CN101086008A - 微生物检测质量控制标准物质及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用在微生物检测实验室作质量控制对照，指示微生物检测实验室中检测质量的，定量的微生物标准物质及其制备方法。其主要方法是将定量的已稀释至应用浓度的细菌芽孢或真菌孢子加入到已经环氧乙烷灭菌处理，并已达到无菌要求的定量载体中，均质，达到定量数值的细菌芽胞或真菌孢子均匀结合在载体上，将灭菌后的吸附有定量数值细菌芽胞或真菌孢子的定量载体置于已经灭菌的尖底2ml具塞塑料管中。制成微生物检测质量控制标准物质。

Description

微生物检测质量控制标准物质及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用在微生物检测实验室作质量控制对照，指示微生物检测实验室中检测质量的，定量的微生物标准物质及其制备方法。

背景技术

产品(食品、饮用水、化妆品、医疗用品、生活用品、卫生用品等)和环境中存在大量的微生物(非致病微生物、致病微生物、条件致病微生物、弱毒性致病微生物和强毒性致病微生物等)，由于产品中存在大量的微生物极大多数是繁殖体(正在大量繁殖的微生物)，产品质量监督监测部门和企业内部的实验室，进行检测检测，检测的数据只能表示检测当时的卫生标准。同一产品，不同时间检测，检测的微生物数据均为不一致，有时差异会很大。因此，微生物检测有一个不成文的规定：微生物检测不复检。由于没有一个统一的微生物检测质量控制标准物质，使各系统、各单位的微生物检测实验室对产品等微生物检测时，没有标准物质作同步检测对照，使检测结果成为不确定性。

为了能证明检测质量的准确，只有在微生物检测时，同步进行“微生物检测质量控制标样”检测，当检测的数据符合标定的“微生物检测质量控制标准物质”数据时，才能证明本次微生物检测过程中的各方面的影响因素(技术人员的技能、生物试剂的质量、实验检测环境条件等)得到控制，检测的数据是准确的。同时，每周采用“微生物检测质量控制标准物质”进行检测，绘制质量控制曲线图进行分析、总结，分析微生物检测实验室质量保证体系运行情况，提出整改措施。才能保证该微生物检测实验室的质量体系正常运行。

发明内容

为提供一种微生物检测质量的标准物质，本发明提供以下技术方案。

微生物检测质量控制标准物质的制备方法，包括以下步骤：

a.选择性状稳定、形成集落能识别的、容易保存的、对人和动、植物无毒害的微生物，利用芽孢形成培养基或真菌孢子形成培养基制备细菌芽胞或真菌孢子，

b.用灭菌蒸馏水洗下细菌芽孢或真菌孢子，染色，用灭菌蒸馏水稀释至应用浓度，即内含指示微生物含量为10²～10⁹CFU/0.01G(或片、支、粒)，

c.将定量的己稀释至应用浓度的细菌芽孢或真菌孢子加入到已经环氧乙烷灭菌处理，并已达到无菌要求的定量载体中，均质，达到定量数值的细菌芽胞或真菌孢子均匀结合在载体上，

d.将灭菌后的吸附有定量数值细菌芽胞或真菌孢子的定量载体置于已经灭菌的尖底2ml具塞塑料管中。

步骤a中优选的微生物为嗜热脂肪杆菌芽胞、枯草杆菌黑色变种芽胞、短小杆菌芽胞、蜡样芽胞或白色念珠菌、酵母。

优选步骤a中芽孢形成培养基的配方如下：蛋白胨1.0％、牛肉浸膏粉0.3％、氯化钠0.5％、葡萄糖0.1％、碳酸氢钠0.08％、琼脂粉1.2％。

优选步骤a中真菌孢子形成培养基的配方如下：蛋白胨0.5％、葡萄糖4.0％、玉米淀粉4.0％、吐温80 0.1％、琼脂粉1.0％、碳酸氢钠0.01％。

优选的方案中步骤c中载体可以是不溶性淀粉或可溶性淀粉、磁珠、直径为1～6mm的塑料圆珠、琼脂颗粒、明胶片、50％明胶溶液、直径为6mm的厚滤纸片、葡萄糖、蔗糖、乳糖。

