JP2001128660A - 血管網類似構造体を有する細胞培養用モジュール - Google Patents
血管網類似構造体を有する細胞培養用モジュールInfo
- Publication number
- JP2001128660A JP2001128660A JP2000188275A JP2000188275A JP2001128660A JP 2001128660 A JP2001128660 A JP 2001128660A JP 2000188275 A JP2000188275 A JP 2000188275A JP 2000188275 A JP2000188275 A JP 2000188275A JP 2001128660 A JP2001128660 A JP 2001128660A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- module
- cells
- culture
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 title description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 117
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 claims abstract description 91
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 29
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 27
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims abstract description 21
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 20
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 51
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims description 22
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 12
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 12
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 12
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 claims description 11
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 claims description 11
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 claims description 9
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 claims description 8
- 229960000355 copper sulfate Drugs 0.000 claims description 8
- 229940082569 selenite Drugs 0.000 claims description 8
- MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-L selenite(2-) Chemical compound [O-][Se]([O-])=O MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 7
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 3
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims description 3
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 3
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 2
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 31
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 27
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 abstract 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 abstract 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 abstract 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 22
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 18
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 18
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 16
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 12
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 12
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- RZLVQBNCHSJZPX-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O RZLVQBNCHSJZPX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 8
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 8
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 8
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 8
- 239000000306 component Substances 0.000 description 7
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 7
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 5
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 5
- ZWQVYZXPYSYPJD-RYUDHWBXSA-N Glu-Gly-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZWQVYZXPYSYPJD-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 229920005830 Polyurethane Foam Polymers 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 4
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 4
- 239000011496 polyurethane foam Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 229960004232 linoleic acid Drugs 0.000 description 3
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 3
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-N selenous acid Chemical compound O[Se](O)=O MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 2
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 2
- 230000006706 cellular oxygen consumption Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Cu+2].[O-]S([O-])(=O)=O JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 2
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 2
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 238000004382 potting Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 229920002284 Cellulose triacetate Polymers 0.000 description 1
- 102100033779 Collagen alpha-4(IV) chain Human genes 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000710870 Homo sapiens Collagen alpha-4(IV) chain Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N [(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-diacetyloxy-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-triacetyloxy-6-(acetyloxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-triacetyloxy-2-(acetyloxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@@H](COC(C)=O)O1)OC(C)=O)COC(=O)C)[C@@H]1[C@@H](COC(C)=O)O[C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000036267 drug metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N flutamide Chemical compound CC(C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(F)(F)F)=C1 MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- LNEPOXFFQSENCJ-UHFFFAOYSA-N haloperidol Chemical compound C1CC(O)(C=2C=CC(Cl)=CC=2)CCN1CCCC(=O)C1=CC=C(F)C=C1 LNEPOXFFQSENCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011076 safety test Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 229920002050 silicone resin Polymers 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D63/00—Apparatus in general for separation processes using semi-permeable membranes
- B01D63/02—Hollow fibre modules
- B01D63/033—Specific distribution of fibres within one potting or tube-sheet
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
- C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/10—Hollow fibers or tubes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2313/00—Details relating to membrane modules or apparatus
- B01D2313/14—Specific spacers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 動物細胞が本来の機能を損うことなく長期間
生存することができる組織体を形成する方法を提供し、
かつそのような組織体を高密度に組み込み、有用物質生
産やハイブリッド型人工臓器に応用可能なモジュールを
提供する。 【解決手段】 ２枚以上の規則的に配置された小孔を有
するスペーサーの各小孔に中空糸を通した、微小間隔で
規則的に配管した構造体を有することを特徴とする細胞
培養用モジュール、該細胞培養用モジュールに肝細胞が
充填された人工肝臓モジュール、及び該細胞培養用モジ
ュールにおける中空糸の内腔もしくは外腔部に遠心力を
利用して細胞を充填し、該充填された細胞を培養するこ
とを特徴とする細胞培養方法。ＤＭＥＭを基礎培地とす
る培養培地で肝細胞を培養することを特徴とする該細胞
培養方法。
生存することができる組織体を形成する方法を提供し、
かつそのような組織体を高密度に組み込み、有用物質生
産やハイブリッド型人工臓器に応用可能なモジュールを
提供する。 【解決手段】 ２枚以上の規則的に配置された小孔を有
するスペーサーの各小孔に中空糸を通した、微小間隔で
規則的に配管した構造体を有することを特徴とする細胞
培養用モジュール、該細胞培養用モジュールに肝細胞が
充填された人工肝臓モジュール、及び該細胞培養用モジ
ュールにおける中空糸の内腔もしくは外腔部に遠心力を
利用して細胞を充填し、該充填された細胞を培養するこ
とを特徴とする細胞培養方法。ＤＭＥＭを基礎培地とす
る培養培地で肝細胞を培養することを特徴とする該細胞
培養方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は動物細胞を用いた有
用物質生産、或いはハイブリッド型（もしくはバイオ
型）人工臓器に応用可能な細胞組織体形成法及びそれを
組み込んだモジュールに関する。より詳しくは、本発明
は、細胞の本来の機能を損なうことなく長期間維持する
ことが可能な細胞組織体を形成する方法としての、遠心
力を用いた培養細胞の組織体形成誘導技術、及び中空糸
膜を用いて生体内の血管網類似構造を再現した細胞培養
用モジュール、並びに該モジュールと上述の組織体誘導
技術とを組み合わせた細胞培養法に関するものである。
さらに、本発明は、該細胞組織体の培養に適した培地及
び該培地を用いた該細胞組織体の培養方法に関する。
用物質生産、或いはハイブリッド型（もしくはバイオ
型）人工臓器に応用可能な細胞組織体形成法及びそれを
組み込んだモジュールに関する。より詳しくは、本発明
は、細胞の本来の機能を損なうことなく長期間維持する
ことが可能な細胞組織体を形成する方法としての、遠心
力を用いた培養細胞の組織体形成誘導技術、及び中空糸
膜を用いて生体内の血管網類似構造を再現した細胞培養
用モジュール、並びに該モジュールと上述の組織体誘導
技術とを組み合わせた細胞培養法に関するものである。
さらに、本発明は、該細胞組織体の培養に適した培地及
び該培地を用いた該細胞組織体の培養方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より、動物細胞を有用物質生産、或
いはハイブリッド型人工臓器の要素として利用するため
の培養装置が知られている。公知のこの培養装置は細胞
の高密度培養を行うためにマイクロキャリアーを用いた
攪拌槽培養（W.R.Tolbertら、Ann. Rep. Ferment. Pro
c., 第６巻、第３５頁(1983)など）や多孔質担体を用い
た流動床・固定床培養（特公平７−４６９８８号公報な
ど）、また多孔性の中空糸膜を利用し、その内腔或いは
外部に細胞を充填する培養（仲ら、人工臓器，第２８
巻、第１号、第６８〜７３頁(1999)など）が行われてい
た。なかでも、中空糸膜を用いた培養は、細胞が中空糸
膜によって流動培地から隔離されるために剪断応力から
の保護、漏洩の防止の点で優れており、また培養装置も
多数の中空糸を束ねて内蔵している既存の透析装置や血
漿分離装置がそのまま流用可能であり広く使用されてい
る。しかしながら、これらの中空糸型の培養装置では培
養タンク（モジュール）内に中空糸が均一に存在してお
らず、そのため中空糸外部に細胞を充填する場合、膜表
面からの物質移動距離がモジュール各部位で異なり、細
胞の生存・増殖に極在化が生じてしまうという問題があ
った。
いはハイブリッド型人工臓器の要素として利用するため
の培養装置が知られている。公知のこの培養装置は細胞
の高密度培養を行うためにマイクロキャリアーを用いた
攪拌槽培養（W.R.Tolbertら、Ann. Rep. Ferment. Pro
c., 第６巻、第３５頁(1983)など）や多孔質担体を用い
た流動床・固定床培養（特公平７−４６９８８号公報な
ど）、また多孔性の中空糸膜を利用し、その内腔或いは
外部に細胞を充填する培養（仲ら、人工臓器，第２８
巻、第１号、第６８〜７３頁(1999)など）が行われてい
た。なかでも、中空糸膜を用いた培養は、細胞が中空糸
膜によって流動培地から隔離されるために剪断応力から
の保護、漏洩の防止の点で優れており、また培養装置も
多数の中空糸を束ねて内蔵している既存の透析装置や血
漿分離装置がそのまま流用可能であり広く使用されてい
る。しかしながら、これらの中空糸型の培養装置では培
養タンク（モジュール）内に中空糸が均一に存在してお
らず、そのため中空糸外部に細胞を充填する場合、膜表
面からの物質移動距離がモジュール各部位で異なり、細
胞の生存・増殖に極在化が生じてしまうという問題があ
った。
【０００３】さらに、細胞の培養法として、壁付着性の
動物細胞の培養法としては従来より二次元的な単層培養
法が主流であったが、培養細胞が急速にその機能を消失
することが問題となっている。例えば、高度に分化した
初代肝細胞は単層培養条件下では数日の培養期間中にそ
の機能を消失してしまう。これに対し、高度な分化機能
の発現、維持のために細胞の集塊培養（組織体培養）の
開発も行われており、例えば、多孔性のポリウレタンフ
ォーム（ＰＵＦ）を用いた培養細胞の球状組織体（スフ
ェロイド）培養などが例えば高機能発現が要求されるハ
イブリッド型人工肝臓の開発に利用されている（松下
ら、人工臓器，第２１巻、第３号、第１０５０〜１０５
４頁(1992)）。
動物細胞の培養法としては従来より二次元的な単層培養
法が主流であったが、培養細胞が急速にその機能を消失
することが問題となっている。例えば、高度に分化した
初代肝細胞は単層培養条件下では数日の培養期間中にそ
の機能を消失してしまう。これに対し、高度な分化機能
の発現、維持のために細胞の集塊培養（組織体培養）の
開発も行われており、例えば、多孔性のポリウレタンフ
ォーム（ＰＵＦ）を用いた培養細胞の球状組織体（スフ
ェロイド）培養などが例えば高機能発現が要求されるハ
イブリッド型人工肝臓の開発に利用されている（松下
ら、人工臓器，第２１巻、第３号、第１０５０〜１０５
４頁(1992)）。
【０００４】モジュール内にこの様に組織体を組み込ん
だ場合、細胞集塊（組織体）内では細胞密度が非常に高
い状態となるため、細胞の高密度培養が可能となり、モ
ジュールのコンパクト化が達成できる利点もある。しか
しながら、モジュール内での酸素・栄養分の消費も著し
い。特に初代肝細胞の様な酸素消費量の著しい細胞を培
養する場合、従来の装置では高密度に充填しても物質の
供給が不十分で組織体内部の細胞が壊死し、装置として
の性能が低下するという問題から、1×１０7 cells/cm3
程度の細胞密度が限界であった。このような問題によっ
て、高密度培養条件下において細胞が本来の機能を損う
ことなく長期間生存することは困難であった。
だ場合、細胞集塊（組織体）内では細胞密度が非常に高
い状態となるため、細胞の高密度培養が可能となり、モ
ジュールのコンパクト化が達成できる利点もある。しか
しながら、モジュール内での酸素・栄養分の消費も著し
い。特に初代肝細胞の様な酸素消費量の著しい細胞を培
養する場合、従来の装置では高密度に充填しても物質の
供給が不十分で組織体内部の細胞が壊死し、装置として
の性能が低下するという問題から、1×１０7 cells/cm3
程度の細胞密度が限界であった。このような問題によっ
て、高密度培養条件下において細胞が本来の機能を損う
ことなく長期間生存することは困難であった。
【０００５】一方、初代肝細胞の機能維持には、培養形
態とともに培養培地の組成が重要であるとされ、これま
でにも種々の添加因子を含む培養培地の例が報告されて
いる。例えば、Ｌ−アラニンを高濃度で添加した培養培
地による肝細胞の生存率の向上（特開平５−３３６９５
９号公報）や、アスコルビン酸を添加した培養培地によ
る肝細胞のアルブミン分泌の維持（特開平７−２７４９
５２号公報）、ウィリアムのＥ培地（ＷＥＭ）にデキサ
メサゾン、グルカゴン、インスリン、上皮増殖因子（Ｅ
ＧＦ）を添加した培養培地を用いたスフェロイド培養肝
細胞における６０日程度のアルブミン分泌の維持（J.Z.
