CN115786254B

CN115786254B - 一种促进体外培养细胞生成外泌体的培养基及其诱导方法

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Publication number: CN115786254B
Application number: CN202211516071.8A
Authority: CN
Inventors: 李健; 薛珂; 冯婉怡; 丰玫玫; 王利群; 杨宗繁; 邓智敏; 曾胜
Original assignee: Hainan Susheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hainan Susheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-11-30
Filing date: 2022-11-30
Publication date: 2023-09-29
Anticipated expiration: 2042-11-30
Also published as: CN115786254A

Abstract

本发明提出了一种促进体外培养细胞生成外泌体的培养基及其诱导方法，每L培养基包括如下重量的组分：L‑天冬酰胺7‑8mg、L‑谷氨酰胺360‑370mg、D‑葡萄糖900‑1100mg、次黄嘌呤钠1.5‑3mg、亚油酸0.03‑0.05mg、硫辛酸0.05‑0.15mg、生物素0.003‑0.004mg、氯化胆碱8‑10mg、烟酰胺1.5‑2.5mg、盐酸吡哆醇1.5‑2.5mg、腐胺0.07‑0.09mg、丙酮酸钠50‑60mg、胸腺嘧啶0.3‑0.5mg、碳酸氢钠2300‑2500mg、磷酸氢二钠65‑75mg、磷酸二氢钠57‑67mg、氯化物7400‑7600mg、硫酸盐45‑55mg、硝酸铁0.04‑0.06mg、复合维生素15‑25mg、复合氨基酸1000‑1200mg。本发明获得的体外培养细胞生成外泌体的培养基，可用于培育骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞或羊膜间充质干细胞，促进其外泌体的生成，获得的外泌体数量为2.0‑3.3×10¹⁰，对人脐静脉内皮细胞的细胞活力达到83‑88％。

Description

一种促进体外培养细胞生成外泌体的培养基及其诱导方法

技术领域

本发明涉及外泌体培养领域，特别涉及一种促进体外培养细胞生成外泌体的培养基及其诱导方法。

背景技术

正常细胞体外培养，所分泌的外泌体含量很少，提高细胞分泌外泌体的数量，对于后期进行外泌体的研究十分必要。

外泌体一词的首次提出来源于1983年美国the Johnstone and StahlLaboratories（约翰斯通实验室）发表的文章上，其后，随着电子显微镜的应用，人们对外泌体的功能和结构越来越清晰。外泌体是细胞间通讯的主要形式之一，并且来源不同的外泌体，所包含的物质也不相同，所表达的功效也不一样，例如来源于间充质干细胞的外泌体主要功效是消炎、修复；来源于免疫细胞的外泌体主要功效是介导杀伤细胞和刺激免疫应答。此外，外泌体对于疾病的治疗可能也会有意想不到的作用，由于有些药物经传统给药途径对于靶细胞的作用微乎其微，所以现在已经有学者把外泌体包裹药物对疾病进行治疗，经过设计之后外泌体包裹药物能够准确的给细胞输送进我们想要它吸收的药物，从而使药物的疗效达到最大化。

现有技术大部分都是外泌体应用和收集，对于促进细胞生成外泌体的研究较少，其中有使用电刺激促进细胞分泌外泌体的，有使用生长因子促进细胞分泌外泌体的，这些都有可能会使得细胞受到损伤或者残留有相应的生长因子，使得研究者不好判断出外泌体的准确效果。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提出一种促进体外培养细胞生成外泌体的培养基及其诱导方法，提高细胞分泌外泌体的能力。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种促进体外培养细胞生成外泌体的培养基，每L培养基包括如下重量的组分：L-天冬酰胺7-8mg、L-谷氨酰胺360-370mg、D-葡萄糖900-1100mg、次黄嘌呤钠1.5-3mg、亚油酸0.03-0.05mg、硫辛酸0.05-0.15mg、生物素0.003-0.004mg、氯化胆碱8-10mg、烟酰胺1.5-2.5mg、盐酸吡哆醇1.5-2.5mg、腐胺0.07-0.09mg、丙酮酸钠50-60mg、胸腺嘧啶0.3-0.5mg、碳酸氢钠2300-2500mg、磷酸氢二钠65-75mg、磷酸二氢钠57-67mg、氯化物7400-7600mg、硫酸盐45-55mg、硝酸铁0.04-0.06mg、复合维生素15-25mg、复合氨基酸1000-1200mg；

