定实施方式中，驱动器5可以被连接至间隔件27的一个第一座圈(即，一个内座圈)，平台25可以连接至间隔件27的一个第二座圈(即，一个外座圈)。相应的，第一位置28对应于所述内座圈，第二位置29对应于所述第二座圈。
在间隔件27是一个轴承且平台25被连接到间隔件27的一个外座圈的实施方式中，平台25可绕着偏离所述第一轴线的一条第二轴线旋转。在一些实施方式中，所述第二轴线可以穿过所述平台25的一个旋转中心。在其他实施方式中，所述第二轴线可以穿过所述平台25的所述旋转中心以外的一个点。所述第一轴线和所述第二轴线可以偏离任何距离，只要其几何形状允许装置1的操作及其元件(即将在下文中详细描述的一个或多个冲击托架和一个或多个冲击缓冲器)的插入。在特定实施方式中，所述第一轴线(即，所述第一位置)和所述第二轴线(即，所述第二位置)偏离约4mm、约4.5mm、约5mm、约5.5mm、约6mm、约6.5毫米、约7毫米、约7.5毫米、约8毫米、约8.5毫米、约9毫米、约9.5毫米或约10毫米。
在一些实施方式中，平台25还可以包括导向件30(导向件30帮助将所述细胞培养容器放置在其上面)。导向件30可对应于从平台25的一个顶表面向上升起的突起，例如但不限于销或脊。除了有助于将所述细胞培养容器放置在平台25上面之外，在装置2操作期间，导向件30还可有助于将细胞培养容器固定在平台25上面。
在平台25是四边形的实施方式中，导向件30可以位于平台25的一个或多个角上。在某些实施方式中，导向件30可以位于平台25的至少两个角上。在更优选的实施方式中，导向件30可以位于平台25的所有四个角上。
在平台25不是四边形的实施方式中，可将导向件30简单地适当设置成有助于放置细胞培养容器的构造，以及，可选地，设置成将细胞培养容器固定到平台25的构造。
装置1还可包括一个或多个连接到平台25的冲击托架35。冲击托架35可连接至平台25的任何部分，例如但不限于其一个或多个边缘或其底面。如果所述细胞培养容器的立足面比平台25的表面积大，那么重要的是要确保冲击托架35的顶表面不会突出到平台25的上平面之上。
冲击托架35可以由任何材料制成，但是为了尽量减小或防止过度的磨损和噪音，由橡胶或橡胶类物质是可取的，并且优选地，由相对致密的橡胶或橡胶类物质制造冲击托架35。或者，冲击托架35可以由更坚固和更耐用的材料制成，例如但不限于金属或准金属，并且可选地在冲击部位用橡胶或类橡胶物质覆盖。
在一个具体实施方式中，装置2包括两个冲击托架35a和35b。冲击托架35a和35b可以连接到平台25的底面或相对边缘。无论冲击托架35(包括冲击托架35a和25b)在哪里连接到平台25，唯一重要的是它们可以接触到连接至安装表面10的一个或多个冲击缓冲器40。
冲击缓冲器40通常耦合至所述安装表面10的一个上表面，并且轴向地从所述安装表面10向着所述平台25的一个底面延伸。在一些实施方式中，特别是当所述冲击托架35被耦合到平台25的一个底面时，冲击缓冲器40通常向着所述平台25的一个底面延伸一段距离(该距离小于所述安装表面10和所述平台25之间的间隔)。
冲击缓冲器40可以由任何材料制成，但是为了尽量减小或防止过度的磨损和噪音，由橡胶或橡胶类物质是可取的，并且优选地由相对致密的橡胶或橡胶类物质制造冲击缓冲器40。或者，冲击缓冲器40可以由更坚固且更耐用的材料制成，例如但不限于金属或准金属，并且可选地在冲击部位用橡胶或类橡胶物质覆盖。
在一个具体实施方式中，装置2包括设置在安装表面10上的四个冲击缓冲器40a、40b、40c和40d，以限定一个四边形。冲击缓冲器40a、40b、40c和40d的设置可以确保任何一个冲击托架(例如35a或35b)的行程分别由两个冲击缓冲器(例如40c和40d或40a和40b)限制。在任何一个冲击托架的行程都受到两个冲击缓冲器限制的情况下，冲击托架(以及因此平台)的行程被限制在两个冲击缓冲器之间。
