CN117965441A - 一种提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法。本发明对于脐带间充质干细胞培养过程中的培养基成分进行了改进，首先是将原代培养得到的脐带间充质干细胞接种在添加了京尼平苷酸等成分的培养基中，细胞融合度达到80%~90%后进行传代，传代后将其接种在添加FBS的培养基中培养20h~30h后又向培养基中添加了贝母辛等成分。京尼平苷酸、贝母辛成分的使用能够显著提升脐带间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制作用，显著降低T淋巴细胞亚群Th1、Th17的占比。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法。
背景技术
自身免疫性疾病是一种由于免疫系统应答紊乱而攻击自身正常组织和器官，造成组织器官损伤和功能障碍的炎症性疾病。免疫应答紊乱主要表现为免疫细胞的异常激活、免疫系统的失调、免疫蛋白及抗体的分泌异常。淋巴细胞、免疫细胞以及间充质干细胞都在自身免疫性疾病中发挥着重要作用。且已有研究发现，靶向抑制淋巴细胞的药物无法有效治疗自身免疫性疾病，间充质干细胞却能够缓解自身免疫性疾病的症状。
间充质干细胞是一类能够从脐带、脂肪、骨髓等组织中分离获得，具有免疫调节能力的多能干细胞。其中，脐带间充质干细胞是一种从脐带华通氏胶分离出来的一种间充质干细胞，此类细胞具有间充质干细胞的生物学特性，且具有多向分化潜能，能够分化为多种细胞类型。脐带间充质干细胞由于取材方便，免疫原性低、且无伦理学争议，以及在临床试验中高增殖能力被广泛研究。临床研究发现，脐带间充质干细胞能够通过抑制免疫细胞的增殖能力，调控淋巴细胞的分化能力以及淋巴细胞分泌抗体的能力等来缓解自身免疫性疾病，进而维持免疫系统的平衡。目前，脐带间充质干细胞已被应用于临床治疗自身免疫性疾病的治疗方法中。然而，现有技术获得的脐带间充质干细胞免疫能力差的技术问题。因此，亟需提供一种提高脐带间充质干细胞免疫能力的方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法，该方法能够提高脐带间充质干细胞的免疫调节能力。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法，包括以下步骤：
（1）将原代培养得到的脐带间充质干细胞接种在添加京尼平苷酸、FBS的培养基中，当细胞融合度达到80%~90%后进行传代，持续传代2~3次；
（2）收集步骤（1）培养得到的脐带间充质干细胞，将其接种在添加FBS的培养基中，培养20h~30h后向培养基中添加GM-CSF、贝母辛，继续培养40h~60h，收获细胞。
进一步地，所述步骤（1）、步骤（2）中的培养基为DMEM/F12培养基。
进一步地，所述步骤（1）京尼平苷酸在培养基中的含量为32~50ng/mL。
进一步地，所述步骤（1）、步骤（2）添加FBS的培养基中，FBS的体积分数为1%~5%。
进一步地，所述步骤（2）GM-CSF、贝母辛在培养基中的含量为：GM-CSF 63~85ng/mL、贝母辛9~24ng/mL。
进一步地，所述步骤（1）、（2）脐带间充质干细胞在培养基中的接种密度为1×104~3×104个/mL。
进一步地，所述步骤（2）培养的温度为37℃，CO2浓度为5%。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要在于：
（1）本发明对于脐带间充质干细胞培养过程中的培养基成分进行了改进，首先是将原代培养得到的脐带间充质干细胞接种在添加了京尼平苷酸等成分的培养基中，细胞融合度达到80%~90%后进行传代，传代后将其接种在添加FBS的培养基中培养20h~30h后又向培养基中添加了贝母辛等成分。
（2）实验例的结果说明：本发明提供的方法适用于脐带间充质干细胞的培养；京尼平苷酸、贝母辛成分的使用显著提升了脐带间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制作用，显著降低了T淋巴细胞亚群Th1、Th17的占比。由上可知，本发明提供的方法能够提高脐带间充质干细胞的免疫调节能力。
附图说明
图1为实施例1~3获得的脐带间充质干细胞的形态图，其中（A）为实施例1获得的脐带间充质干细胞的形态图，（B）为实施例2获得的脐带间充质干细胞的形态图，（C）为实施例3获得的脐带间充质干细胞的形态图；
图2为实施例3、对比例1~5获得的脐带间充质干细胞对植物血凝素刺激的外周血单个核细胞增殖情况图；