所述氯化物为氯化钙、氯化镁、氯化钾和氯化钠；

所述硫酸盐为硫酸铜、硫酸铁和硫酸镁；

复合氨基酸为氨基酸盐酸盐、甘氨酸、L-丙氨酸、天冬氨酸、L-谷氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸和L-缬氨酸；

所述复合维生素为核黄素、d-泛酸钙、叶酸、盐酸硫胺素、肌醇和维生素B12。

进一步的，所述每L培养基包括如下重量的组分：L-天冬酰胺7.5mg、L-谷氨酰胺365mg、D-葡萄糖1000mg、次黄嘌呤钠2.4mg、亚油酸0.04mg、硫辛酸0.1mg、生物素0.0035mg、氯化胆碱9mg、烟酰胺2mg、盐酸吡哆醇2.0mg、腐胺0.08mg、丙酮酸钠55mg、胸腺嘧啶0.365mg、碳酸氢钠2438mg、磷酸氢二钠71mg、磷酸二氢钠62.5mg、氯化物7568mg、硫酸盐49mg、硝酸铁0.05mg、复合维生素21mg、复合氨基酸1110mg。

更进一步的，所述氯化钙、氯化镁、氯化钾和氯化钠的质量比为232：28-30：310-312：6995-7000；

所述硫酸铜、硫酸铁和硫酸镁的质量比为0.0013：0.415-0.420：48-49；

所述氨基酸盐酸盐、甘氨酸、L-丙氨酸、天冬氨酸、L-谷氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸和缬氨酸的质量比为373-375：18-19：4-5：6-7：7-8：54-55：59-60：17-18：35-36：17-18：26-27：53-54：9-10：52-53；

所述核黄素、d-泛酸钙、叶酸、盐酸硫胺素、肌醇和维生素B12的质量比为0.21-0.22：2.2-2.3：2.6-2.7：2.1-2.2：12-13：0.6-0.7。

更进一步的，所述氨基酸盐酸盐为L-精氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-胱氨酸二盐酸盐、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐和L-酪氨酸二钠盐二水合物；所述L-精氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-胱氨酸二盐酸盐、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐和L-酪氨酸二钠盐二水合物的质量比为147-148：17-18：31-32：31-32：91-92：55-56。

进一步的，还包括糖胺聚糖和齐墩果酸；每L所述培养基添加糖胺聚糖80-90mg和齐墩果酸60-65mg。

更进一步的，每L所述培养基添加糖胺聚糖86mg和齐墩果酸63mg。

本发明还提供一种上述的培养基用于体外培养细胞的诱导方法，包括如下步骤：

S1：取P3-P4代培养的细胞，待细胞融合度80%-90%时，换用上述的培养基，培养2-6d，收集培养上清液，过滤，得培养液；

S2：将培养液加入上述的培养基，培养1-2d，进行刺激培养2-3d后，梯度离心，收集外泌体，得外泌体。

进一步的，所述培养2-6d的培养条件为：CO₂体积浓度4.5-5.5%、O₂体积浓度1-3%和余下体积浓度的N₂；所述培养1-2d的培养条件为：CO₂体积浓度4.5-5.5%、O₂体积浓度4-5%和余下体积浓度的N₂；所述刺激培养2-3d的培养条件为：CO₂体积浓度4.5-5.5%和余下体积浓度的N₂。

进一步的，所述刺激培养为在细胞培养过程中进行重复磁刺激；所述重复磁刺激的条件为：频率12-13 Hz、最大输出强度30-32%、脉冲200-300个/12-16h。

进一步的，所述梯度离心为：10000-12000g离心10-15min，取上清液，过滤，100000-110000g离心90-100min。

本发明为了提高细胞分泌外泌体的能力，采用多种刺激方法对细胞进行诱导，以保证细胞分泌外泌体的量。

Ga²⁺作为细胞内信号转导的第二信使，高浓度的Ga²⁺刺激会使得细胞内的外泌体进入活化状态，从而使细胞释放尽可能多的外泌体，减少外泌体在细胞内的降解；低糖环境可进一步促使细胞分泌外泌体。