参见图19，其示出了冲击托架35a和35b以及冲击缓冲器40a、40b、40c和40d的一个示例性布置。仅作为示例，当平台25(图19中未示出)在驱动器5的直接影响下沿着一个给定方向旋转时，冲击托架35a与冲击缓冲器40c碰撞。借助于间隔件27，托架35a可以，不依赖于驱动器5的旋转，朝着冲击缓冲器40d回弹并且可能与之接触。同样的动态也发生在冲击托架35b和冲击缓冲器40a和40b。
因此，当平台25在驱动器5的影响下旋转时，一个或多个冲击缓冲器40被连接到安装表面10并且是一个或多个冲击托架35可接触到的。一个或多个冲击托架35与一个或多个冲击缓冲器40的反复碰撞将力传递到平台25上，并且传递到平台25上面的任何细胞培养容器，包括其中所包含的内容物。这种搅动或冲击力可使得所述细胞培养容器中包含的所述细胞培养物的一个或多个集落被解离成较小的单位，例如但不限于细胞团或簇。
装置2还可以包括一个控制器(其调节驱动器5的输出)。通过操纵所述控制器，可调整：驱动器5的旋转方向、驱动器5的旋转速度；以及驱动器5的旋转加速度。在具体实施方式中，驱动器5的旋转方向可以是顺时针方向。在其他实施方式中，驱动器5的旋转方向可以是逆时针方向。在一个更具体的实施方式中，驱动器5的旋转方向可以是顺时针或逆时针。在又一更具体的实施方式中，驱动器5的旋转方向可在顺时针和逆时针之间规则变换。
装置2还可以包括传感器，例如一个加速度计或光学标记传感器，以接收关于该装置操作的反馈。
装置2还可以进一步包括一个原点传感器，以提供平台的定向。
装置的使用方法
在本发明的另一方面，装置2可用于解离一种细胞培养物中的一个或多个集落的方法中。在一个非限制性实施方式中，所述细胞培养物可以是包含在一个或多个集落中的多能干细胞的培养物。在一个更具体的非限制性实施方式中，一种细胞培养物中的一个或多个集落可以是一种多能干细胞培养物中的一个或多个未分化集落，并且可选地，其中所述多能干细胞是人类的。
在本发明的其他方面，装置2可用于分散接种到一个细胞培养容器的一个孔内的一种培养基中的细胞的方法中，或用在以一种涂覆材料(例如细胞外基质)涂覆一个细胞培养容器的一个孔的方法中。
接下来的方法依赖于：提供根据本发明的一种装置，以及将包含一种细胞培养物中的一个或多个集落的一个细胞培养容器放置在该装置上。在某些实施方式中，将所述细胞培养容器固定到所述载物台将是可取的。例如，可以通过所述细胞培养容器和所述导向件的配合将所述细胞培养容器固定在所述载物台上。
在一些实施方式中，所述细胞培养物可能已经在存在一种分离液的情形下温育，该分离液可能随后被去除、失活或被中和。当被培养的细胞的所述一个或多个集落被直接或间接地粘附在所述细胞培养容器的一个孔底时，使用一种分离液可能是可取的。分离液的常见例子包括ReLeSRTM(干细胞技术公司)和STEMdiffTM神经Rosette选择试剂(干细胞技术公司)。参见一般分离液，具体参见ReLeSRTM和STEMdiffTM神经Rosette选择试剂，这种分离液可添加到以一种合适的细胞培养物中并保留一段较短时间(例如1至15分钟)，然后去除，之后再温育所述细胞培养物一段时间。在这样的温育之后，所述集落的一些或所有可能已经从所述孔底剥离或在最小的力的作用下易于从所述孔底剥离。
在其他实施方式中，所述细胞培养物可能已经在一种解离溶液存在的情形下温育，该解离溶液随后可能被去除、失活或被中和。当用于作为一个单层生长的细胞时，使用解离溶液可能是可取的。解离溶液的常见例子是胰蛋白酶。本领域技术人员应意识到，对于某些细胞系或细胞类型来说，过度暴露于一种解离溶液中可能会完全解离一种细胞培养物中的一个或多个集落和/或可能破坏所述细胞培养物。