用上述任一种方法制备的微生物检测质量控制标准物质，其特征在于载体上均匀地分布有细菌芽胞或真菌孢子，载体内含指示微生物含量为10²～10⁹CFU/0.01G(或片、支、粒)。

用上述任一种方法制备的微生物检测质量控制标准物质，可用于样品或产品等菌落计数项目检测过程中同步阳性对照。培养基的质量检定。灭菌器灭菌工艺制订及灭菌效果考核、绘制微生物检测实验室内质量控制曲线图及微生物检测实验室室内、室间盲样(技术人员技能)考核。

1、样品(或产品)等菌落计数项目检测过程中同步阳性对照。

在每批(每天)进行样品(产品)等菌落计数检测时，采用“微生物检测质量控制标准物质”进行同步检测，作为阳性对照，判定本次实验结果是否准确和实验过程中存在引起误差的原因。

2、绘制微生物检测实验室内质量控制曲线图。

为了保证微生物实验室的检测质量，每周用“微生物检测质量控制标准物质”进行检测，将检测结果标入质量控制图内，对本微生物检测实验室内存在的影响检测质量的因素进行系统分析，并提出整改意见。

3、用于培养基(营养琼脂)质量检定。

样品(产品)等菌落计数检测时，培养基(营养琼脂)的质量是保证微生物实验检测质量的关键因素之一，为了保证微生物实验室的检测质量，必须对本实验室使用的培养基(营养琼脂)进行质量检定，选择适用于本微生物检测实验室使用的培养基，并对培养基(营养琼脂)存在的不足之处提出建设性意见。

4、用于微生物检测实验室室内、室间盲样考核。

为了保证各微生物实验室的检测质量和检测数据具有可比性，经常性地用“微生物检测质量控制标准物质”开展微生物检测实验室室内、室间盲样考核，保证微生物实验室的检测质量。

5、用于灭菌器进行产品灭菌时的工艺制订、确认和灭菌效果考核。

由于产品的规格、包装和性质均不相同，产品灭菌灭菌时的各种技术数据均不一样，为了保证产品的灭菌质量，对各类产品灭菌灭菌时，必须制订灭菌工艺和工艺确认。“微生物检测质量控制标准物质”适用于灭菌工艺、工艺确认灭菌效果考核，保证产品的灭菌质量。

具体实施方式

实施例1

微生物在细菌芽胞形成培养基或真菌孢子形成培养基上经过2～4小时适应(枯草杆菌黑色变种芽胞、短小杆菌芽胞和蜡样芽胞杆菌等的培养温度为35℃～37℃，嗜热脂肪杆菌芽胞的培养温度为54℃～56℃，白色念珠菌培养温度为25℃)，微生物进入对数生长期，微生物数量大量增加，微生物生长旺盛，将培养基中的营养耗尽，培养基可利用成分大量减少，产生的有害物质大量增加。微生物在营养成分不足、有害物质存在的这种恶劣环境中经过10天以上的培养，90％以上的微生物形成芽胞和孢子，进入休眠状态。

用灭菌蒸馏水将培养基上的菌苔洗下，充分混匀，形成2.0×10⁹cfu/ml细菌悬液，置于盛有玻璃珠的灭菌三角洗瓶中

将三角烧瓶置于80℃的水浴中，水浴的液面高于三角烧瓶中菌悬液的液面，摇动三角烧瓶，作用10分钟，杀灭未形成芽胞的繁殖体和未形成孢子的真菌，保留具有活性、能复苏的芽胞和孢子，并将形成链状的芽胞菌体和真菌孢子分离成单个菌体。

无菌操作，将菌悬液置于灭菌的沉淀管中，置于离心机中，4000转/分钟，离心30分钟，倾弃上清液，加入沉淀物10倍量的灭菌蒸馏水，置于混和器中，充分混匀。再进行4000转/分钟离心30分钟，倾弃上清液。重复操作3次。