同时，本发明通过三气培养箱调节三种气体培养环境，并逐步调控细胞培养的低氧环境，同时结合重复磁刺激，有助于分步刺激细胞，保持外泌体的生物活性。

本发明发现糖胺聚糖和齐墩果酸有助于增强外泌体的生物活性，获得的外泌体可促进共培养细胞的成熟、增殖等作用，有效预防细胞氧化应激，减轻细胞损伤，提高对细胞的保护活性，提高外泌体的作用效果和应用领域。

本发明使用对细胞危害最小的组合刺激诱导方法，以期能够提高细胞分泌外泌体的量，并维持外泌体的生物活性。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明通过科学选用L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、D-葡萄糖、次黄嘌呤钠、亚油酸、硫辛酸、生物素、氯化胆碱、烟酰胺、盐酸吡哆醇、腐胺、丙酮酸钠、胸腺嘧啶、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化物、硫酸盐、硝酸铁、复合维生素和复合氨基酸，组成体外培养细胞生成外泌体的培养基，可用于培育骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞或羊膜间充质干细胞，促进其外泌体的生成，获得的外泌体数量为2.0-3.3×10¹⁰，对人脐静脉内皮细胞的细胞活力达到83-88%。

本发明通过添加因子、逐步调控细胞培养的低氧环境、结合重复磁刺激，使用对细胞危害最小的组合刺激诱导方法，进行多种刺激，可对骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞或羊膜间充质干细胞进行诱导，提高其分泌外泌体的量，并维持外泌体的生物活性。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种促进体外培养细胞生成外泌体的培养基，配方如下表1：

表1 体外培养细胞生成外泌体的培养基配方

促进体外培养细胞生成外泌体的诱导方法，包括如下步骤：

S1：取脐带间充质干细胞P4代细胞，待细胞融合度达到80%时，换用上述配方1的培养基（培养基加入2%的血清替代物），培养4d，调节三气培养箱的气体条件为：CO₂体积浓度5%、O₂体积浓度1%和N₂体积浓度94%，培养后收集培养上清液，用0.22μm过滤器进行过滤，得培养液；

S2：将收获的培养液加入至新的上述配方1的培养基，培养2d，调节三气培养箱的气体条件为：CO₂体积浓度5%、O₂体积浓度5%和N₂体积浓度90%，调节重复磁刺激的频率12-13Hz、最大输出强度30-32%、脉冲200-300个/12-16h，对培养液进行刺激培养2d，刺激培养的三气培养箱的气体条件为：CO₂体积浓度5%、O₂体积浓度0%和N₂体积浓度95%，10000g、4℃离心10min，取上清液，用0.22μm过滤器进行过滤，100000g、4℃离心90min，沉淀即为外泌体，收集外泌体，得外泌体。

实施例2

一种促进体外培养细胞生成外泌体的培养基，配方如下表2：

表2 体外培养细胞生成外泌体的培养基配方

促进体外培养细胞生成外泌体的诱导方法，包括如下步骤：

S1：取骨髓间充质干细胞P4代细胞，待细胞融合度达到90%时，换用上述配方2的培养基（培养基加入2%的血清替代物），培养4d，调节三气培养箱的气体条件为：CO₂体积浓度5%、O₂体积浓度3%和N₂体积浓度92%，培养后收集培养上清液，用0.22μm过滤器进行过滤，得培养液；

S2：将收获的培养液加入至新的上述配方2的培养基，培养2d，调节三气培养箱的气体条件为：CO₂体积浓度5%、O₂体积浓度4%和N₂体积浓度91%，调节重复磁刺激的频率12-13Hz、最大输出强度30-32%、脉冲200-300个/12-16h，对培养液进行刺激培养3d，刺激培养的三气培养箱的气体条件为：CO₂体积浓度5%、O₂体积浓度0%和N₂体积浓度95%，10000g、4℃离心15min，取上清液，用0.22μm过滤器进行过滤，100000g、4℃离心100min，沉淀即为外泌体，收集外泌体，得外泌体。

实施例3

一种促进体外培养细胞生成外泌体的培养基，配方如下表3：

表3 体外培养细胞生成外泌体的培养基配方

促进体外培养细胞生成外泌体的诱导方法，包括如下步骤：

S1：取脐带间充质干细胞P3代细胞，待细胞融合度达到90%时，换用上述配方3的培养基（培养基加入5%的血清替代物），培养6d，调节三气培养箱的气体条件为：CO₂体积浓度5%、O₂体积浓度2%和N₂体积浓度93%，培养后收集培养上清液，用0.22μm过滤器进行过滤，得培养液；

