CN112980785A - 一种高活性的肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及一种高活性的肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，包括：步骤一、将经过胶原酶、DNA酶和透明质酶处理后的肿瘤浸润淋巴细胞消化液进行密度梯度离心；将原代肿瘤浸润淋巴细胞接种至完全RPMI培养基中扩增；将一代肿瘤浸润淋巴细胞接种至转瓶中继续培养，即得高活性的肿瘤浸润淋巴细胞。本发明解决现有技术中高活性的肿瘤浸润淋巴细胞制备手段繁琐、产率低的问题。上述制备方法中，在肿瘤浸润淋巴细胞消化液的制备过程中采用“综合酶消化法”消化组织或细胞富集物，综合酶消化可以确保的单个细胞最佳获取率。上述制备方法可以用于临床肿瘤浸润淋巴细胞的制备，可以获得足够数量的淋巴细胞。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及一种高活性的肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法。
背景技术
肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocytes，TIL/TILs)是指在肿瘤组织中分离出来的淋巴细胞，具有异质性，主要为CD3+T细胞，也包括CD4+和CD8+T细胞。目前的研究表明，肿瘤组织中TILs数量与预后具有相关性。同时，TILs细胞中那部分能够特异识别和杀伤肿瘤细胞的淋巴细胞，在体外经过扩增培养后，如果回输到体内，能够杀灭肿瘤细胞，因此具有抑制肿瘤生长和抑制转移的作用。这种治疗肿瘤的方法称为TILs治疗法，属于过继性肿瘤治疗中的一种方法。
1986年Rosenberg从荷瘤小鼠肿瘤内分离得到TILs细胞。TILs细胞表型具有异质性，包括T细胞、B细胞和NK细胞，但主要为CD3+T细胞，而CD3+T细胞可进一步分化成为CD8+的细胞毒T细胞(CTL)、记忆性T细胞(Tm)、辅助性T细胞(Th)。不同病人来源或不同组织来源的TILs细胞中各种细胞类型存在明显差异。
目前研究发现，TILs细胞数量与病人的预后间存在相关性，在肿瘤组织内TILs高者预后更好。已知在TILs内CD8+T细胞在肿瘤微环境中被认为具有抗肿瘤功能。目前研究也证明TILs内存在可以识别肿瘤新生抗原、突变基因等的TCR(T细胞抗原受体，T cellreceptor)，具有特异杀伤肿瘤细胞的作用。因此，利用TILs抑制肿瘤或抑制转移是一种可行的方法。
现在已经在研究并认为有效的有以下几种方法：①、通过分析TILs从而筛选获得特异识别肿瘤抗原的T细胞受体用以改造外周血T细胞，从而获得肿瘤杀伤性TCR-T细胞并进行抗肿瘤治疗；②、采用二代测序技术，对TILs进行分析和筛选，从而获得促进T细胞杀伤肿瘤的基因及T细胞表征，用以改造CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)和TCR-T细胞，提高这些细胞对肿瘤的杀伤力。
目前的TILs用于肿瘤治疗过程大致分为以下几个：①收集手术切下的肿瘤组织(原发性或转移性肿瘤)或肿瘤引流淋巴组织或癌性胸腹水；②机械处理或酶消化，然后密度梯度离心，分离TILs；③体外扩增培养TILs，传统方式为加用IL-2及抗CD3抗体，现在也有加用IL-7或IL-15，促进T细胞增殖，维持TILs中CD4+和CD8+T细胞比例，使得体外扩增的T细胞具有更好的表型；④将扩增的T细胞回输病人体内。