在其他实施方式中，温育所述细胞培养物之时(在所述剥离或解离溶液存在的情形下)，可将所述细胞培养物放置在所述装置上。在这样的实施方式中，通过使用本发明的装置，可以同时解离所述细胞培养物中的一个或多个集落，或在足够的温育期之后，通过使用本发明的装置，可立即解离所述细胞培养物中的一个或多个集落。在一些实施方式中，某些剥离或解离溶液可以在给定温度下(即，37℃或更高)起到最好效果。在一些实施方式中，向本发明的所述装置提供一个加热元件是可取的，以用于加热所述平台和/或围绕所述装置或所述平台的一个壳体。
不管前述的剥离或解离是如何实际操作的，在所述细胞培养物已经温育足够的时间之后，所述细胞培养物中的所述一个或多个集落可能已经便于使用本发明中所描述的一个装置用来解离成较小的单元。如上所述，在所述驱动器的影响下，旋转所述平台，使一个或多个冲击托架与一个或多个冲击缓冲器接触，从而将一个解离力传递至所述细胞培养物中的所述一个或多个集落。
在一些实施方式中，调节所述驱动器的旋转速度，并由此调节所述平台的旋转速度可能是可取的，以便于最佳地解离所述细胞培养物中的所述一个或多个集落。通过调节所述驱动器向上的旋转速度，可以提高冲击频率。同样地，调节所述驱动器向下的旋转速度会降低冲击频率。本领域技术人员应认识到，恰当的冲击频率可以取决于所培养的特定细胞系或细胞类型。
在一些实施方式中，调节所述驱动器的旋转方向以最佳地解离所述细胞培养物中的所述一个或多个集落可能是可取的。在一个实施方式中，沿顺时针方向旋转所述载物台。在另一个实施方式中，沿逆时针方向旋转所述载物台。在又一个实施方式中，沿顺时针或逆时针方向旋转所述载物台。
在又一个实施方式中，旋转所述载物台可以包括在顺时针方向和逆时针方向之间规则变换。在包括使所述载物台的旋转方向沿顺时针方向和逆时针方向规则变换的实施方式中，规则变换可以包括沿顺时针方向和逆时针方向旋转之间的延迟小于五秒。在一个更具体的实施方式中，包括使所述载物台的旋转方向在顺时针方向和逆时针方向间规则变换，该规则变换可以包括沿顺时针方向和逆时针方向旋转之间的延迟小于1秒。在更具体的实施方式中，包括使所述载物台的旋转方向沿顺时针方向和逆时针方向规则变换，该规则变换可以包括沿顺时针方向和逆时针方向旋转之间的延迟约0.5毫秒或更短。
在包括调节所述驱动器的旋转速度、方向或加速度的实施方式中，该等操作可由如上所述的一个控制器来实现。因此，本发明公开的所述方法的某些实施方式还可以包括使用一个控制器来控制所述驱动器的旋转速度、方向或加速度。
本发明所公开的所述方法的一些实施方式特别地涉及解离多能干细胞(例如但不限于人类的多能干细胞)的一个或多个未分化集落。在这样的方法中，优选利用某些分离液(例如但不限于ReLeSRTM)可能是可取的，以选择性地剥离多能干细胞的未分化集落。相应地，将选择性的分离液(例如但不限于ReLeSRTM)与本发明装置的使用进行匹配的方法，可有利地选择期望的细胞类型，同时将一种细胞培养物中存在的期望的所述一个或多个集落解离为较小的单位。
在将一种细胞培养物中的人类的多能干细胞的一个或多个未分化集落进行解离的实施方式中，一种分离液(例如但不限于ReLeSRTM)可减弱人类的多能干细胞的未分化集落对细胞培养容器的孔的孔底的粘附。一经向所述中添加一定体积的溶液(例如但不限于细胞培养基)，人类的多能干细胞的一个或多个集落的一些或全部可能会与孔底剥离并悬浮在溶液中。一经在所述驱动器的作用下旋转所述平台并使一个或多个冲击托架与一个或多个冲击缓冲器反复碰撞，附着于所述孔底的任何剩余的人类的多能干细胞的未分化集落都可变成从孔底剥离。与人类的多能干细胞的一个或多个未分化集落的选择同时，当该等集落彼此碰撞并与细胞培养容器的孔壁碰撞时，这些集落被分裂成较小的单位(即团)。
在一个替代实施方式中，例如但不限于在一个分化实验期间，选择多能干细胞的一个或多个分化集落可能是可取的。按照与上述相同的过程，可以将剥离并解离的多能干细胞从细胞培养容器的孔中吸出并丢弃，以产生附着在所述孔底的所述(分化的)目标集落，以进行进一步的培养或处理。