Tongら，Exp. Cell Res., 第１８９巻，第８７〜９２
頁，１９９０年）、ダルベッコの改変イーグル培地にプ
ロリン、インスリン、グルカゴン、ヒドロコルチゾン、
ＥＧＦを添加した培養培地を用いたコラーゲンサンドイ
ッチ培養肝細胞における１ヶ月程度のアルブミン分泌能
の維持（J. Leeら，Biotech. Bioeng., 第４０巻，第２
９８〜３０５頁，１９９２年）等が報告されている。
態とともに培養培地の組成が重要であるとされ、これま
でにも種々の添加因子を含む培養培地の例が報告されて
いる。例えば、Ｌ−アラニンを高濃度で添加した培養培
地による肝細胞の生存率の向上（特開平５−３３６９５
９号公報）や、アスコルビン酸を添加した培養培地によ
る肝細胞のアルブミン分泌の維持（特開平７−２７４９
５２号公報）、ウィリアムのＥ培地（ＷＥＭ）にデキサ
メサゾン、グルカゴン、インスリン、上皮増殖因子（Ｅ
ＧＦ）を添加した培養培地を用いたスフェロイド培養肝
細胞における６０日程度のアルブミン分泌の維持（J.Z.
Tongら，Exp. Cell Res., 第１８９巻，第８７〜９２
頁，１９９０年）、ダルベッコの改変イーグル培地にプ
ロリン、インスリン、グルカゴン、ヒドロコルチゾン、
ＥＧＦを添加した培養培地を用いたコラーゲンサンドイ
ッチ培養肝細胞における１ヶ月程度のアルブミン分泌能
の維持（J. Leeら，Biotech. Bioeng., 第４０巻，第２
９８〜３０５頁，１９９２年）等が報告されている。
【０００６】しかしながら、肝細胞はアルブミン等の蛋
白質合成能の他に、生体外異物や体内で生成されるアン
モニアや薬物等を解毒する解毒機能も有しているが、そ
の維持は難しく、例えばアンモニア代謝能は、従来の培
養では培養２週間程度しか維持できないという問題があ
った。
白質合成能の他に、生体外異物や体内で生成されるアン
モニアや薬物等を解毒する解毒機能も有しているが、そ
の維持は難しく、例えばアンモニア代謝能は、従来の培
養では培養２週間程度しか維持できないという問題があ
った。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、種々
の動物細胞が本来の機能を損なわずに長期間生存するこ
とができる組織体を形成する方法を提供することであ
り、かつそのような組織体を高密度に組み込み、有用物
質生産やハイブリッド型人工臓器に応用可能なモジュー
ルを提供することである。また、本発明の別の目的は、
人工肝臓において、初代肝細胞が有する種々の生理機
能、特にアルブミン分泌能に加えて、少なくともアンモ
ニア代謝能を長期間維持させるのに適した培養培地を提
供することであり、当該培地を用いて、ハイブリッド型
人工肝臓や動物実験代替法（動物愛護の観点から動物に
代えて細胞を用いて薬物等の安全性試験を行う方法）等
に長期にわたって利用できる培養技術を提供することで
ある。
の動物細胞が本来の機能を損なわずに長期間生存するこ
とができる組織体を形成する方法を提供することであ
り、かつそのような組織体を高密度に組み込み、有用物
質生産やハイブリッド型人工臓器に応用可能なモジュー
ルを提供することである。また、本発明の別の目的は、
人工肝臓において、初代肝細胞が有する種々の生理機
能、特にアルブミン分泌能に加えて、少なくともアンモ
ニア代謝能を長期間維持させるのに適した培養培地を提
供することであり、当該培地を用いて、ハイブリッド型
人工肝臓や動物実験代替法（動物愛護の観点から動物に
代えて細胞を用いて薬物等の安全性試験を行う方法）等
に長期にわたって利用できる培養技術を提供することで
ある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記のような目的を達成
するために、本発明者らは鋭意研究を行った結果、中空
糸の内腔、外腔部或いはその他の培養担体内に遠心力を
利用して細胞を強制的に充填し細胞間の接触頻度を高め
ることにより、高機能を有する細胞組織体の形成を誘導
することが可能なことと、規則的に小孔の配置されたス
ペーサーを２枚以上用い、スペーサーの各小孔に半透膜
から形成される中空糸を通すことで中空糸を微小間隔で
規則的に配管した構造体、すなわち生体内の毛細血管網
を模倣した血管網類似構造体を組み込んだモジュールを
用いて、該血管網類似構造体を構成する中空糸外腔或い
は内腔に細胞を高密度に充填し、中空糸膜を介して細胞
の生存に必要な酸素・栄養分の供給を行うことにより、
該細胞が組織様構造体を構築することが可能であること
を見出した。
するために、本発明者らは鋭意研究を行った結果、中空
糸の内腔、外腔部或いはその他の培養担体内に遠心力を
利用して細胞を強制的に充填し細胞間の接触頻度を高め
ることにより、高機能を有する細胞組織体の形成を誘導
することが可能なことと、規則的に小孔の配置されたス
ペーサーを２枚以上用い、スペーサーの各小孔に半透膜
から形成される中空糸を通すことで中空糸を微小間隔で
規則的に配管した構造体、すなわち生体内の毛細血管網
を模倣した血管網類似構造体を組み込んだモジュールを
用いて、該血管網類似構造体を構成する中空糸外腔或い
は内腔に細胞を高密度に充填し、中空糸膜を介して細胞
の生存に必要な酸素・栄養分の供給を行うことにより、
該細胞が組織様構造体を構築することが可能であること
を見出した。
【０００９】また、本発明者らは、肝細胞組織体の培養
において、アミノ酸、ビタミン類及びエネルギー源が豊
富なＤＭＥＭ、或いは約６０〜約９０％のＤＭＥＭと約
１０〜約４０％の他の培地からなる混合培地に、追加成
分としてプロリン、ＥＧＦ、インスリン、ヒドロコルチ
ゾン、亜セレン酸、リノール酸、硫酸銅及び硫酸亜鉛を
含む培養培地を使用することによって、アンモニア代謝
能を含む初代肝細胞の代表的な機能の維持が飛躍的に延
長されることを見出した。さらに、この培地を上記モジ
ュール及び細胞組織体形成方法と組み合わせることによ
り、アンモニア代謝能を含む初代肝細胞の代表的な機能
が少なくとも４ヶ月間にわたって維持される人工肝臓を
作製することに成功して、本発明を完成するに至った。
において、アミノ酸、ビタミン類及びエネルギー源が豊
富なＤＭＥＭ、或いは約６０〜約９０％のＤＭＥＭと約
１０〜約４０％の他の培地からなる混合培地に、追加成
分としてプロリン、ＥＧＦ、インスリン、ヒドロコルチ
ゾン、亜セレン酸、リノール酸、硫酸銅及び硫酸亜鉛を
含む培養培地を使用することによって、アンモニア代謝
能を含む初代肝細胞の代表的な機能の維持が飛躍的に延
長されることを見出した。さらに、この培地を上記モジ
ュール及び細胞組織体形成方法と組み合わせることによ
り、アンモニア代謝能を含む初代肝細胞の代表的な機能
が少なくとも４ヶ月間にわたって維持される人工肝臓を
作製することに成功して、本発明を完成するに至った。
【００１０】すなわち、本発明は、２枚以上の規則的に
小孔が配置されたスペーサーの各小孔に中空糸を通し
た、微小間隔で規則的に配管された構造体を有すること
を特徴とする細胞培養用モジュールを提供する。このよ
うな構造体は生体内の毛細血管網に類似した構造を有
し、中空糸の外腔および／または内腔に充填された細胞
に中空糸膜を介して細胞の生存に必要な酸素や栄養分を
効率よく供給することにより、高い生理機能を発揮する
細胞組織体の形成を促進するとともに、該細胞組織体に
おける種々の生理機能の維持に寄与する。
小孔が配置されたスペーサーの各小孔に中空糸を通し
た、微小間隔で規則的に配管された構造体を有すること
を特徴とする細胞培養用モジュールを提供する。このよ
うな構造体は生体内の毛細血管網に類似した構造を有
し、中空糸の外腔および／または内腔に充填された細胞
に中空糸膜を介して細胞の生存に必要な酸素や栄養分を
効率よく供給することにより、高い生理機能を発揮する
細胞組織体の形成を促進するとともに、該細胞組織体に
おける種々の生理機能の維持に寄与する。
【００１１】本発明はまた、中空糸の内腔部あるいは細
胞培養用モジュールにおける中空糸の内腔もしくは外腔
部に遠心力を利用して細胞を充填し、該充填された細胞
を培養することを特徴とする細胞培養方法を提供する。
遠心力を負荷することにより細胞が集合して接触頻度を
増し、細胞組織体の形成が促進される。
胞培養用モジュールにおける中空糸の内腔もしくは外腔
部に遠心力を利用して細胞を充填し、該充填された細胞
を培養することを特徴とする細胞培養方法を提供する。
遠心力を負荷することにより細胞が集合して接触頻度を
増し、細胞組織体の形成が促進される。
【００１２】さらに、本発明は、上記の培養方法、特に
肝細胞の培養方法において、ＤＭＥＭもしくはＤＭＥＭ
と他の培地との混合培地を基礎培地として使用すること
により、解毒機能を含む初代肝細胞の代表的機能を長期
間維持させ得る培養方法を提供する。また、ＤＭＥＭも
しくはＤＭＥＭ含有混合培地に加えて、プロリン、ＥＧ
Ｆ、インスリン、ヒドロコルチゾン、亜セレン酸、リノ
ール酸、硫酸銅及び硫酸亜鉛をさらに含有させることに
より、当該肝細胞機能をより長期にわたって維持するこ
とができる。したがって、本発明は、ＤＭＥＭに加えて
上記追加成分をさらに含む培養培地を提供する。
肝細胞の培養方法において、ＤＭＥＭもしくはＤＭＥＭ
と他の培地との混合培地を基礎培地として使用すること
により、解毒機能を含む初代肝細胞の代表的機能を長期
間維持させ得る培養方法を提供する。また、ＤＭＥＭも
しくはＤＭＥＭ含有混合培地に加えて、プロリン、ＥＧ
Ｆ、インスリン、ヒドロコルチゾン、亜セレン酸、リノ
ール酸、硫酸銅及び硫酸亜鉛をさらに含有させることに
より、当該肝細胞機能をより長期にわたって維持するこ
とができる。したがって、本発明は、ＤＭＥＭに加えて
上記追加成分をさらに含む培養培地を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】まず、遠心力を用いた細胞の組織
体形成法について具体的に説明する。細胞が分散した細
胞懸濁液に適当な遠心力を負荷すると、細胞は遠心力に
よって沈降し、細胞集合体を形成する。このとき細胞同
士は密に接した状態、すなわち細胞同士の接触頻度が非
常に高まった状態となる。この様な状態で細胞に適切な
酸素、栄養分の供給を行うことで，細胞が高い機能を長
期間発現できる組織体を形成することが可能である。例
えば、半透膜からなる中空糸の内腔に肝細胞を遠心力に
よって高密度に充填し、中空糸外部から酸素、栄養分の
供給、代謝老廃物の除去を行うことで、細胞は中空糸内
腔で円柱状の組織体を形成することが可能である。遠心
力による細胞の高密度充填は中空糸内腔のみに適用され
るわけではなく、例えば、後述のように中空糸を規則的
に配管した場合、中空糸の外腔部に充填することも可能
である。いずれの場合においても、細胞が生存できる環
境を与えてやることで細胞の組織化が可能である。
体形成法について具体的に説明する。細胞が分散した細
胞懸濁液に適当な遠心力を負荷すると、細胞は遠心力に
よって沈降し、細胞集合体を形成する。このとき細胞同
士は密に接した状態、すなわち細胞同士の接触頻度が非
常に高まった状態となる。この様な状態で細胞に適切な
酸素、栄養分の供給を行うことで，細胞が高い機能を長
期間発現できる組織体を形成することが可能である。例
えば、半透膜からなる中空糸の内腔に肝細胞を遠心力に
よって高密度に充填し、中空糸外部から酸素、栄養分の
供給、代謝老廃物の除去を行うことで、細胞は中空糸内
腔で円柱状の組織体を形成することが可能である。遠心
力による細胞の高密度充填は中空糸内腔のみに適用され
るわけではなく、例えば、後述のように中空糸を規則的
に配管した場合、中空糸の外腔部に充填することも可能
である。いずれの場合においても、細胞が生存できる環
境を与えてやることで細胞の組織化が可能である。
【００１４】遠心力は用いる細胞種によって傷害を受け
ない範囲で設定すれば良く、例えば初代ラット肝細胞の
場合、好ましくは１５００×Ｇ以下、より好ましくは５
×Ｇ〜４００×Ｇの遠心力が望ましいが、特に限定され
るものではない。遠心時間の選択も遠心力に合わせて設
定すればよい。
ない範囲で設定すれば良く、例えば初代ラット肝細胞の
場合、好ましくは１５００×Ｇ以下、より好ましくは５
×Ｇ〜４００×Ｇの遠心力が望ましいが、特に限定され
るものではない。遠心時間の選択も遠心力に合わせて設
定すればよい。
【００１５】本発明の遠心力を用いた細胞組織体形成法
に使用される中空糸は、半透膜構造を有するものであれ
ば特に制限はないが、その内径が、好ましくは２０〜１
０００μｍ、より好ましくは５０〜５００μｍ、さらに
好ましくは５０〜１５０μｍ程度のものである。また、
本発明の遠心力を用いた細胞組織体形成法に使用される
細胞培養用モジュールは中空糸膜を有する構造のもので
あれば特に制限はないが、好ましい態様においては、微
小間隔で規則的に配管された構造体を有する後述の細胞
培養用モジュールが使用される。
に使用される中空糸は、半透膜構造を有するものであれ
ば特に制限はないが、その内径が、好ましくは２０〜１
０００μｍ、より好ましくは５０〜５００μｍ、さらに
好ましくは５０〜１５０μｍ程度のものである。また、
本発明の遠心力を用いた細胞組織体形成法に使用される
細胞培養用モジュールは中空糸膜を有する構造のもので
