CN117511867A - 一种靶向肺部且高表达nkg2d的nk细胞的培养试剂盒及其应用 - Google Patents

一种靶向肺部且高表达nkg2d的nk细胞的培养试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向肺部且高表达NKG2D的NK细胞的培养试剂盒及其应用，所述试剂盒包括活化培养基；所述活化培养基为包含以下至少一种的基础培养基：白细胞介素、干细胞因子、干扰素、BMP信号通路激活剂、维生素、糖皮质激素、酪氨酸激酶抑制剂、白细胞介素受体激动剂、TLR激动剂、自体血浆。本发明提供的试剂盒能够培养出一群靶向肺部且高表达NKG2D受体的NK细胞，可以用于解决现有技术中NK细胞体外扩增中存在的NK细胞组织靶向性弱、NKG2D受体表达低导致靶向性杀伤活性较差的问题。

Description

一种靶向肺部且高表达NKG2D的NK细胞的培养试剂盒及其 应用
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种靶向肺部且高表达NKG2D的NK细胞的培养试剂盒及其应用。
背景技术
自然杀伤细胞(Nature Killer cells，NK)是机体固有免疫系统的细胞毒性淋巴细胞，存在于淋巴器官和外周组织中，具有抗肿瘤、抗感染和免疫调节等功能，其无须抗原预先致敏就可以直接识别，并且非特异性地杀伤肿瘤细胞，是人体防御体系的第一道屏障。NK细胞具有强大的细胞毒活性，它对刺激因素产生的应答十分迅速，而且免疫应答强度高；同时，NK的杀伤活性无需抗原刺激，也不受MHC分子的限制；此外，NK细胞还具有强大的细胞因子/趋化因子分泌功能，有助于启动和活化其他免疫细胞(如T细胞、B细胞、树突状细胞和内皮细胞等)的应答。
表达于NK细胞表面的NKG2D既是激活性受体又是识别性受体，由于肿瘤细胞和一些病原菌感染的细胞均表达NKG2D配体MICA、MICB和ULBP，因此，高表达NKG2D的NK细胞对上述疾病的治疗至关重要。目前，用市售的NK细胞培养基培养的NK细胞表达NKG2D较低，器官和组织靶向性也较差。因此，目前亟待研究开发一种能够在短周期内大量高效的扩增得到杀伤功能强、靶向性高的NK细胞培养方法。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一种靶向肺部且高表达NKG2D的NK细胞的培养试剂盒，能够高效扩增并活化NK细胞，制备得到一群靶向肺部且高表达NKG2D受体的NK细胞。
本发明还提供一种上述试剂盒的应用。
本发明还提供一种诱导单个核细胞分化为NK细胞的方法。
本发明还提供一种NK细胞。
本发明还提供一种药物组合物。
本发明还提出上述NK细胞和/或上述药物组合物的应用。
根据本发明的第一方面，提出了一种靶向肺部且高表达NKG2D的NK细胞的培养试剂盒，包括活化培养基；所述活化培养基为包含以下中的至少一种的基础培养基：白细胞介素、干细胞因子、干扰素、BMP信号通路激活剂、维生素、糖皮质激素、酪氨酸激酶抑制剂、白细胞介素受体激动剂、TLR激动剂、自体血浆。
在本发明的一些实施方式中，所述白细胞介素包括IL-2、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21中的至少一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述白细胞介素在活化培养基中的浓度为：IL-25～1200U/mL、IL-7 4000～11000U/mL、IL-15 1～60ng/mL、IL-18 1～60ng/mL、IL-211～60ng/mL。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述白细胞介素在活化培养基中的浓度为：IL-2 10～1000U/mL、IL-7 5000～10000U/mL、IL-15 5～50ng/mL、IL-18 5～50ng/mL、IL-21 5～50ng/mL。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述白细胞介素在活化培养基中的浓度为：IL-2 500U/mL、IL-7 7000U/mL、IL-15 20ng/mL、IL-18 20ng/mL、IL-21 20ng/mL。
在本发明的一些实施方式中，所述干细胞因子在活化培养基中的浓度为1～60U/mL。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述干细胞因子在活化培养基中的浓度为5～50U/mL。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述干细胞因子在活化培养基中的浓度为20U/mL。
在本发明的一些实施方式中，所述干扰素包括干扰素-α。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述干扰素-α在活化培养基中的浓度为1～120pg/mL。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述干扰素-α在活化培养基中的浓度为1～100pg/mL。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述干扰素-α在活化培养基中的浓度为50pg/mL。
在本发明的一些实施方式中，所述BMP信号通路激活剂包括BMP2、BMP4、SB4、SJ000291942、SJ000063181、SJ000370178、异甘草素、香叶木素、芹菜素和鹰嘴豆芽素中的至少一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述BMP信号通路激活剂为芹菜素。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述芹菜素在活化培养基中的浓度为0.05～60μM。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述芹菜素在活化培养基中的浓度为0.1～50μM。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述芹菜素在活化培养基中的浓度为25μM。