尽管出于说明性的目的，本发明结合各种实施方式对申请人的技术教导进行了描述，但是这并不旨在将申请人的技术教导限于该等实施方式，因为本发明所描述的实施方式旨在作为示例。相反的，本发明所描述的和示出的申请人的技术教导涵盖了各种替代、修改和等同形式，而不偏离本发明所描述的实施方式以及由所附权利要求书所限定的总体范围。

Claims (73)

1.一种自动化系统，用于自适应地传代细胞培养容器内的细胞培养基中的细胞培养物，所述自动化系统包括：
一个成像模块，用于在一个第一时间点以及一个或多个后续时间点采集所述细胞培养物的一张或多张图像；
一个移液器模块，具有一个或多个移液器，用于通过与所述一个或多个移液器的端部配合的一个移液器吸头从所述细胞培养容器中吸取液体；
一个液体分配器模块，与所述移液器模块间隔开，且所述液体分配器模块与一个以上储液器呈流体连通；
一个处理模块，具有一对相对的臂，用于在所述自动化系统内夹持和运送所述细胞培养容器或其盖子或是一个子代细胞培养容器或其盖子；以及
至少一个处理器，其与所述成像模块、所述移液器模块、所述液体分配器模块以及所述处理模块相连通，所述处理器被配置为：
接收来自于所述成像模块的所述一张或多张图像；
基于从所述成像模块接收到的所述一张或多张图像，计算所述细胞培养物的一个或多个特征；以及
执行一个自动传代实验计划，以传代所述细胞培养物，所述实验计划包括协调所述移液器模块、所述液体分配器模块以及所述成像模块的操作，所述协调基于将所述细胞培养物的计算出的所述一个或多个特征与
a)所述一个或多个特征的一个已知阈值水平；或
b)所述一个或多个特征的一个输入阈值水平；
进行的比较。
2.根据权利要求1的所述自动化系统，其特征在于：所述一个或多个特征包括：
a)所述细胞培养物的融合度的度量；
b)所述细胞培养物的细胞或集落的形态的度量；
c)所述细胞培养物的细胞或集落的分化的度量；
d)所述细胞培养物的集落大小分布的度量；
e)a)、b)、c)或d)从所述第一时间点到所述一个或多个后续时间点的变化的度量；或
f)a)相对于b)、c)或d)的度量，b)相对于a)、c)或d)的度量，c)相对于a)、b)或d)的度量，或d)相对于a)、b)或c)的度量。
3.根据权利要求2的所述自动化系统，其特征在于：所述已知或输入阈值水平为：
i、对于a)，细胞或集落融合度大约在30-90％之间；
ii、对于b)，大约在一种对照培养物的±30％之间；
iii、对于c)，大约在一个维持实验计划中的一种对照培养物的0-30％之间，或者大约在一个分化实验计划中的一种对照培养物的50％-100％之间；或
iv、对于d)，大约在一种对照培养物的一个平均集落大小分布15％或其子分数以内。
4.根据权利要求1-3中任意一项的所述自动化系统，其特征在于：在所述第一时间点或所述一个或多个后续时间点，计算出的关于所述细胞培养容器中的所述细胞培养物的所述一个或多个特征，与一个第二细胞培养容器中的所述第二细胞培养物是不同的，并且所述一个或多个特征在一个随后传代过程中变得更加一致。
5.根据权利要求1-4中任意一项的所述自动化系统，其特征在于：所述成像模块包括一台照相机，能够分辨所述培养容器中的单个细胞。
6.根据权利要求1-5中任意一项的所述自动化系统，其特征在于：所述自动化系统还包括一个载物台模块，用于支撑所述细胞培养容器。
7.根据权利要求6的所述自动化系统，其特征在于：所述载物台模块在一个第一平面内沿一条第一轴线或一条第二轴线或沿二者是可移动的。
8.根据权利要求6或7的所述自动化系统，其特征在于：所述载物台模块或其子部件绕其边缘沿一条第三轴线枢转。
9.根据权利要求1-8中任意一项的所述自动化系统，其特征在于：所述一个或多个移液器被附接到一个滑架上。
10.根据权利要求1-9中任意一项的所述自动化系统，其特征在于：所述液体分配器模块包括一根以上的导管，且每根导管与所述一个以上储液器中的单独一个呈流体连通。