图3为实施例3、对比例1~5获得的脐带间充质干细胞对Th1淋巴细胞亚群分化能力影响图；
图4为实施例3、对比例1~5获得的脐带间充质干细胞对Th17淋巴细胞亚群分化能力影响图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步描述。但是本领域技术人员应当理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为对本发明的限制。实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器，如无特殊说明，均为通过市购渠道获得的常规产品。
（一） 实施例
实施例1
该实施例提供一种提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法，详细过程如下：
（1）使用PBS缓冲液清洗脐带组织，用手术剪将其剪碎为2mm3大小的组织，平铺于10cm的培养皿中（含10%胎牛血清的无血清DMEM/F12培养基），于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养至细胞汇合度达80%后，用Tryspin-EDTA酶消化并收获细胞，即获得原代培养的脐带间充质干细胞；按照3×104个/mL的密度，将原代培养得到的脐带间充质干细胞接种在添加京尼平苷酸、FBS的DMEM/F12培养基中，京尼平苷酸在DMEM/F12培养基中的含量为50ng/mL，FBS在DMEM/F12培养基中的体积分数为5%；当细胞融合度达到90%后，使用0.25% EDTA的胰蛋白酶溶液消化细胞，于37℃、5%CO2细胞培养箱中进行传代，传代比例为1：2，持续传代2次；
（2）收集步骤（1）培养得到的脐带间充质干细胞，按照3×104个/mL的密度将其接种在添加FBS的DMEM/F12培养基中，FBS在DMEM/F12培养基中的体积分数为5%，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养20h；向DMEM/F12培养基中添加GM-CSF、贝母辛，GM-CSF、贝母辛在培养基中的含量为：GM-CSF 85ng/mL、贝母辛24ng/mL，继续于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养40h，收获细胞。
实施例2
该实施例提供一种提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法，详细过程如下：
（1）使用PBS缓冲液清洗脐带组织，用手术剪将其剪碎为2mm3大小的组织，平铺于10cm的培养皿中（含10%胎牛血清的无血清DMEM/F12培养基），于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养至细胞汇合度达80%后，用Tryspin-EDTA酶消化并收获细胞，即获得原代培养的脐带间充质干细胞；按照2×104个/mL的密度，将原代培养得到的脐带间充质干细胞接种在添加京尼平苷酸、FBS的DMEM/F12培养基中，京尼平苷酸在DMEM/F12培养基中的含量为32ng/mL，FBS在DMEM/F12培养基中的体积分数为1%；当细胞融合度达到80%后，使用0.25% EDTA的胰蛋白酶溶液消化细胞，于37℃、5%CO2细胞培养箱中进行传代，传代比例为1：2，持续传代3次；
（2）收集步骤（1）培养得到的脐带间充质干细胞，按照2×104个/mL的密度将其接种在添加FBS的DMEM/F12培养基中，FBS在DMEM/F12培养基中的体积分数为1%，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24h；向DMEM/F12培养基中添加GM-CSF、贝母辛，GM-CSF、贝母辛在培养基中的含量为：GM-CSF 63ng/mL、贝母辛9ng/mL，继续于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养52h，收获细胞。
实施例3
该实施例提供一种提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法，详细过程如下：