用50倍量的灭菌蒸馏水，将沉淀管中的芽胞菌体和真菌孢子洗下，置于灭菌的玻璃容器内，充分混匀。杀灭非细菌芽胞和非真菌孢子的微生物。

取菌悬液一滴，置于洁净的载玻片上，涂布均匀，自然干燥，在酒精灯上过火焰固定；在菌膜上滴加足量的5.0％孔雀绿水溶液；取平皿一只，内放置二张滤纸，在滤纸上滴加蒸馏水，使滤纸吸足蒸馏水，无多余的蒸馏水外溢，将载玻片置于平皿中，盖好平皿盖，将平皿置于54℃~56℃培养箱，烘30分钟。将载玻片取出，用自来水水洗，将孔雀绿残留洗净。加入0.6％沙黄水溶液，复染2分钟，用自来水水洗，将沙黄残留洗净，待干。完成芽胞染色。将载玻片置于显微镜载物台上，用油镜观察，芽胞呈绿色，菌体成红色，计算芽胞形成率。芽胞形成率达95％以上即可。用灭菌蒸馏水稀释至应用浓度。即内含指示微生物含量为10²～10⁹CFU/0.01G(或片、支、粒)，

(1)、定量菌悬液的制备：

①、取已处理的细菌芽胞和真菌孢子悬液，

②、用灭菌蒸馏水作10^-1～10^-9稀释。

③、取各稀释度的菌悬液1ml，分别置于灭菌平皿中，倾注入已熔化、并已冷却至50～60℃的营养琼脂或真菌培养基。凝固后，置于36±1℃(细菌芽胞)或26±1℃(真菌孢子)的培养箱内，培养24小时。