あれば特に制限はないが、好ましい態様においては、微
小間隔で規則的に配管された構造体を有する後述の細胞
培養用モジュールが使用される。
【００１６】次に、微小間隔で規則的に配管した構造体
（以下、血管網類似構造体ともいう）を組み込んだ細胞
培養用モジュールについて説明する。ここで、血管網類
似構造体とは、毛細血管に見立てた多数の中空糸（好ま
しくは上記のような内径を有する中空糸）を、数百μｍ
程度の間隔、好ましくは２０〜１０００μｍ、より好ま
しくは５０〜５００μｍ、さらに好ましくは５０〜１５
０μｍの微小間隔で規則的に配管した構造体をいうもの
であり、シェルサイドに存在する細胞に酸素と栄養を供
給し、老廃物を除去することが可能な構造を有するもの
である。図１，図２，図３は、本発明の細胞培養用モジ
ュールの一例を示すものである。
（以下、血管網類似構造体ともいう）を組み込んだ細胞
培養用モジュールについて説明する。ここで、血管網類
似構造体とは、毛細血管に見立てた多数の中空糸（好ま
しくは上記のような内径を有する中空糸）を、数百μｍ
程度の間隔、好ましくは２０〜１０００μｍ、より好ま
しくは５０〜５００μｍ、さらに好ましくは５０〜１５
０μｍの微小間隔で規則的に配管した構造体をいうもの
であり、シェルサイドに存在する細胞に酸素と栄養を供
給し、老廃物を除去することが可能な構造を有するもの
である。図１，図２，図３は、本発明の細胞培養用モジ
ュールの一例を示すものである。
【００１７】図１のようなモジュールの作製方法につい
て具体的に説明する。まず、使用するスペーサーを、ス
ペーサー上に配置された小孔が合致するように重ね合わ
せ、合致した小孔に中空糸を通していく。中空糸を通し
終わった後にスペーサーを任意の間隔に広げ、容器１内
の任意の場所に固定する。その後、中空糸は封止部４に
おいて固定される。このような封止部の形成方法として
は、遠心力をもってポッティング剤を封止部に該当する
空間に注入し、ポッティング剤硬化後、硬化部を鋭利な
刃物等で切断し、中空糸の開口面を露出させる方法が好
ましく利用される。
て具体的に説明する。まず、使用するスペーサーを、ス
ペーサー上に配置された小孔が合致するように重ね合わ
せ、合致した小孔に中空糸を通していく。中空糸を通し
終わった後にスペーサーを任意の間隔に広げ、容器１内
の任意の場所に固定する。その後、中空糸は封止部４に
おいて固定される。このような封止部の形成方法として
は、遠心力をもってポッティング剤を封止部に該当する
空間に注入し、ポッティング剤硬化後、硬化部を鋭利な
刃物等で切断し、中空糸の開口面を露出させる方法が好
ましく利用される。
【００１８】図１において、容器１内に適宜の本数の中
空糸２から構成される血管網類似構造体が設置される。
血管網類似構造体を構成する各中空糸はスペーサー３の
小孔９を通り、封止部４で固定される。すなわち、各中
空糸２は図２に示すように２枚以上設置されたスペーサ
ー３の小孔９の間隔をもって空間部５内に均一に配置さ
れた状態となる。
空糸２から構成される血管網類似構造体が設置される。
血管網類似構造体を構成する各中空糸はスペーサー３の
小孔９を通り、封止部４で固定される。すなわち、各中
空糸２は図２に示すように２枚以上設置されたスペーサ
ー３の小孔９の間隔をもって空間部５内に均一に配置さ
れた状態となる。
【００１９】この様な構成のモジュールにおいて中空糸
外腔に細胞を配置する場合、細胞１０は容器１に１カ所
以上設置された細胞導入口６から遠心力によって空間部
５内に配管された各中空糸の周囲に高密度に充填され
る。さらに、培養液は培養液流入口７から血管網類似構
造体を構成する各中空糸に分散し、図３に示すように空
間部５に充填された細胞１０に酸素・栄養分を供給し、
細胞の生産物・代謝老廃物を回収した後に培養液流出口
８から装置外に排出される。
外腔に細胞を配置する場合、細胞１０は容器１に１カ所
以上設置された細胞導入口６から遠心力によって空間部
５内に配管された各中空糸の周囲に高密度に充填され
る。さらに、培養液は培養液流入口７から血管網類似構
造体を構成する各中空糸に分散し、図３に示すように空
間部５に充填された細胞１０に酸素・栄養分を供給し、
細胞の生産物・代謝老廃物を回収した後に培養液流出口
８から装置外に排出される。
【００２０】さらに、規則的に配管した中空糸に培養液
供給用、排出用の独立した機能を持たせることも可能で
ある。すなわち培養液供給用の役割を持った中空糸は封
止部４の一端においてその端を封じられており、ここを
通ってモジュール内に流入した培養培地は強制的に空間
部５に流入する。そこで、細胞１０と直接接触し、種々
の物質交換を行った後に培養液排出用の中空糸を通って
モジュール外に排出される。同様に酸素供給用の独立の
パイプラインとして中空糸を配管することも可能であ
る。
供給用、排出用の独立した機能を持たせることも可能で
ある。すなわち培養液供給用の役割を持った中空糸は封
止部４の一端においてその端を封じられており、ここを
通ってモジュール内に流入した培養培地は強制的に空間
部５に流入する。そこで、細胞１０と直接接触し、種々
の物質交換を行った後に培養液排出用の中空糸を通って
モジュール外に排出される。同様に酸素供給用の独立の
パイプラインとして中空糸を配管することも可能であ
る。
【００２１】このような構成によって、モジュール内に
は細胞に対し、酸素・栄養分の供給、生産物・代謝老廃
物の回収を行う中空糸が微小間隔で配管され，生体内の
微小血管網がモジュール内において再現されることにな
る。さらに、その中空糸の周囲に細胞を遠心力によって
高密度に充填し、培養することにより細胞が高機能を有
する組織体を形成することが可能である。遠心力を用い
て充填される細胞の細胞密度は、細胞種、用いる遠心力
によって変化するが、１×１０7〜１×１０9 cells/ml
程度が望ましい。細胞がこのような高密度状態に置かれ
た場合、或いは組織体を形成した場合、供給される物質
として最も律速因子になりうると考えられるのは酸素で
あり、中空糸束２の各中空糸の間隔は空間部５に充填さ
れた細胞の酸素消費量を考慮して決定することが可能で
ある。これは、スペーサー３に設けられた小孔９の間隔
を制御すればよい。具体的には、中空糸の間隔として
は、好ましくは２０〜１０００μｍ、より好ましくは５
０〜５００μｍ、さらに好ましくは５０〜１５０μｍで
あるが、この間隔は上述のように細胞の酸素消費量を考
慮して決定される値であり、この範囲に限定されるもの
ではない。
は細胞に対し、酸素・栄養分の供給、生産物・代謝老廃
物の回収を行う中空糸が微小間隔で配管され，生体内の
微小血管網がモジュール内において再現されることにな
る。さらに、その中空糸の周囲に細胞を遠心力によって
高密度に充填し、培養することにより細胞が高機能を有
する組織体を形成することが可能である。遠心力を用い
て充填される細胞の細胞密度は、細胞種、用いる遠心力
によって変化するが、１×１０7〜１×１０9 cells/ml
程度が望ましい。細胞がこのような高密度状態に置かれ
た場合、或いは組織体を形成した場合、供給される物質
として最も律速因子になりうると考えられるのは酸素で
あり、中空糸束２の各中空糸の間隔は空間部５に充填さ
れた細胞の酸素消費量を考慮して決定することが可能で
ある。これは、スペーサー３に設けられた小孔９の間隔
を制御すればよい。具体的には、中空糸の間隔として
は、好ましくは２０〜１０００μｍ、より好ましくは５
０〜５００μｍ、さらに好ましくは５０〜１５０μｍで
あるが、この間隔は上述のように細胞の酸素消費量を考
慮して決定される値であり、この範囲に限定されるもの
ではない。
【００２２】スペーサー３に設けられた小孔９の直径は
使用する中空糸の径に合わせて適宜設定すればよく、用
いる中空糸外径より２０〜１００μｍ程度大きな径が望
ましいがこれに限定されるものではない。また、スペー
サー３は通常中空糸束２の両封止部４に隣接して設置さ
れるが、必要に応じて空間部５内に追加することも可能
である。例えば、中空糸の長さが長くなった場合、空間
部５にスペーサー３を数枚追加することで中空糸はより
規則的に配管される。
使用する中空糸の径に合わせて適宜設定すればよく、用
いる中空糸外径より２０〜１００μｍ程度大きな径が望
ましいがこれに限定されるものではない。また、スペー
サー３は通常中空糸束２の両封止部４に隣接して設置さ
れるが、必要に応じて空間部５内に追加することも可能
である。例えば、中空糸の長さが長くなった場合、空間
部５にスペーサー３を数枚追加することで中空糸はより
規則的に配管される。
【００２３】一方、中空糸内径よりも小径のシャフトを
中空糸内に通すことで中空糸の長さが長くなっても２枚
のスペーサーで中空糸をたわませることなく規則的に配
管することが可能である。シャフトを用いる場合、シャ
フトの材質は生体適合性に優れたものであれば特に限定
されず、中空糸内面を傷つけないよう滑らかな外面をも
ち比較的強度のあるものが望ましい。スペーサー３に設
けられた小孔９の配列方式、すなわち中空糸の配管方式
は、空間部５に充填された細胞を効率良く培養するため
に三角配置が望ましいが、条件に応じて四角配置やその
他の配置方法も可能である。
中空糸内に通すことで中空糸の長さが長くなっても２枚
のスペーサーで中空糸をたわませることなく規則的に配
管することが可能である。シャフトを用いる場合、シャ
フトの材質は生体適合性に優れたものであれば特に限定
されず、中空糸内面を傷つけないよう滑らかな外面をも
ち比較的強度のあるものが望ましい。スペーサー３に設
けられた小孔９の配列方式、すなわち中空糸の配管方式
は、空間部５に充填された細胞を効率良く培養するため
に三角配置が望ましいが、条件に応じて四角配置やその
他の配置方法も可能である。
【００２４】細胞との間で各種の物質交換を行う中空糸
の内径は特に限定されないが、好ましくは２０〜１００
０μｍ、より好ましくは５０〜５００μｍ、さらに好ま
しくは５０〜１５０μｍ程度が望ましい。該中空糸の膜
厚は１０〜２００μｍ程度が好ましい。また中空糸の材
質は、細胞、体液に対して有害な作用を行うものでなけ
れば特に限定されるものではないが、例えば、セルロー
ス系素材、ポリスルホン、ポリプロピレン等を挙げるこ
とができる。また、多孔性中空糸膜の平均孔径は物質交
換性を考慮すると大きな方が望ましく、０．１〜５μｍ
程度が望ましい。しかしながら、孔径はこの範囲に限定
されるものではなく、使用目的に合わせて適宜設定する
ことが可能である。例えば、モジュール内に血漿を導入
する場合、異種免疫反応を抑制するために分画分子量の
小さい膜、すなわち孔径０．１μｍ未満の小さな膜を選
択することも可能である。
の内径は特に限定されないが、好ましくは２０〜１００
０μｍ、より好ましくは５０〜５００μｍ、さらに好ま
しくは５０〜１５０μｍ程度が望ましい。該中空糸の膜
厚は１０〜２００μｍ程度が好ましい。また中空糸の材
質は、細胞、体液に対して有害な作用を行うものでなけ
れば特に限定されるものではないが、例えば、セルロー
ス系素材、ポリスルホン、ポリプロピレン等を挙げるこ
とができる。また、多孔性中空糸膜の平均孔径は物質交
換性を考慮すると大きな方が望ましく、０．１〜５μｍ
程度が望ましい。しかしながら、孔径はこの範囲に限定
されるものではなく、使用目的に合わせて適宜設定する
ことが可能である。例えば、モジュール内に血漿を導入
する場合、異種免疫反応を抑制するために分画分子量の
小さい膜、すなわち孔径０．１μｍ未満の小さな膜を選
択することも可能である。
【００２５】以上が中空糸外腔部に細胞を配置する場合
のモジュールの構成であるが、中空糸内腔に細胞を遠心
力で充填することも可能である。その場合、細胞を遠心
力によって中空糸内腔に充填した後、中空糸の両端を閉
じる。培養培地は中空糸外腔部を流れ、中空糸膜を介し
て細胞との間で物質交換を行う。培地流動用に容器１に
は培養培地流動用のポートを２箇所以上設置する。
のモジュールの構成であるが、中空糸内腔に細胞を遠心
力で充填することも可能である。その場合、細胞を遠心
力によって中空糸内腔に充填した後、中空糸の両端を閉
じる。培養培地は中空糸外腔部を流れ、中空糸膜を介し
て細胞との間で物質交換を行う。培地流動用に容器１に
は培養培地流動用のポートを２箇所以上設置する。
【００２６】モジュールを構成する素材は生体適合性に
優れたものを選択すれば特に限定されるものではなく、
従来より人工透析器、血漿分離器等で用いられてきたも
のが応用可能である。また、中空糸を固定し、循環する
液体と培養装置内の細胞を分離する封止部４に用いられ
る接着剤に関しても、同様に従来用いられてきたものが
応用可能であり、例えば、ポリウレタン、シリコーン及
びエポキシ樹脂等が挙げられる。
優れたものを選択すれば特に限定されるものではなく、
従来より人工透析器、血漿分離器等で用いられてきたも
のが応用可能である。また、中空糸を固定し、循環する
液体と培養装置内の細胞を分離する封止部４に用いられ
る接着剤に関しても、同様に従来用いられてきたものが
応用可能であり、例えば、ポリウレタン、シリコーン及
びエポキシ樹脂等が挙げられる。
【００２７】本発明において培養される細胞について
は、その種類に関して何ら限定されるものではなく、ま
たその由来についても同様であり、ヒト、マウス、ラッ
