JP2012019718A - 膵島の分離方法および膵島組織を保護するための保護液 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の膵島分離方法は、摘出した膵臓の膵管内に保存液を注入する注入工程と、前記膵臓を浸漬液の中に浸して保存する保存工程と、前記膵臓を崩壊させて膵組織を得る消化工程と、前記膵組織を純化溶液の中に浸して膵島を得る純化工程とを含む膵島の分離方法であって、前記消化工程は、消化酵素を含む酵素溶液を前記膵臓の内部に注入する酵素注入ステップと、前記消化酵素を活性化させる消化開始ステップと、前記消化酵素を不活化させる消化停止ステップと、崩壊させた膵組織を回収する回収ステップとからなり、前記消化開始ステップの前までに系に好中球エラスターゼ阻害剤を添加することにより、前記消化開始ステップを始める時点において、前記膵臓の内部に好中球エラスターゼ阻害剤を存在させることを特徴とする。
【選択図】なし
Description
膵島分離方法の最初の工程として、膵管内へ保存液の注入を行う。保存液の注入は、例えば、膵管にカテーテルを挿入することにより行うことができる。その際、ポンプにより注入圧を調節してもよい。挿入するカテーテルの数は、1本であることが好ましい。1本とすることで、膵管内に注入する溶液の液漏れを少なくすることができ、臓器の損傷も最小限に抑えることができる。
膵島分離方法における二番目の工程として、膵管内に保存液を注入した膵臓を、浸漬液に浸して保存する。保存方法は、臓器保存液単体を用いる単純浸漬法、もしくは二層法を用いることができる。二層法による保存は、容器内にパーフルオロカーボン液(PFC)および臓器保存液を入れて二層を形成した後、臓器を入れ、容器内に酸素を供給しながら臓器を保存する方法である。従って、本発明における浸漬液とは、例えば、単純浸漬法を用いる場合には臓器保存液を意味し、二層法を用いる場合にはPFCおよび臓器保存液を意味するが、これらに限定されない。膵臓を保存することができる溶液であれば、本発明の浸漬液として使用することが可能である。二層法を用いる場合、パーフルオロカーボン液(PFC)と臓器保存液との割合は、体積比で1:1程度であることが好ましい。酸素の供給は、少なくとも30分以上行うことが好ましい。二層法により膵臓を保存することにより、膵組織の生存能力を高く維持することができる。
膵島分離方法の三番目の工程として、消化酵素を膵臓内に注入し、膵臓を崩壊(消化)させる。具体的には、膵臓を崩壊させる作用を有する酵素溶液を膵管内に注入し膵臓を膨化させた後(以下「酵素注入ステップ」と呼ぶ。)、前記酵素を活性化することにより膵臓を崩壊させる(以下「消化開始ステップ」と呼ぶ。)。その後、酵素を不活化させることにより消化を停止させ(以下「消化停止ステップ」と呼ぶ。)、崩壊された膵組織を回収する(以下「回収ステップ」と呼ぶ。)。
消化開始ステップにおける酵素の活性化は、例えば、系の温度を上昇させることにより行うことができる。具体的には、コラゲナーゼを注入して膨化させた膵臓をチェンバーに入れ、消化のための回路を溶液で満たし、閉鎖系とする。その後、溶液をポンプで循環させ、溶液の温度をコラゲナーゼが活性化する温度まで上昇させる。温度の上昇により、膵組織に浸潤したコラゲナーゼが活性化され、細胞と細胞を結合する組織を形成するコラーゲンを溶解し、膵組織が崩壊する。コラゲナーゼは、37℃程度で最も活性化する。従って、コラゲナーゼを作用させて膵臓を崩壊させる場合には、系の温度を37℃程度まで上昇させる必要がある。
(4)純化工程
膵島分離方法の四番目の工程として、前工程で回収した膵組織の純化を行う。純化とは、膵組織を膵島と膵外分泌腺組織とに分離する工程である。本工程作業は、密度勾配剤を含む純化溶液を用いて行う。膵島は、膵外分泌腺組織と比較して比重が軽い。このことを利用して、密度勾配剤により密度勾配が形成された純化溶液中に分解された膵組織を入れ、比重遠沈法にて膵島と膵外分泌腺組織とを分離する。
まず、ET−Kyoto液に終濃度が20μMとなるようにエラスポール(小野薬品工業株式会社製、登録商標、一般名:シベレスタット)を添加し、保護液(以下、S−Kyoto液と称する)を調製しておく。
比較例1は、実施例1の保護液の代わりにET−Kyoto液(エラスポールを添加しない)を採用した。純化溶液としては、ET−Kyoto液にオプティプレップを添加した溶液を採用した。それ以外の作業は実施例1と同様に行った。
比較例2は、実施例1の保護液の代わりに、ET-Kyoto液にミラクリッド(持田製薬株式会社、登録商標、一般名:ウリナスタチン)を添加したもの(以下、M−Kyotoと称する)を使用した。純化溶液としては、ET−Kyoto液にオプティプレップとミラクリッドを添加した溶液を採用した。ET−Kyoto液1Lに対し100,000単位のミラクリッドを添加する。それ以外の作業は実施例1と同様に行った。
比較例3は、実施例1の保護液の代わりにビアスパン(ブリストルマイヤーズスクイブ製、登録商法、一般名:UW液)を採用した。純化溶液にはビアスパンを採用した。それ以外の作業は実施例1と同様に行った。