（1）使用PBS缓冲液清洗脐带组织，用手术剪将其剪碎为2mm3大小的组织，平铺于10cm的培养皿中（含10%胎牛血清的无血清DMEM/F12培养基），于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养至细胞汇合度达80%后，用Tryspin-EDTA酶消化并收获细胞，即获得原代培养的脐带间充质干细胞；按照1×104个/mL的密度，将原代培养得到的脐带间充质干细胞接种在添加京尼平苷酸、FBS的DMEM/F12培养基中，京尼平苷酸在DMEM/F12培养基中的含量为43ng/mL，FBS在DMEM/F12培养基中的体积分数为3%；当细胞融合度达到80%后，使用0.25% EDTA的胰蛋白酶溶液消化细胞，于37℃、5%CO2细胞培养箱中进行传代，传代比例为1：2，持续传代3次；
（2）收集步骤（1）培养得到的脐带间充质干细胞，按照1×104个/mL的密度将其接种在添加FBS的DMEM/F12培养基中，FBS在DMEM/F12培养基中的体积分数为3%，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养30h；向DMEM/F12培养基中添加GM-CSF、贝母辛，GM-CSF、贝母辛在培养基中的含量为：GM-CSF 76ng/mL、贝母辛18ng/mL，继续于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养60h，收获细胞。
（二） 对比例
对比例1
该对比例提供一种提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法，与实施例3的不同之处在于：采用京尼平苷替换步骤（1）中的京尼平苷酸，其余与实施例3相同。
对比例2
该对比例提供一种提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法，与实施例3的不同之处在于：采用京尼平替换步骤（1）中的京尼平苷酸，其余与实施例3相同。
对比例3
该对比例提供一种提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法，与实施例3的不同之处在于：仅省去步骤（1）中的京尼平苷酸，其余与实施例3相同。
对比例4
该对比例提供一种提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法，与实施例3的不同之处在于：仅省去步骤（2）中的贝母辛，其余与实施例3相同。
对比例5
该对比例提供一种提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法，与实施例3的不同之处在于：同时省去步骤（1）中的京尼平苷酸、步骤（2）中的贝母辛，其余与实施例3相同。
（三） 实验例
实验例1
该实验例对实施例1~3获得的脐带间充质干细胞的形态进行鉴定，具体是：
于倒置显微镜下观察实施例1~3获得的脐带间充质干细胞的形态，结果如图1所示。
图1为实施例1~3获得的脐带间充质干细胞的形态图。其中，图1中（A）为实施例1获得的脐带间充质干细胞的形态图，图1中（B）为实施例2获得的脐带间充质干细胞的形态图，图1中（C）为实施例3获得的脐带间充质干细胞的形态图。观察图1可知，实施例1~3获得的脐带间充质干细胞的形态相对均一、呈梭形、长条状纤维样，符合脐带间充质干细胞的典型特征，也说明了本发明提供的方法能够用于培养脐带间充质干细胞。
实验例2
该实验例探究实施例3、对比例1~5获得的脐带间充质干细胞对植物血凝素刺激的外周血单个核细胞增殖情况的影响，具体是：
将新鲜抗凝外周血（70mL）加入离心管中，离心后小心吸出血浆层并置于新的离心管中，灭活处理（于55℃水浴条件下进行）；经4℃冰浴、离心处理后将上层血浆移入新的离心管中，加入等体积的生理盐水稀释后，再加入16mL淋巴细胞分离液进行离心处理20min，离心后的离心管从上到下分为四层：第一层为血浆层；第二层为环状乳白色淋巴细胞层；第三层为分离液层；第四层为红细胞层，收集第二层细胞即获得外周血单个核细胞（PBMC）；外周血单个核细胞计数后，将外周血单个核细胞重悬于PBS中，加入0.2μmol/L的CFSE染液，避光孵育2min，洗去多余染液，得到CFSE标记的外周血单个核细胞；
将实施例3、对比例1~5获得的脐带间充质干细胞接种至24孔板中（DMEM/F12培养基），细胞接种密度为1×105个/孔，细胞完全贴壁后添加10mg/L的丝裂霉素C，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养20min，弃上清，采用PBS清洗细胞后，每孔加入1mLCFSE标记的外周血单个核细胞（细胞数目为1×106个），每组设置3个复孔；然后加入10mg/L的植物血凝素，200IU/mL的白细胞介素2，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养18h，离心弃上清后，更换新鲜培养基，继续于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养48h；设置植物血凝素刺激外周血单个核细胞的阳性对照组；