トその他の動物由来のものに用いることができる。特
に、肝細胞を上記のような遠心充填によって、血管網類
似構造体を有するモジュールに充填することにより、従
来の人工肝臓と比較して、コンパクトで長期間機能を維
持することが可能な人工肝臓モジュールを作製すること
が可能である。
は、その種類に関して何ら限定されるものではなく、ま
たその由来についても同様であり、ヒト、マウス、ラッ
トその他の動物由来のものに用いることができる。特
に、肝細胞を上記のような遠心充填によって、血管網類
似構造体を有するモジュールに充填することにより、従
来の人工肝臓と比較して、コンパクトで長期間機能を維
持することが可能な人工肝臓モジュールを作製すること
が可能である。
【００２８】本発明においては、細胞を遠心力によって
充填するために、充填時にかかる剪断応力が小さく、良
好な生存状態の細胞が三次元的に積層される。さらに、
規則的に配管された中空糸（中空糸内腔に細胞を充填す
る場合は中空糸外腔部）が生体内における毛細血管の役
割を果たし、細胞との間で良好な物質交換を行う。中空
糸は空間内の全ての細胞との物質交換が可能となるよう
に配管可能であり、そのため、生体組織内に匹敵する細
胞密度（１×１０8〜１×１０9cells/cm3）条件下にお
いて細胞を生体内を模倣した微小空間内に置くことが可
能である。このため、遠心力を用いて細胞を高密度に充
填した細胞が壊死することなく培養早期において組織体
を形成することが可能であり、種々の動物細胞の培養に
おいて細胞が本来の機能を損なわず長期間生存可能な中
空糸型培養モジュールとして様々な用途に利用可能であ
る。具体的な応用分野としては、人工肝臓、人工膵臓な
どの培養細胞を利用するハイブリッド型人工臓器、薬物
代謝などを解析するための培養細胞を利用する臓器シミ
ュレーター、あるいは培養細胞を利用する有用物質生産
用のバイオリアクターなどが挙げられる。
充填するために、充填時にかかる剪断応力が小さく、良
好な生存状態の細胞が三次元的に積層される。さらに、
規則的に配管された中空糸（中空糸内腔に細胞を充填す
る場合は中空糸外腔部）が生体内における毛細血管の役
割を果たし、細胞との間で良好な物質交換を行う。中空
糸は空間内の全ての細胞との物質交換が可能となるよう
に配管可能であり、そのため、生体組織内に匹敵する細
胞密度（１×１０8〜１×１０9cells/cm3）条件下にお
いて細胞を生体内を模倣した微小空間内に置くことが可
能である。このため、遠心力を用いて細胞を高密度に充
填した細胞が壊死することなく培養早期において組織体
を形成することが可能であり、種々の動物細胞の培養に
おいて細胞が本来の機能を損なわず長期間生存可能な中
空糸型培養モジュールとして様々な用途に利用可能であ
る。具体的な応用分野としては、人工肝臓、人工膵臓な
どの培養細胞を利用するハイブリッド型人工臓器、薬物
代謝などを解析するための培養細胞を利用する臓器シミ
ュレーター、あるいは培養細胞を利用する有用物質生産
用のバイオリアクターなどが挙げられる。
【００２９】本発明はまた、本発明の細胞培養用モジュ
ール及び細胞組織体形成法を利用した人工肝臓の培養に
おいて、ＤＭＥＭもしくはＤＭＥＭと他の培地との混合
培地を基礎培地として使用することにより、初代肝細胞
の代表的な機能を長期間維持することができる肝細胞培
養方法を提供する。ここで「初代肝細胞の代表的な機
能」とは、アルブミン分泌能に加えて、少なくともアン
モニア代謝能を含む解毒機能を含むことを意味する。
ール及び細胞組織体形成法を利用した人工肝臓の培養に
おいて、ＤＭＥＭもしくはＤＭＥＭと他の培地との混合
培地を基礎培地として使用することにより、初代肝細胞
の代表的な機能を長期間維持することができる肝細胞培
養方法を提供する。ここで「初代肝細胞の代表的な機
能」とは、アルブミン分泌能に加えて、少なくともアン
モニア代謝能を含む解毒機能を含むことを意味する。
【００３０】本発明においてＤＭＥＭと混合される「他
の培地」とは、従来より自体基礎培地として動物細胞の
培養に使用されている培地であって、ＤＭＥＭの上記初
代肝細胞機能の長期維持効果を阻害しないか、もしくは
増大させ得るものであれば特に制限はないが、例えば、
ハムのＦ−１０培地、Ｆ−１２培地、ウィリアムズＥ培
地、ＭＣＤＢ１５３培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、１
９９培地、Ｌ−１５培地等が挙げられる。好ましくは、
ハムのＦ−１２培地、ウィリアムズＥ培地、ＭＣＤＢ１
５３培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等である。ＤＭＥＭと
他の培地との混合比も上記ＤＭＥＭの効果を阻害しない
か、もしくは増大させ得る範囲で適宜選択することがで
きるが、約６０〜約９０％のＤＭＥＭと約１０〜約４０
％の他の培地からなる混合培地が、本発明の基礎培地と
して好ましく例示される。
の培地」とは、従来より自体基礎培地として動物細胞の
培養に使用されている培地であって、ＤＭＥＭの上記初
代肝細胞機能の長期維持効果を阻害しないか、もしくは
増大させ得るものであれば特に制限はないが、例えば、
ハムのＦ−１０培地、Ｆ−１２培地、ウィリアムズＥ培
地、ＭＣＤＢ１５３培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、１
９９培地、Ｌ−１５培地等が挙げられる。好ましくは、
ハムのＦ−１２培地、ウィリアムズＥ培地、ＭＣＤＢ１
５３培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等である。ＤＭＥＭと
他の培地との混合比も上記ＤＭＥＭの効果を阻害しない
か、もしくは増大させ得る範囲で適宜選択することがで
きるが、約６０〜約９０％のＤＭＥＭと約１０〜約４０
％の他の培地からなる混合培地が、本発明の基礎培地と
して好ましく例示される。
【００３１】上記の肝細胞培養方法において使用される
培地は、ＤＭＥＭもしくは上記ＤＭＥＭ含有混合培地の
他にいかなる追加成分を含んでもよいが、好ましくは、
追加成分としてプロリン、ＥＧＦ、インスリン、ヒドロ
コルチゾン、亜セレン酸、リノール酸、硫酸銅および硫
酸亜鉛をさらに含むものが挙げられる。したがって、本
発明はまた、ＤＭＥＭを基礎培地とし、追加成分として
プロリン、ＥＧＦ、インスリン、ヒドロコルチゾン、亜
セレン酸、リノール酸、硫酸銅および硫酸亜鉛をさらに
含むことを特徴とする培地を提供する。当該培地は、本
発明の細胞培養用モジュール及び細胞組織体形成法を組
み合わせた肝細胞培養法において最適に使用し得ること
は云うまでもないが、従来の肝細胞培養法をはじめとし
て、一般に動物細胞または組織の培養において使用する
ことができる。
培地は、ＤＭＥＭもしくは上記ＤＭＥＭ含有混合培地の
他にいかなる追加成分を含んでもよいが、好ましくは、
追加成分としてプロリン、ＥＧＦ、インスリン、ヒドロ
コルチゾン、亜セレン酸、リノール酸、硫酸銅および硫
酸亜鉛をさらに含むものが挙げられる。したがって、本
発明はまた、ＤＭＥＭを基礎培地とし、追加成分として
プロリン、ＥＧＦ、インスリン、ヒドロコルチゾン、亜
セレン酸、リノール酸、硫酸銅および硫酸亜鉛をさらに
含むことを特徴とする培地を提供する。当該培地は、本
発明の細胞培養用モジュール及び細胞組織体形成法を組
み合わせた肝細胞培養法において最適に使用し得ること
は云うまでもないが、従来の肝細胞培養法をはじめとし
て、一般に動物細胞または組織の培養において使用する
ことができる。
【００３２】本発明の培養培地において、プロリン、Ｅ
ＧＦ、インスリン、ヒドロコルチゾン、亜セレン酸、リ
ノール酸、硫酸銅および硫酸亜鉛の濃度は、本発明の肝
細胞培養法におけるＤＭＥＭの効果を妨げない限り特に
制限はないが、好ましくは本発明の肝細胞培養法におけ
るＤＭＥＭの効果を有意に向上させ得る濃度である。こ
こで「ＤＭＥＭの効果」とは、アルブミン分泌能に加え
て、少なくともアンモニア代謝能を含む肝細胞の解毒機
能を長期間維持させる作用を意味する。例えば、各追加
成分の好ましい濃度として、プロリンは０．１〜１００
０ｍｇ／Ｌ、ＥＧＦは１〜１×１０6ｎｇ／Ｌ、インス
リンは１〜１×１０9ｎｇ／Ｌ、ヒドロコルチゾンは１
〜１×１０5μｇ／Ｌ、亜セレン酸は０．１〜１×１０5
ｎＭ、リノール酸は０．１〜１×１０6μｇ／Ｌ、硫酸
銅は１〜１×１０6ｎＭ、硫酸亜鉛は０．１〜１×１０9
ｐＭが挙げられる。
ＧＦ、インスリン、ヒドロコルチゾン、亜セレン酸、リ
ノール酸、硫酸銅および硫酸亜鉛の濃度は、本発明の肝
細胞培養法におけるＤＭＥＭの効果を妨げない限り特に
制限はないが、好ましくは本発明の肝細胞培養法におけ
るＤＭＥＭの効果を有意に向上させ得る濃度である。こ
こで「ＤＭＥＭの効果」とは、アルブミン分泌能に加え
て、少なくともアンモニア代謝能を含む肝細胞の解毒機
能を長期間維持させる作用を意味する。例えば、各追加
成分の好ましい濃度として、プロリンは０．１〜１００
０ｍｇ／Ｌ、ＥＧＦは１〜１×１０6ｎｇ／Ｌ、インス
リンは１〜１×１０9ｎｇ／Ｌ、ヒドロコルチゾンは１
〜１×１０5μｇ／Ｌ、亜セレン酸は０．１〜１×１０5
ｎＭ、リノール酸は０．１〜１×１０6μｇ／Ｌ、硫酸
銅は１〜１×１０6ｎＭ、硫酸亜鉛は０．１〜１×１０9
ｐＭが挙げられる。
【００３３】本発明の培養培地は、本発明の肝細胞培養
法におけるＤＭＥＭの効果を妨げない限り、上記追加成
分に加えてさらに他の培地成分を含んでいてもよい。そ
のような他の培地成分は、従来公知の添加因子から適宜
選択することができる。
法におけるＤＭＥＭの効果を妨げない限り、上記追加成
分に加えてさらに他の培地成分を含んでいてもよい。そ
のような他の培地成分は、従来公知の添加因子から適宜
選択することができる。
【００３４】
【実施例】以下、実施例を用いて、本発明をより具体的
に説明する。なお、本発明は実施例により特に制限され
るものではない。
に説明する。なお、本発明は実施例により特に制限され
るものではない。
【００３５】＜実施例１＞セルローストリアセテート製
の血漿分離用中空糸（東洋紡績製ＡＰ２５０Ｎ１５タイ
プ；内径２８５μｍ，外径３８７μｍ）内腔にコラゲナ
ーゼ消化法により調製した初代ラット肝細胞５×１０5
個を６０×Ｇ、９０秒の遠心によって充填した。このと
き、中空糸内腔での肝細胞の密度は４．５×１０7cells
/cm3であった。肝細胞を封入した長さ３cmの中空糸５本
を直径３５mmの培養ディッシュ（岩城硝子製）に収め、
William's E medium（ＷＥＭ；シグマ製）１０．８ｇ／
Ｌに、５０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（フナコシ製）、１０ｍ
ｇ／Ｌ インシュリン（シグマ製）、０．１μＭ 硫酸
銅・５水和物（和光純薬工業製）、３μｇ／Ｌ 亜セレ
ン酸（和光純薬工業製）、５０ｐＭ 硫酸亜鉛・７水和
物（和光純薬工業製）、５０μｇ／Ｌ リノール酸（シ
グマ製）、５８．８ｍｇ／Ｌ ペニシリン（明治製菓
製）、１００ｍｇ／Ｌ ストレプトマイシン（明治製菓
製）、１．０５ｇ／Ｌ 炭酸水素ナトリウム（和光純薬
工業製）、１．１９ｇ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（同仁化学製）
を添加した無血清培地（Hormonally defined medium；
ＨＤＭ）を２ml添加して、５％炭酸ガス，９５％大気の
雰囲気下、震盪器上で４５rpmで旋回培養を行った。細
胞の機能評価として培養培地に１ｍＭの濃度でアンモニ
アを負荷し、経時的な濃度変化を定量することでその代
謝活性を測定した。また、培地中に分泌されるアルブミ
ン濃度を定量することでアルブミン分泌活性を測定し
た。
の血漿分離用中空糸（東洋紡績製ＡＰ２５０Ｎ１５タイ
プ；内径２８５μｍ，外径３８７μｍ）内腔にコラゲナ
ーゼ消化法により調製した初代ラット肝細胞５×１０5
個を６０×Ｇ、９０秒の遠心によって充填した。このと
き、中空糸内腔での肝細胞の密度は４．５×１０7cells
/cm3であった。肝細胞を封入した長さ３cmの中空糸５本
を直径３５mmの培養ディッシュ（岩城硝子製）に収め、
William's E medium（ＷＥＭ；シグマ製）１０．８ｇ／
Ｌに、５０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（フナコシ製）、１０ｍ
ｇ／Ｌ インシュリン（シグマ製）、０．１μＭ 硫酸
銅・５水和物（和光純薬工業製）、３μｇ／Ｌ 亜セレ
ン酸（和光純薬工業製）、５０ｐＭ 硫酸亜鉛・７水和
物（和光純薬工業製）、５０μｇ／Ｌ リノール酸（シ
グマ製）、５８．８ｍｇ／Ｌ ペニシリン（明治製菓
製）、１００ｍｇ／Ｌ ストレプトマイシン（明治製菓
製）、１．０５ｇ／Ｌ 炭酸水素ナトリウム（和光純薬
工業製）、１．１９ｇ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（同仁化学製）
を添加した無血清培地（Hormonally defined medium；
ＨＤＭ）を２ml添加して、５％炭酸ガス，９５％大気の
雰囲気下、震盪器上で４５rpmで旋回培養を行った。細