在本发明的一些实施方式中，所述维生素包括L-抗坏血酸。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述L-抗坏血酸在活化培养基中的浓度为1～60μg/mL。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述L-抗坏血酸在活化培养基中的浓度为5～50μg/mL。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述L-抗坏血酸在活化培养基中的浓度为20μg/mL。
在本发明的一些实施方式中，所述糖皮质激素包括地塞米松、氢化可的松中的至少一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述糖皮质激素为氢化可的松。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述氢化可的松在活化培养基中的浓度为0.05～15μM。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述氢化可的松在活化培养基中的浓度为0.1～10μM。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述氢化可的松在活化培养基中的浓度为5μM。
在本发明的一些实施方式中，所述酪氨酸激酶抑制剂包括伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼中的至少一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述酪氨酸激酶抑制剂为尼洛替尼。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述尼洛替尼在活化培养基中的浓度为0.01～10nM。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述尼洛替尼在活化培养基中的浓度为0.1nM。
在本发明的一些实施方式中，所述白细胞介素受体激动剂包括SHR-1501、SOT101中的至少一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述白细胞介素受体激动剂为SOT101。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述SOT101在活化培养基中的浓度为0.001～1.5nM。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述SOT101在活化培养基中的浓度为0.001～1nM。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述SOT101在活化培养基中的浓度为0.1nM。
在本发明的一些实施方式中，所述TLR激动剂包括TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂中的至少一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述TLR7激动剂包括TLR7 agonist1、TLR7agonist3、TLR7 agonist9中的至少一种。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述TLR7激动剂为TLR7 agonist3。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述TLR7 agonist3在活化培养基中的浓度为10nM。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述TLR8激动剂包括TLR8 agonist2、TLR8agonist5、TLR8 agonist6中的至少一种
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述TLR8激动剂为TLR8 agonist5。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述TLR8 agonist5在活化培养基中的浓度为10nM。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述TLR9激动剂包括ODN M362、ODN M1668、ODN M1018中的至少一种
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述TLR9激动剂为ODN M1018。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述ODN M1018在活化培养基中的浓度为10nM。
在本发明的一些实施方式中，所述自体血浆在活化培养基中的浓度为4-12v/v％。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述自体血浆在活化培养基中的浓度为5-10v/v％。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述自体血浆在活化培养基中的浓度为10v/v％。