④、计数。

⑤、用灭菌蒸馏水稀释至应用浓度的定量菌悬液。

其中菌量计数的方法：

①、取一支菌落计数质量控制标样，(管上标明的重量为内容物重量)。在微生物检测实验室(P1级生物安全防护实验室)内。打开塑料管(或安瓿瓶)。

②、取一支移液管，吸取1.0ml灭菌蒸馏水，加入塑料管中，充分混匀。

③、另取一支移液管，将塑料管中的液体吸出，加入灭菌试管中。

④、继续吸取1.0ml灭菌蒸馏水，加入塑料管中，充分混匀，然后将混和样液吸出，置于上述中试管中。按此方法再重复5次，将塑料管中的样品充分洗净，置于中试管内。

⑤、继续在中试管内加入5.0ml灭菌蒸馏水，总量为10.0ml，为1号中试管。

⑥、另取二支中试管，分别加入9.0ml灭菌蒸馏水。

⑦、用1.0ml移液管将1号中试管内的样液吹打均匀，静止20min。吸取1.0ml样液置于2号中试管内，将移液弃掉。

⑧、另取1支1.0ml移液管吹打2号中试管内的液体，充分混匀，吸取1.0ml溶液置于灭菌平皿中(共四只平皿)。

⑨、在平皿中加入已融化并冷却至45℃～50℃的营养琼脂20ml/皿。凝固后置于36±1℃培养箱内，培养24h，计数。

计算

注：N₁-N₄：10^-2稀释度的四只平皿中的菌落数。

(2)、吸附：

①、载体吸附前处理：

A、不溶性淀粉、糖(葡萄糖、蔗糖、乳糖等)、奶粉：

a、将不溶性淀粉、(糖类、奶粉)置于自封式塑料袋中，排除气体，封口，再用一只自封式塑料袋封口包装，平摊成为厚1cm的包装，每袋250g。

b、在其中一袋不溶性淀粉、(糖类、奶粉)包装袋中，同时放入一支“微生物检测标样”。

c、采用环氧乙烷灭菌。

d、灭菌后在通风的环境中放置15天。

e、在生物安全防护实验室内，从包装袋中取出一支“微生物检测标样”。进行灭菌效果检测。

B、磁珠、塑料珠、：

a、用蒸馏水将磁珠清洗。凉燥。

b、将磁珠置于自封式塑料袋中，排除气体，封口，再用一只自封式塑料袋封口包装，平摊成为厚1cm的包装，每袋100g。

c、在其中一袋磁珠包装袋中，同时放入一支“微生物检测标样”。

d、采用环氧乙烷灭菌。

e、灭菌后在通风的环境中放置15天。

f、在生物安全防护实验室内，从包装袋中取出一支“微生物检测标样”。进行灭菌效果检测。

C、琼脂颗粒：

a、用200目的铜丝网过筛。

b、将琼脂粉置于自封式塑料袋中，排除气体，封口，再用一只自封式塑料袋封口包装，平摊成为厚1cm的包装，每袋250g。

c、在其中一袋琼脂粉包装袋中，同时放入一支“微生物检测标样”。

d、采用环氧乙烷灭菌。

e、灭菌后在通风的环境中放置15天。

f、在生物安全防护实验室内，从包装袋中取出一支“微生物检测标样”。进行灭菌效果检测。

D、滤纸片：

a、将直径为6mm的厚纸片置于自封式塑料袋中，排除气体，封口，再用一只自封式塑料袋封口包装，每袋5000片。

b、在其中一袋滤纸片包装袋中，同时放入一支“微生物检测标样”。

c、采用环氧乙烷灭菌。

d、灭菌后在通风的环境中放置15天。

e、在生物安全防护实验室内，从包装袋中取出一支“微生物检测标样”。进行灭菌效果检测。

②、吸附：

a、磁珠、塑料珠、滤纸片：

将已灭菌的载体置于已灭菌的烧瓶内。

根据载体的吸水量，加入已定量的菌悬液。充分混匀。

烘干。

定量分装于已灭菌的尖底2ml具塞塑料管内。

b、不溶性淀粉、糖(葡萄糖、蔗糖、乳糖等)、奶粉、琼脂颗粒：

将已灭菌的载体置于已灭菌的烧瓶内。

根据载体的吸水量，加入已定量的菌悬液。充分混匀。

将已加入微生物菌悬液的载体置于已灭菌的球磨机内，滚动混匀。

定量分装于已灭菌的尖底2ml具塞塑料管内。

c、明胶片：

取15g明胶，置于100ml蒸馏水内，121℃灭菌20min。

待冷却至45～50℃时，加入1倍量的菌悬液，置于混匀器内，充分混匀。

用灭菌的200ul移液器，分装于已灭菌的尖底2ml具塞塑料管内。

实施例2    用于菌落计数项目检测过程中同步阳性对照

a，取一支“微生物检测质量控制标准物质”。

b，在微生物检测实验室(生物安全防护实验室)内。打开塑料管。

c，取一支移液管，吸取1.0ml灭菌蒸馏水，加入塑料管中，充分混匀。

d，另取一支移液管，将塑料管中的液体吸出，加入灭菌中试管中(1号管)。

e，继续吸取1.0ml灭菌蒸馏水，加入塑料管中，冲洗塑料管，然后将样液吸出，置于上述中试管中。按此方法再重复2次，将塑料管中的样品充分洗净，置于中试管内。

f，继续在中试管内加入灭菌蒸馏水，总量为5.0ml。

g，另取灭菌中试管，加入4.0ml灭菌蒸馏水(2号管)，另取一支移液管，从1号中试管中吸取1.0ml混和样液，加入2号中试管中，充分混匀。

h，用1.0ml移液管，将2号中试管内的样液吹打(或用混和器)均匀，静止20min。

i，吸取1.0ml上清样液，置于灭菌平皿中(共二只平皿)，加入已融化并冷却至45℃～50℃的营养琼脂20ml/皿。充分混匀，凝固后置于36±1℃培养箱内，培养24h，计数。