S2：将收获的培养液加入至新的上述配方3的培养基，培养1d，调节三气培养箱的气体条件为：CO₂体积浓度5%、O₂体积浓度5%和N₂体积浓度90%，调节重复磁刺激的频率12-13Hz、最大输出强度30-32%、脉冲200-300个/12-16h，对培养液进行刺激培养3d，刺激培养的三气培养箱的气体条件为：CO₂体积浓度5%、O₂体积浓度0%和N₂体积浓度95%，10000g、4℃离心10min，取上清液，用0.22μm过滤器进行过滤，100000g、4℃离心90min，沉淀即为外泌体，收集外泌体，得外泌体。

实施例4

一种促进体外培养细胞生成外泌体的培养基，配方如下表4：

表4 体外培养细胞生成外泌体的培养基配方

促进体外培养细胞生成外泌体的诱导方法，包括如下步骤：

S1：取脐带间充质干细胞P4代细胞，待细胞融合度达到80%时，换用上述配方4的培养基（培养基加入2%的血清替代物），培养4d，调节三气培养箱的气体条件为：CO₂体积浓度5%、O₂体积浓度1%和N₂体积浓度94%，培养后收集培养上清液，用0.22μm过滤器进行过滤，得培养液；

S2：将收获的培养液加入至新的上述配方4的培养基，培养2d，调节三气培养箱的气体条件为：CO₂体积浓度5%、O₂体积浓度5%和N₂体积浓度90%，调节重复磁刺激的频率12-13Hz、最大输出强度30-32%、脉冲200-300个/12-16h，对培养液进行刺激培养2d，刺激培养的三气培养箱的气体条件为：CO₂体积浓度5%、O₂体积浓度0%和N₂体积浓度95%，10000g、4℃离心10min，取上清液，用0.22μm过滤器进行过滤，100000g、4℃离心90min，沉淀即为外泌体，收集外泌体，得外泌体。

实施例5

促进体外培养细胞生成外泌体的诱导方法，步骤如下：

取脐带间充质干细胞P4代细胞，待细胞融合度达到80%时，换用实施例4相同配方的培养基（培养基加入2%的血清替代物），培养4d，调节三气培养箱的气体条件为：CO₂体积浓度5%、O₂体积浓度1%和N₂体积浓度94%，培养后收集培养上清液，10000g、4℃离心10min，用0.22μm过滤器进行过滤，100000g、4℃离心90min，沉淀即为外泌体，收集外泌体，得外泌体。

对比例1

根据实施例4相同的诱导方法，培养基成分不同，配方如下表5：

表5 体外培养细胞生成外泌体的培养基配方

统计上述外泌体数量，采用CCK-8实验测定上述外泌体对内皮细胞活力的作用，人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购自中国医学科学院细胞库。将内皮细胞置于内皮细胞培养基中，于气体调节培养箱中进行细胞复苏和传代，按细胞密度1×10⁴个/孔，将内皮细胞接种至96孔培养板，37℃、CO₂体积浓度5%培养至细胞贴壁生长，继续培养8h后，更换内皮细胞基础培养基，继续培养12h，将外泌体（浓度均为100 μg/mL）加入至内皮细胞中，继续培养1d或3d，培养结束，每孔加入CCK-8溶液10 μL，孵育1h，培养阶段和孵育条件均为37℃、5%CO₂，于波长450nm处测定吸光度值，细胞活力=(A ₁-A ₀)/(CK-A ₀)，式中，A ₁、CK分别为实验组、对照组（等体积PBS）的吸光度值，A ₀为不含细胞的培养基的吸光度值，结果如下表6。

表6 外泌体数量和对内皮细胞活力的结果

注：“-”表示未进行该实验。

由上表6看出，本发明通过科学调配体外培养细胞生成外泌体的培养基组分，获得的外泌体数量为2.0-3.3×10¹⁰，对人脐静脉内皮细胞的细胞活力达到83-88%。

实施例4与实施例1-3相比，糖胺聚糖和齐墩果酸有助于增强外泌体的生物活性，获得的外泌体可促进共培养细胞的成熟、增殖等作用，有效预防细胞氧化应激，减轻细胞损伤，提高对细胞的保护活性。