在本发明的一些实施方式中，所述NK细胞的培养试剂盒还包括包被液，所述包被液为包含以下中的至少一种的溶液：TLR激动剂、NCR抗体、CD52抗体、CD137抗体。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述包被液的溶剂包括磷酸缓冲盐溶液(PBS)、生理盐水。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述包被液的溶剂为生理盐水。
本发明的一些优选的实施方式中，所述NCR抗体包括NKp30抗体、NKp44抗体、NKp46抗体中的至少一种。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述NCR抗体在包被液中的浓度为：10μg/mL NKp30抗体、10μg/mL NKp44抗体、10μg/mL NKp46抗体。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述CD52抗体在包被液中的浓度为：0.1-50μg/mL。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述CD52抗体在包被液中的浓度为：10μg/mL。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述CD137抗体在包被液中的浓度为：0.1-50μg/mL。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述CD137抗体在包被液中的浓度为：10μg/mL。
在本发明的一些实施方式中，所述基础培养基包括Iscove's ModifiedDulbecco'sMedium(IMDM)培养基、Eagle's Basal Medium(BME)培养基、MEM培养基、DMEM培养基，Ham's F-12培养基、RPMI1640培养基、Fischer's培养基、DMEM/F12培养基SCGM培养基中的至少一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述基础培养基为SCGM培养基。
根据本发明的第二方面，提供了一种上述试剂盒在(1)～(2)中任一项中的应用：
(1)制备NK细胞；(2)制备诱导单个核细胞分化为NK细胞的产品。
在本发明的一些实施方式中，所述单个核细胞来源于人外周血。
在本发明的一些实施方式中，所述NK细胞为高表达NKG2D、CXCR3和CCR5的NK细胞。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述人外周血单个核细胞采用密度梯度离心法分离得到。
根据本发明的第三方面，提供了一种诱导单个核细胞分化为NK细胞的方法，包含采用本发明第一个方面的试剂盒的步骤。
在本发明的一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：
S1：将外周血单个核细胞接种于用包被液包被后的细胞培养容器中，加入活化培养基进行培养至2～4d；
S2：将培养2～4d后的细胞转移到新的培养容器中，补充活化培养基并继续培养至6～8d；
S3：将培养6～8d后的细胞转移到新的培养容器中，补充活化培养基并继续培养至14～20d，即得NK细胞。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S1中所述包被的条件为：2～6℃下孵育10～14h。
在本发明的一些更优选的实施方式中，步骤S1中所述包被的条件为：4℃下孵育12h。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S1中所述培养的时间为48～96h；进一步为60～84h；更进一步为68～72h。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S2中所述培养的时间为48～144h；进一步为72～120h；更进一步为90～96h。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S3中所述培养的时间为144～288h；进一步为168～264h；更进一步为200～216h。
在本发明的一些优选的实施方式中，上述步骤中培养的条件为35～38℃、4～6％CO2。
在本发明的一些更优选的实施方式中，上述步骤中培养的条件为37℃、5％ CO2。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S1所述细胞培养容器包括T75培养瓶，步骤S2所述细胞培养容器包括T175培养瓶，步骤S3所述细胞培养容器包括1L培养袋。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述接种的步骤中，单个核细胞接种浓度为2.5～6×106个/mL。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述接种的步骤中，单个核细胞接种浓度为3～5×106个/mL。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述接种的步骤中，单个核细胞接种浓度为3×106个/mL。
在本发明的一些实施方式中，所述补充活化培养基的步骤后，单个核细胞的浓度为1.5～5×106个/mL。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述补充活化培养基的步骤后，单个核细胞的浓度为2～4×106个/mL。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述补充活化培养基的步骤后，单个核细胞的浓度为3×106个/mL。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S1-S3中所述的培养为悬浮培养。
根据本发明的第四方面，提供了一种NK细胞，通过本发明第一方面的试剂盒和/或本发明第三方面的方法制备得到。