然而，TILs疗法相较于其他细胞免疫方法来说，尽管在肿瘤杀伤方面具有优势，但是，也存在一定的局限性，主要表现为：①TILs制备技术复杂，相较于利用外周血制备CAR-T或TCR-T细胞而言，分离、培养、体外扩增TILs的过程更为复杂；②TILs中更多的是T细胞分化中末端的效应T细胞，虽然具备较强的杀伤功能，但缺乏记忆和长期增殖能力；③TILs的来源局限于新鲜且无菌保存的肿瘤组织或转移性肿瘤形成的体液，对于无法提供此类组织或体液的病人则无法获得这种疗法；④部分患者的肿瘤组织内TILs过少或没有，无法分离获得TILs，而且往往这类病人预后更差，迫切需要免疫治疗。
因此，在全部过程中，获得足量的可以回输体内的TILs细胞是免疫治疗的关键。要获得足量的细胞，现有技术中主要采用的有效过程是：从来自病人的肿瘤组织内获得尽可能多的淋巴细胞，将这些淋巴细胞扩增培养成具有肿瘤杀伤特异性的细胞。因此，在制备细胞过程中需要在前面减少淋巴细胞的丢失，在后面的过程中需要淋巴细胞尽可能增殖。
目前所有的分离TILs方案中多采用组织切碎、胶原酶消化方法，即先将组织切成1mm3的组织块，在不完全培养基中用胶原酶消化，获得单细胞悬液后加入健康供者血清、重组人IL-2等，体外培养14～28天，质量检测后进行体内回输。在组织被切下离开机体及切碎过程中，细胞破碎后内部DNA释放出来，形成粘液丝状物将细胞包裹在内，即使在胶原酶等作用后这些粘液丝状物也不会断裂，因而导致单个细胞的获得率大大下降。
此外，还有的方案采用转移性肿瘤引起的胸水或腹水来离心浓集淋巴细胞，也因DNA的大量存在而导致单个细胞获得率低。转移性肿瘤导致的体腔积液中，由于肿瘤生长快速、局部出血等导致体液中DNA浓度高，离心得到的细胞富集物中同样存在因DNA形成粘液丝而包裹交连的细胞，这些被DNA交连物包裹的细胞并不能因反复吹打或胶原酶消化而成为单细胞悬液，因而导致单个细胞的获得率大大下降。
另外，在胶原酶消化过程中，由于肿瘤组织的间质中存在胶原蛋白、透明质酶等间质成份，由于酶的特异性，因此，目前采用的胶原酶消化法并不能完全降解细胞外的间质成份，也导致肿瘤组织中淋巴细胞不能尽可能多的充分获取。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种高活性的肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，用于解决现有技术中高活性的肿瘤浸润淋巴细胞制备手段繁琐、产率低的问题。上述制备方法中，在肿瘤浸润淋巴细胞消化液的制备过程中采用“综合酶消化法”消化组织或细胞富集物，“综合酶消化法”中的酶类包括胶原酶、DNA酶和透明质酶，这样的综合酶消化可以确保的单个细胞最佳获取率。上述制备方法可以用于临床肿瘤浸润淋巴细胞的制备，可以获得足够数量的淋巴细胞。
为实现上述目的及其他相关目的，
本发明提供一种高活性的肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、将经过胶原酶、DNA酶和透明质酶处理后的肿瘤浸润淋巴细胞消化液采用Hank's平衡盐溶液洗涤，再进行密度梯度离心，得到原代肿瘤浸润淋巴细胞；
步骤二、将原代肿瘤浸润淋巴细胞接种至完全RPMI培养基中扩增，得到一代肿瘤浸润淋巴细胞；
步骤三、将一代肿瘤浸润淋巴细胞接种至转瓶中继续培养，即得高活性的肿瘤浸润淋巴细胞；其中，所述转瓶中含有anti-CD3抗体、重组人IL-2蛋白和饲养细胞。
在肿瘤浸润淋巴细胞消化液的制备过程中采用“综合酶消化法”消化组织或细胞富集物，“综合酶消化法”中的酶类包括胶原酶、DNA酶和透明质酶，这样的综合酶消化可以确保的单个细胞最佳获取率，其中单个细胞来源为肿瘤组织消化或恶性肿瘤转移性浆膜腔积液。综合酶消化法中，加入DNA酶可以降低DNA形成的粘液丝对细胞的包裹；加入透明质酸酶可以减少粘多糖类对细胞消化物及细胞富集物中细胞数量的影响，降低粘稠度从而易于获得单个细胞，最终提高了淋巴细胞的获得率。
