CN107254440A - Cd4阳性th17t细胞培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种TH17T细胞的培养方法，旨在通过TH17T细胞代替临床现有的CD8T细胞，TH17T细胞相比CD8T细胞而言，在不进行二次刺激的情况下，在体外能够活跃的增值长达21天，产生5000倍数量的T细胞以供使用。从而确保了数量充足。另外，TH17细胞的干细胞特性使其能够具有较强的抗衰老特性，在体外经历两周的增值之后还保留较强的清楚体内肿瘤的能力，极大地提高了临床效果。

Description

CD4阳性TH17T细胞培养方法
技术领域
本发明应用于细胞及细胞治疗领域，具体涉及一种细胞的培养方法，尤其涉及一种CD4阳性TH17T细胞培养方法。
背景技术
免疫治疗为肿瘤治疗提供了一种有吸引力的疗法，其优势是在增强或重建患者的抗肿瘤免疫的同时副作用较小。目前已有两种主要策略被用于刺激抗肿瘤免疫。包括肿瘤治疗性疫苗和过继性细胞治疗（adoptive cell therapy ACT）.其中过继性细胞治疗主要是指向荷瘤宿主体内回输自体或异体免疫细胞，如以肿瘤反应性T细胞为主要成分的CTL（cytotoxic T lymphocyte）细胞,肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor-infiltratinglymphocyte,TIL）等。肿瘤反应性CTL细胞回输已被成功应用于黑色素瘤，EB病毒诱导淋巴瘤等肿瘤的临床治疗。现有技术的ACT通常采用CD8T细胞来作为靶细胞转入ACT。
然而目前将过继性细胞治疗广泛应用于大多数非病毒相关实体瘤中还存在不少问题亟待解决，包括：1）如何获得充分数量的肿瘤反应性T细胞是决定过继性细胞治疗效果的最关键因素。2）目前回输的免疫细胞尤其是克隆化CD8T细胞在体外培养的过程中会不断失去杀瘤活性，14天以后杀瘤活性就所剩无几了，极大的影响了过继性细胞治疗的临床疗效。
因为，实有必要提供一种新的细胞培养方法替代现有技术中的T细胞以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种T细胞培养方法，尤其涉及一种CD4阳性TH17T细胞培养方法，以替代现有技术和临床应用中CD8T细胞，以解决现有技术产量不足，杀瘤活性不足的问题。
本发明提供了一种T细胞培养方法，该方法包括如下步骤：
分离、纯化：提供外周血，并从外周血中分离并纯化得到CD4+T细胞；
刺激、生成：采用CD3、CD28或ICOS中的任意一种或多种包被的磁珠刺激所述CD4+T细胞产生TH17T细胞；
扩增、培养：将TH17T细胞接种到培养基中，加入细胞因子刺激扩增TH17T细胞扩增，并持续添加TGF-β，所述细胞因子采用rhIL-1β，rhIL-6，rhIL23，anti-hIL-4，anti-hIFN-γ中的任意一种或多种。
优选的，所述T细胞的分离、纯化过程包括：
从外周血中分离得到单个核细胞，将细胞重悬在PBS中，并调整细胞浓度；
取一定量细胞至聚苯乙烯中，加入正常的人血白蛋白；
加入分离试剂混匀后室温孵育；
通过PBS调节总体积，通过反复吹打混匀提取溶液并重复多次进行提纯；
离心收集上清液得到CD4+T细胞。
优选的，加入分离试剂后孵育的过程包括：
加入EasySepTMHuman CD4+T Cell Isolation Coktail 50µl/ml细胞混匀后室温孵育10分钟；
震荡混匀EasySepTMStreptavidin RapidSpheresTM50001 75µl/ml细胞混匀后室温孵育2.5分钟；
优选的，所述T细胞分裂、纯化过程还包括上机检测CD4+T细胞纯度，若阳性细胞比例大于95%则合格，否则弃去不用，重新进行分离纯化步骤。