在本发明的一些实施方式中，所述NK细胞中CD3-CD56+细胞的含量为80％以上、82％以上、84％以上或86％以上。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述NK细胞中CD3-CD56+细胞的含量为86％以上。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述NK细胞中CD3-CD56+细胞的含量为86.2％。
在本发明的一些实施方式中，所述CD3-CD56+的NK细胞中NKG2D+细胞的含量为80％以上、85％以上、90％以上、92％以上、94％以上、96％以上或98％以上。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述CD3-CD56+的NK细胞中NKG2D+细胞的含量为98％以上。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述CD3-CD56+的NK细胞中NKG2D+细胞的含量为98.5％。
在本发明的一些实施方式中，所述CD3-CD56+的NK细胞中CXCR3+细胞的含量为80％以上、85％以上、90％以上、92％以上、94％以上、96％以上或98％以上。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述CD3-CD56+的NK细胞中CXCR3+细胞的含量为98％以上。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述CD3-CD56+的NK细胞中CXCR3+细胞的含量为99.0％。
在本发明的一些实施方式中，所述CD3-CD56+的NK细胞中CCR5+细胞的含量为80％以上、85％以上、90％以上、92％以上、94％以上、96％以上、98％以上或99％以上。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述CD3-CD56+的NK细胞中CCR5+细胞的含量为99％以上。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述CD3-CD56+的NK细胞中CCR5+细胞的含量为99.7％。
根据本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，包含本发明第四方面的NK细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述药学上可接受的载体包括但不限于：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、DMSO、及其组合。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物为液体制剂。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述药物组合物为静脉注射试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物还包含抗肿瘤药物和/或抗病毒药物。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述抗肿瘤药物为治疗肺癌的药物。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述抗肿瘤药物包括紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、吉西他滨、培美曲赛、依托泊苷、卡铂、顺铂、洛铂、吉非替尼中的至少一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述抗病毒药物包括阿昔洛韦、奥司他韦、利巴韦林、更普洛韦中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物中NK细胞和所述抗肿瘤药物和/或抗病毒药物混合或独立存在。
根据本发明的第六方面，提供了本发明第四方面的NK细胞和/或本发明第五方面的药物组合物在(1)～(2)中任一项中的应用：
(1)制备预防和/或治疗肿瘤的药物；
(2)制备预防和/或治疗病毒感染的药物。
在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤包括肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、子宫内膜癌、头颈癌、宫颈癌、肝癌、肾癌、胶质瘤中的至少一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述肿瘤为肺癌。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述肺癌包括小细胞肺癌、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、大细胞肺癌中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述病毒感染包括肺部病毒感染。
本发明至少具有以下有益效果：
本发明提供了一种诱导单个核细胞分化为NK细胞的试剂盒，还基于上述试剂盒提出了一种高效且明确的、用于诱导NK细胞的培养方法，该方法在体外培养外周血单个核细胞16～20天后，能使NK细胞扩增500～800倍，NK细胞比例＞85％，表达靶向肺部的标志性趋化因子受体CCR5和CXCR3的阳性细胞比例均超过95％，同时NKG2D阳性率＞98％。此外，本方案制备得到的NK细胞，在体外对A549肺癌细胞的杀伤率＞90％。本发明提供的培养方法使用了上述试剂盒中包含多种活性组分的活化培养基和培养瓶包被液，这些活性组分复配使用后能够发挥协同增效作用，培养得到一群高纯度的靶向肺部且高表达NKG2D受体的NK细胞，可以用于解决现有技术中NK细胞体外扩增中存在的NK细胞组织靶向性弱、杀伤活性较差的问题，进一步为肺癌和肺部病毒感染提供一种新的治疗思路和技术支持。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例2、对比例1和对比例2的细胞生长曲线图；