上述制备方法通过“综合酶消化法”提高自肿瘤组织或恶性肿瘤转移性浆膜腔积液中单个细胞的获得率，进而提高获得淋巴细胞的数量，从而可以最大限度地在体外培养TILs，即获得足够数量的TILs“种子”，以保证免疫治疗的进行。这种“综合酶消化法”较目前采用的技术，“综合酶消化法”的单个细胞及淋巴细胞的获得率明显提高，尽可能避免了在消化过程中的细胞丢失。这种制备方法中在淋巴细胞浸润少的病例中作用尤其明显，因为这些病例预后更差(无论化疗、放疗还是单克隆抗体技术获得的抗体免疫治疗中都较淋巴细胞浸润多的病例预后更差)。
RPMI 1640是Roswell Park Memorial Institute的缩写，RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号。
Hank's平衡盐溶液(Hank's Balanced Salt Solution，HBSS)。
上述制备方法可以用于临床肿瘤浸润淋巴细胞的制备，可以获得足够数量的淋巴细胞。
于本发明的一实施例中，所述胶原酶为胶原酶IV，所述DNA酶为DNA酶type 1，所述透明质酸酶为透明质酸酶V。
于本发明的一实施例中，所述肿瘤浸润淋巴细胞消化液的制备过程包括：将肿瘤组织切碎后移入含有胶原酶IV、DNA酶type 1和透明质酸酶V的无血清培养基中，在室温下消化处理6～24h，即得。
于本发明的一实施例中，所述无血清培养基为无血清的RPMI1640培养基。
于本发明的一实施例中，所述肿瘤浸润淋巴细胞消化液的制备过程包括：将恶性肿瘤转移性浆膜腔积液离心，向细胞富集物中加入胶原酶IV、DNA酶type 1和透明质酸酶V，室温处理0.5～2h，即得。
于本发明的一实施例中，所述恶性肿瘤转移性浆膜腔积液为胸腔积液、腹腔积液或心包腔积液。
于本发明的一实施例中，所述原代肿瘤浸润淋巴细胞的接种量为每孔(1.5～1.7)×106cells/ml；所述一代肿瘤浸润淋巴细胞的接种量为(1.5～1.7)×106cells/ml。
于本发明的一实施例中，所述原代肿瘤浸润淋巴细胞的接种量为每孔1.6×106cells/ml；所述一代肿瘤浸润淋巴细胞的接种量为1.6×106cells/ml。
于本发明的一实施例中，所述饲养细胞的制备过程为：将外周血单个核细胞经过60钴治疗机放疗10Gy，即得。
如上所述，本发明的一种高活性的肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，具有以下有益效果：
1、在肿瘤浸润淋巴细胞消化液的制备过程中采用“综合酶消化法”消化组织或细胞富集物，“综合酶消化法”中的酶类包括胶原酶、DNA酶和透明质酶，这样的综合酶消化可以确保的单个细胞最佳获取率，其中单个细胞来源为肿瘤组织消化或恶性肿瘤转移性浆膜腔积液。综合酶消化法中，加入DNA酶可以降低DNA形成的粘液丝对细胞的包裹；加入透明质酸酶可以减少粘多糖类对细胞消化物及细胞富集物中细胞数量的影响，降低粘稠度从而易于获得单个细胞，最终提高了淋巴细胞的获得率。
2、上述制备方法通过“综合酶消化法”提高自肿瘤组织或恶性肿瘤转移性浆膜腔积液中单个细胞的获得率，进而提高获得淋巴细胞的数量，从而可以最大限度地在体外培养TILs，即获得足够数量的TILs“种子”，以保证免疫治疗的进行。这种“综合酶消化法”较目前采用的技术，“综合酶消化法”的单个细胞及淋巴细胞的获得率明显提高，尽可能避免了在消化过程中的细胞丢失。这种制备方法中在淋巴细胞浸润少的病例中作用尤其明显，因为这些病例预后更差(无论化疗、放疗还是单克隆抗体技术获得的抗体免疫治疗中都较淋巴细胞浸润多的病例预后更差)。上述制备方法可以用于临床肿瘤浸润淋巴细胞的制备，可以获得足够数量的淋巴细胞。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
实施例1
一种高活性的肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，包括如下步骤：