优选的，所述单个核细胞，重悬在PBS中，调整细胞浓度为100×106/ml，人血白蛋白的加入量为0.5mg。
优选的，加入分离试剂室温孵育后的提纯过程包括如下步骤：
加入PBS使其总体积达到2.5ml；
反复吹打混匀后将试管连同磁柱一起拿起，将溶液倒入一个新的离心管中，将试管从磁柱中取出，加入2.5mlPBS溶液；
放入紫色的EasySepTM磁柱中重复上述过程。
优选的，所述T细胞的刺激、生成过程包括：取培养瓶一个加入用CD3、CD28或ICOS中的任意一种或多种包被的磁珠，将纯化后CD4+T细胞按1×106/ml密度接种到培养瓶中。
优选的，所述T细胞的扩增、培养过程中，培养基采用X-VIVO，其中含有10ng/mlrhIL-1β，10ng/ml rhIL-6，20ng/ml rhIL-23，10µg/ml anti-hIL-4和 anti-hIFN-γ。
本发明的有益效果在于：本发明提供一种TH17T细胞的培养方法，旨在通过TH17T细胞代替临床现有的CD8T细胞，TH17T细胞相比CD8T细胞而言，在不进行二次刺激的情况下，在体外能够活跃的增值长达21天，产生5000倍数量的T细胞以供使用。从而确保了数量充足。另外，TH17细胞的干细胞特性使其能够具有较强的抗衰老特性，在体外经历两周的增值之后还保留较强的清楚体内肿瘤的能力，极大地提高了临床效果。
附图说明
图1是本发明提供的方法的流程图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例及附图对的技术方案进行详细的描述，以使其更加清楚。以下实施例仅为了描述本发明所列举的较为详细的实施例，并不作为对本发明的限定。
本发明提供的T细胞培养方法，参见图1，该方法包括如下步骤：
步骤S1：分离、纯化：提供人类的外周血，并从外周血中分离并纯化得到CD4+T细胞，具体过程包括：
步骤S11：从外周血中分离得到单个核细胞，将细胞重悬在PBS（Phosphate BufferedSaline，磷酸盐缓冲液）中，并调整细胞浓度至100×106/ml；取一定数量的细胞至5ml聚苯乙烯中，加入正常的人血白蛋白0.5mg；
步骤S12：加入分离试剂混匀在15-25℃的室温环境下孵育，具体在本实施方式中包括：步骤S121：加入EasySepTMHuman CD4+T Cell Isolation Coktail 50µl/ml细胞混匀后室温孵育10分钟；步骤S122：震荡混匀EasySepTMStreptavidin RapidSpheresTM50001 75µl/ml细胞混匀后室温孵育2.5分钟；
步骤S13：通过PBS调节总体积，通过反复吹打混匀提取溶液并重复多次进行提纯，具体步骤如下：
加入PBS使其总体积达到2.5ml；反复吹打混匀后将试管连同磁柱一起拿起，将溶液倒入一个新的离心管中，将试管从磁柱中取出，加入2.5mlPBS溶液；放入紫色的EasySepTM磁柱中重复上述过程。
步骤S14：将收集细胞的离心管离心收集上清液得到CD4+T细胞；
步骤S15：染色荧光抗体，上机检测CD4+T细胞纯度，若阳性细胞比例大于95%则合格，否则弃去不用，重新进行分离纯化步骤。
步骤S2：刺激、生成：取培养瓶一个加入用CD3、CD28或ICOS中的任意一种或多种包被的磁珠，将纯化后CD4+T细胞按1×106/ml密度接种到培养瓶中刺激生成TH17T细胞。
步骤S3：扩增、培养：将TH17T细胞接种到培养基中，加入细胞因子刺激扩增TH17T细胞扩增，并持续添加TGF-β。
其中，步骤S2和步骤S3中采用的培养基均为X-VIVO，细胞因子采用采用rhIL-1β，rhIL-6，rhIL23，anti-hIL-4，anti-hIFN-γ中的任意一种或多种，具体在本实施方式中，加入营养基中的细胞因子包括10ng/ml rhIL-1β，10ng/ml rhIL-6，20ng/ml rhIL-23，10µg/ml anti-hIL-4，以及 anti-hIFN-γ。