图2为本发明实施例2、对比例1和对比例2的细胞存活曲线图；
图3为本发明实施例2在接种(a)时及培养16天(b)时，NK细胞纯度检测流式结果图；
图4为本发明实施例2、对比例1和对比例2在培养16天后，检测NK细胞中NKD2G表达情况的流式结果图，其中阴性对照为实施例2培养16天后的细胞中只加入了NKG2D抗体的同型对照抗体；
图5为本发明实施例2培养16天后，检测NK细胞中CCR5和CXCR3表达情况的流式结果图，其中阴性对照为实施例2培养16天后的细胞只加入了使用抗体(CCR5、CXCR3)的同型对照抗体；
图6为本发明实施例2、对比例1和对比例2在培养16天后，NK细胞对A549肺癌细胞的杀伤活性结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1一种靶向肺部并高表达NKG2D受体的NK细胞的培养试剂盒
本实施例提供了一种靶向肺部并高表达NKG2D受体的NK细胞的培养试剂盒，所述试剂盒包括刺激因子包被的T75培养瓶和活化培养基。
上述包被培养瓶的具体制备步骤如下：
在生理盐水中加入10μg/mL NKp30抗体、10μg/mL NKp44抗体、10μg/mL NKp46抗体、10μg/mL CD137抗体和10μg/mL CD52抗体，得到包被液，用于包被T75细胞培养瓶，包被温度为4℃，孵育时间为12h，得到刺激因子包被的培养瓶。
上述活化培养基为包括以下组分的SCGM培养基：浓度为7000U/mL的IL-7、IL-2浓度为500U/mL、IL-15浓度为20ng/mL、IL-18浓度为20ng/mL、IL-21浓度为20ng/mL、L-抗坏血酸浓度为20μg/mL、氢化可的松浓度为5μM、干细胞因子浓度为20U/mL、尼洛替尼浓度为0.1nM、干扰素-α浓度为50pg/mL、芹菜素浓度为25μM、SOT101浓度为0.1nM、TLR7 agonist3浓度为10nM、TLR8 agonist5浓度为10nM、ODN M1018浓度为10nM、自体血浆浓度为10v/v％。
实施例2
本实施例制备了一种靶向肺部并高表达NKG2D受体的NK细胞，具体培养方法如下：
1)分离人外周血单个核细胞(PBMC)；
2)将PBMC用适量活化培养基重悬，细胞悬液浓度为3×106个/mL，接种于包被好的T75培养瓶中，细胞培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％；
2)接种3天后，将细胞转移到T175培养瓶中，补充适量活化培养基，使细胞悬液的浓度为3×106个/mL；
3)接种7天后，将细胞转移到1L培养袋中，补充适量活化培养基，使细胞悬液的浓度为3×106个/mL，之后根据培养状况不断添加相应的培养基，使细胞悬液的浓度维持在3×106个/mL；
4)接种16天后，收集细胞。
对比例1
本对比例制备了一种NK细胞，具体的培养方法与实施例2的区别仅在于，本对比例使用的活化培养基不含L-抗坏血酸、氢化可的松、尼洛替尼、芹菜素和SOT101。
对比例2
本对比例制备了一种NK细胞，具体的培养方法与实施例2的区别仅在于，本对比例使用的活化培养基不含IL-7、IL-18、IL-21、L-抗坏血酸、氢化可的松、尼洛替尼、干扰素-α、芹菜素和SOT101。
试验例
本试验例测试了实施例2和对比例1-2培养得到的NK细胞的生长/存活情况、NK细胞纯度、NKG2D的表达情况、CXCR3/CCR5的表达情况和NK细胞对A549肺癌细胞的杀伤活性，具体试验步骤及结果如下：
1.细胞生长/存活情况：
采用全自动计数仪分别在培养第0天、3天、5天、7天、9天、11天和16天检测实施例2和对比例1-2的细胞数量，并绘制相应的细胞生长曲线(图1)及细胞存活曲线(图2)。由图1和图2可知，培养16天后，实施例2的NK细胞扩增超过500倍，与对比例1和2相比，实施例2培养的NK细胞生长速度更快且存活能力更强，能够满足临床治疗所需细胞数量。
2.NK细胞纯度检测：
收集等量实施例2刚接种时的细胞和培养第16天的细胞，用冰的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)清洗3次，清洗后弃去上清，轻轻震散细胞，加入CD3-FITC和CD56-APC荧光标记的流式单抗混匀，随后在4℃条件下避光孵育25min，加入大体积PBS终止孵育，离心去除上清，再用PBS重悬至合适体积，使用流式细胞仪进行表面标记检测，结果如图3所示。由图3a可知，在接种时，CD56+的NK细胞占PBMC的12.2％，由图3b可知，在培养16天后，表型为CD3-CD56+的NK细胞，占比达到86.2％。结合图1和图3的结果可知，培养16天后NK细胞相比接种时扩增了约773倍，说明本方案的培养方法能够获得大量高纯度的NK细胞。
3.NKG2D表达量检测：
收集等量实施例2、对比例1和对比例2培养第16天的细胞，用冰的PBS清洗3次，清洗后弃去上清，轻轻震散细胞，加入NKG2D-PE荧光标记的流式单抗混匀，随后在4℃条件下避光孵育25min，加入大体积PBS终止孵育，离心去除上清，再用PBS重悬至合适体积，使用流式细胞仪进行表面标记检测，结果如图4所示。由图4可知，实施例2、对比例1和对比例2制备的NK细胞(CD3-CD56+)中NKG2D阳性率分别为98.5％、67.3％和27.4％，说明本方案的培养方法能够获得高表达NKG2D的活化NK细胞。
4.CXCR3/CCR5表达量检测：