收集培养后的外周血单个核细胞，采用流式细胞仪分析各检验组外周血单个核细胞的增殖情况，结果如图2所示。
图2为实施例3、对比例1~5获得的脐带间充质干细胞对植物血凝素刺激的外周血单个核细胞增殖情况的影响图。由图2可知，实施例3获得的脐带间充质干细胞能够显著抑制植物血凝素刺激的外周血单个核细胞增殖，对比例1~5获得的脐带间充质干细胞对植物血凝素刺激的外周血单个核细胞增殖抑制能力有着不同程度的降低。上述结果表明采用本发明提供的方法获得的脐带间充质干细胞能够抑制植物血凝素刺激的外周血淋巴细胞的增殖。
实验例3
该实验例对实施例3、对比例1~5获得的脐带间充质干细胞对淋巴细胞亚群分化能力的影响，具体是：
外周血单个核细胞培养过程同实验例2；培养48h后，每孔添加2μL的白细胞活化混合物（Leukocyte Activation Cocktail With BD GolgiPlug），于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养4h，收集外周血单个核细胞进行流式检测，检测过程参考检测试剂盒进行，以未处理的外周血单个核细胞作为空白对照组，结果如图3所示。
图3为实施例3、对比例1~5获得的脐带间充质干细胞对Th1淋巴细胞亚群分化能力影响图。图4为实施例3、对比例1~5获得的脐带间充质干细胞对Th17淋巴细胞亚群分化能力影响图。分析图3~图4可知，实施例3获得的脐带间充质干细胞能够显著抑制T淋巴细胞亚群Th1、Th17的比例。对比例1~5获得的脐带间充质干细胞对T淋巴细胞亚群Th1、Th17的分化抑制能力有着不同程度的降低。检验结果说明，本发明的方法能够增加脐带间充质干细胞对T淋巴细胞亚群分化抑制能力。
综上，本发明提供的方法适用于脐带间充质干细胞的培养，且获得的脐带间充质干细胞能够显著抑制淋巴细胞增殖，降低T淋巴细胞亚群Th1、Th17的占比。
最后说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制。上文中已经用具体实施方案描述了本发明的基本原理和主要特征，在本发明的基础上，可以对之进行一些修改或替换，但这些修改或者替换并不使相应技术方案的本质脱离本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将原代培养得到的脐带间充质干细胞接种在添加京尼平苷酸、FBS的培养基中，当细胞融合度达到80%~90%后进行传代，持续传代2~3次；
（2）收集步骤（1）培养得到的脐带间充质干细胞，将其接种在添加FBS的培养基中，培养20h~30h后向培养基中添加GM-CSF、贝母辛，继续培养40h~60h，收获细胞。
2.根据权利要求1所述的提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法，其特征在于，所述步骤（1）、步骤（2）中的培养基为DMEM/F12培养基。
3.根据权利要求1所述的提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法，其特征在于，所述步骤（1）京尼平苷酸在培养基中的含量为32~50ng/mL。
4.根据权利要求1所述的提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法，其特征在于，所述步骤（1）、步骤（2）添加FBS的培养基中，FBS的体积分数为1%~5%。
5. 根据权利要求1所述的提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法，其特征在于，所述步骤（2）GM-CSF、贝母辛在培养基中的含量为：GM-CSF 63~85ng/mL、贝母辛9~24ng/mL。
6.根据权利要求1所述的提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法，其特征在于，所述步骤（1）、（2）脐带间充质干细胞在培养基中的接种密度为1×104~3×104个/mL。
7.根据权利要求1所述的提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法，其特征在于，所述步骤（2）培养的温度为37℃，CO2浓度为5%。
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