11.根据权利要求10的所述自动化系统，其特征在于：所述液体分配器模块包括一根第一导管，其与一种第一溶液的一个储液器呈流体连通；以及一根第二导管，其与一种第二溶液的一个储液器呈流体连通；并且所述第一溶液和所述第二溶液同时被分配到一个子代细胞培养容器中。
12.根据权利要求10或11的所述自动化系统，其特征在于：每根导管是可重复使用或可更换的。
13.根据权利要求1-12中任意一项的所述自动化系统，其特征在于：还包括一个壳体，所述壳体至少要容纳所述像模块、移液器模块、液体分配器模块、载物台模块和处理模块。
14.根据权利要求13的所述自动化系统，其特征在于：所述壳体是无菌的。
15.根据权利要求13或14的所述自动化系统，其特征在于：还包括一个制冷模块，用于存放所述一个以上储液器中的一个或多个以及一个储水器，其中，所述一个以上储液器、所述制冷模块以及所述废料储存器位于所述壳体的外部。
16.根据权利要求15的所述自动化系统，其特征在于：所述废料储存器与所述壳体内的一个废料槽呈流体连通。
17.根据权利要求16的所述自动化系统，其特征在于：所述废料槽涂覆有一疏水涂层。
18.根据权利要求15-17中任意一项的所述自动化系统，其特征在于：还包括一个或多个传感器，其中所述一个或多个传感器被配置为检测并报告所述成像模块上、所述载物台模块上或在所述一个以上储液器中的负载质量，以便于
a)检测所述成像模块上、所述载物台模块上或所述一个以上储液器中的负载质量；以及
b)在所述负载质量不同于预期时触发一个警报。
19.根据权利要求13-18中任意一项的所述自动化系统，其特征在于：还包括一个封闭传送机模块，其连接至所述壳体和一个培养箱模块，并用于将所述细胞培养容器从所述培养箱模块传送到所述处理模块的附近。
20.根据权利要求19的所述自动化系统，其特征在于：所述培养箱模块维持用于所述细胞培养物的允许环境条件。
21.根据权利要求1-20中任意一项的所述自动化系统，其特征在于：还包括一个图形用户界面。
22.根据权利要求21的所述自动化系统，其特征在于：所述图形用户界面就所述一个以上储液器中的每一个显示一个液位报告。
23.一种自动化系统，用于自适应传代细胞培养容器内的细胞培养基中的多能干细胞粘附培养物，所述自动化系统包括：
一个成像模块，用于在一个第一时间点以及一个或多个后续时间点采集所述多能干细胞培养物的一张或多张图像；
一个移液器模块，其具有一个或多个移液器，以用于通过与所述一个或多个移液器的端部相配合的一个移液器吸头从所述细胞培养容器中吸取液体；
一个液体分配器模块，其与所述移液器模块间隔开，且所述液体分配器模块与一个以上储液器呈流体连通；
一个处理模块，其具有一对相对的臂，用于在所述自动化系统内夹持和运送所述细胞培养容器或其盖子或是一个子代细胞培养容器或其盖子的；以及
至少一个处理器，其与所述成像模块、所述移液器模块、所述液体分配器模块以及处理模块相连通，所述处理器被配置为：
接收来自于所述成像模块的一张或多张图像；
基于从所述成像模块接收到的所述一张或多张图像，计算所述多能干细胞培养物的一个或多个特征；以及
执行一个自动传代实验计划，以传代所述多能干细胞培养物，所述实验计划包括所述移液器模块、所述液体分配器模块以及所述成像模块的操作协调，所述操作协调基于将所述多能干细胞培养物的计算出的所述一个或多个特征与
a)所述一个或多个特征的一个已知阈值水平；或
b)所述一个或多个特征的一个输入阈值水平；
进行比较。
24.根据权利要求23的所述自动化系统，其特征在于：所述一个或多个特征包括：
a)所述细胞培养物的融合度的度量；
b)所述细胞培养物的细胞或集落的形态的度量；
c)所述细胞培养物的细胞或集落的分化的度量；
d)所述细胞培养物的集落大小分布的度量；
e)a)、b)、c)或d)从所述第一时间点到所述一个或多个后续时间点的变化的度量；或