胞の機能評価として培養培地に１ｍＭの濃度でアンモニ
アを負荷し、経時的な濃度変化を定量することでその代
謝活性を測定した。また、培地中に分泌されるアルブミ
ン濃度を定量することでアルブミン分泌活性を測定し
た。
【００３６】対照として、３．０×１０6個の肝細胞を
２５ｍｍ×２５ｍｍ×１ｍｍのポリウレタンフォーム
（ＰＵＦ）シートに播種し、直径３５ｍｍの培養ディッ
シュで培養したスフェロイド培養、および２．５×１０
5個の肝細胞を直径３５ｍｍのコラーゲンコートディッ
シュ（岩城硝子製）に播種し、培養した単層培養を行
い、その機能の比較を行った。図４に細胞数当たりのア
ンモニア代謝速度の経時変化を示す。
２５ｍｍ×２５ｍｍ×１ｍｍのポリウレタンフォーム
（ＰＵＦ）シートに播種し、直径３５ｍｍの培養ディッ
シュで培養したスフェロイド培養、および２．５×１０
5個の肝細胞を直径３５ｍｍのコラーゲンコートディッ
シュ（岩城硝子製）に播種し、培養した単層培養を行
い、その機能の比較を行った。図４に細胞数当たりのア
ンモニア代謝速度の経時変化を示す。
【００３７】これらの結果から、遠心力を用いて充填す
ることで組織体を形成した肝細胞は従来の培養法に比
べ、高いアンモニア代謝活性を培養後２週間維持するこ
とが示された。また、図５に細胞数当たりのアルブミン
分泌速度の経時変化を示す。この結果、遠心によって誘
導された肝細胞組織体は、従来の培養法に比べより長期
に渡りアルブミン分泌活性を維持することが示され、遠
心によって誘導された肝細胞組織体が高い肝機能を長期
間維持することが示された。
ることで組織体を形成した肝細胞は従来の培養法に比
べ、高いアンモニア代謝活性を培養後２週間維持するこ
とが示された。また、図５に細胞数当たりのアルブミン
分泌速度の経時変化を示す。この結果、遠心によって誘
導された肝細胞組織体は、従来の培養法に比べより長期
に渡りアルブミン分泌活性を維持することが示され、遠
心によって誘導された肝細胞組織体が高い肝機能を長期
間維持することが示された。
【００３８】＜実施例２＞内径９mm、長さ２７mmのモジ
ュール内に直径５００μｍの小孔をピッチ６００μｍの
三角配置で配置したスペーサー２枚を用い、実施例１で
用いた中空糸１８７本を規則的に配管したモジュールを
作製した。このモジュールの中空糸外腔部に初代ラット
肝細胞を６０×Ｇ、３分の遠心によって充填し、中空糸
内腔に培養培地ＨＤＭを３０ml/minの流量で灌流し培養
を行った。このときモジュール単位体積当たりの細胞密
度は３×１０7cells/cm3であった。
ュール内に直径５００μｍの小孔をピッチ６００μｍの
三角配置で配置したスペーサー２枚を用い、実施例１で
用いた中空糸１８７本を規則的に配管したモジュールを
作製した。このモジュールの中空糸外腔部に初代ラット
肝細胞を６０×Ｇ、３分の遠心によって充填し、中空糸
内腔に培養培地ＨＤＭを３０ml/minの流量で灌流し培養
を行った。このときモジュール単位体積当たりの細胞密
度は３×１０7cells/cm3であった。
【００３９】モジュールの機能評価として、培養培地に
１ｍＭの濃度でアンモニアを負荷し、アンモニア濃度変
化の定量、尿素合成量の定量を行うことにより、アンモ
ニア代謝活性，尿素合成活性の評価を行った。図６にモ
ジュール単位体積当たりのアンモニア代謝速度の経時変
化を示す。対照として多孔質担体にスフェロイドが充填
されたモジュールの活性を示す。本発明のモジュールは
同じ肝細胞組織体を組み込んだモジュールであるスフェ
ロイド型モジュールと比較して高密度培養が達成されて
いることから、モジュール当たりのアンモニア代謝能は
スフェロイド型モジュールの最大４倍程度の高い活性を
示した。
１ｍＭの濃度でアンモニアを負荷し、アンモニア濃度変
化の定量、尿素合成量の定量を行うことにより、アンモ
ニア代謝活性，尿素合成活性の評価を行った。図６にモ
ジュール単位体積当たりのアンモニア代謝速度の経時変
化を示す。対照として多孔質担体にスフェロイドが充填
されたモジュールの活性を示す。本発明のモジュールは
同じ肝細胞組織体を組み込んだモジュールであるスフェ
ロイド型モジュールと比較して高密度培養が達成されて
いることから、モジュール当たりのアンモニア代謝能は
スフェロイド型モジュールの最大４倍程度の高い活性を
示した。
【００４０】＜実施例３＞培養培地として、Dulbecco's
modified eagle medium（ＤＭＥＭ；ギブコ製）１３．
５ｇ／Ｌに、６０ｍｇ／Ｌ プロリン、５０ｎｇ／ｍｌ
ＥＧＦ（フナコシ製）、１０ｍｇ／Ｌ インシュリン
（シグマ製）、７．５mg／Ｌ ヒドロコルチゾン（和光
純薬工業製）、０．１μＭ 硫酸銅・５水和物（和光純
薬工業製）、３μｇ／Ｌ 亜セレン酸（和光純薬工業
製）、５０ｐＭ 硫酸亜鉛・７水和物（和光純薬工業
製）、５０μｇ／Ｌ リノール酸（シグマ製）、５８．
８ｍｇ／Ｌ ペニシリン（明治製菓製）、１００ｍｇ／
Ｌ ストレプトマイシン（明治製菓製）、１．０５ｇ／
Ｌ 炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業製）、１．１９
ｇ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（同仁化学製）を添加した無血清培
地（培地Ａ）を用いる以外は、実施例１と同様にしてラ
ット肝細胞を培養し、アンモニア代謝能、尿素合成能、
アルブミン分泌能を経時的に測定した。具体的には、培
養培地に１ｍＭの濃度でアンモニアを負荷して２４時間
反応させ、反応時間中に代謝されるアンモニア量、合成
される尿素量を定量してそれぞれの活性を測定した。同
様に、培地中に分泌されるアルブミン量を定量すること
によりアルブミン分泌活性を測定した。実施例１と同じ
ＷＥＭを基礎培地とするＨＤＭ（培地Ｂ）を用いて培養
した肝細胞についても同様に活性測定を行い、両者にお
ける肝細胞機能の長期持続性を比較した。
modified eagle medium（ＤＭＥＭ；ギブコ製）１３．
５ｇ／Ｌに、６０ｍｇ／Ｌ プロリン、５０ｎｇ／ｍｌ
ＥＧＦ（フナコシ製）、１０ｍｇ／Ｌ インシュリン
（シグマ製）、７．５mg／Ｌ ヒドロコルチゾン（和光
純薬工業製）、０．１μＭ 硫酸銅・５水和物（和光純
薬工業製）、３μｇ／Ｌ 亜セレン酸（和光純薬工業
製）、５０ｐＭ 硫酸亜鉛・７水和物（和光純薬工業
製）、５０μｇ／Ｌ リノール酸（シグマ製）、５８．
８ｍｇ／Ｌ ペニシリン（明治製菓製）、１００ｍｇ／
Ｌ ストレプトマイシン（明治製菓製）、１．０５ｇ／
Ｌ 炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業製）、１．１９
ｇ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（同仁化学製）を添加した無血清培
地（培地Ａ）を用いる以外は、実施例１と同様にしてラ
ット肝細胞を培養し、アンモニア代謝能、尿素合成能、
アルブミン分泌能を経時的に測定した。具体的には、培
養培地に１ｍＭの濃度でアンモニアを負荷して２４時間
反応させ、反応時間中に代謝されるアンモニア量、合成
される尿素量を定量してそれぞれの活性を測定した。同
様に、培地中に分泌されるアルブミン量を定量すること
によりアルブミン分泌活性を測定した。実施例１と同じ
ＷＥＭを基礎培地とするＨＤＭ（培地Ｂ）を用いて培養
した肝細胞についても同様に活性測定を行い、両者にお
ける肝細胞機能の長期持続性を比較した。
【００４１】細胞あたりのアンモニア代謝速度、尿素合
成速度及びアルブミン分泌速度の経時変化をそれぞれ図
７、８及び９に示す。培地Ｂを用いた場合、肝細胞のア
ンモニア代謝能、尿素合成能及びアルブミン分泌能は培
養の経過に伴って急激に低下し、培養４〜５週目にはい
ずれも消失したのに対し、培地Ａを用いた場合、肝細胞
はいずれの機能においても、初期活性からの低下は見ら
れるものの、培養２３週目においてもなお良好な活性を
維持していることが示された。以上のように、遠心充填
によって形成させた肝細胞組織体を、ＤＭＥＭにプロリ
ン、ＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、亜セレン酸、リノール
酸、硫酸銅及び硫酸亜鉛を添加した培養培地で培養する
ことにより、少なくとも５ヶ月以上の長期にわたって高
い肝機能が維持されることが分かった。
成速度及びアルブミン分泌速度の経時変化をそれぞれ図
７、８及び９に示す。培地Ｂを用いた場合、肝細胞のア
ンモニア代謝能、尿素合成能及びアルブミン分泌能は培
養の経過に伴って急激に低下し、培養４〜５週目にはい
ずれも消失したのに対し、培地Ａを用いた場合、肝細胞
はいずれの機能においても、初期活性からの低下は見ら
れるものの、培養２３週目においてもなお良好な活性を
維持していることが示された。以上のように、遠心充填
によって形成させた肝細胞組織体を、ＤＭＥＭにプロリ
ン、ＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、亜セレン酸、リノール
酸、硫酸銅及び硫酸亜鉛を添加した培養培地で培養する
ことにより、少なくとも５ヶ月以上の長期にわたって高
い肝機能が維持されることが分かった。
【００４２】
【発明の効果】上述したように、本発明のように、遠心
力を利用することにより培養担体に細胞を充填された培
養細胞の組織体誘導技術は、従来の培養法に比べて、高
い機能を長期間維持することが可能な組織体の形成が可
能である。また、本発明のように、中空糸を規則的に配
管した血管網類似構造体を有するモジュールの利用と組
み合わせることによって、従来の細胞培養用モジュール
と比べて飛躍的な高密度培養が可能である。さらに、本
発明のモジュールに本発明の組織体誘導技術を用いて調
製した人工肝臓モジュールにおいて、ＤＭＥＭを基礎培
地とする培養培地を用いてモジュール内の肝細胞を培養
することにより、蛋白質合成能だけでなくアンモニア代
謝能をはじめとする解毒機能をも長期間維持する人工肝
臓を提供することが可能となる。したがって、本発明は
これまで困難であった有用物質生産やハイブリッド型人
工臓器として利用可能な高性能、コンパクトな細胞培養
用モジュールの開発を可能とするものである。
力を利用することにより培養担体に細胞を充填された培
養細胞の組織体誘導技術は、従来の培養法に比べて、高
い機能を長期間維持することが可能な組織体の形成が可
能である。また、本発明のように、中空糸を規則的に配
管した血管網類似構造体を有するモジュールの利用と組
み合わせることによって、従来の細胞培養用モジュール
と比べて飛躍的な高密度培養が可能である。さらに、本
発明のモジュールに本発明の組織体誘導技術を用いて調
製した人工肝臓モジュールにおいて、ＤＭＥＭを基礎培
地とする培養培地を用いてモジュール内の肝細胞を培養
することにより、蛋白質合成能だけでなくアンモニア代
謝能をはじめとする解毒機能をも長期間維持する人工肝
臓を提供することが可能となる。したがって、本発明は
これまで困難であった有用物質生産やハイブリッド型人
工臓器として利用可能な高性能、コンパクトな細胞培養
用モジュールの開発を可能とするものである。
【図１】本発明の中空糸型モジュールの一例を示す図で
ある。
ある。
【図２】図１におけるスペーサー近傍の拡大図（ａ）及
び当該モジュールの半径方向に沿って破断した模式的な
断面図（ｂ）である。
び当該モジュールの半径方向に沿って破断した模式的な
断面図（ｂ）である。
【図３】図１において細胞を中空糸外腔部に充填した場
合の概略図である。
合の概略図である。
【図４】本発明の遠心誘導型肝細胞組織体における単位
細胞数当たりのアンモニア代謝活性を示した図である。
細胞数当たりのアンモニア代謝活性を示した図である。
【図５】本発明の遠心誘導型肝細胞組織体における単位
細胞数当たりのアルブミン分泌活性を示した図である。
細胞数当たりのアルブミン分泌活性を示した図である。
【図６】本発明の組織体を組み込んだ中空糸型モジュー
ルのモジュール単位体積当たりのアンモニア代謝活性を
示した図である。
ルのモジュール単位体積当たりのアンモニア代謝活性を
示した図である。
【図７】本発明の遠心誘導型肝細胞組織体における単位
細胞数当たりのアンモニア代謝活性の持続性に及ぼす培
地組成の効果を示した図である。
細胞数当たりのアンモニア代謝活性の持続性に及ぼす培
地組成の効果を示した図である。
【図８】本発明の遠心誘導型肝細胞組織体における単位
細胞数当たりの尿素合成活性の持続性に及ぼす培地組成
の効果を示した図である。
細胞数当たりの尿素合成活性の持続性に及ぼす培地組成
の効果を示した図である。
【図９】本発明の遠心誘導型肝細胞組織体における単位
細胞数当たりのアルブミン分泌活性の持続性に及ぼす培
地組成の効果を示した図である。
細胞数当たりのアルブミン分泌活性の持続性に及ぼす培
地組成の効果を示した図である。
１ 容器 ２ 中空糸 ３ スペーサー ４ 封止部 ５ 空間部 ６ 細胞導入口 ７ 培地流入口 ８ 培地流出口 ９ スペーサーに設けられた小孔 １０ 細胞
