CN109394785A - 一种nk细胞预防黑色素瘤发生的实验方法 - Google Patents

一种nk细胞预防黑色素瘤发生的实验方法 Download PDF

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马洁
赵刚
许蕊
詹举明
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Abstract

本发明涉及一种NK细胞预防黑色素瘤发生的实验方法，涉及免疫细胞及肿瘤细胞种类的选择；NK细胞用途是预防黑色素瘤；NK细胞给药方式和剂量；为了更好的说明NK细胞能够增强小鼠免疫力、提高小鼠体内免疫细胞活力，本发明选择NK细胞停止后1周皮下植入肿瘤细胞，每只2×106cells左右。采用提前回输NK细胞，从而起到预防黑色素瘤发生的方法，最大限度的利用了NK细胞杀伤肿瘤和提高激发自身免疫力的生物特性，从而预防肿瘤的发生，有利于其在后期研究和临床应用中发挥更明显稳定的作用。本发明步骤简单，效果突出，对NK细胞预防癌症临床前研究具有一定意义。

Description

一种NK细胞预防黑色素瘤发生的实验方法
技术领域
本发明属于细胞学、免疫学领域，主要应用于动物实验研究NK细胞预防黑色素瘤发生的效果。尤其是一种NK细胞预防黑色素瘤发生的实验方法。
背景技术
自然杀伤细胞(Nature killer cell)，也称NK细胞，是一类CD56+、CD3-的淋巴细胞，既是重要的外向性自然防御细胞，又是体内多种免疫细胞的调节细胞，具有杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的能力，在机体固有免疫及过继免疫治疗中发挥着重要作用。大多数临床研究所采用的是从癌症患者的外周血中分离得到CD56+、CD3-的NK细胞，而后进行体外扩大培养，随后再回输到患者体内，但是由于大部分患者本身的NK细胞就是缺陷的，所以临床免疫治疗效果并不理想。本发明专利转换了思路，利用健康人外周血分离NK细胞并体外扩增培养，并回输到体内，适用亚健康或者有家族癌症遗传史的人群，此方法可以通过回输NK细胞激活机体的体液免疫和细胞免疫功能，使T淋巴细胞的数量活性增多、加强，并使细胞免疫也进入活跃状态，增强对肿瘤细胞的杀伤作用，增强机体抗肿瘤活性，起到改善亚健康、预防癌症的效果。本发明选择黑色素瘤作为恶性肿瘤的代表，黑色素瘤是一种恶性程度较高，容易出现转移不易治愈，而每个人都可能出现黑色素沉淀，都存在癌变的风险，现阶段使用NK细胞预防肿瘤的实验不多，这是技术领域内的一项空白，所以NK细胞预防黑色素瘤是一项有意义的研究。
发明内容
本发明的目的在于探究NK细胞抗肿瘤效果的不足，采用提前回输NK细胞，从而起到预防黑色素瘤发生的方法，最大限度的利用了NK细胞杀伤肿瘤和提高激发自身免疫力的生物特性，从而预防肿瘤的发生，有利于其在后期研究和临床应用中发挥更明显稳定的作用。本发明步骤简单，效果突出，对NK细胞预防癌症临床前研究具有一定意义。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种NK细胞预防BALB/C裸鼠黑色素瘤发生的实验方法，步骤如下：
⑴选择4周龄，体重在14-16g的BALB/C裸鼠16只，并随机将其分成生理盐水组和NK组，每组8只；
⑵从健康人外周血中分离单个核细胞，并使用细胞因子IL-1530-60ng/mL、IL-21000-3000U/mL、抗CD16单抗30-60ng/mL、抗CD3单抗1-10ng/mL诱导成NK细胞，扩增培养；
⑶根据组别对小鼠尾静脉回输生理盐水和NK细胞，每周连续3天，连续两周，回输体积为每天0.2ml,NK细胞量为每天1-2×106cells；
⑷回输停止后1周，BALB/C裸鼠右腋皮下移植稳定表达RFP+Luciferse的黑色素瘤细胞，每只1-3×106cells；
⑸每周通过小动物活体成像系统监测BALB/C裸鼠肿瘤生长情况，并每周使用游标卡尺测量肿瘤大小计算体积，肿瘤体积＝长径×短径2/2,；
⑹黑色素瘤细胞在BALB/C裸鼠体内生长21天后对其进行取材，对瘤体称重比较，对脾脏上清进行ELISA检测IL-2、IL-6、TNF-α炎性因子浓度。
而且，黑色素瘤细胞为A375细胞。
本发明的优点和积极效果是：
1.本发明中NK组BALB/C裸鼠免疫力较强，成瘤较慢，与生理盐水组存在显著性差异(P≤0.01)。
2.本发明中NK组BALB/C裸鼠成瘤率较低，肿瘤较小，与生理盐水组存在显著性差异(P≤0.01)，
3.本发明中NK组BALB/C裸鼠中促进肿瘤生长因子IL-6浓度较低，抑制肿瘤生长因子IL-2、TNF-α较高，均与生理盐水组存在显著性差异(P≤0.01)。
附图说明
图1为本发明NK细胞回输前表型。
图2为本发明BALB/C裸鼠每周活体成像照片。
图3为本发明BALB/C裸鼠每周活体成像肿瘤荧光值变化。
图4为本发明BALB/C裸鼠每周肿瘤体积变化。
图5为本发明BALB/C裸鼠肿瘤重量。
图6为本发明BALB/C裸鼠炎性因子浓度。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明在实验方法中做了以下创新：
1.免疫细胞及肿瘤细胞种类的选择；
2.NK细胞用途是预防黑色素瘤；
3.NK细胞给药方式和剂量；
4.为了更好的说明NK细胞能够增强小鼠免疫力、提高小鼠体内免疫细胞活力，本发明选择NK细胞停止后1周皮下植入肿瘤细胞，每只2×106cells左右。
具体过程描述如下：
一种NK细胞预防BALB/C裸鼠黑色素瘤发生的实验方法，该方法由下列步骤组成：
⑴选择4周龄，体重在14-16g的BALB/C裸鼠16只，并随机将其分成生理盐水组和NK组，每组8只；
⑵从健康人外周血中分离单个核细胞，并使用细胞因子IL-1530-60ng/mL、IL-21000-3000U/mL、抗CD16单抗30-60ng/mL、抗CD3单抗1-10ng/mL诱导成NK细胞，扩增培养；
⑶根据组别对小鼠尾静脉回输生理盐水和NK细胞，每周连续3天，连续两周，回输体积为每天0.2ml,NK细胞量为每天1-2×106cells；
⑷回输停止后1周，BALB/C裸鼠右腋皮下移植稳定表达RFP+Luciferse的黑色素瘤细胞(A375细胞)，每只2×106cells左右；
⑸每周通过小动物活体成像系统监测BALB/C裸鼠肿瘤生长情况，并每周使用游标卡尺测量肿瘤大小计算体积(肿瘤体积＝长径×短径2/2)；
⑹黑色素瘤细胞在BALB/C裸鼠体内生长21天后对其进行取材，对瘤体称重比较，对脾脏上清进行ELISA检测IL-2、IL-6、TNF-α炎性因子浓度。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例和附图，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