f)a)相对于b)、c)或d)的度量，b)相对于a)、c)或d)的度量，c)相对于a)、b)或d)的度量，或d)相对于a)、b)或c)的度量。
25.根据权利要求24的所述自动化系统，其特征在于：所述已知或输入阈值水平为：
i、对于a)，细胞或集落融合度大约在30-90％之间；
ii、对于b)，大约在一种对照培养物的±30％之间；
iii、对于c)，大约在一个维持实验计划中的一种对照培养物的0-30％之间，或者大约在一个分化实验计划中的一种对照培养物的50％-100％之间；或
iv、对于d)，大约在一种对照培养物的一个平均集落大小的15％以内或其子分数以内。
26.根据权利要求23-25中任意一项的所述自动化系统，其特征在于：在所述第一时间点或一个或多个后续时间点，计算出的关于与所述细胞培养容器中的所述多能干细胞培养物所述一个或多个特征，与一个第二细胞培养容器中的所述第二多能干细胞培养物是不同的，并且所述一个或多个特征在一个随后传代过程中变得更加一致。
27.根据权利要求23-26中任意一项的所述自动化系统，其特征在于：所述成像模块包括一台照相机，能够分辨所述培养容器中的单个细胞。
28.根据权利要求23-27中任意一项的所述自动化系统，其特征在于：所述自动化系统还包括一个载物台模块，用于支撑细胞培养容器。
29.根据权利要求28的所述自动化系统，其特征在于：所述载物台模块在一个第一平面内沿一条第一轴线或一条第二轴线或沿二者是可以移动的。
30.根据权利要求28或29的所述自动化系统，其特征在于：所述载物台模块或其子部件绕其边缘沿一条第三轴线枢转。
31.根据权利要求23-30中任意一项的所述自动化系统，其特征在于：所述一个或多个移液器附接到一个滑架上。
32.根据权利要求23-31中任意一项的所述自动化系统，其特征在于：所述液体分配器模块包括一根以上的导管，且每根导管与一个以上储液器中的单独一个呈流体连通。
33.根据权利要求32的所述自动化系统，其特征在于：所述液体分配器模块包括一根第一导管，该导管与一种第一溶液的一个储存器呈流体连通；以及一根第二导管，该导管与一种第二溶液的一个储存器呈流体连通；并且所述第一溶液和所述第二溶液同时被分配到一个子代细胞培养容器中。
34.根据权利要求32或33的所述自动化系统，其特征在于：每根导管是可重复使用或可更换的。
35.根据权利要求23-34中任意一项的所述自动化系统，其特征在于：还包括一个壳体，用于至少容纳所述成像模块、移液器模块、液体分配器模块、载物台模块和处理模块。
36.根据权利要求35的所述自动化系统，其特征在于：所述壳体是无菌的。
37.根据权利要求35或36的所述自动化系统，其特征在于：还包括一个制冷模块，以用于存放所述一个以上储液器中的一个或多个以及一个储水器，其中所述一个以上储液器、所述制冷模块以及所述废料储存器位于所述壳体的外部。
38.根据权利要求37的所述自动化系统，其特征在于：所述废料储存器与所述壳体内的一个废料槽呈流体连通。
39.根据权利要求38的所述自动化系统，其特征在于：所述废料槽涂覆有一疏水涂层。
40.根据权利要求37-39中任意一项的所述自动化系统，其特征在于：还包括一个或多个传感器，其中所述一个或多个传感器被配置为检测并报告在所述成像模块上、所述载物台模块上或在所述一个以上储液器中的负载质量，以便于
a)检测所述成像模块、所述载物台模块或所述一个以上储液器中的负载质量；以及
b)在所述负载质量不同于预期时触发一个警报。
41.根据权利要求35-40中任意一项的所述自动化系统，其特征在于：还包括一个封闭传送机模块，其连接至所述壳体和一个培养箱模块，并用于将所述细胞培养容器从所述培养箱模块传送到所述处理模块的附近。
42.根据权利要求41的所述自动化系统，其特征在于：所述培养箱模块维持用于所述多能干细胞培养物的允许环境条件。
43.根据权利要求23-42中任意一项的所述自动化系统，其特征在于：还包括一个图形用户界面。
44.根据权利要求43的所述自动化系统，其特征在于：所述图形用户界面就所述一个以上储液器中的每一个显示一个液位报告。
45.用于自适应传代细胞培养物的一种自动化方法，其包括：
在一个细胞培养容器内的一个细胞培养基中提供所述细胞培养物；
通过一个成像模块在一个第一时间点和随后的一个或多个时间点采集所述细胞培养物的一张或多张图像；
基于所述一张或多张图像，通过与所述成像模块通信耦合的至少一个处理器来计算所述细胞培养物的一个或多个特征；以及
通过所述至少一个处理器来执行一个自动传代实验计划，该执行基于将计算出的所述细胞培养物的所述一个或多个特征与
a)所述一个或多个特征的一个已知阈值水平；或者
b)所述一个或多个特征的一个预设阈值水平；
进行比较。
46.根据权利要求45的所述自动化系统，其特征在于：所述一个或多个特征包括：
a)所述细胞培养物的融合度的度量；
b)所述细胞培养物的细胞或集落的形态的度量；
c)所述细胞培养物的细胞或集落的分化的度量；
d)所述细胞培养物的集落大小分布的度量；
e)a)、b)、c)或d)从所述第一时间点到所述一个或多个后续时间点的变化的度量；或
f)a)相对于b)、c)或d)的度量，b)相对于a)、c)或d)的度量，c)相对于a)、b)或d)的度量，或d)相对于a)、b)或c)的度量。
47.根据权利要求46的所述自动化系统，其特征在于：所述已知或输入阈值水平为：
i、对于a)，细胞或集落融合度大约在30-90％之间；
ii、对于b)，大约在一种对照培养物的±30％之间；
iii、对于c)，大约在一个维持实验计划中的一种对照培养物的0-30％之间，或者大约在一个分化实验计划中的一种对照培养物的50％-100％之间；或
iv、对于d)，就而言，大约在一种对照培养物的一个平均集落大小分布的15％以内或其子分数以内。
48.根据权利要求45-47中任意一项的所述自动化系统，其特征在于：在所述第一时间点或一个或多个后续时间点，计算出的关于与所述细胞培养容器中的所述细胞培养物的所述一个或多个特征，与一个第二细胞培养容器中的所述第二细胞培养物是不同的，并且所述一个或多个特征在一个随后传代过程中变得更加一致。
49.根据权利要求45-48中任意一项的所述自动化方法，其特征在于：提供所述细胞培养物包括将所述细胞培养物从所述培养箱转移。
50.根据权利要求45-49中任意一项的所述自动化方法，其特征在于：还包括将所述细胞培养容器放置在一个载物台模块上。
51.根据权利要求45-50中任意一项的所述自动化方法，其特征在于：还包括从所述细胞培养物中获得一细胞悬液，并将所述细胞悬液的部分或全部接种到一个子代细胞培养容器中。
52.根据权利要求51的所述自动化方法，其特征在于：接种到所述子代细胞培养容器中之前，将所述细胞悬液通过一个第一移液器吸头传递，从而将所述细胞培养物解离成一单细胞悬液或多个簇，所述簇平均直径不超过所述第一移液器吸头的孔直径。
53.根据权利按要求51或52的所述自动化方法，其特征在于：所述细胞悬液的获得包括从所述细胞培养容器中吸出所述细胞培养基，并使所述细胞培养容器中的所述细胞培养物与一种分离液接触。
54.根据权利要求53的所述自动化方法，其特征在于：所述分离液是一种解离溶液，并且所述解离溶液选择性地从所述细胞培养容器的壁上剥离出第一组分化细胞或第二组未分化细胞。
55.根据权利要求51-54中任意一项的所述自动化方法，其特征在于：还包括在接种所述细胞悬液之前，将一种第一溶液和一种第二溶液同时分配到所述子代细胞培养容器中。
56.根据权利要求55的所述自动化方法，其特征在于：所述第一溶液是所述细胞培养基，所述第二溶液是一种溶解的细胞外基质。
57.根据权利要求45-56中任意一项的所述自动化方法，其特征在于：所述细胞培养物是多能干细胞。
58.根据权利要求57的所述自动化方法，其特征在于：所述多能干细胞是人类的多能干细胞。
59.根据权利要求57或58的所述自动化方法，其特征在于：所述多能干细胞以簇传代。
60.一种用于适应性地传代一种多能粘附细胞培养物的自动化方法，其包括：
在一个细胞培养容器内的一个细胞培养基中提供所述细胞培养物；
通过一个成像模块在一个第一时间点和随后的一个或多个时间点采集所述细胞培养物的一张或多张图像；
基于所述一张或多张图像，通过与所述成像模块通信耦合的至少一个处理器来计算所述多能干细胞培养物的一个或多个特征；以及
通过所述至少一个处理器执行一个自动传代实验计划，该执行基于将计算出的所述多能干细胞培养物的所述一个或多个特与
a)所述一个或多个特征的一个已知阈值水平；或是
b)所述一个或多个特征的一个输入阈值水平；
进行比较。
61.根据权利要求60的所述自动化系统，其特征在于：所述一个或多个特征包括：
a)所述多能干细胞培养物的融合度的度量；
b)所述多能干细胞培养物的细胞或集落的形态的度量；
c)所述多能干细胞培养的细胞或集落的分化的度量；
d)所述多能干细胞培养物的集落大小分布的度量；
e)a)、b)、c)或d)从所述第一时间点到所述一个或多个后续时间点的变化的度量；或
f)a)相对于b)、c)或d)的度量，b)相对于a)、c)或d)的度量，c)相对于a)、b)或d)的度量，或d)相对于a)、b)或c)的度量。
62.根据权利要求61的所述自动化系统，其特征在于：所述已知或输入阈值水平为：
i、对于a)，细胞或集落融合度大约在30-90％之间；
ii、对于b)，大约在一种对照培养物的±30％之间；
iii、对于c)，维持实验计划中的对照培养物的约0-30％，或分化实验计划中的对照培养物的约50％-100％；或
iv、对于d)，大约在一种对照培养物的一个平均集落大小分布的15％以内或其子分数以内。
63.根据权利要求60-62中任意一项的所述自动化系统，其特征在于：在所述第一时间点或一个或多个后续时间点，计算出的关于与所述细胞培养容器中的所述多能干细胞培养物的所述一个或多个特征，与一个第二细胞培养容器中的所述第二多能干细胞培养物是不同的，并且在一个随后传代过程中，所述一个或多个特征变得更加一致。
64.根据权利要求60-63中任意一项的所述自动化方法，其特征在于：所述多能干(粘附的)细胞培养物的提供，包括将所述细胞培养物从所述培养箱中转移。
65.根据权利要求60-64中任意一项的所述自动化方法，其特征在于：还包括将所述细胞培养容器放置在一个载物台模块上。
66.根据权利要求65的所述自动化方法，其特征在于：还包括从所述细胞培养容器中吸出所述细胞培养基，并使所述细胞培养容器中的所述多能干粘附的细胞培养物与一种分离液接触以产生一细胞悬液。
67.根据权利要求66的所述自动化方法，其特征在于：所述分离液是一种解离溶液，其产生所述细胞悬液，所述细胞悬液作为从所述细胞培养容器壁上选择性剥离的第一组分化细胞或第二组未分化细胞。
68.根据权利要求66或67的所述自动化方法，其特征在于：所述细胞悬液包括多能干细胞簇，所述簇平均直径不超过能使所述细胞悬液通过的一个第一移液器吸头的孔径。
69.根据权利要求66-68中任意一项的所述自动化方法，其特征在于：还包括将所述细胞悬液接种到一个子代培养容器中。
70.根据权利要求69的所述自动化方法，其特征在于：还包括在接种所述细胞悬液之前将一种第一溶液和一种第二溶液同时分配到所述子代培养容器中。
71.根据权利要求70的所述自动化方法，其特征在于：所述第一溶液是所述细胞培养基，所述第二溶液是一种溶解的细胞外基质。
72.根据权利要求60-71中任意一项的所述自动化方法，其特征在在于：所述多能干细胞是人类的。
73.一种系统、装置或方法，其包括如上所述的和/或如上所请求保护的和/或如附图中所示的特征的一个或多个的组合。
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