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中澤 浩二 福岡県福岡市東区筥松二丁目27−30 たけ し荘208号 (72)発明者 水本 博 福岡県福岡市西区大町団地15番406号 Ｆターム(参考） 4B029 AA02 BB11 CC02 CC12 DA08 DB17 DF05 DG06 4B065 AA90X BB02 BB10 BB12 BB19 BB34 BC22 CA44 4C077 AA07 AA08 BB10 CC06 KK15 KK23 LL05 PP28
Claims (15)
- 【請求項１】 ２枚以上の規則的に小孔が配置されたス
ペーサーの各小孔に中空糸を通した、微小間隔で規則的
に配管された構造体を有することを特徴とする細胞培養
用モジュール。 - 【請求項２】 請求項１記載の細胞培養用モジュールに
肝細胞を充填されたことを特徴とする人工肝臓モジュー
ル。 - 【請求項３】 中空糸の内腔部あるいは細胞培養用モジ
ュールにおける中空糸の内腔もしくは外腔部に遠心力を
利用して細胞を充填し、該充填された細胞を培養するこ
とを特徴とする細胞培養方法。 - 【請求項４】 該細胞培養用モジュールが請求項１記載
のものであることを特徴とする請求項３記載の細胞培養
方法。 - 【請求項５】 該細胞が肝細胞である請求項３または４
記載の方法。 - 【請求項６】 請求項５記載の方法により製造されるこ
とを特徴とする請求項２記載の人工肝臓モジュール。 - 【請求項７】 ダルベッコの改変イーグル培地を基礎培
地とし、プロリン、上皮増殖因子、インスリン、ヒドロ
コルチゾン、亜セレン酸、リノール酸、硫酸銅および硫
酸亜鉛をさらに含むことを特徴とする培地。 - 【請求項８】 ダルベッコの改変イーグル培地と他の培
地との混合培地を基礎培地とし、プロリン、上皮増殖因
子、インスリン、ヒドロコルチゾン、亜セレン酸、リノ
ール酸、硫酸銅および硫酸亜鉛をさらに含むことを特徴
とする培地。 - 【請求項９】 肝細胞培養用である請求項７または８記
載の培地。 - 【請求項１０】 請求項１、２および６のいずれかに記
載のモジュールに使用するための請求項７または８記載
の培地。 - 【請求項１１】 請求項３〜５のいずれかに記載の方法
に使用するための請求項７または８記載の培地。 - 【請求項１２】 ダルベッコの改変イーグル培地を基礎
培地とする培養培地を用いて細胞を培養することを特徴
とする請求項３〜５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１３】 該培養培地が請求項７記載の培地であ
る請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 ダルベッコの改変イーグル培地と他の
培地との混合培地を基礎培地とする培養培地を用いて細
胞を培養することを特徴とする請求項３〜５のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項１５】 該培養培地が請求項８記載の培地であ
る請求項１４記載の方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000188275A JP3553858B2 (ja) | 1999-08-25 | 2000-06-22 | 血管網類似構造体を有する細胞培養用モジュール |
| DE60037370T DE60037370T2 (de) | 1999-08-25 | 2000-08-24 | Sinusförmiges Zellkulturmodul zur Kultivierung von Hepatozyten |
| EP00118346A EP1078982B1 (en) | 1999-08-25 | 2000-08-24 | Cell culture module having sinusoid-like structure for culturing hepatocytes |
| US09/648,027 US6284451B1 (en) | 1999-08-25 | 2000-08-25 | Cell culture module having sinusoid-like structure |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23881899 | 1999-08-25 | ||
| JP11-238818 | 1999-08-25 | ||
| JP2000188275A JP3553858B2 (ja) | 1999-08-25 | 2000-06-22 | 血管網類似構造体を有する細胞培養用モジュール |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004078600A Division JP3725147B2 (ja) | 1999-08-25 | 2004-03-18 | 血管網類似構造体を有する細胞培養用モジュール |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001128660A true JP2001128660A (ja) | 2001-05-15 |
| JP3553858B2 JP3553858B2 (ja) | 2004-08-11 |
Family
ID=26533908
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000188275A Expired - Fee Related JP3553858B2 (ja) | 1999-08-25 | 2000-06-22 | 血管網類似構造体を有する細胞培養用モジュール |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6284451B1 (ja) |
| EP (1) | EP1078982B1 (ja) |
| JP (1) | JP3553858B2 (ja) |
| DE (1) | DE60037370T2 (ja) |
Cited By (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005034069A (ja) * | 2003-07-16 | 2005-02-10 | Fuji Photo Film Co Ltd | バイオリアクター及びそれを用いた細胞培養方法 |
| US6921662B2 (en) | 2001-04-24 | 2005-07-26 | Takagi Industrial Co., Ltd. | Cell/tissue culture apparatus |
| JPWO2004020614A1 (ja) * | 2002-08-28 | 2005-12-15 | 船津 和守 | 異形断面中空糸膜型細胞含有デバイス |
| JP2011103882A (ja) * | 2009-11-16 | 2011-06-02 | Shuhei Nakaji | 細胞培養装置、細胞培養方法および細胞培養用プログラム |
| WO2014017513A1 (ja) | 2012-07-24 | 2014-01-30 | 日産化学工業株式会社 | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 |
| WO2015111686A1 (ja) | 2014-01-23 | 2015-07-30 | 日産化学工業株式会社 | 培地組成物 |
| WO2015111685A1 (ja) | 2014-01-23 | 2015-07-30 | 日産化学工業株式会社 | 培地組成物の製造方法 |
| JP2015221038A (ja) * | 2011-09-28 | 2015-12-10 | ステムバイオス テクノロジーズ, インコーポレイテッドStembios Technologies, Inc. | 体性幹細胞 |
| US9664671B2 (en) | 2012-07-24 | 2017-05-30 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Culture medium composition and method of culturing cell or tissue using thereof |
| US9770473B2 (en) | 2009-02-24 | 2017-09-26 | StemBios Technologies, Inc. | Treatment of immunosuppression-related disorders |
| JP6205507B1 (ja) * | 2016-05-19 | 2017-09-27 | 光次 斉藤 | 培養装置および培養方法、並びにこの培養方法により製造された培養臓器 |
| US9810684B2 (en) | 2012-12-21 | 2017-11-07 | StemBios Technologies, Inc. | Method for increasing number of stem cells in human or animal bodies |
| US9856452B2 (en) | 2012-12-06 | 2018-01-02 | StemBios Technologies, Inc. | Lgr5+ somatic stem cells |
| JP2018050498A (ja) * | 2016-09-27 | 2018-04-05 | ユニチカ株式会社 | 細胞培養用中空糸膜及び細胞培養方法 |
| US10017805B2 (en) | 2012-08-23 | 2018-07-10 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Enhancing ingredients for protein production from various cells |
| US10143710B2 (en) | 2010-08-04 | 2018-12-04 | StemBios Technologies, Inc. | Somatic stem cells |
| US20190105353A1 (en) * | 2014-11-19 | 2019-04-11 | StemBios Technologies, Inc. | Somatic stem cells for treating bone defects |
| JPWO2018029970A1 (ja) * | 2016-08-10 | 2019-06-06 | Cyberdyne株式会社 | 細胞の立体構造化方法及び立体構造化システム |
| WO2023120710A1 (ja) * | 2021-12-23 | 2023-06-29 | 国立大学法人東京大学 | 人工三次元組織製造方法、人工三次元組織製造装置、および人工三次元組織体 |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USH2168H1 (en) * | 2001-06-13 | 2006-09-05 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Arrangement and construction of an element bundling module |
| US20040058309A1 (en) * | 2001-10-12 | 2004-03-25 | Junji Washizu | Plasma supplement and use in liver assist systems |
| FR2834466A1 (fr) * | 2002-01-10 | 2003-07-11 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux moyens pour l'hebergement de cellules et leurs applications |
| AU2003265228A1 (en) * | 2002-03-12 | 2003-12-22 | Surface Logix, Inc. | Assay device that analyzes the absorption, metabolism, permeability and/or toxicity of a candidate compound |
| HUE032238T2 (en) * | 2002-03-15 | 2017-09-28 | Univ North Carolina Chapel Hill | Primitive and proximal liver stem cells |
| ATE408666T1 (de) * | 2002-05-28 | 2008-10-15 | Toyo Boseki | Verfahren zur kultur, zum speichern und zur induzierung von differenzierung von zellen und gerät zur verwendung in diesem verfahren, und dazugehöriges gebrauchsverfahren. |