计算

注：N₁和N₂：二只平皿中的菌落数。

净重量：在塑料管上标明。

实施例3  培养基(营养琼脂)质量检定

a、取一支“微生物检测质量控制标准物质”。

b、在微生物检测实验室(生物安全防护实验室)内。打开塑料管。

c、取一支移液管，吸取1.0ml灭菌蒸馏水，加入塑料管中，充分混匀。

d、另取一支移液管，将塑料管中的液体吸出，加入灭菌中试管中。

e、继续吸取1.0ml灭菌蒸馏水，加入塑料管中，冲洗塑料管，然后将样液吸出，置于上述中试管中。按此方法再重复2次，将塑料管中的样品充分洗净，置于中试管内。

f、继续在中试管内加入灭菌蒸馏水，总量为5.0ml，用lml移液管(或用混和器)充分混匀。

g、用100ul移液器吸取混匀样液，置于被检定培养基(四只)和对照1号培养基(四只)上。每只培养基100ul。

h、用灭菌L棒将培养基表面的混匀样液涂布均匀，并涂布至干燥。

i、将八只培养基置于37℃培养箱内，培养24h。

j、计算菌落数和用数显式游标卡尺测量菌落直径。

计算

①、菌落平均数计算：

②、菌落平均直径计算：

③、生长率计算：

④、总分值计算

总分值＝菌落直径分值+菌落差分值+生长率分值

菌落差分值＝(X-Y+1)×5

注：X为被检定培养基菌落直径平均数

Y为对照1号培养基菌落直径平均数

ρ为生长率

被检定培养基质量判定：

总分值：≥20.00为合格。≤19.99为不合格；其中：≤12.08为促生长能力偏弱；≤3.16为促生长能力不良。

菌落直径分值≥10.00为合格，≤9.99为不合格；其中：≤5.00为促生长能力偏弱；≤0.00为促生长能力不良。

菌落差分值≥5.00为合格，≤4.99为不合格；其中：≤4.08为促生长能力偏弱；≤3.16为促生长能力不良。

生长率分值≥5.00为合格，≤4.99为不合格；其中：≤3.00为促生长能力偏弱；≤0.00为促生长能力不良。

Claims (9)

1.微生物检测质量控制标准物质的制备方法，包括以下步骤：

a.选择性状稳定、形成集落能识别的、容易保存的、对人和动、植物无毒害的微生物，利用芽孢形成培养基或真菌孢子形成培养基制备细菌芽胞或真菌孢子，

b.用灭菌蒸馏水洗下细菌芽孢或真菌孢子，染色，用灭菌蒸馏水稀释至应用浓度，即内含指示微生物含量为10²～10⁹CFU/0.01G(或片、支、粒)，

c.将定量的已稀释至应用浓度的细菌芽孢或真菌孢子加入到已经环氧乙烷灭菌处理，并已达到无菌要求的定量载体中，均质，达到定量数值的细菌芽胞或真菌孢子均匀结合在载体上，

d.将灭菌后的吸附有定量数值细菌芽胞或真菌孢子的定量载体置于已经灭菌的尖底2ml具塞塑料管中。

2.如权利要求1所述的微生物检测质量控制标准物质的制备方法，其特征在于选择的微生物为嗜热脂肪杆菌芽胞、枯草杆菌黑色变种芽胞、短小杆菌芽胞、蜡样芽胞或白色念珠菌、酵母。

3.如权利要求1所述的微生物检测质量控制标准物质的制备方法，其特征在于步骤a中芽孢形成培养基的配方如下：蛋白胨1.0％、牛肉浸膏粉0.3％、氯化钠0.5％、葡萄糖0.1％、碳酸氢钠0.08％、琼脂粉1.2％。

4.如权利要求1所述的微生物检测质量控制标准物质的制备方法，其特征在于步骤a中真菌孢子形成培养基的配方如下：蛋白胨0.5％、葡萄糖4.0％、玉米淀粉4.0％、吐温80 0.1％、琼脂粉1.0％、碳酸氢钠0.01％。

5.如权利要求1所述的微生物检测质量控制标准物质的制备方法，其特征在于步骤c中载体可以是不溶性淀粉或可溶性淀粉、磁珠、直径为1～6mm的塑料圆珠、琼脂颗粒、明胶片、50％明胶溶液、直径为6mm的厚滤纸片、葡萄糖、蔗糖、乳糖。

6.以权利要求1至5的任一种方法制备的微生物检测质量控制标准物质，其特征在于载体上均匀地分布有细菌芽胞或真菌孢子，载体内含指示微生物含量为10²～10⁹CFU/0.01G(或片、支、粒)。

7.以权利要求1至5的任一种方法制备的微生物检测质量控制标准物质用于样品或产品等菌落计数项目检测过程中同步阳性对照。

8.以权利要求1至5的任一种方法制备的微生物检测质量控制标准物质用于培养基的质量检定。

9.以权利要求1至5的任一种方法制备的微生物检测质量控制标准物质用于灭菌器灭菌工艺制订及灭菌效果考核、绘制微生物检测实验室内质量控制曲线图及微生物检测实验室室内、室间盲样(技术人员技能)考核。