Claims (5)

1.一种NK细胞预防BALB/C裸鼠黑色素瘤发生的实验方法，其特征在于：步骤如下：
⑴选择4周龄，体重在14-16g的BALB/C裸鼠16只，并随机将其分成生理盐水组和NK组，每组8只；
⑵从健康人外周血中分离单个核细胞，并使用细胞因子IL-1530-60ng/mL、IL-21000-3000U/mL、抗CD16单抗30-60ng/mL、抗CD3单抗1-10ng/mL诱导成NK细胞，扩增培养；
⑶根据组别对小鼠尾静脉回输生理盐水和NK细胞，每周连续3天，连续两周，回输体积为每天0.2ml,NK细胞量为每天1-2×106cells；
⑷回输停止后1周，BALB/C裸鼠右腋皮下移植稳定表达RFP+Luciferse的黑色素瘤细胞，每只1-3×106cells；
⑸每周通过小动物活体成像系统监测BALB/C裸鼠肿瘤生长情况，并每周使用游标卡尺测量肿瘤大小计算体积，肿瘤体积＝长径×短径2/2,；
⑹黑色素瘤细胞在BALB/C裸鼠体内生长21天后对其进行取材，对瘤体称重比较，对脾脏上清进行ELISA检测IL-2、IL-6、TNF-α炎性因子浓度。
2.根据权利要求1所述的NK细胞预防BALB/C裸鼠黑色素瘤发生的实验方法，其特征在于：黑色素瘤细胞为A375细胞。
3.根据权利要求1所述的NK细胞预防BALB/C裸鼠黑色素瘤发生的实验方法，其特征在于：所述NK组BALB/C裸鼠免疫力较强，成瘤较慢，与生理盐水组存在显著性差异(P≤0.01)。
4.根据权利要求1所述的NK细胞预防BALB/C裸鼠黑色素瘤发生的实验方法，其特征在于：NK组BALB/C裸鼠成瘤率较低，肿瘤较小，与生理盐水组存在显著性差异(P≤0.01)。
5.根据权利要求1所述的NK细胞预防BALB/C裸鼠黑色素瘤发生的实验方法，其特征在于：NK组BALB/C裸鼠中促进肿瘤生长因子IL-6浓度较低，抑制肿瘤生长因子IL-2、TNF-α较高，均与生理盐水组存在显著性差异(P≤0.01)。
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