实施例4与实施例5相比，通过三气培养箱调节三种气体培养环境，并逐步调控细胞培养的低氧环境，同时结合重复磁刺激，有助于分步刺激细胞，保持外泌体的生物活性。

实施例4与对比例1相比，通过选用氯化钾、氯化钙和硫酸镁等物质，能够使得细胞内的外泌体进入活化状态，促进细胞释放外泌体，并减少外泌体在细胞内的降解。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种促进体外培养细胞生成外泌体的培养基，其特征在于，每L培养基包括如下重量的组分：L-天冬酰胺7-8mg、L-谷氨酰胺360-370mg、D-葡萄糖900-1100mg、次黄嘌呤钠1.5-3mg、亚油酸0.03-0.05mg、硫辛酸0.05-0.15mg、生物素0.003-0.004mg、氯化胆碱8-10mg、烟酰胺1.5-2.5mg、盐酸吡哆醇1.5-2.5mg、腐胺0.07-0.09mg、丙酮酸钠50-60mg、胸腺嘧啶0.3-0.5mg、碳酸氢钠2300-2500mg、磷酸氢二钠65-75mg、磷酸二氢钠57-67mg、苯酚红7-9mg、氯化物7400-7600mg、硫酸盐45-55mg、硝酸铁0.04-0.06mg、复合维生素15-25mg、复合氨基酸1000-1200mg、糖胺聚糖80-90mg和齐墩果酸60-65mg；

所述氯化物为氯化钙、氯化镁、氯化钾和氯化钠；所述氯化钙、氯化镁、氯化钾和氯化钠的质量比为232：28-30：310-312：6995-7000；

所述硫酸盐为硫酸铜、硫酸铁和硫酸镁；所述硫酸铜、硫酸铁和硫酸镁的质量比为0.0013：0.415-0.420：48-49；

复合氨基酸为氨基酸盐酸盐、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸和缬氨酸；所述氨基酸盐酸盐、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸和L-缬氨酸的质量比为373-375：18-19：4-5：6-7：7-8：54-55：59-60：17-18：35-36：17-18：26-27：53-54：9-10：52-53；

所述氨基酸盐酸盐为L-精氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-胱氨酸二盐酸盐、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐和L-酪氨酸二钠盐二水合物；所述L-精氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-胱氨酸二盐酸盐、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐和L-酪氨酸二钠盐二水合物的质量比为147-148：17-18：31-32：31-32：91-92：55-56；

所述复合维生素为核黄素、d-泛酸钙、叶酸、盐酸硫胺素、肌醇和维生素B₁₂；所述核黄素、d-泛酸钙、叶酸、盐酸硫胺素、肌醇和维生素B₁₂的质量比为0.21-0.22：2.2-2.3：2.6-2.7：2.1-2.2：12-13：0.6-0.7；

所述的培养基用于体外培养细胞的诱导方法，包括如下步骤：

S1：取P3-P4代培养的脐带间充质干细胞或骨髓间充质干细胞，待细胞融合度80%-90%时，换用所述的培养基，培养2-6d，收集培养上清液，过滤，得培养液；

所述培养2-6d的培养条件为：CO₂体积浓度4.5-5.5%、O₂体积浓度1-3%和余下体积浓度的N₂；

S2：将培养液加入至所述的培养基，培养1-2d，进行刺激培养2-3d后，梯度离心，收集外泌体，得外泌体；

所述培养1-2d的培养条件为：CO₂体积浓度4.5-5.5%、O₂体积浓度4-5%和余下体积浓度的N₂；所述刺激培养2-3d的培养条件为：CO₂体积浓度4.5-5.5%和余下体积浓度的N₂；

所述刺激培养为在细胞培养过程中进行重复磁刺激；所述重复磁刺激的条件为：频率12-13 Hz、最大输出强度30-32%、脉冲200-300个/12-16h。

2.根据权利要求1的一种促进体外培养细胞生成外泌体的培养基，其特征在于，每L所述培养基添加糖胺聚糖86mg和齐墩果酸63mg。

3.根据权利要求1的一种促进体外培养细胞生成外泌体的培养基，其特征在于，所述梯度离心为：10000-12000g离心10-15min，取上清液，过滤，100000-110000g离心90-100min。