S1、无菌操作收集恶性肿瘤转移性浆胸腔积液，置于100ml离心管中，置于4℃冰浴中；转入实验室离心，得到细胞富集物(不同的浆膜腔积液，处理方式相同)；
S2、向弃上清后的细胞富集物加入胶原酶IV 0.1wt％、DNA酶type 1 0.002wt％、透明质酸酶V 0.01wt％，室温处理60min得到消化液；
S3、将上述消化液全部置入培养皿中，轻轻搅拌并过滤，去除未消化的组织块后单个细胞以HBSS洗涤二次；
S4、将上述细胞进行密度梯度离心，洗涤后得到原代肿瘤浸润淋巴细胞；
S5、将原代肿瘤浸润淋巴细胞按每孔1.6×106cells/ml接种至完全RPMI 1640培养基，半量换液培养，得到一代肿瘤浸润淋巴细胞；其中，RPMI 1640培养基中人AB型血清(10wt％)、重组人IL-2蛋白(6000IU/ml)；
S6、将一代肿瘤浸润淋巴细胞接种按1.6×106cells/ml接种至转瓶中继续培养，即得高活性的肿瘤浸润淋巴细胞；其中，所述转瓶中含有anti-CD3抗体(30ng/ml)、重组人IL-2蛋白(6000IU/ml)和饲养细胞(将外周血单个核细胞经过60钴治疗机放疗10Gy，即得)。
S7、将制得的高活性的肿瘤浸润淋巴细胞剂取1ml转入离心管中留样，样品封口并贴好标签送QC检测，采用台盼蓝斥染试验(活细胞对台盼蓝是斥染的，只有死细胞才会被染成阳性)计数细胞活力，再进行无菌检测、内毒素检测、支原体检测；
S8、细胞计数以判断细胞数量；
S9、采用流式细胞分析技术对所收获细胞进行表型分析；
S10、按107cells/ml进行冻存，以备用；
S11、用注射器将细胞悬液转入转移袋中，热合封口、核对批号、贴好标签。
实施例1中获得的淋巴细胞(以CD3+细胞计)纯度在95％以上(验证方法为以抗-CD3+-FITC标记后进行流式细胞分析，流式数据证实)。CD8+细胞比例根据不同病人来源而异。
实施例2
一种高活性的肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，包括如下步骤：
S1、手术切除后的肺癌标本在术后2h内(组织离开机体的2h内)，浸于医用级生理盐水中，去除血凝块及坏死组织、纤维结缔组织，尽可能保留肿瘤组织，用锐利刀片切成1×1×1mm3；
S2、将切碎后的组织小块移入无血清的RPMI 1640培养基中(培养基中含胶原酶IV0.1％、DNA酶type 1 0.002％、透明质酸酶V 0.01％)，室温消化24h，得到消化液；
S3、将上述消化液全部置入培养皿中，轻轻搅拌并过滤，去除未消化的组织块后单个细胞以HBSS洗涤二次；
S4、将上述细胞进行密度梯度离心，洗涤后得到原代肿瘤浸润淋巴细胞；
S5、将原代肿瘤浸润淋巴细胞按每孔1.6×106cells/ml接种至完全RPMI 1640培养基，半量换液培养，得到一代肿瘤浸润淋巴细胞；其中，RPMI 1640培养基中人AB型血清(10wt％)、重组人IL-2蛋白(6000IU/ml)；
S6、将一代肿瘤浸润淋巴细胞接种按1.6×106cells/ml接种至转瓶中继续培养，即得高活性的肿瘤浸润淋巴细胞；其中，所述转瓶中含有anti-CD3抗体(30ng/ml)、重组人IL-2蛋白(6000IU/ml)和饲养细胞(将外周血单个核细胞经过60钴治疗机放疗10Gy，即得)。
S7、将制得的高活性的肿瘤浸润淋巴细胞剂取1ml转入离心管中留样，样品封口并贴好标签送QC检测，采用台盼蓝斥染试验(活细胞对台盼蓝是斥染的，只有死细胞才会被染成阳性)计数细胞活力，再进行无菌检测、内毒素检测、支原体检测；
S8、细胞计数以判断细胞数量；
S9、采用流式细胞分析技术对所收获细胞进行表型分析；
S10、按107cells/ml进行冻存，以备用；
S11、用注射器将细胞悬液转入转移袋中，热合封口、核对批号、贴好标签。