对比例
本实施方式采用CD8T细胞作为对照组实验。
对照组CD8T细胞使用与实验组相同的用CD3、CD28或ICOS中的任意一种或多种包被的磁珠激活，IFN-γ培养基维持培养。
根据对照组和实验组的对比，TH17T细胞相比CD8T细胞而言，在不进行二次刺激的情况下，在体外能够活跃的增值长达21天，产生5000倍数量的T细胞以供使用。从而确保了数量充足。另外，TH17T细胞的干细胞特性使其能够具有较强的抗衰老特性，在体外经历两周的增值之后还保留较强的清楚体内肿瘤的能力，这一特性是CD8T细胞所无法达到的。
本发明提供一种TH17T细胞的培养方法，旨在通过TH17T细胞代替临床现有的CD8T细胞，基于上述的TH17T细胞的优越性，可以极大地提高临床效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种T细胞培养方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
分离、纯化：提供外周血，并从外周血中分离并纯化得到CD4+T细胞；
刺激、生成：采用CD3、CD28或ICOS中的任意一种或多种包被的磁珠刺激所述CD4+T细胞产生TH17T细胞；
扩增、培养：将TH17T细胞接种到培养基中，加入细胞因子刺激扩增TH17T细胞扩增，并持续添加TGF-β，所述细胞因子采用rhIL-1β，rhIL-6，rhIL23，anti-hIL-4，anti-hIFN-γ中的任意一种或多种。
2.根据权利要求1所述的T细胞培养方法，其特征在于，所述T细胞的分离、纯化过程包括：
从外周血中分离得到单个核细胞，将细胞重悬在PBS中，并调整细胞浓度；
取一定量细胞至聚苯乙烯中，加入正常的人血白蛋白；
加入分离试剂混匀后室温孵育；
通过PBS调节总体积，通过反复吹打混匀提取溶液并重复多次进行提纯；
离心收集上清液得到CD4+T细胞。
3.根据权利要求2所述的T细胞培养方法，其特征在于，加入分离试剂后孵育的过程包括：
加入EasySepTMHuman CD4+T Cell Isolation Coktail 50µl/ml细胞混匀后室温孵育10分钟；
震荡混匀EasySepTMStreptavidin RapidSpheresTM50001 75µl/ml细胞混匀后室温孵育2.5分钟。
4.根据权利要求2所述的T细胞培养方法，其特征在于，所述T细胞分裂、纯化过程还包括上机检测CD4+T细胞纯度，若阳性细胞比例大于95%则合格，否则弃去不用，重新进行分离纯化步骤。
5.根据权利要求2所述的T细胞培养方法，其特征在于，所述单个核细胞，重悬在PBS中，调整细胞浓度为100×106/ml。
6.根据权利要求2所述的T细胞培养方法，其特征在于，所述聚苯乙烯的含量为5ml，所述人血白蛋白的加入量为0.5mg。
7.根据权利要求2所述的T细胞培养方法，其特征在于，加入分离试剂室温孵育后的提纯过程包括如下步骤：
加入PBS使其总体积达到2.5ml；
反复吹打混匀后将试管连同磁柱一起拿起，将溶液倒入一个新的离心管中，将试管从磁柱中取出，加入2.5mlPBS溶液；
放入紫色的EasySepTM磁柱中重复上述过程。
8.根据权利要求1所述的T细胞培养方法，其特征在于，所述T细胞的刺激、生成过程包括：取培养瓶一个加入用CD3、CD28或ICOS中的任意一种或多种包被的磁珠，将纯化后CD4+T细胞按1×106/ml密度接种到培养瓶中。
9.根据权利要求2所述的T细胞培养方法，其特征在于，所述T细胞的扩增、培养过程中，培养基采用X-VIVO，其中含有10ng/ml rhIL-1β，10ng/ml rhIL-6，20ng/ml rhIL-23，10µg/ml anti-hIL-4和 anti-hIFN-γ。
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