実施例および比較例において行った分離方法の各工程での好中球エラスターゼの活性を測定した。測定の時期は、「消化前」と、「消化後」と、「純化前」と、「純化後」との4点とした。ここで、「消化前」とは、膵臓を崩壊させる作用を有するコラゲナーゼを膵管内に注入し、膵臓を膨化させた状態、すなわち本願発明における酵素注入ステップの後であって、かつ消化開始ステップの前を指す。「消化後」とは、膨化後にコラゲナーゼを活性化させることで膵臓を崩壊させた後、コラゲナーゼを不活化することで消化を停止させた状態、すなわち本願発明における消化停止ステップの後であって、かつ回収ステップの前を指す。「純化前」とは、消化を停止させた後に膵組織を洗浄した状態、すなわち本願発明における回収ステップの後であって、かつ純化工程の前を指す。そして、「純化後」とは、密度勾配剤を用いて膵島を膵外分泌腺組織から分離した状態、すなわち本願発明における純化工程の後を示す。
実施例1および比較例1から3に示した方法で得られた膵島の個数、長径および面積を計測することによって、これらの指標を計算した。IEQとはIslet Equivalents(膵島当量)の略語であり、直径が150μmの膵島を1と規定する、膵島のボリュームを示す国際単位である。分離膵島の個数は、膵島細胞を含む液1mLから50μLを採取し、ジチゾンにて染色される膵島の個数を計測し、その20倍を分離膵島の個数とした。膵島の長径および面積は、蛍光顕微鏡VH アナライザー(KEYENCE社)を用いた画像解析により計測した。分離指数は、IEQおよび膵島の個数を用い、分離指数=IEQ/膵島の個数、で示す計算式を用いて算出した。純度は画像解析から得られた面積を用い、純度=ジチゾンで染色された面積/全面積、で示す計算式を用いて算出した。膵島サイズの分布は画像解析で得られた膵島の長径を基準に50μm〜100μm、100μm〜150μm、150μm〜200μm、200μm〜250μm、250μm〜300μm、300μm〜350μm、350μm以上に分け、全膵島の個数に占める各分布の割合を算出した。
図9は、得られた膵島の写真を示す。図9(a)〜(d)は電子顕微鏡下の写真である。図中、(a)は比較例3を、(b)は比較例1を、(c)は比較例2を、(d)は実施例1を示す。これによると、実施例1で得られた膵島は、比較例の膵島よりも良好な丸みがあり、密集した構造であり、破壊されている組織が少ないことが分かる。実施例1および比較例1〜比較例3で得られた膵島の形状は消化後の好中球エラスターゼ活性の結果と一致している。従って、実施例1では、好中球エラスターゼ阻害剤の作用により、膵組織の損傷が抑制されたと考えられる。
図10は、得られた膵島の刺激指数を示す。ここで刺激指数とは、膵島の分泌能を示す指標である。膵島分離は実施例1と同じ操作を行った。実施例1および比較例1〜比較例3で得られた各々30個の膵島を37℃条件下で24時間培養した後、低グルコースまたは高グルコース濃度条件下で一定時間の培養を行い、培養上清中のインスリン濃度を測定した。刺激指数は低グルコース濃度と高グルコース濃度におけるインスリン分泌能の比率から算出した。図10によると、実施例1は比較例1および比較例3と比較して有意に刺激指数が高かった。このことから、実施例1で得られた膵島は比較例1および比較例3で得られた膵島よりもグルコース刺激に応答したインスリン分泌が良好であることが明らかとなった。
Claims (8)
- 摘出した膵臓の膵管内に保存液を注入する注入工程と、前記膵臓を浸漬液の中に浸して保存する保存工程と、前記膵臓を崩壊させて膵組織を得る消化工程と、前記膵組織を純化溶液の中に浸して膵島を得る純化工程とを含む膵島の分離方法であって、
前記消化工程は、消化酵素を含む酵素溶液を前記膵臓の内部に注入する酵素注入ステップと、前記消化酵素を活性化させる消化開始ステップと、前記消化酵素を不活化させる消化停止ステップと、崩壊させた膵組織を回収する回収ステップとからなり、
前記消化開始ステップの前までに系に好中球エラスターゼ阻害剤を添加することにより、前記消化開始ステップを始める時点において、前記膵臓の内部に好中球エラスターゼ阻害剤を存在させることを特徴とする、膵島の分離方法。 - 前記好中球エラスターゼ阻害剤の添加は、前記酵素溶液に好中球エラスターゼ阻害剤を添加することにより行うことを特徴とする、請求項1に記載の膵島の分離方法。
- 前記好中球エラスターゼ阻害剤の添加は、前記酵素溶液および前記純化溶液に好中球エラスターゼ阻害剤を添加することにより行うことを特徴とする、請求項1に記載の膵島の分離方法。
- 前記好中球エラスターゼ阻害剤の添加は、前記保存液、前記浸浸液、前記酵素溶液および前記純化溶液のすべてに好中球エラスターゼ阻害剤を添加することにより行うことを特徴とする、請求項1に記載の膵島の分離方法。
- 前記保存液、前記浸浸液、前記酵素溶液および前記純化溶液における前記好中球エラスターゼ阻害剤の濃度が2〜200μMであることを特徴とする、請求項2〜4のいずれか1項に記載の膵島の分離方法。
- 前記注入工程および/または前記保存工程を省略することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の膵島の分離方法。
- 膵組織に浸潤した好中球から放出されるエラスターゼの作用から前記膵組織を保護するための保護液であって、好中球エラスターゼ阻害剤を含むことを特徴とする保護液。
- 前記保護液における前記好中球エラスターゼ阻害剤の濃度が2〜200μMであることを特徴とする、請求項7に記載の保護液。
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