| US20040029266A1 (en) * | 2002-08-09 | 2004-02-12 | Emilio Barbera-Guillem | Cell and tissue culture device |
| WO2004050824A1 (ja) * | 2002-12-05 | 2004-06-17 | Amcite Research, Ltd. | 組織培養装置 |
| US8557571B2 (en) | 2004-12-27 | 2013-10-15 | Fresenius Medical Care Deutschland Gmbh | Reactor and reactor unit with hollow fibers |
| US7514256B2 (en) * | 2005-02-11 | 2009-04-07 | Emilio Barbera-Guillem | Bioreactor for selectively controlling the molecular diffusion between fluids |
| GB0512214D0 (en) | 2005-06-15 | 2005-07-27 | Capsant Neurotechnologies Ltd | Method |
| GB0512216D0 (en) | 2005-06-15 | 2005-07-27 | Capsant Neurotechnologies Ltd | Device |
| CN101096639B (zh) * | 2007-05-16 | 2011-08-10 | 宁波 | 多组纤维管均匀分布的多功能中空纤维膜管生物反应器 |
| AT506826B1 (de) * | 2008-05-23 | 2010-03-15 | Greiner Bio One Gmbh | Bioreaktor und verfahren zum kultivieren von zellen und geweben |
| WO2010042478A2 (en) * | 2008-10-07 | 2010-04-15 | Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Modular experimental platform for microorganism physiology and scale-up studies |
| CN101549179B (zh) * | 2009-04-30 | 2011-09-14 | 浙江大学 | 人工肝用多孔砖式填充支架型反应器 |
| US8961600B2 (en) * | 2009-06-25 | 2015-02-24 | Optonol Ltd. | Method of using a fiber matrix for maintaining space in soft tissues |
| CN101711898B (zh) * | 2009-12-14 | 2012-05-23 | 浙江大学 | 人工肝用微囊悬浮型搅拌池式生物反应器 |
| EP2844733B1 (en) | 2012-04-18 | 2020-07-15 | Hemoshear, LLC | In vitro model for pathological or physiologic conditions |
| SG11201508747XA (en) | 2013-06-10 | 2015-11-27 | Kuraray Co | Tissue structure and manufacturing method therefor |
| US10752879B2 (en) | 2014-05-30 | 2020-08-25 | Corning Incorporated | Culture method and cell cluster |
| CN106139289B (zh) * | 2016-07-29 | 2018-06-19 | 武汉仝干医疗科技股份有限公司 | 半透膜分层一体式生物反应器 |
| CN106139285B (zh) * | 2016-07-29 | 2018-07-06 | 武汉仝干医疗科技股份有限公司 | 四合一毛绒线式生物人工肝在线监测与恒温加热一体系统 |
| CN207760352U (zh) * | 2017-12-18 | 2018-08-24 | 上海白泽医疗器械有限公司 | 细胞培养模块、培养液模块、细胞培养芯片及细胞培养机箱 |
| CN110205245B (zh) * | 2019-06-14 | 2022-07-08 | 科先医疗科技(苏州)有限公司 | 一种用于生物型人工肝支持系统的细胞反应器 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4367139A (en) * | 1978-11-16 | 1983-01-04 | Monsanto Company | Hollow fiber permeator |
| IL69664A0 (en) * | 1982-09-15 | 1983-12-30 | Collaborative Res Inc | Medium supplement and method for growing cells in vitro |
| SE8505921D0 (sv) | 1985-12-13 | 1985-12-13 | Kabigen Ab | A method to export gene products to the growth medium of gram negative bacteria |
| US5043260A (en) * | 1987-11-02 | 1991-08-27 | Rhode Island Hospital | Perfusion device with hepatocytes |
| CA2092474A1 (en) | 1992-05-12 | 1993-11-13 | Edwin R. Evans | Flame retardant system for polyorganosiloxane compositions |
| JPH0669364A (ja) | 1992-08-21 | 1994-03-11 | Kyocera Corp | 半導体素子収納用パッケージ |
| DE4230194C2 (de) * | 1992-09-09 | 1995-07-27 | Joerg Dr Med Gerlach | Reaktor zur Züchtung und zur Nutzung von Stoffwechselleistungen und/oder zum Erhalt von Mikroorganismen |
| US5525144A (en) * | 1995-04-20 | 1996-06-11 | A/G Technology Corporation | Tangential flow filtering and separating |
| JP3452161B2 (ja) | 1995-08-24 | 2003-09-29 | 株式会社ジェイ・エム・エス | 中空糸型人工肝臓 |
| DE69633189T2 (de) * | 1995-10-06 | 2005-08-11 | Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam | Fester Träger zur Verwendung in der Zellkultivierung, insbesondere für die Kultivierung von Leberzellen, Bioreaktor, welcher den festen Träger enthält, und die Verwendung davon in einem biologisch-künstlichen Lebersystem |
| US6043092A (en) * | 1996-03-18 | 2000-03-28 | University Of Pittsburgh | Cell culture media for mammalian cells |
| JP3887435B2 (ja) | 1996-07-12 | 2007-02-28 | 第一製薬株式会社 | スフェロイド形成促進剤 |
| JPH1033671A (ja) * | 1996-07-24 | 1998-02-10 | Jms Co Ltd | 中空糸型人工肝臓とその灌流及び培養システム |
| US5955353A (en) * | 1997-05-22 | 1999-09-21 | Excorp Medical, Inc. | Hollow fiber bioreactor with an extrafilament flow plug |
-
2000
- 2000-06-22 JP JP2000188275A patent/JP3553858B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-08-24 EP EP00118346A patent/EP1078982B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-24 DE DE60037370T patent/DE60037370T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-25 US US09/648,027 patent/US6284451B1/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6921662B2 (en) | 2001-04-24 | 2005-07-26 | Takagi Industrial Co., Ltd. | Cell/tissue culture apparatus |
| JPWO2004020614A1 (ja) * | 2002-08-28 | 2005-12-15 | 船津 和守 | 異形断面中空糸膜型細胞含有デバイス |
| JP2005034069A (ja) * | 2003-07-16 | 2005-02-10 | Fuji Photo Film Co Ltd | バイオリアクター及びそれを用いた細胞培養方法 |
| US9770473B2 (en) | 2009-02-24 | 2017-09-26 | StemBios Technologies, Inc. | Treatment of immunosuppression-related disorders |
| JP2011103882A (ja) * | 2009-11-16 | 2011-06-02 | Shuhei Nakaji | 細胞培養装置、細胞培養方法および細胞培養用プログラム |
| US10143710B2 (en) | 2010-08-04 | 2018-12-04 | StemBios Technologies, Inc. | Somatic stem cells |
| JP2015221038A (ja) * | 2011-09-28 | 2015-12-10 | ステムバイオス テクノロジーズ, インコーポレイテッドStembios Technologies, Inc. | 体性幹細胞 |
| US9777259B2 (en) | 2011-09-28 | 2017-10-03 | StemBios Technologies, Inc. | Somatic stem cells |
| US10590380B2 (en) | 2012-07-24 | 2020-03-17 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Culture medium composition and method of culturing cell or tissue using thereof |
| KR20190133287A (ko) | 2012-07-24 | 2019-12-02 | 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 | 배지 조성물 및 당해 조성물을 사용한 세포 또는 조직의 배양 방법 |
| US9664671B2 (en) | 2012-07-24 | 2017-05-30 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Culture medium composition and method of culturing cell or tissue using thereof |
| KR20210118251A (ko) | 2012-07-24 | 2021-09-29 | 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 | 배지 조성물 및 당해 조성물을 사용한 세포 또는 조직의 배양 방법 |
| WO2014017513A1 (ja) | 2012-07-24 | 2014-01-30 | 日産化学工業株式会社 | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 |