实施例2中利用肺癌组织获得的淋巴细胞(以CD3+细胞计)纯度在88％以上(验证方法为以抗-CD3+-FITC标记后进行流式细胞分析，流式数据证实)。CD8+细胞比例根据不同病人来源而异。
综上所述，本发明在肿瘤浸润淋巴细胞消化液的制备过程中采用“综合酶消化法”消化组织或细胞富集物，“综合酶消化法”中的酶类包括胶原酶、DNA酶和透明质酶，这样的综合酶消化可以确保的单个细胞最佳获取率，最终提高了淋巴细胞的获得率。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (9)
1.一种高活性的肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、将经过胶原酶、DNA酶和透明质酶处理后的肿瘤浸润淋巴细胞消化液采用Hank's平衡盐溶液洗涤，再进行密度梯度离心，得到原代肿瘤浸润淋巴细胞；
步骤二、将原代肿瘤浸润淋巴细胞接种至完全RPMI培养基中扩增，得到一代肿瘤浸润淋巴细胞；
步骤三、将一代肿瘤浸润淋巴细胞接种至转瓶中继续培养，即得高活性的肿瘤浸润淋巴细胞；其中，所述转瓶中含有anti-CD3抗体、重组人IL-2蛋白和饲养细胞。
2.根据权利要求1所述的一种高活性的肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于：所述胶原酶为胶原酶IV，所述DNA酶为DNA酶type 1，所述透明质酸酶为透明质酸酶V。
3.根据权利要求2所述的一种高活性的肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于：所述肿瘤浸润淋巴细胞消化液的制备过程包括：将肿瘤组织切碎后移入含有胶原酶IV、DNA酶type 1和透明质酸酶V的无血清培养基中，在室温下消化处理6～24h，即得。
4.根据权利要求3所述的一种高活性的肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于：所述无血清培养基为无血清的RPMI1640培养基。
5.根据权利要求2所述的一种高活性的肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于：所述肿瘤浸润淋巴细胞消化液的制备过程包括：将恶性肿瘤转移性浆膜腔积液离心，向细胞富集物中加入胶原酶IV、DNA酶type 1和透明质酸酶V，室温处理0.5～2h，即得。
6.根据权利要求5所述的一种高活性的肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于：所述恶性肿瘤转移性浆膜腔积液为胸腔积液、腹腔积液或心包腔积液。
7.根据权利要求1～6任一项所述的一种高活性的肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于：所述原代肿瘤浸润淋巴细胞的接种量为每孔(1.5～1.7)×106cells/ml；所述一代肿瘤浸润淋巴细胞的接种量为(1.5～1.7)×106cells/ml。
8.根据权利要求7所述的一种高活性的肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于：所述原代肿瘤浸润淋巴细胞的接种量为每孔1.6×106cells/ml；所述一代肿瘤浸润淋巴细胞的接种量为1.6×106cells/ml。
9.根据权利要求1～6任一项所述的一种高活性的肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于：所述饲养细胞的制备过程为：将外周血单个核细胞经过60钴治疗机放疗10Gy，即得。
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