收集实施例2培养第16天的细胞，用冰的PBS清洗3次，清洗后弃去上清，轻轻震散细胞，加入CCR5-FITC和CXCR3-BV421荧光标记的流式单抗混匀，随后在4℃条件下避光孵育25min，加入大体积PBS终止孵育，离心去除上清，再用PBS重悬至合适体积，使用流式细胞仪进行表面标记检测，结果如图5所示。由图5可知，实施例2制备得到的NK细胞(CD3-CD56+)的CCR5阳性率达到99.7％，CXCR3阳性率达到99.0％，该结果说明本方案的培养方法能够获得高表达CCR5和CXCR3的靶向肺部的NK细胞。
5.杀伤活力检测(LDH法)：
1)收集对数生长期的A549肺癌细胞(表达NKG2D配体)以及实施例2、对比例1和对比例2培养16天后得到的NK细胞；
2)将处于对数期生长的A549肺癌细胞用0.25％的胰酶消化，制备成单个细胞悬液，台盼蓝染色计数，随后调整细胞的密度至1×105个/mL；
3)将A549细胞悬液加入96孔板中，每孔50μL，将NK细胞按照不同比例重悬(效应细胞：靶细胞＝1:1、2：1、5:1、10:1)，每孔同样加入50μL NK细胞悬液：
4)同时设立效应细胞自然释放孔(只加入NK细胞)、靶细胞自然释放孔(只加入A549细胞)、靶细胞最大释放孔(加入A549细胞和细胞裂解液)、培养基自然释放孔(只加入培养基)以及体积校正对照孔(只加入生理盐水)，每孔体积100μL，且均设立3个复孔；
5)将96孔板置于37℃、5％CO2培养箱孵育12h，在反应结束前45min向靶细胞最大释放孔中每孔中加入10μL裂解液；
6)待反应结束，从每孔吸取50μL上清液加入到另一新的96孔板，再向新的96孔板中每孔加入50μL LDH酶反应液，在室温条件下避光反应30min，最后每孔加入反应终止液50μL，使用酶标仪在490nm处检测其OD值；
7)按照如下公式计算杀伤活性：杀伤活性(％)＝(测定管OD值-靶细胞自然释放管OD值-效应细胞自然释放管OD值)/(靶细胞最大释放管OD值-靶细胞自然释放管OD值)×100％。计算结果如图6所示。
由图6可知，在不同的效/靶细胞比例中，实施例2所制备的NK细胞的杀伤活力均高于对比例1和2。当效/靶比为10:1时，实施例2所得NK细胞的杀伤活力达到最高，杀伤率为94.0％，而对比例和对比例2的杀伤率分别为78.6％和70.4％。以上结果说明，实施例2培养得到的NK细胞具有更强的杀伤功能。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种靶向肺部且高表达NKG2D的NK细胞的培养试剂盒，其特征在于，包括活化培养基；所述活化培养基为包含以下中的至少一种的基础培养基：白细胞介素、干细胞因子、干扰素、BMP信号通路激活剂、维生素、糖皮质激素、酪氨酸激酶抑制剂、白细胞介素受体激动剂、TLR激动剂、自体血浆。
2.根据权利要求1所述的靶向肺部且高表达NKG2D的NK细胞的培养试剂盒，其特征在于，所述活化培养基的白细胞介素包括IL-2、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21中的至少一种；和/或，所述干扰素包括干扰素-α；和/或，所述BMP信号通路激活剂包括BMP2、BMP4、SB4、SJ000291942、SJ000063181、SJ000370178、异甘草素、香叶木素、芹菜素和鹰嘴豆芽素中的至少一种；和/或，所述维生素包括L-抗坏血酸；和/或，所述糖皮质激素包括地塞米松、氢化可的松中的至少一种；和/或，所述酪氨酸激酶抑制剂包括伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼中的至少一种；和/或，所述白细胞介素受体激动剂包括SHR-1501、SOT101中的至少一种；和/或，所述TLR激动剂包括TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的靶向肺部且高表达NKG2D的NK细胞的培养试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括包被液，所述包被液为包含以下中的至少一种的溶液：NCR抗体、CD52抗体、CD137抗体；优选地，所述包被液的NCR抗体包括NKp30抗体、NKp44抗体、NKp46抗体中的至少一种。
4.如权利要求1～3任一项所述的靶向肺部且高表达NKG2D的NK细胞的培养试剂盒在(1)～(2)中任一项中的应用：
(1)制备NK细胞；
(2)制备诱导单个核细胞分化为NK细胞的产品。
5.一种诱导单个核细胞分化为NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包含采用权利要求1～3中任一项所述的靶向肺部且高表达NKG2D的NK细胞的培养试剂盒的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1：将外周血单个核细胞接种于用包被液包被后的细胞培养容器中，加入活化培养基进行培养至2～4d；
S2：将培养2～4d后的细胞转移到新的培养容器中，补充活化培养基并继续培养至6～8d；
S3：将培养6～8d后的细胞转移到新的培养容器中，补充活化培养基并继续培养至14～20d，即得NK细胞。
7.一种NK细胞，其特征在于，所述NK细胞通过权利要求1～3中任一项所述的靶向肺部且高表达NKG2D的NK细胞的培养试剂盒和/或权利要求5～6中任一项所述的方法制备得到。
8.一种药物组合物，其特征在于，包含如权利要求7所述的NK细胞。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体；所述药物组合物还包含抗肿瘤药物和/或抗病毒药物。
10.如权利要求7所述的NK细胞和/或权利要求8～9中任一项所述的药物组合物在(1)～(2)中任一项中的应用：
(1)制备预防和/或治疗肿瘤的药物；
(2)制备预防和/或治疗病毒感染的药物。
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