| KR20210022778A (ko) | 2012-07-24 | 2021-03-03 | 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 | 배지 조성물 및 당해 조성물을 사용한 세포 또는 조직의 배양 방법 |
| EP3409761A1 (en) | 2012-07-24 | 2018-12-05 | Nissan Chemical Corporation | Culture medium composition, and method for culturing cell or tissue using said composition |
| KR20220147706A (ko) | 2012-07-24 | 2022-11-03 | 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 | 배지 조성물 및 당해 조성물을 사용한 세포 또는 조직의 배양 방법 |
| KR20150038190A (ko) | 2012-07-24 | 2015-04-08 | 닛산 가가쿠 고교 가부시키 가이샤 | 배지 조성물 및 당해 조성물을 사용한 세포 또는 조직의 배양 방법 |
| US11371013B2 (en) | 2012-07-24 | 2022-06-28 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Culture medium composition and method of culturing cell or tissue using thereof |
| US10017805B2 (en) | 2012-08-23 | 2018-07-10 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Enhancing ingredients for protein production from various cells |
| US9856452B2 (en) | 2012-12-06 | 2018-01-02 | StemBios Technologies, Inc. | Lgr5+ somatic stem cells |
| US11492592B2 (en) | 2012-12-06 | 2022-11-08 | StemBios Technologies, Inc. | Lgr5+ somatic stem cells |
| US9810684B2 (en) | 2012-12-21 | 2017-11-07 | StemBios Technologies, Inc. | Method for increasing number of stem cells in human or animal bodies |
| WO2015111686A1 (ja) | 2014-01-23 | 2015-07-30 | 日産化学工業株式会社 | 培地組成物 |
| KR20220088523A (ko) | 2014-01-23 | 2022-06-27 | 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 | 배양 배지 조성물 |
| KR20160117496A (ko) | 2014-01-23 | 2016-10-10 | 닛산 가가쿠 고교 가부시키 가이샤 | 배양 배지 조성물 |
| KR20220020418A (ko) | 2014-01-23 | 2022-02-18 | 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 | 배양 배지 조성물 |
| KR20210034121A (ko) | 2014-01-23 | 2021-03-29 | 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 | 배양 배지 조성물 |
| WO2015111685A1 (ja) | 2014-01-23 | 2015-07-30 | 日産化学工業株式会社 | 培地組成物の製造方法 |
| US20190105353A1 (en) * | 2014-11-19 | 2019-04-11 | StemBios Technologies, Inc. | Somatic stem cells for treating bone defects |
| US11306281B2 (en) | 2016-05-19 | 2022-04-19 | Koji Saito | Culture device, culture method and cultured organ produced by the culture method |
| WO2017199387A1 (ja) * | 2016-05-19 | 2017-11-23 | 光次 斉藤 | 培養装置および培養方法、並びにこの培養方法により製造された培養臓器 |
| JP6205507B1 (ja) * | 2016-05-19 | 2017-09-27 | 光次 斉藤 | 培養装置および培養方法、並びにこの培養方法により製造された培養臓器 |
| JPWO2018029970A1 (ja) * | 2016-08-10 | 2019-06-06 | Cyberdyne株式会社 | 細胞の立体構造化方法及び立体構造化システム |
| JP2018050498A (ja) * | 2016-09-27 | 2018-04-05 | ユニチカ株式会社 | 細胞培養用中空糸膜及び細胞培養方法 |
| WO2023120710A1 (ja) * | 2021-12-23 | 2023-06-29 | 国立大学法人東京大学 | 人工三次元組織製造方法、人工三次元組織製造装置、および人工三次元組織体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE60037370D1 (de) | 2008-01-24 |
| EP1078982A3 (en) | 2004-03-31 |
| EP1078982A2 (en) | 2001-02-28 |
| US6284451B1 (en) | 2001-09-04 |
| EP1078982B1 (en) | 2007-12-12 |
| JP3553858B2 (ja) | 2004-08-11 |
| DE60037370T2 (de) | 2008-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3553858B2 (ja) | 血管網類似構造体を有する細胞培養用モジュール | |
| US6008049A (en) | Diffusion gradient bioreactor and extracorporeal liver device | |
| Dixit | Development of a bioartificial liver using isolated hepatocytes | |
| Park et al. | Bioartificial liver systems: current status and future perspective | |
| Gerlach et al. | Bioreactor for a larger scale hepatocyte in vitro perfusion | |
| JP5524824B2 (ja) | 改良されたバイオリアクタ表面 | |
| JP3692147B2 (ja) | フィルターデバイス | |
| Miyoshi et al. | Long‐term continuous culture of hepatocytes in a packed‐bed reactor utilizing porous resin | |
| JP4656789B2 (ja) | 細胞から組織を操作するためのバイオリアクターデザインとプロセス | |
| Gerlach | Long-term liver cell cultures in bioreactors and possible application for liver support | |
| CN108410797A (zh) | 在中空纤维生物反应器中扩增干细胞 | |
| US20080293133A1 (en) | Textiles for use in bioreactors for expansion and maintenance of cells | |
| Flendrig et al. | Semipermeable hollow fiber membranes in hepatocyte bioreactors: a prerequisite for a successful bioartificial liver? | |
| JP3725147B2 (ja) | 血管網類似構造体を有する細胞培養用モジュール | |
| US20050032218A1 (en) | Method to manufacture a cell preparation and such manufactured cell preparations | |
| Kashte et al. | Bioinspired engineering for liver tissue regeneration and development of bioartificial liver: a review | |
| McGuigan et al. | Modular tissue engineering: fabrication of a gelatin‐based construct | |
| Tilles et al. | Critical issues in bioartificial liver development | |
| De Bartolo et al. | Review of a flat membrane bioreactor as a bioartificial liver | |
| Qiang et al. | Comparative evaluation of different membranes for the construction of an artificial liver support system | |
| Ijima | Practical and functional culture technologies for primary hepatocytes | |
| Liu et al. | Coencapsulation of hepatocytes and bone marrow cells: in vitro and in vivo studies | |
| Maringka et al. | Preclinical characterization of primary porcine hepatocytes in a clinically relevant flat membrane bioreactor | |
| LEE et al. | Optimization of Chitosan-Alginate Encapsulation Process Using Pig Hepatocytes or Development of Bioartificial Liver | |
| JP2002542817A (ja) | 三次元的な細胞増殖のためのモジュール状の細胞キャリヤー系 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040120 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040318 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040413 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040430 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080514 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090514 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090514 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100514 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110514 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110514 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130514 Year of fee payment: 9 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |