TW202409066A

TW202409066A - 長效神經生長因數多肽及其用途

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Publication number: TW202409066A
Application number: TW112124144A
Authority: TW
Inventors: 李平; 張磊
Original assignee: 大陸商舒泰神（北京）生物製藥股份有限公司
Priority date: 2020-11-19
Filing date: 2021-11-19
Publication date: 2024-03-01
Also published as: ZA202306005B; TW202229322A; KR20230107663A; JP2023551440A; CN114829384B; AU2021384629B2; CN114829384A; WO2022105847A1; AU2021384629A1; EP4247841A1; CN117946281A; CA3199589A1

Abstract

本發明涉及長效神經生長因數(Nerve Growth Factor，NGF)多肽，從N端到C端包含NGF部分和Fc部分，及其製備方法和用途。

Description

長效神經生長因數多肽及其用途

本申請要求2020年11月19日提交的國際專利申請No.PCT/CN2020/129925的優先權，其全部內容通過引用併入本文。

以ASCII TEXT文字檔提交序列表

以下提交的ASCII TEXT文字檔的內容通過整體引用併入本文中：電腦可讀形式(Computer Readable Format，CRF)的序列表(檔案名稱：202009094982_SEQLIST.txt，記錄日期：2020.09.09，大小：169KB)。

本發明涉及長效神經生長因數(NGF)多肽，從N端到C端包含NGF部分和Fc部分，及其製備方法和用途。

神經營養因數是一個高度同源的生長因數家族，在脊椎動物神經系統的發育和成熟階段對神經元的存活和維持至關重要。神經營養因數的產生受限可導致外周神經系統(Peripheral Nervous System，PNS)或中樞神經系統(central nervous system，CNS)神經元的變性或死亡。

神經生長因數(NGF)是神經營養因數家族中首個被發現的成員，由義大利科學家Levi-Montlcini於1953年在小鼠肉瘤細胞中首次發現。NGF是一種神經生長調節劑，具有為神經元提供營養和促進神經突生長的雙重生物學功能，在中樞和外周神經元的發育、分化、生長、再生和功能表達過程中發揮重要的調節作用。NGF包含α、β和γ三個亞基。β亞基是一個活性區域，由兩條單鏈通過非共價鍵結合而成。

對NGF的研究已經數十載。然而，市面上的NGF產品非常少，其中大部分產品主要應用於眼科疾病的治療，包括角膜潰瘍、視神經挫傷和視損傷。其根本原因在於實際應用中存在的限制和問題。

與其它蛋白相似，NGF的生物活性取決於其二級和三級結構，因此，在製備、純化、儲存和給藥過程中保持其生物活性尤為重要。

此外，在治療過程中，NGF可能引起一些患者產生無法忍受的痛疼，這也在一定程度上限制了它的使用。根據疼痛的神經生理機制可將其分為兩類：感覺性疼痛和神經性疼痛。前者由傷害性刺激直接引起，與組織損傷或炎症反應有關，也稱為炎症性疼痛。後者是由體感神經系統損傷或疾病直接引起的慢性疼痛。NGF通過影響炎症介質的釋放、離子通道的開放和促進神經纖維的生長引起疼痛，參與疼痛的病理生理過程；並通過調節離子通道和分子信號傳導參與疼痛的發展。一些學者推測NGF可能也通過促進致痛物質的表達引起疼痛，並且可能會在機體損傷後改變神經元的出芽和再生。研究表明NGF不會引起人類痛覺過敏的最大施用劑量為0.03μg/kg(Petty et al.,Ann Neurol.1994；36(2)：244-246)。然而，如此低的劑量限制了NGF的應用，也限制了其適應症的擴展，如用於中樞神經系統。

作為一種蛋白類藥物，NGF促進神經生長的活性部分主要在於β-NGF。β-NGF的沉降係數為2.5S，分子量為13.5KDa，且在代謝過程中容易被腎小球過濾掉，導致其在體內的半衰期短。研究表明小鼠肌肉注射β-NGF藥物的T1/2(β)=2.2h，Tmax=0.5h，且注射頻率為一天一次。由於在NGF注射期間，注射部位或注射側下肢出現的不良疼痛反應，最好能減少施用的總次數和頻率。

本文提及的所有出版物、專利、專利申請和已公開的專利申請所披露的內容，全部以引用方式併入本文。

本發明一方面涉及一種長效神經生長因數(NGF)多肽，從N端到C端包含NGF部分和Fc部分，所述NGF部分包含SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(如SEQ ID NOs：1-3中的任一氨基酸序列)，且所述Fc部分來自IgG1 Fc或IgG4 Fc。

在一些實施例中，如上所述任一種長效NFG多肽，NGF部分通過肽接頭與Fc部分融合。在一些實施例中，肽接頭包含SEQ ID NOs：68-99中的任一氨基酸序列，如SEQ ID NOs：68-72或SEQ ID NO：68或69中的任一氨基酸序列。在一些實施例中，肽接頭包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：70)，其中n為1、2、3、4、5或6中的任何一個。

在一些實施例中，如上所述任一種長效NGF多肽，Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或8的IgG1 Fc。在一些實施例中，Fc部分在相對於SEQ ID NO：8的位置上包含突變，所述位置選自E233、L234、L235、G236、G237、N297、A327、A330和P331中的一個或多個。在一些實施例中，Fc部分相對於SEQ ID NO：8包含突變，所述突變選自E233P、L234V、L234A、L235A、L235E、G236del、G237A、N297A、A327G、A330S和P331S中的一個或多個。在一些實施例中，Fc部分進一步缺失SEQ ID NO：7或8的前5個氨基酸。在一些實施例中，Fc部分相對於SEQ ID NO：8包含L234A、L235A和P331S突變。在一些實施例中，Fc部分包含氨基酸序列SEQ ID NO：11或12。在一些實施例中，長效NGF多肽包含SEQ ID NOs：62-64中的任一氨基酸序列。在一些實施例中，Fc部分相對於SEQ ID NO：8包含E233P、L234V、L235A、G236del、A327G、A330S和P331S突變。在一些實施例中，Fc部分包含氨基酸序列SEQ ID NO：15或16。在一些實施例中，長效NGF多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：66。在一些實施例中，Fc部分相對於SEQ ID NO：8包含L234A、L235E、G237A、A330S和P331S突變。在一些實施例中，Fc部分包含氨基酸序列SEQ ID NO：13或14。在一些實施例中，長效NGF多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：65。在一些實施例中，Fc部分相對於SEQ ID NO：8包含N297A突變。在一些實施例中，Fc部分包含氨基酸序列SEQ ID NO：9或10。在一些實施例中，長效NGF多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：61。

在一些實施例中，如上所述任一種長效NGF多肽，Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：17的IgG4 Fc。在一些實施例中，Fc部分在相對於 SEQ ID NO：17的位置上包含突變，所述位置選自S228、F234和L235中的一個或多個。在一些實施例中，Fc部分相對於SEQ ID NO：17包含突變，所述突變選自S228P、F234A和L235A中的一個或多個。在一些實施例中，Fc部分包含氨基酸序列SEQ ID NO：18。在一些實施例中，長效NGF多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：67。

在一些實施例中，如上所述任一種長效NGF多肽，當通過靜脈注射、肌肉注射或皮下注射給個體(例如，人類)時，長效NGF多肽的半衰期至少為10小時(例如，至少為11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100小時中的任何一個)。

在一些實施例中，如上所述任一種長效NGF多肽，與包含氨基酸序列SEQ ID NO：4的NGF部分的NGF多肽相比，長效NGF多肽引起更少的疼痛(例如，至少減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的疼痛)。

同時涉及編碼本文所述任何長效NGF多肽的分離核酸、包含所述核酸的載體、包含所述核酸或載體的宿主細胞(例如，CHO細胞(Chinese hamster ovary cell)、HEK 293細胞(Human Embryonic Kidney Cells 293)、Hela細胞或COS細胞)、組合物(例如，藥物組合物)、試劑盒以及包含本文所述任何長效NGF多肽的製品。還涉及使用本文所述任何長效NGF多肽或包含其的藥物組合物用於個體(例如，人類)治療NGF相關疾病(例如，神經系統疾病或非神經系統疾病)的方法。

圖1A-1F所示分別為人類野生型IgG1 Fc IGHG1*05和IgG1 Fc自然變體IGHG1*03(圖1A)、修飾的IgG1 Fc M1-5和IGHG1*03(圖1B)、修飾的IgG1 Fc M3-5和IGHG1*03(圖1C)、修飾的IgG1 Fc M5-5和IGHG1*03(圖1D)、修飾的IgG1 Fc M7和IGHG1*03(圖1E)以及修飾的IgG4 Fc和人類野生型IgG4 Fc(圖1F)的序列比對圖。

圖2所示為包含信號肽(Signal peptide，SP)、前導肽和成熟NGF的preproNGF結構。在主要裂解位點的Furin裂解負責將proNGF加工為成熟NGF。

圖3A-3M所示為尺寸排阻色譜法(Size Exclusion Chromatography，SEC)測量各成熟NGF-Fc融合蛋白在40℃穩定性加速試驗中不同時間點的聚集體百分比、片段含量百分比和單體含量百分比。

圖4A-4M所示為應用十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(capillary electrophoresis-Sodium dodecyl sulfate，CE-SDS)方法測定各成熟NGF-Fc融合蛋白在40℃穩定性加速試驗中不同時間點的檢測結果。

圖5A-5B所示為各NGF-Fc融合蛋白處理下，TF-1細胞的增殖活性結果。蘇肽生^®鼠NGF、NGF突變體118aa(mNGF118)和重組人NGF(rhNGF)作為對照。

圖6A-6D所示為各NGF-Fc融合蛋白對大鼠體內頸上神經節(superior cervical ganglion，SCG)生長的生物活性結果。蘇肽生^®鼠NGF和mNGF118作為對照。PBS作為陰性對照。

圖7A所示為血漿中2-118-L3Fc10-M3-5、2-118-L3G4-BM和對照組mNGF118(無Fc融合的β-NGF118aa突變體)的藥代動力學(Pharmacokinetics，PK)曲線。圖7B所示為肌肉注射劑量為235μg/kg時它們的體內半衰期。

圖8所示為NGF(蘇肽生^®鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3Fc10-M3-5或2-118-L3G4-BM)處理下，糖尿病小鼠的傷口癒合率。PBS處理作為陰性對照。

圖9A-9B所示分別為NGF(蘇肽生^®鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3Fc10-M3-5或2-118-L3G4-BM)處理下，人卵巢顆粒細胞(KGN)的增殖率和分泌的雌激素濃度。圖9C所示為NGF(蘇肽生^®鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3Fc10-M3-5或2-118-L3G4-BM)處理下，大鼠卵巢早衰動物疾病模型中各級卵泡的數量。

圖10A和10B所示為NGF(蘇肽生^®鼠NGF或mNGF118)、NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3Fc10-M3-5或2-118-L3G4-BM)或作為陰性對照的0.9%氯化鈉溶液處理下，神經營養性角膜炎動物模型的角膜螢光素鈉染色評分(圖10A)和平均角膜神經長度(圖10B)。

本發明涉及長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分和Fc部分。術語“長效NGF多肽”、“長效NGF-Fc融合蛋白”和“長效NGF構建體”可互換使用。

NGF在中樞和外周神經元的發育、分化、生長、再生和功能性表達過程中發揮重要的調節作用。NGF已被用於治療神經系統發育異常，包括弱視、神經瘤、各種神經損傷及神經系統疾病。然而，其引起疼痛、體內半衰期短、為避免痛敏的低劑量限制和頻繁給藥等副作用限制了NGF的廣泛應用。將蛋白類藥物與半衰期更長和/或分子量更大的部分融合是使某些蛋白類藥物具有長效活性的一種策略。然而，如何在延長蛋白類藥物半衰期的同時提高或維持其生物活性仍是臨床上的一道難題。

本文所述的長效NGF多肽具有以下一種或多種優越效果：1)它們在體外和體內都具有高度的生物活性(例如，促進頸上神經節生長)，甚至優於現有的NGF-Fc融合蛋白或NGF藥物；2)它們在體內的半衰期很長，不僅比無融合部分的NGF蛋白長得多，而且顯著長於現有的NGF-Fc融合蛋白，從而減少了給藥頻率和總給藥次數，為患者提供了方便並減少了成本；3)它們可以減少如疼痛等副作用，甚至達到無痛，從而增加了患者耐受的劑量，並為擴大適應症範圍和適用於中樞神經系統提供了可能性；4)它們降低或最小化抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)和/或補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC)，從而避免在治療期間產生不期望的免疫反應；5)它們具有優異的熱穩定性(例如，高熔解溫度(Melting Temperature，Tm)和/或高聚集起始溫度(Tagg))；6)它們在加速應力(例如，加熱)下具有優異的穩定性，如較少的或沒有片段化、聚集體形成和/或聚集體增量，從而保持藥性；以及7)它們在體內治療NGF相關疾病方面非常有效，例如，神經系統疾病，如糖尿病神經性病變、阿爾茨海默症和神經營養性角膜炎，非神經系統疾病，如卵巢早衰和生精障礙(例如，少精子症、弱精子症、少弱精子症)，與無Fc融合的NGF部分相比，具有與之相當甚至更好的治療效果。

因此，本發明一方面涉及長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分和Fc部分，所述NGF部分包含SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列，且所述Fc部分來自IgG1 Fc或IgG4 Fc。

同時涉及編碼所述長效NGF多肽的分離的核酸、包含所述核酸的載體、包含所述核酸或載體的宿主細胞、生產所述長效NGF多肽的方法、藥物組合物和包含所述長效NGF多肽的生產製品，以及使用所述長效NGF多肽或藥物組合物治療疾病(例如，與神經元變性或損傷有關的神經系統疾病，如糖尿病神經性病變、阿爾茨海默症和神經營養性角膜炎，非神經系統疾病，如卵巢早衰和生精障礙)的方法。

I.定義

除非上下文另有明確說明，實施本發明將採用本領域技術範圍內的病毒學、免疫學、微生物學、分子生物學和重組DNA技術的常規方法，許多所述方法將在下文詳述以供說明。所述技術在文獻中有充分解釋。參見Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,New York,N.Y.(2009)；Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed.,John Wiley & Sons,1995；Sambrook and Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd Edition,2001)；Maniatis et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982)；DNA Cloning：A Practical Approach,vol.I&II(D.Glover,ed.)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,ed.,1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames & S.Higgins,eds.,1985)；Transcription and Translation(B.Hames & S.Higgins,eds.,1984)；Animal Cell Culture(R.Freshney,ed.,1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)和其它相似參考資料。

如本文所用，“治理(treatment)”或“治療(treating)”是一種為獲得有益或期望的結果的方法，包括臨床結果。鑒於本申請的目的，所述有益或期望的臨床結果包括但不限於下列一種或多種：緩解由疾病引起的一種或多種症狀、減少疾病範圍、穩定疾病(例如，預防或延緩疾病惡化)、預防或延緩疾病傳播、預防或延緩疾病復發、延緩或減緩疾病發展、改善疾病狀態、緩解疾病(部分或全部)、減少治療疾病所需的一種或多種其它藥物的劑量、延緩疾病發展、提高生存品質和/或延長生存期。同時，“治療”還包括減少疾病的病理結果。本發明的方法考慮了這些治療的任何一個或多個方面。例如，如果一個或多個與該疾病相關的症狀得到緩解或消除，包括但不限於減少該疾病引起的症狀，提高該疾病患者的生活品質，減少治療疾病所需的其它藥物的劑量，和/或延長個體的生存期，則認為該患者被成功“治療”。

術語“預防(prevent)”和類似的詞語，如“預防(prevented)”、“預防(preventing)”等表示預防、抑制或降低疾病或病症復發可能性的方法。它還指延緩疾病或病症的復發或延緩疾病或病症的復發。如本文所用，“預防”和類似詞語還包括在疾病或病症復發之前降低疾病或病症的強度、影響、症狀和/或負擔。

如本文所用，“延緩”疾病的發展表示推遲、阻礙、減緩、減慢、穩定和/或推遲疾病的發展。根據疾病史和/或接受治療的個體不同，延緩的時間可能不同。一種“延緩”疾病發展的方法是指與不使用該方法相比，在給定時間範圍內降低疾病發展概率和/或在給定時間範圍內降低疾病程度的方法。這種比較通常基於臨床研究，使用統計上顯著的個體數。

如本文所用，術語“有效量”是指足以治療特定紊亂、病症或疾病的藥物劑量或藥物組合物劑量，如改善、減輕、減弱和/或延緩一個或多個症狀。在一些實施例中，有效量是足以延緩疾病發展的量。在一些實施例中，有效量是足以預防或延緩疾病復發的量。有效量可在一次或多次施用中給藥。在一些實施例中，藥物或組合物的有效量可能：(i)支持神經元存活；(ii)促進神經突生長；(iii)增強神經化學分化；(iv)促進胰腺β細胞增殖；(v)誘導先天性和/或獲得性免疫；(vi)預防或延緩疾病的發生和/或復發；和/或(vii)在一定程度上緩解與該疾病相關的一個或多個症狀。

如本文所用，“個體”或“主體”是指哺乳動物，包括但不限於人類、牛、馬、貓、狗、齧齒動物或靈長類動物。在一些實施例中，所述個體是指人類。

術語“恒定結構域”是指免疫球蛋白分子的一部分，相對於免疫球蛋白分子中包含抗原結合位元點可變結構域的另一部分，恒定結構域具有更保守的氨基酸序列。恒定結構域包含重鏈的C_H1、C_H2和C_H3結構域(統稱為C_H)和輕鏈的CHL(或C_L)結構域。根據免疫球蛋白重鏈(C_H)恒定結構域的氨基酸序列，免疫球蛋白可分為不同類別或亞型。有五類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，重鏈分別為α、δ、ε、γ和μ。根據C_H序列和功能的相對較小差異，將γ和α進一步劃分為亞類，例如，人類表達以下亞類：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。

如本文所用，術語“Fc區”、“片段結晶區”、“Fc結構域”或“Fc部分”用於定義免疫球蛋白重鏈的C端區域，包括天然序列Fc區和變體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈Fc區的邊界可能不同，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為從Cys226位置的氨基酸殘基或從Pro230開始，延伸至其羧基末端。Fc區的C端賴氨酸(根據EU編號系統為447殘基)可能被移除，例如，在蛋白質的生產或純化過程中，或通過重組工程編碼蛋白質的核酸而移除。用於本文所述構建體的合適的天然序列Fc區包括人類IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。

如本文所用，術語IgG“亞型”或“亞類”是指通過恒定結構域的化學和抗原特性定義的免疫球蛋白的任何亞類。免疫球蛋白主要分為五大類：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，並且其中多個可進一步分為亞類(亞型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。與不同免疫球蛋白類別相對應的的重鏈恒定結構域分別稱為α、γ、ε、γ和μ。不同類別免疫球蛋白的亞單位結構和三維構型已眾所周知，並在Abbas等人的《細胞和分子免疫學》第四版(W.B.Saunders，Co.，2000)中進行了詳述。

“Fc受體”或“FcR”描述了與包含Fc的結構(例如，抗體)中的Fc區結合的受體。首選的FcR是人類FcR天然序列。此外，首選的FcR是一種結合IgG抗體(一種γ受體)的FcR，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII等受體亞類，以及這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(一種“啟動受體”)和FcγRIIB(一種“抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，主要在胞質結構域有所不同。啟動受體FcγRIIA在其胞質結構域中包含免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞質結構域中包含免疫受體酪氨酸抑制基序(Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)(見於M.Daëron,Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。在Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel et al.,Immunomethods 4：25-34(1994)和de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中對FcRs進行了綜述。本文中術語“FcR”涵蓋其它FcRs，包括那些在未來將被鑒定的FcRs。

術語“Fc受體”或“FcR”也包括新生兒受體FcRn，負責將母體IgG轉運給胎兒。Guyer et al.,J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.,J.Immunol.24：249(1994)。測定與FcRn結合的方法已眾所周知(參見Ghetie and Ward,Immunol.Today 18：(12)：592-8(1997)；Ghetie et al.,Nature Biotechnology 15(7)：637-40(1997)；Hinton et al.,J.Biol.Chem.279(8)：6213-6(2004)；WO 2004/92219(Hinton et al.))。可以測定人類FcRn高親和力結合多肽在體內和血清中與FcRn結合的半衰期，例如，在表達人類FcRn的轉基因小鼠或轉染的人類細胞系中，或在施用具有變體Fc區的多肽的靈長類動物中。WO 2004/42072(Presta)詳述了增強或減弱與FcRs結合的抗體變體。參見Shield et al.,J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。

“抗體效應功能”是指那些由包含Fc的結構(例如，抗體)中的Fc區(天然序列Fc區或氨基酸序列變體Fc區)引起的生物活性，並隨Fc亞型改變。抗體效應功能的示例包括：C1q結合和補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc 受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體的下調(例如，B細胞受體)和B細胞活化。“減少或最小化”抗體效應功能表示與野生型或未經修飾的包含Fc的結構(例如，抗體)相比，減少至少50%(或者60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)。測定抗體效應功能可由本領域普通技術人員輕而易舉地測定和測量。在優選實施例中，補體結合、補體依賴性細胞毒性和抗體依賴性細胞毒性的抗體效應功能會受到影響。在一些實施例中，通過恒定結構域中的突變消除糖基化來消除效應功能，例如，“無效應功能突變”。在一些實施例中，無效應功能突變體是在C_H2區的N297A或DANA突變(D265A+N297A)。Shields et al.,J.Biol.Chem.276(9)：6591-6604(2001)。另外，導致效應功能降低或消除的其它突變包括：K322A和L234A/L235A(LALA)。另外，可以通過生產技術減少或消除效應功能，如在不進行糖基化的宿主細胞中(例如，大腸桿菌)或導致糖基化模式改變的宿主細胞中表達，所述糖基化模式改變在促進效應功能方面無效或效果較小(例如，Shinkaw et al.,J.Biol.Chem.278(5)：3466-3473(2003))。

“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”或ADCC是指一種細胞毒性形式，其中分泌型Ig(或配體-Fc結構)與存在於某些細胞毒性細胞(例如，自然殺傷細胞(natural killer，NK)、中性粒細胞和巨噬細胞)上的Fc受體(Fc receptors，FcRs)結合，使這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜帶抗原(或攜帶配體受體)的靶細胞，隨後用細胞毒素殺死靶細胞。抗體(或包含Fc的結構)“武裝”細胞毒性細胞，且是通過這種機制殺死靶細胞所必需的。介導ADCC的主要細胞，即NK細胞只表達FcγRIII，而單核細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)第464頁的Table 2中總結了造血細胞Fc的表達。為評估目標分子的ADCC活性，可以進行體外ADCC試驗，如U.S.Pat.No.5,500,362或5,821,337中進行了詳述。適用於此類試驗的效應細胞包括外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)和自然殺傷細胞(NK)。或者，或額外地，目標分子的ADCC活性也可以在體內進行評估，例如，在動物模型中如在Clynes et al.,PNAS(USA)95：652-656(1998)中所公開的。

“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”是指在補體存在的情況下裂解靶細胞。經典的補體途徑的啟動是由補體系統第一組分(C1q)與(合適亞類的)包含Fc的結構結合起始的，所述包含Fc的結構通過Fc融合的配體與其同源受體結合。為了評估補體啟動，可以進行CDC試驗，如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述。U.S.Pat.No.6,194,551B1和WO99/51642中詳述了具有改變的Fc區氨基酸序列從而增加或減少C1q結合能力的抗體變體。這些專利出版物的內容通過引用併入本文。參見Idusogie et al.J.Immunol.164：4178-4184(2000)。

如本文所用，術語“特異性結合”、“特異性識別”或“特異性用於”是指可測量和可再現的相互作用，如配體和受體之間的結合，當存在包括生物分子在內的異質分子群的情況下可確定配體的存在。例如，與受體特異性結合的配體，與結合其它受體相比時，在結合目標受體時具有更大的親和性、親和力、更容易和/或持續時間更長。在一些實施例中，通過例如放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)法進行測定，配體與無關受體的結合程度小於配體與目標受體結合程度的10%。在一些實施例中，特異性結合靶受體的配體的平衡解離常數(K_d)

10^-5M、

10^-6M、

10^-7M、

10^-8M、

10^-9M、

10^-10M、

10^-11M或

10^-12M。在一些實施例中，配體特異性結合在不同物種中保守的受體。在一些實施例中，特異性結合可以包括但不要求排他性結合。可利用本領域已知的方法通過實驗確定配體的結合特異性。如包括但不限於Western blots、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIACORE^TM-測試和肽掃描。

“結合親和力”通常指分子(例如，配體)的單個結合位點和其結合搭檔(例如，受體)之間的非共價相互作用總和的強度。除非另有說明，如本文所用，“結合親和力”指內在結合親和力，該內在親和力可以反映結合對成員之間的1：1相互作用。結合親和力可以採用K_d、K_off、K_on或K_a表示。如本文所用，術語“K_off”是指配體從配體/受體複合物中解離的速率常數，通過動力學選擇裝置測定，以s^-1為單位來表示。如本文所用，術語“K_on”是指配體與受體結合形成配體/受體複合物的結合速率常數，以M^-1s^-1為單位來表示。如本文所用，術語平衡解離常數“K_d”是指特定配體-受體相互作用時的解離常數，是指在受體溶液中，配體佔據所有受體結合位點的一半並且達到平衡時所需的配體濃度，等於K_off/K_on，以M為單位來表示。測定K_d的前提是所有的結合分子均在溶液中。當受體在細胞膜上的情況下，相應的解離速率常數用EC₅₀表示，是K_d的一個很好的近似值。親和常數K_a，是解離常數K_d的倒數，以M^-1為單位來表示。解離常數(K_d)可以作為反映配體與受體親和力的指標。使用所述方法得到的K_d值，以M(mol/L)為單位來表示。

半抑制濃度(IC₅₀)是對物質(例如，配體)在抑制特定生物或生化功能中有效性的度量。它表示需要多少特定藥物或其它物質(抑制劑，例如，配體)能將給定的生物過程抑制一半。數值通常表示為摩爾濃度。IC₅₀與激動劑藥物或其它物質(例如，配體)的“EC₅₀”相當。EC₅₀也代表在體內獲得最大效應的50%所需的血漿濃度。如本文所用，“IC₅₀”用於表示在體外中和50%的受體生物活性所需配體的有效濃度。可通過生物測量測定IC₅₀或EC₅₀，如通過FACS分析(競爭結合試驗)抑制配體結合、基於細胞的細胞因數釋放試驗或放大發光的均相酶聯免疫試驗(AlphaLISA)。

如本文所用，“共價鍵”是指兩個原子之間通過共用一個或多個電子形成的穩定鍵。共價鍵的示例包括但不限於肽鍵和二硫鍵。如本文所用，“肽鍵”是指氨基酸的羧基與相鄰氨基酸的胺基之間形成的共價鍵。如本文所用，“二硫鍵”是指兩個硫原子之間形成的共價鍵，如兩個Fc片段通過一個或多個二硫鍵結合。兩個片段之間的一個或多個二硫鍵可能通過連接兩個片段中的硫醇基形成。在一些實施例中，兩個Fc片段的一個或多個半胱氨酸之間可能形成一個或多個二硫鍵。氧化兩個硫醇基可形成二硫鍵。在一些實施例中，共價連接是由共價鍵直接連接而成的。在一些實施例中，共價連接直接由肽鍵或二硫鍵連接。

肽或多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(%)”或“同源性”被定義為候選序列中與特定多肽或多肽序列中相同氨基酸殘基所占的百分比，在序列比對並引入間隙(如果必要)後以實現序列同一性百分比的最大化，並且不考慮任何保守替換作為序列同一性的一部分。為了確定氨基酸序列同一性百分比，可以通過本領域技術範圍內的多種比對方式，例如，使用如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)、或MUSCLE軟體等可公開獲得的電腦軟體。本領域技術人員可以確定用於測量比對的合適參數，包括在所比較的序列的全長上實現最大比對所需的任何演算法。

如本文所用，多肽的“C端”是指該多肽的最後一個氨基酸殘基，該殘基賦予其胺基以與其相鄰氨基酸殘基的羧基形成肽鍵。如本文所用，多肽的“N末端”是指該多肽的第一個氨基酸，該殘基賦予其羧基以與其相鄰氨基酸殘基的胺基形成肽鍵。

“分離的”多肽是指一種已從其生產環境(例如，天然或重組)的組分中鑒定、分離和/或回收的多肽。優選地，所分離的多肽與其生產環境中的所有其它成分沒有關聯。生產環境的污染成分，如重組轉染細胞產生的污染成分，通常會幹擾多肽的研究、診斷或治療，並且可能包括酶、激素和其它蛋白溶質或非蛋白溶質。在一些實施例中，多肽將被純化至：(1)按重量計算，多肽含量大於95%，如通過Lowry法確定，在一些實施例中，按重量計算，多肽含量大於99%；(2)通過使用旋杯測序儀達到足以獲得至少15個N端殘基或內部氨基酸序列的程度；或(3)通過SDS-PAGE在非還原性或還原性條件下使用考馬斯藍或優選為銀染色達到同質性。分離的多肽包括在重組細胞內的原位多肽，因為多肽天然環境中的至少一個要素是不存在的。然而，通常情況下，一個分離的多肽至少要經過一個純化步驟。

一種編碼一個構建體(如本文所述的NGF多肽)的“分離的”核酸分子為一種從至少含一種雜質的核酸分子中鑒定和分離出來的核酸分子，所述雜質核酸分子通常與生產它的環境有關。優選地，所分離的核酸與其生產環境中的所有成分沒有關聯。如本文所述的編碼多肽的分離的核酸分子是以一種並非它在自然界中發現時的形式或形態存在。因此，分離的核酸分子不同於自然存在於細胞中編碼本文所述多肽的核酸。一種分離的核酸包括含有該核酸分子的細胞中所含的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或與其自然染色體位置不同的染色體位置上。

術語“控制序列”是指在特定宿主生物體中表達可操作連接編碼序列所必需的DNA序列。例如，適合原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操作序列和核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、多聚腺苷酸化信號和增強子。

當核酸與另一個核酸序列建立功能性關係時，所述核酸即為“可操作地連接”。例如，如果前序列或分泌先導物的DNA作為參與多肽分泌的前蛋白表達，則所述DNA可操作連接到多肽的DNA；如果啟動子或增強子影響序列的轉錄，則所述啟動子或增強子可操作連接到編碼序列；或如果核糖體結合位點處在便於翻譯的位置，則所述核糖體結合位點可操作連接到編碼序列。一般來說，“可操作連接”意味著連接的DNA序列是連續的，並且，對於分泌先導物，其不僅是連續的並且處於讀取階段(reading phase)。然而，增強子不必是連續的。連接是通過在適宜的限制性位點進行連接來完成的。如果不存在此類位點，則按照常規做法使用合成的寡核苷酸適配體或接頭。

如本文所用，術語“載體”是指一種核酸分子能夠擴增與其連接的另一核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構的載體以及被引入已知宿主細胞基因組的載體。某些載體能夠指導與之連接的核酸表達。在本文中稱此類載體為“表達載體”。

如本文所用，術語“轉染”或“轉化”或“轉導”是指外源核酸轉移或引入宿主細胞的過程。“轉染的”或“轉化的”或“轉導的”細胞是用外源核酸轉染、轉化或轉導的細胞。所述細胞包括原代受試細胞及其子代。

術語“宿主細胞”、“宿主細胞系”和“宿主細胞培養”可互換使用，指已引入外源核酸的細胞，包括此類細胞的子代。宿主細胞包括“轉化體”和“轉化細胞”，其中包括原代轉化細胞和由此產生的子代，而不考慮傳代次數。子代在核酸上可能與母細胞不完全相同，可能含有突變。本文包括在原始轉化細胞中篩選或選擇與其具有相同功能或生物活性的突變子代。

術語“藥物製劑”或“藥物組合物”是指一種製劑，所述製劑為使活性成分的生物活性有效的形式，並且不包含對施用所述製劑的受試者具有不可接受毒性的額外成分。這種製劑是無菌的。“無菌”製劑是無菌的或不含任何活的微生物及其孢子。

本文中所述的本發明的實施例應理解為包括“由......組成”和/或“基本上由......組成”的實施例。

本文中提及“約”為一個數值或參數，包含(和描述)針對該數值或參數本身的變體。例如，涉及“約X”的描述包括“X”的描述。

如本文所用，提及“不是”一個數值或參數，通常表示並描述“除了”某一數值或參數之外。例如，該方法不能用於治療X型癌症，意味著該方法通常用於治療除X型癌症之外的其它類型。

如本文所用，術語“約X-Y”與“約X到約Y”意思相同。

除非上下文另有明確說明，本文和所述請求項中所採用的單數形式“一”，“一個”和“該”包括複數物件。

II.長效NGF多肽

本發明一方面涉及長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分和Fc部分。在一些實施例中，所涉及的長效NGF多肽從N端到C端包含NGF部分和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，並且所述Fc部分來自IgG1 Fc或IgG4 Fc。在一些實施例中，NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：1。在一些實施例中，當通過靜脈注射、肌肉注射或皮下注射給個體(例如，人類)時，長效NGF多肽的半衰期至少為10小時(例如，至少為11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100小時中的任何一個)。在一些實施例中，與包含氨基酸序列SEQ ID NO：4的NGF部分相比，長效NGF多肽引起的疼痛更少(例如，至少減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的疼痛)。

在一些實施例中，NGF部分通過肽接頭與Fc部分融合。因此，在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，並且所述Fc部分來自IgG1 Fc或IgG4 Fc。在一些實施例中，肽接頭包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：70)，其中n為1、2、3、4、5或6中的任一個。在一些實施例中，肽接頭包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：68或69。在一些實施例中，NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：1。在一些實施例中，當通過靜脈注射、肌肉注射或皮下注射給個體(例如，人類)時，長效NGF多肽的半衰期至少約為10小時(例如，至少約為11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100小時中的任何一個)。在一些實施例中，與包含氨基酸序列SEQ ID NO：4的NGF部分相比，長效NGF多肽引起的疼痛更少(例如，至少減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的疼痛)。

在一些實施例中，Fc部分來自IgG1 Fc，如人類IgG1 Fc。在一些實施例中，Fc部分為野生型IgG1 Fc(例如，人類IgG1 Fc)或其天然突變體。在一些實施例中，Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或8的IgG1 Fc。因此，在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，並且所述Fc部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：7或8。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，並且所述Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的IgG1 Fc。在一些實施例中，Fc部分缺失SEQ ID NO：7或8的前5個氨基酸。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，所述Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的IgG1 Fc，並且所述Fc部分在相對於SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的位置上包含(或基本上由......組成、或由......組成)突變，所述位置選自E233、L234、L235、G236、G237、N297、A327、A330和P331中的一個或多個。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，所述Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的IgG1 Fc，並且所述Fc部分相對於SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)包含(或基本上由......組成、或由......組成)突變，所述突變選自E233P、L234V、L234A、L235A、L235E、G236del、G237A、N297A、A327G、A330S和P331S中的一個或多個。在一些實施例中，Fc部分進一步缺失SEQ ID NO：7或8的前5個氨基酸。在一些實施例中，肽接頭包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：70)，並且其中n為1、2、3、4、5或6中的任何一個。在一些實施例中，肽接頭包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：68或69。在一些實施例中，NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：1。在一些實施例中，當通過靜脈注射、肌肉注射或皮下注射給個體(例如，人類)時，長效NGF多肽的半衰期至少為10小時(例如，至少為11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100小時中的任何一個)。在一些實施例中，與包含氨基酸序列SEQ ID NO：4的NGF部分相比，長效NGF多肽引起的疼痛更少(例如，至少減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的疼痛)。

在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NOs：1-4中的任一個(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，所述Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的IgG1 Fc，並且所述Fc部分在相對於SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的位置上包含(或基本上由......組成、或由......組成)突變，所述位置為L234、L235和P331。在一些實施例中，Fc部分進一步缺失SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的前5個氨基酸。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，所述Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的IgG1 Fc，並且所述Fc部分相對於SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)包含(或基本上由......組成、或由......組成)L234A、L235A和P331S突變。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，所述Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的IgG1 Fc，所述Fc部分相對於SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)包含(或基本上由......組成、或由......組成)L234A、L235A和P331S突變，並且所述Fc部分進一步缺失SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的前5個氨基酸。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，並且所述Fc部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：11或12。在一些實施例中，肽接頭包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：70)，並且其中n為1、2、3、4、5或6中的任何一個。在一些實施例中，肽接頭包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：68或69。在一些實施例中，NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：1。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：62-64中的任一氨基酸序列。在一些實施例中，當通過靜脈注射、肌肉注射或皮下注射給個體(例如，人類)時，長效NGF多肽的半衰期至少為10小時(例如，至少為11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100小時中的任何一個)。在一些實施例中，與包含氨基酸序列SEQ ID NO：4的NGF部分相比，長效NGF多肽引起的疼痛更少(例如，至少減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的疼痛)。

在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，所述Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的IgG1 Fc，並且所述Fc部分在相對於SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的位置上包含(或基本上由......組成、或由......組成)突變，所述位置為E233、L234、L235、G236、A327、A330和P331上。在一些實施例中，Fc部分進一步缺失SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的前5個氨基酸。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF 部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，所述Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的IgG1 Fc，並且所述Fc部分相對於SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)包含(或基本上由......組成、或由......組成)E233P、L234V、L235A、G236del、A327G、A330S和P331S突變。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含一個NGF部分、一個可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，所述Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的IgG1 Fc，並且所述Fc部分相對於SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)包含(或基本上由......組成、或由......組成)E233P、L234V、L235A、G236del、A327G、A330S和P331S突變，並且所述Fc部分進一步缺失SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的前5個氨基酸。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，並且所述Fc部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：15或16。在一些實施例中，肽接頭包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：70)，並且其中n為1、2、3、4、5或6中的任何一個。在一些實施例中，肽接頭包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：68或69。在一些實施例中，NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：1。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：66。在一些實施例中，當通過靜脈注射、肌肉注射或皮下注射給個體(例如，人類) 時，長效NGF多肽的半衰期至少為10小時(例如，至少為11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100小時中的任何一個)。在一些實施例中，與包含氨基酸序列SEQ ID NO：4的NGF部分相比，長效NGF多肽引起的疼痛更少(例如，至少減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的疼痛)。

在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，所述Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的IgG1 Fc，並且所述Fc部分在相對於SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的位置上包含(或基本上由......組成、或由......組成)突變，所述位置為L234、L235、G237、A330和P331。在一些實施例中，Fc部分進一步缺失SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的前5個氨基酸。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，所述Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的IgG1 Fc，並且所述Fc部分相對於SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)包含(或基本上由......組成、或由......組成)L234A、L235E、G237A、A330S和P331S突變。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，所述Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的IgG1 Fc，所述Fc部分相對於SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)包含(或基本上由......組成、或由......組成)L234A、L235E、G237A、A330S和P331S突變，並且所述Fc部分進一步缺失SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的前5個氨基酸。因此在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，並且所述Fc部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：13或14。在一些實施例中，肽接頭包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：70)，並且其中n為1、2、3、4、5或6中的任何一個。在一些實施例中，肽接頭包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：68或69。在一些實施例中，NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：1。因此在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：65。在一些實施例中，當通過靜脈注射、肌肉注射或皮下注射給個體(例如，人類)時，長效NGF多肽的半衰期至少為10小時(例如，至少為11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100小時中的任何一個)。在一些實施例中，與包含氨基酸序列SEQ ID NO：4的NGF部分相比，長效NGF多肽引起的疼痛更小(例如，至少減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的疼痛)。

在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，所述Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的IgG1 Fc，並且所述Fc部分在相對於SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的位置N297上包含(或基本上由......組成、或由......組成) 一個突變。在一些實施例中，Fc部分進一步缺失SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的前5個氨基酸。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，所述Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的IgG1 Fc，並且所述Fc部分相對於SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)包含(或基本上由......組成、或由......組成)一個N297A突變。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，所述Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的IgG1 Fc，所述Fc部分相對於SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)包含(或基本上由......組成、或由......組成)一個N297A突變，並且所述Fc部分進一步缺失SEQ ID NO：7或8(例如，SEQ ID NO：8)的前5個氨基酸。因此在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，並且所述Fc部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：9或I0。在一些實施例中，肽接頭包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：70)，並且其中n為1、2、3、4、5或6中的任何一個。在一些實施例中，肽接頭包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：68或69。在一些實施例中，NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：1。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：61。在一些實施例中，當通過靜脈注射、肌肉注射或皮下注射給個體(例如，人類)時，長效NGF多肽的半衰期至少為10小時(例如，至少為11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100小時中的任何一個)。在一些實施例中，與包含氨基酸序列SEQ ID NO：4的NGF部分相比，長效NGF多肽引起的疼痛更小(例如，至少減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的疼痛)。

在一些實施例中，Fc部分來自IgG4 Fc，如人類IgG4 Fc。在一些實施例中，Fc部分為野生型IgG4 Fc(例如，人類IgG4 Fc)或其天然突變體。在一些實施例中，Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：17的IgG4 Fc。因此，在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，並且所述Fc部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：17。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，並且所述Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：17的IgG4 Fc。在一些實施例中，Fc部分缺失SEQ ID NO：17的前5個氨基酸。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，所述Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：17的IgG4 Fc，並且所述Fc部分在相對於SEQ ID NO：17的位置上包含(或基本上由......組成、或由......組成)突變，所述位置選自S228、F234和L235中一個或多個。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如， SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，所述Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：17的IgG4 Fc，並且所述Fc部分在相對於SEQ ID NO：17的位置上包含(或基本上由......組成、或由......組成)突變，所述位置為S228、F234和L235。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，所述Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：17的IgG4 Fc，並且所述Fc部分相對於SEQ ID NO：17包含(或基本上由......組成、或由......組成)突變，所述突變選自S228P、F234A和L235A中的一個或多個。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，所述Fc部分來自包含氨基酸序列SEQ ID NO：17的IgG4 Fc，並且所述Fc部分相對於SEQ ID NO：17包含(或基本上由......組成、或由......組成)S228P、F234A和L235A突變。在一些實施例中，Fc部分進一步缺失SEQ ID NO：17的前5個氨基酸。因此在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，從N端到C端包含NGF部分、可選的肽接頭(例如，SEQ ID NOs：68-99中的任一個，如SEQ ID NOs：68-72中的任一個)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任何一個)，並且所述Fc部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：18。在一些實施例中，肽接頭包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：70)，並且其中n為1、2、3、4、5或6中的任何一個。在一些實施例中，肽接頭包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：68或69。在一些實施例中，NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：1。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：67。在一些實施例中，當通過靜脈注射、肌肉注射或皮下注射給個體(例如，人類)時，長效NGF多肽的半衰期至少為10小時(例如，至少為11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100小時中的任何一個)。在一些實施例中，與包含氨基酸序列SEQ ID NO：4的NGF部分相比，長效NGF多肽引起的疼痛更少(例如，至少減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的疼痛)。

在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：34、36、38、40、42、44和46中的任一氨基酸序列。在一些實施例中，涉及一種長效NGF多肽，包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：34、36、38、40、42、44和46中的任一氨基酸序列，不包括信號肽序列SEQ ID NO：6。在一些實施例中，當通過靜脈注射、肌肉注射或皮下注射給個體(例如，人類)時，長效NGF多肽的半衰期至少為10小時(例如，至少為11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100小時中的任何一個)。在一些實施例中，與包含氨基酸序列SEQ ID NO：4的NGF部分相比，長效NGF多肽引起的疼痛更少(例如，至少減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的疼痛)。

NGF部分

在表達時，NGF最初是一個7S、130kDa的由3蛋白-α-NGF、β-NGF和γ-NGF(比例2：1：2)組成的複合物。所述複合物的γ亞基作為一種絲氨酸蛋白酶，切割β亞基的N端，進而將蛋白質啟動為功能性NGF。人類NGF基因位於1號染色體短臂上，並且完整的NGF外顯子編碼241個氨基酸，通常被稱為preproNGF前體(SEQ ID NO：50)。preproNGF前體包含一個信號肽序列(SEQ ID NO：6)、一個前導肽(SEQ ID NO：5)和成熟的NGF序列(β-NGF,SEQ ID NO：4)。preproNGF前體的信號肽在內質網中被切除，形成 proNGF前體(223個氨基酸；SEQ ID NO：54)。proNGF前體在內質網中以同源二聚體形式存在，隨後轉移至高爾基體。在高爾基體中，proNGF前體二聚體在前導肽的3個Furin基序上被Furin切割。位於成熟NGF序列-1和-2位置的Furin基序被Furin切割，形成成熟β-NGF二聚體，每個單體含有118或120個氨基酸。成熟的β-NGF二聚體隨後被運送到細胞外。一些未被切割的proNGF前體同樣被分泌到細胞外，見於圖2中NGF結構。

NGF存在於多種物種中，在雄性小鼠頜下腺、牛精漿、蛇毒、豚鼠前列腺、人胎盤組織等中含量豐富。小鼠NGF與人類NGF的氨基酸序列同源性高達90%。

NGF與原肌球蛋白受體激酶A(Tropomyosin receptor kinase A，TrkA)和低親和力NGF受體(LNGFR/p75NTR)結合，兩者都與神經退行性疾病有關。NGF與TrkA受體結合，促使受體發生同源二聚化，進而引起酪氨酸激酶片段的自磷酸化，啟動PI 3-激酶、ras和PLC信號通路。p75NTR受體同樣可以與TrkA形成異源二聚體，該異源二聚體對NGF具有更高的親和力和特異性。另一方面，proNGF與p75NTR和分揀蛋白高親和力結合，產生一個信號複合物，招募NRAGE和Rac啟動JNK信號級聯反應，主要驅動細胞凋亡。ProNGF與p75NTR結合也可促進NFκB活化，從而誘導神經元存活。

如本文所用，術語“NGF部分”是指一種NGF分子、一種物種變體、片段、突變體或其衍生物。NGF部分可以是截短版本、翻譯後修飾版本、雜交變體、肽模擬物、生物活性片段、缺失變體、替換變體或插入變體，這些變體至少能在一定程度上維持親代NGF的活性，如與NGF受體結合，通過NGF受體誘導信號傳遞。本文所述的“親本的NGF”或“親本NGF”是指NGF參考序列，NGF部分是由它設計、修飾或衍生出來的。

在一些實施例中，NGF部分為野生型NGF。在一些實施例中，NGF部分為NGF天然變體。在一些實施例中，NGF部分為NGF類似物，如一個NGF包含不超過6個氨基酸(如6、5、4、3、2和1個氨基酸)突變。在一些實施例中，NGF部分為NGF衍生物。如本文所用，術語“NGF衍生物”是指一種具有NGF氨基酸序列或NGF類似物的分子，但在一個或多個氨基酸基團、α碳原子、氨基末端或羧基末端上還具有額外的化學修飾。化學修飾包括但不限於，添加化學基團、生成新化學鍵和移除化學基團。氨基酸側基團的修飾包括但不限於賴氨酸的ε氨基醯基化，精氨酸、組氨酸或賴氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸的羧基烷基化，穀氨醯胺或天冬醯胺的脫氨。氨基末端的修飾包括但不限於脫氨、N-低烷基，N-二低烷基和N-醯基修飾。羧基末端的修飾包括但不限於醯胺、低烷基醯基、二烷基醯胺和低烷基酯修飾。在一些實施例中，低烷基基團為C1-C4烷基基團。此外，一個或多個側基或末端基團可以由化學領域的技術人員利用已知的保護基團來保護。氨基酸的α碳可以是單甲基化或二甲基化。在一些實施例中，NGF部分為修飾的NGF，如聚乙二醇化NGF，或共價修飾的NGF，如糖基化NGF。

NGF部分可以來自任何有機體，如哺乳動物，包括但不限於家畜(例如，牛、綿羊、山羊、貓、狗、驢和馬)、靈長類動物(例如，人類和非人類靈長類動物，如猴子或黑猩猩)、兔子和齧齒動物(例如，小鼠、大鼠、沙鼠和倉鼠)。

在一些實施例中，NGF部分為一種人類NGF(hNGF)。在一些實施例中，NGF部分為野生型(wt)hNGF。在一些實施例中，NGF部分為hNGF天然變體。在一些實施例中，NGF部分為hNGF類似物，如hNGF包含不超過6個氨基酸(如6、5、4、3、2或1個氨基酸)突變。在一些實施例中，NGF部分為hNGF衍生物。hNGF的許多活性片段、類似物和衍生物在本領域都是眾所周知的，並且這些活性片段、類似物和衍生物中的任一種都可能是本申請中應用的NGF部分。

如本文所述，NGF部分可以是從各種來源分離出的NGF，如從人體組織或從其它來源，或通過重組或合成方法製備。在一些實施例中，NGF部分為重組NGF，如重組hNGF(rhNGF)。在一些實施例中，NGF部分為鼠源NGF，如重組鼠源NGF。

在一些實施例中，NGF部分為全長NGF。在一些實施例中，NGF部分為NGF功能片段，其能夠產生全長NGF分子的大部分或全部生物活性，如全長β-NGF的大部分或全部生物活性。在一些實施例中，NGF部分為preproNGF(如人類preproNGF)或其活性片段，即，包含所有信號肽、前導肽和β-NGF的全長或片段。在一些實施例中，NGF部分包含SEQ ID NOs：47-50中的任一氨基酸序列。在一些實施例中，NGF部分為proNGF(如人類proNGF)或其活性片段，即，包含前導肽和β-NGF的全長或片段。在一些實施例中，NGF部分包含SEQ ID NOs：51-54中的任一氨基酸序列。在一些實施例中，NGF部分為成熟NGF或其活性片段，即，包含β-NGF(如人類β-NGF)的全長或活性片段。在一些實施例中，NGF部分包含SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列。在一些實施例中，NGF部分為野生型人類β-NGF(SEQ ID NO：4)。在一些實施例中，NGF部分為最後2個氨基酸被截短的野生型人類β-NGF(SEQ ID NO：3)。在一些實施例中，NGF部分在β-NGF的N端包含一個信號肽，所述信號肽或來自不同分子，或來自相同的NGF分子。在一些實施例中，信號肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：6。在一些實施例中，NGF部分在β-NGF的N端包含一個前導肽。在一些實施例中，前導肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：5。

在一些實施例中，NGF部分為突變體或NGF變體，如能夠產生野生型NGF的大部分或全部生物活性的NGF突變體或變體。突變的NGF部分可包括在NGF分子中(例如，成熟β-NGF)的一個或多個氨基酸位點的突變。在一些實施例中，突變的NGF部分包括在NGF中的一個或多個氨基酸位點的氨基酸取代。在一些實施例中，突變的NGF部分包括在NGF中的一個或多個氨基酸位點的氨基酸缺失或插入。在一些實施例中，突變的NGF部分包括在NGF中一個或多個氨基酸的修飾。

在一些實施例中，NGF部分具有一個或多個保守的氨基酸取代。“保守取代”是指應用另一種氨基酸進行取代，所述另一氨基酸與被取代氨基酸帶有相同的淨電荷和大致相同的大小和形狀。當側鏈上的碳原子和雜原子總數相差不超過4個時，帶有脂肪族或取代脂肪族氨基酸側鏈的氨基酸大小大致相同。當其側鏈上的分支數相差不超過1個時，氨基酸的形狀大致相同。在側鏈上具有苯基或取代苯基的氨基酸，可以認為其大小和形狀大致相同。除非另有說明，保守取代優選應用天然氨基酸。參見下文“氨基酸取代基”小節。

“氨基酸”在本文中以其最廣泛的定義使用，即包括天然存在的氨基酸也包括非天然存在的氨基酸，包括氨基酸的類似物和衍生物。後者包括含有氨基酸部分的分子。根據這一寬泛的定義，本領域的技術人員會發現，本文所述氨基酸包括，例如，形成蛋白質的天然L-氨基酸；D-氨基酸；化學修飾的氨基酸，如氨基酸類似物和衍生物；不形成蛋白質的天然氨基酸，如正亮氨酸、β-丙氨酸、鳥氨酸、GABA等；以及本領域已知的具有氨基酸特徵的化學合成的化合物。如本文所用，術語“蛋白質形成”是指可以通過代謝途徑合成細胞的肽、多肽或蛋白質的氨基酸。

將包括合成的非天然氨基酸、取代氨基酸或一種或多種D-氨基酸在內的非天然氨基酸插入到本發明的長效NGF多肽(或NGF部分)中可具有多種益處。與含有L-氨基酸的多肽相比，含有D-氨基酸的多肽等在體外和體內表現出更高的穩定性。因此，當需要更好的細胞內穩定性時，如通過加入D-氨基酸進行多肽的構建是特別有用的。特別是D-肽和其類似物對內源性肽酶和蛋白酶活性有抵抗力，從而在需要時提高分子的生物有效性並延長其在體內的壽命。此外，D-肽和其類似物不能被有效加工，這是由於II型主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex，MHC)呈遞給輔助T細胞的過程受限，因此不易在受試者中誘導體液免疫反應。

在一些實施例中，NGF部分為突變體或NGF變體，與野生型NGF相比，所述突變體或NGF變體減少了副作用(例如，疼痛)，或為無痛的。在一些實施例中，NGF部分為突變體或NGF變體，與野生型NGF相比，所述突變體或NGF變體減少了至少5%(例如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%中的任何一個)的疼痛，如在給藥後的一個或多個時間點(例如，全部時間點)減少了至少5%的疼痛。在一些實施例中，NGF部分為突變體或NGF變體，與野生型NGF相比，所述突變體或NGF變體增加了至少5%(例如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%中的任何一個)的疼痛閾值。例如，在一些實施例中，個體的疼痛閾值約為8，施用野生型NGF後，疼痛閾值降至約6，施用突變體或NGF變體(或本文所述的包含其的長效NGF多肽)後，疼痛閾值保持在8左右，例如，疼痛減少約25%或疼痛閾值增加約25%。在一些實施例中，NGF部分為如專利CN107286233A、WO2017157325和WO2017157326所述的突變體或NGF變體，其全部內容通過引用併入本文。在一些實施例中，相對於人類野生型β-NGF序列(SEQ ID NO：4)，NGF部分包含相對於人類野生型β-NGF序列(SEQ ID NO：4)的F12E突變。在一些實施例中，NGF部分包含氨基酸序列SEQ ID NO：2。在一些實施例中，相對於人類野生型β-NGF序列(SEQ ID NO：4)，NGF部分包含F12E突變並且最後2個氨基酸被截短。在一些實施例中，NGF部分包含氨基酸序列SEQ ID NO：1(以下也稱為“mNGF118”)。

如本文所述，NGF部分或長效NGF多肽的氨基酸序列變體可能是通過在編碼蛋白質的核酸序列中引入適當的修飾或通過肽合成來製備的。所述修飾包括，例如，在NGF部分或長效NGF多肽的氨基酸序列中進行缺失和/或插入和/或取代殘基。可以通過缺失、插入和取代的任何組合來獲得最終的構建體，只要最終構建體具有所需的特性，例如保留/改進的配體-受體結合、保留/增強的生物活性(例如，促進神經元的生長、維持、增殖和/或存活)、保留/增強半衰期、保留/降低ADCC/CDC，保留/減少致痛活性等。

表A為保守型取代。在表A“取代示例”標題下提供了更多實質性取代，如下文關於氨基酸側鏈類別部分進一步詳述。氨基酸可以根據常見的側鏈性質分類：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈方向的殘基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保守型取代需要將這些類別中的一個成員替換為另一類別的成員。可以將氨基酸取代引入到蛋白質構建體中，並篩選符合上文所述所需活性的產品。

表A氨基酸取代

Fc部分

如本文所述，長效NGF多肽在C端包含一個Fc部分。

在一些實施例中，Fc部分來自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM及其亞類中的任何一種，。在所有免疫球蛋白中，IgG的血清含量最高，半衰期最長。與其它免疫球蛋白不同，在與Fc受體(FcRs)結合後，IgG可有效回收。在一些實施例中，Fc部分來自IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在一些實施例中，Fc部分來自人類IgG。在一些實施例中，Fc部分包含CH2和CH3。在一些實施例中，Fc部分進一步包含全部或部分鉸鏈區。在一些實施例中，Fc部分來自人類IgG1或人類IgG4。在一些實施例中，Fc部分的兩個亞基通過一個或多個(例如，1、2、3、4或更多)二硫鍵二聚化。在一些實施例中，Fc部分的每個亞基都包含全長Fc序列。在一些實施例中，Fc部分的每個亞基都包含N端截短的Fc序列，如截短的Fc結構域含有較少的N端半胱氨酸，以減少二聚化過程中二硫鍵的錯配。在一些實施例中，Fc部分在N端被截短，例如，缺失完整免疫球蛋白Fc結構域的前1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸。在一些實施例中，Fc部分包含一個或多個突變，如插入、缺失和/或取代。

我們希望篩選出Fc片段，所述Fc片段能夠為長效NGF多肽提供如本文所述的高生物活性、長半衰期和低免疫毒性(例如，ADCC和/或CDC)。

通過Fc結構域，含Fc的蛋白可以啟動補體並與Fc受體(FcRs)相互作用。這種固有的免疫球蛋白特性已經被認為是不利的，因為NGF-Fc融合蛋白可能靶向表達Fc受體的細胞，而不是優選的表達NGF受體的細胞，而且進一步考慮到Fc融合蛋白的半衰期長，由於全身毒性，使其難以應用於治療。因此，在一些實施例中，Fc部分被改造(例如，包含一個或多個氨基酸突變)以改變其與FcR的結合，特別是改變與Fcγ受體(負責ADCC)的結合和/或改變效應功能，如改變抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴型細胞吞噬作用(ADCP)和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。優選地，此類氨基酸突變不會減少與FcRn受體(負責半衰期)的結合。

Fc部分(例如，人類IgG1 Fc)發生突變，以去除一個或多個效應功能，如ADCC、ADCP或CDC，以下稱為“無效應”或“幾乎無效應”Fc部分。例如，在一些實施例中，Fc部分為一種無效應人類IgG1 Fc，所述人類IgG1 Fc包含一個或多個以下突變(如在每一個Fc亞基中)：L234A、L235E、G237A、A330S和P331S。IgG1 Fc中K322A、L234A和L235A的組合足以完全消除FcγR和C1q的結合(Hezareh et al.,J Virol 75,12161-12168,2001)。MedImmune發現一組三突變L234F/L235E/P331S具有非常相似的效應(Oganesyan et al.,Acta Crystallographica 64,700-704,2008)。在一些實施例中，Fc部分包含IgG1 Fc結構域N297上的糖基化修飾，已知這是最優FcR相互作用所必需的。Fc部分修飾可以是Wang等人提到的任何合適的IgG Fc工程。(“IgG Fc engineering to modulate antibody effector functions,”Protein Cell.2018 Jan；9(1)：63-73)，其內容全部通過引用併入本文。

在一些實施例中，如本文所述，長效NGF多肽不具有ADCC和/或CDC，或不具有可檢測的ADCC和/或CDC。在一些實施例中，如本文所述，長效NGF多肽與包含相同NGF部分但為野生型或未修飾Fc片段的NGF-Fc構建體相比，ADCC和/或CDC減少了至少5%(如至少為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%中的任何一個)

糖基化變體

在一些實施例中，通過改變Fc部分或長效NGF多肽來增加或減少構建體的糖基化程度。可以通過改變氨基酸序列在Fc部分中加入或刪除糖基化位點，以創建或移除一個或多個糖基化位點。

哺乳動物細胞產生的天然含Fc蛋白通常包含一個分支鏈的雙觸角寡糖，所述雙觸角寡糖通常通過N-鍵連接到Fc區CH2結構域的Asn297上。參見Wright et al.,TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可以包括各種碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙醯葡萄糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附著在雙觸角寡糖結構的“莖”上GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可對Fc部分中的寡糖進行修飾以產生某些改良的特性。

在一些實施例中，如本文所述的Fc部分或長效NGF多肽具有碳水化合物結構，該結構缺乏附著(直接或間接)在Fc部分的岩藻糖。例如，在這種Fc部分或長效NGF多肽中的岩藻糖含量可能從1%至80%、從1%至65%、從5%至65%或從20%至40%。如WO 2008/077546所述，岩藻糖的含量通過MALDI-TOF質譜測量連接到Asn297上的糖鏈內岩藻糖平均含量相對於附著在Asn297(例如，複合、雜交和高甘露糖結構)上的所有糖結構的總和來確定的。Asn297是指位於Fc區297位的天冬醯胺殘基(Fc區殘基EU編號系統)；然而，由於Fc區的微小序列變化，Asn297也可位於297位的上游或下游約±3個氨基酸，即在294和300位之間。這類岩藻糖基化變體可能具有增強的ADCC 功能。參見US Patent Publication Nos.US 2003/0157108(Presta,L.)，US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。與“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”的抗體變體相關的出版物示例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki et al.,J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki et al.,Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能夠產生去岩藻糖基化含Fc蛋白的細胞系的示例包括缺乏蛋白岩藻糖基化功能的Lec13 CHO細胞(Ripka et al.,Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；US Pat Appl No US 2003/0157108 A1,Presta,L；和WO 2004/056312 A1,Adams et al.，尤其是實施例11)，和基因敲除細胞系，如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因、FUT8基因敲除的CHO細胞(參見Yamane-Ohnuki et al.,Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；和WO2003/085107)。

效應功能變體

在一些實施例中，本申請考慮了一種Fc部分或長效NGF多肽，具有一些但非全部Fc效應功能，使得其成為某種應用的理想候選，在該應用中長效NGF多肽在體內的半衰期很重要，但某些效應功能(如CDC和ADCC)是非必需的或有害的。可以在體外或體內進行細胞毒性試驗，以確定CDC和/或ADCC活性的減少/耗盡。例如，可以進行Fc受體(FcR)結合試驗，以確保Fc部分或長效NGF多肽缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。介導ADCC的主要細胞，自然殺傷細胞(NK)，僅表達FcγRIII，然而單核細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)第464頁的表2中匯總了FcR在造血細胞上的表達。U.S.Patent No.5,500,362(參見Hellstrom,I.et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))和Hellstrom,I.et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(見於Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))中詳述了用於評估目標分子ADCC活性的體外試驗的非限制性示例。或者，可採用非放射性檢測方法(參見用於流式細胞術的ACTI^TM非放射性毒性試驗(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)和CytoTox 96^®非放射性毒性試驗(Promega,Madison,WI))。適用於這種檢測的效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和NK細胞。此外，也可以在體內評估目標分子的ADCC活性，例如，在如Clynes et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)所公開的動物模型中。也可進行C1q結合試驗以確定長效NGF多肽不能與C1q結合並因此缺失CDC活性。參見WO 2006/029879和WO 2005/100402中C1q和C3c結合酶聯免疫吸附試驗。可以進行CDC試驗以評估補體活性(參見Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.et al.,Blood 101：1045-1052(2003)和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。可以利用本領域已知的方法進行FcRn結合和體內清除/半衰期測定(參見Petkova,S.B.et al..,Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。

效應功能降低的Fc部分包含那些在Fc區第238、265、269、270、297、327和329位中一個或多個殘基的取代(U.S.專利No.6,737,056)。這類Fc突變體包括在氨基酸位點265、269、270、297和327中的兩個或更多位點上的取代，包括所謂的將265和297殘基替換成丙氨酸的“DANA”Fc突變體(US專利No.7,332,581)。詳述了增強或減少與FcRs的結合的某些抗體變體(參見U.S.專利No.6,737,056；WO 2004/056312，和Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。在一些實施例中，改造Fc區以改變(即，增加或減少)C1q結合和/或CDC，例如US專利No.6,194,551、WO 99/51642和Idusogie et al.,J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述的。

在一些實施例中，Fc部分包含一個或多個氨基酸替換，這增加了半衰期和/或增強了與新生兒Fc受體(Neonatal Fc receptor,FcRn)的結合。半衰期增加和與新生兒FcRn結合增強了的抗體負責將母體IgGs轉運給胎兒(Guyer et al.,J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.,J.Immunol.24：249(1994))，並在US2005/0014934A1(Hinton等)中進行了詳述。那些包含帶有一個或多個替換的Fc結構域的抗體因此增加了Fc區與FcRn的結合。這類Fc變體包括那些帶有一個或多個Fc區殘基替換的變體，例如，Fc區434殘基替換(US專利No.7,371,826)。

參見Duncan和Winter,Nature 322：738-40(1988)；U.S.專利No.5,648,260；U.S.專利No.5,624,821；和WO 94/29351關於Fc結構域變體的其它示例。

半胱氨酸工程變體

在一些實施例中，可能需要創建半胱氨酸工程的Fc部分或長效NGF多肽，其中Fc結構域的一個或多個殘基被半胱氨酸殘基取代。在一些實施例中，取代殘基出現在Fc部分或長效NGF多肽上易接近的位點。通過將這些.殘基替換成半胱氨酸，活性硫醇基因此被定位在Fc部分或長效NGF多肽的易接近位點，並可用於將分子與其它部分共軛，如藥物部分或接頭-藥物部分，以創建長效NGF多肽共軛物。在一些實施例中，下列殘基中的任一個和多個可能被半胱氨酸取代：重鏈A118(EU編號系統)和重鏈Fc結構域S400(EU編號系統)。半胱氨酸工程分子可以按照U.S.Patent No.7,521,541中所述的那樣產生。

在一些實施例中，Fc部分來自IgG1 Fc。在一些實施例中，Fc部分來自人類IgG1 Fc。在一些實施例中，Fc部分來自野生型IgG1 Fc(IGHG1*05)。在一些實施例中，Fc部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：7。在一些實施例中，Fc部分為IgG1自然變體(例如，IGHG1*03，相對於IGHG1*05包含D239E和L241M雙突變)。在一些實施例中，Fc部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：8。在一些實施例中，Fc部分不包含IgG1 Fc的鉸鏈區。在一些實施例中，Fc部分包含從IgG1 Fc的N端截短最多5個氨基酸，例如從IgG1 Fc的N端截短第一個、前兩個、前三個、前四個或前五個氨基酸。在一些實施例中，Fc部分包含一個或多個無效應突變和/或去糖基化突變。在一些實施例中，Fc部分在相對於SEQ ID NO：7或8的位置上包含(或基本上由......組成、或由......組成)突變，所述位置選自E233、L234、L235、G236、G237、N297、A327、A330和P331 中的一個或多個。在一些實施例中，Fc部分相對於SEQ ID NO：7或8包含突變，所述突變選自E233P、L234V、L234A、L235A、L235E、G236del、G237A、N297A、A327G、A330S和P331S中的一個或多個。在一些實施例中，Fc部分進一步缺失SEQ ID NO：7或8的前(N端)5個氨基酸。在一些實施例中，Fc部分在相對於SEQ ID NO：7或8的位置N297上包含(或基本上由......組成、或由......組成)突變。在一些實施例中，Fc部分相對於SEQ ID NO：7或8包含(或基本上由......組成、或由......組成)N297A突變。在一些實施例中，Fc部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：9或10。在一些實施例中，Fc部分在相對於SEQ ID NO：7或8的位置上包含(或基本上由......組成、或由......組成)突變，所述位置為L234、L235和P331。在一些實施例中，Fc部分相對於SEQ ID NO：7或8包含(或基本上由......組成、或由......組成)L234A、L235A和P331S突變。在一些實施例中，Fc部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：11或12。在一些實施例中，Fc部分在相對於SEQ ID NO：7或8的位置上包含(或基本上由......組成、或由......組成)突變，所述位置為L234、L235、G237、A330和P331。在一些實施例中，Fc部分相對於SEQ ID NO：7或8包含(或基本上由......組成、或由......組成)L234A、L235E、G237A、A330S和P331S突變。在一些實施例中，Fc部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：13或14。在一些實施例中，Fc部分在相對於SEQ ID NO：7或8的位置上包含(或基本上由......組成、或由......組成)突變，所述位置為E233、L234、L235、G236、A327、A330和P331。在一些實施例中，Fc部分相對於SEQ ID NO：7或8包含(或基本上由......組成、或由......組成)E233P、L234V、L235A、G236del、A327G、A330S和P331S突變。在一些實施例中，Fc部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：15或16。

在一些實施例中，Fc部分來自IgG4 Fc。在一些實施例中，Fc部分來自人類IgG4 Fc。在一些實施例中，Fc部分是野生型IgG4 Fc。在一些實施例中，Fc部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：17。在一些實施例中，Fc部分為IgG4自然變體。在一些實施例中，Fc部分不包含IgG4的鉸鏈區。在一些實施例中，Fc部包含從IgG4的N端截短最多5個氨基酸，如從IgG4的N端截短第一個、前兩個、前三個、前四個或前五個氨基酸。在一些實施例中，Fc部分包含一個或多個無效應突變和/或去糖基化突變。在一些實施例中，Fc部分在相對於SEQ ID NO：17的位置上包含(或基本上由......組成、或由......組成)突變，所述位置選自S228、F234和L235中的一個或多個。在一些實施例中，Fc部分在相對於SEQ ID NO：17的位置上包含(或基本上由......組成、或由......組成)突變，所述位置為S228、F234和L235。在一些實施例中，Fc部分相對於SEQ ID NO：17包含突變，所述突變選自S228P、F234A和L235A中的一個或多個。在一些實施例中，Fc部分相對於SEQ ID NO：17包含突變，所述突變選自S228P、F234A和L235A。在一些實施例中，Fc部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：18。在一些實施例中，Fc部分進一步缺失SEQ ID NO：17的前(N端)5個氨基酸。在一些實施例中，Fc部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：19或20。

接頭

NGF部分和Fc部分通過一個可選的接頭(例如，肽接頭、非肽接頭)連接。在一些實施例中，該接頭為一種柔性接頭。在一些實施例中，該接頭為一種穩定接頭。一般來說，理想的接頭不會影響或顯著影響本文所述的長效NGF多肽的正確折疊和構象。優選地，該接頭賦予了長效NGF多肽靈活性，保留/提高了NGF的生物功能，和/或不顯著影響長效NGF多肽在體內的半衰期和/或穩定性。在一些實施例中，接頭為穩定接頭(例如，不能被蛋白酶，特別是MMP切割)。

在一些實施例中，該接頭為肽接頭。肽接頭可以是任意長度。在一些實施例中，肽接頭長度為從1個到10個氨基酸，從3個到18個氨基酸，從1個到20個氨基酸，從10個到20個氨基酸，從21個到30個氨基酸，從1個到30個氨基酸，從10個到30個氨基酸，從1個到50個氨基酸，從5個到40個氨基酸，從12個到18個氨基酸，從4個到25個氨基酸。在一些實施例中，該肽接頭長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19或20個氨基酸中的任何一個。在一些實施例中，該肽接頭長度為21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個氨基酸中的任何一個。在一些實施例中，該肽接頭長度為31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個氨基酸中的任何一個。優選地，如本文所述的長效NGF多肽在體內的功能和穩定性通過添加肽接頭來優化，以防止潛在的不期望的結構域的相互作用。在一些實施例中，接頭長度不超過防止不期望的結構域相互作用和/或優化生物功能和/或穩定性所必需的長度。在一些實施例中，肽接頭的長度最多為30個氨基酸，例如最多20個氨基酸，或最多15個氨基酸。在一些實施例中，接頭長度為5個到30個氨基酸，或5個到18個氨基酸。

肽接頭可以具有天然存在的序列，也可以具有非天然存在的序列。例如，可以使用來自抗體重鏈鉸鏈區的序列作為接頭。例如，參見WO1996/34103。在一些實施例中，肽接頭為人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4鉸鏈。在一些實施例中，肽接頭為突變的人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4鉸鏈。在一些實施例中，接頭是柔性接頭。典型的柔性接頭包括但不限於甘氨酸聚合物(G)n(SEQ ID NO：73)、甘氨酸-絲氨酸聚合物(包括例如，(GS)n(SEQ ID NO：74)、(GGS)n(SEQ ID NO：75)、(GGGS)n(SEQ ID NO：76)、(GGS)n(GGGS)n(SEQ ID NO：77)、(GSGGS)n(SEQ ID NO：78)、(GGSGS)n(SEQ ID NO：79)或(GGGGS)n(SEQ ID NO：70)，其中n為至少是1的整數)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-絲氨酸聚合物和其它本領域已知的柔性接頭。甘氨酸和甘氨酸-絲氨酸聚合物為相對非結構化的，並且因此可以作為組分之間的一種中性鏈。甘氨酸比丙氨酸擁有更多的phi-psi空間，且相比具有更長側鏈的殘基，受到的限制更少(見於Scheraga,Rev.Computational Chem.11 173-142(1992))。柔性接頭的示例包括但不限於GG(SEQ ID NO：86)、GGSG(SEQ ID NO：87)、GGSGG(SEQ ID NO：88)、GSGSG(SEQ ID NO：89)、GSGGG(SEQ ID NO：90)、GGGSG(SEQ ID NO：91)、GSSSG(SEQ ID NO：92)、GGSGGS(SEQ ID NO：93)、SGGGGS(SEQ ID NO：94)、GGGGS(SEQ ID NO：95)、(GA)n(SEQ ID NO：96,n為至少是1的整數)、GRAGGGGAGGGG(SEQ ID NO：97)、 GRAGGG(SEQ ID NO：98)、GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：80)、GGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：81)、GGGSGGSGGS(SEQ ID NO：82)、GGSGGSGGSGGSGGG(SEQ ID NO：83)、GGSGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：84)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO：85)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：68)、GGGGGGSGGGGSGGGGSA(SEQ ID NO：69)、GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：71)、KTGGGSGGGS(SEQ ID NO：72)等。在一些實施例中，接頭包含序列ASTKGP(SEQ ID NO：99)。一般來說，本領域技術人員會意識到所設計的長效NGF多肽可以包括全部或部分柔性接頭，使得接頭可以包括一個柔性接頭部分以及一個或多個提供較少柔性結構的部分，以提供一個理想的長效NGF多肽的結構和功能。在一些實施例中，肽接頭富含絲氨酸-甘氨酸。在一些實施例中，肽接頭包含SEQ ID NOs：68-72中的任一氨基酸序列。在一些實施例中，肽接頭包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：70)，所述n為1、2、3、4、5或6中的一個整數，優選地n為2到6中的整數，更優選地n為整數3或4。在一些實施例中，肽接頭包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NO：68或69。

其它關於接頭的考慮因素包括對產生的長效NGF多肽的物理或藥代動力學性質的影響，例如溶解性、親脂性、親水性、疏水性、穩定性(或多或少的穩定性以及計畫內的降解)、剛性、柔韌性、免疫原性、NGF部分/NGF受體結合、膠體或脂質體的結合能力等。

結合親和力

分子(例如，NGF部分或包含NGF部分的NGF多肽)與其結合物件(例如，NGF受體，如TrkA)的結合親和力可以通過任何本領域已知的合適的配體結合試驗或抗體/抗原結合試驗來確定，例如，Western blot、酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、Meso Scale Discovery(MSD)電化學發光、基於珠子的多重免疫分析(multianalyte immunoassay，MIA)、RIA、表面等離子共振(Surface plasmon resonance，SPR)、ECL、IRMA、EIA、Biacore試驗、Octet分析、肽掃描等。例如，通過使用各種標記試劑標記的NGF部分、包含NGF部分的NGF多肽或其受體(例如，TrkA)，或其亞單位來進行簡單分析，同樣可以使用BiacoreX(Amersham Biosciences)，這是一種非處方的測量試劑盒或類似試劑盒，可根據試劑盒隨附的用戶手冊和實驗操作方法來操作。

在一些實施例中，蛋白質微陣列用於大規模分析本文所述的NGF部分或長效NGF多肽與其受體的相互作用、功能和活性。蛋白質微陣列具有與一系列捕獲蛋白(例如，NGF受體或其亞單位)結合的支撐表面。隨後將螢光標記的探針分子(例如，本文所述的NGF部分或長效NGF多肽)添加到陣列中，並且與結合的捕獲蛋白相互作用，釋放螢光信號並通過鐳射掃描器讀取。

結合親和力也可以使用SPR(Biacore T-200)測量。例如，使用EDC/NHS化學法將抗人類IgG抗體耦合到CM-5感測器晶片表面。然後使用人類TrkA-Fc融合蛋白作為該表面的捕獲配體。讓本文所述的NGF部分或長效NGF多肽的一系列稀釋液與捕獲的配體結合，並且可以即時監測NGF與TrkA的結合和解離。解離常數(K_d)和解離速率常數可通過使用BIA評估軟體進行動力學分析來確定。

在一些實施例中，本文所述NGF部分或長效NGF多肽與其受體(例如，TrkA)或其亞單位之間結合的Kd為

10^-5M、

10^-6M、

10^-7M、

10^-8M、

10^-9M、

10^-10M、

10^-11M或

10^-12M中的任何一個。在一些實施例中，野生型NGF與其受體(例如，TrkA)或其亞單位之間結合的K_d接近於(例如，等於)或至少約為本文所述NGF部分或長效NGF多肽與相同受體(例如，TrkA)或其亞單位之間結合K_d值的1.5倍(如至少為2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000倍中的任一個)。在一些實施例中，本文所述NGF部分或長效NGF多肽與其受體(例如，P75)或其亞單位之間結合的K_d接近於(例如，等於)或至少約為野生型NGF與相同受體(例如，P75)或其亞單位之間結合的K_d的2倍(如至少約3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000倍中的任一個)。

在一些實施例中，NGF部分包含突變或修飾(例如，翻譯後修飾)，並且突變/修飾的NGF部分(或長效NGF多肽)與其受體(例如，TrkA)或其亞單位之間結合的K_d接近於(例如，等於)或至少約為野生型NGF與相同受體(例如，TrkA)之間結合的K_d的2倍(如至少為3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000倍中的任一個)。在一些實施例中，NGF部分包含突變或修飾(例如，翻譯後修飾)，野生型NGF與其受體(例如，P75)或其亞單位之間結合的K_d接近於(例如，等於)或至少約為突變/修飾的NGF部分(或長效NGF多肽)與相同受體(例如，P75)之間結合的K_d的2倍(如至少約為3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60中的任何一倍，70、80、90、100、500或1000倍中的任一個)。

生物活性

本文所述的用於確定NGF、NGF部分或長效NGF多肽生物活性的各種方法是本領域已知的。例如，可通過TF-1細胞增殖試驗來評估生物活性，如CN103376248A和CN108727486A中所述，其全部內容通過引用併入本文。參見下文實施例4。生物活性也可基於促進新生大鼠頸上神經節(SCG)生長的能力(參見下文實施例5)或促進雞胚背根神經節生長的能力(參見WO2017157326，其全部內容通過引用併入本文)來確定。生物活性還可以基於是否存在以下情況來確定：i)傷口癒合的改善，如在糖尿病神經性病變動物模型/患者中(例如，參見實施例7)；ii)空間認知、記憶和/或學習能力的改善，如在阿爾茨海默症動物模型/患者中(例如，參見實施例8)；iii)改善了卵巢顆粒樣腫瘤細胞系增殖和/或雌激素分泌和/或改善了卵巢早衰動物模型/患者的卵泡減少(例如，參見實施例9)；iv)在生精障礙動物模型/患者中，挽救了精子數量和/或活力的降低和/或對睾丸生精小管萎縮、生精小管生精障礙和/或附睾管細胞碎片具有治療效果(例如，參見實施例10)；或v)在神經營養性角膜炎動物模型/患者中，恢復受損角膜的完整性(例如，通過螢光素鈉染色試驗)和/或挽救受損的角膜神經(例如，通過測量角膜神經長度)(例如，參見實施例11)；等。本領域已知的任何合適的試驗方案均適用於測試本文所述NGF部分或長效NGF多肽的生物活性。

生物測定的重點是NGF的生物活性，並將其以讀數的形式進行使用。在生物測定中，在敏感細胞系(例如，原代細胞培養物或對測試樣品有依賴和/或響應的體外適應細胞系)或動物模型/患有NGF相關疾病的人上測試樣品的活性，並將該活性(例如，細胞增殖)的結果與標準NGF製劑或對照組(例如，小鼠NGF、mNGF118或已知的長效NGF多肽)對比。NGF生物活性的其它方面包括：(i)支持神經元存活；(ii)促進神經突生長；(iii)增強神經化學分化；(iv)促進胰腺β細胞增殖；(v)誘導先天性和/或獲得性免疫；(vi)修復受損的神經細胞和/或預防損傷(例如，神經營養性角膜炎)；(vii)促進卵巢顆粒細胞的增殖和/或雌激素分泌；(viii)促進傷口癒合(例如，在糖尿病神經性病變中)；(ix)改善患有神經退行性疾病(例如，阿爾茨海默病)的受試者的空間認知、記憶和/或學習能力；(x)治療和/或預防神經退行性病變；(xi)治療睾丸生精小管萎縮、生精小管生精障礙和/或附睾管細胞碎片；(xii)挽救精子數量和/或活力的降低，或增加精子數量和/或活力(例如，在生精障礙中)；和/或(xiii)改善卵泡數量和/或功能的降低，或提高卵泡數量和/或功能(例如，在卵巢早衰中)。可以使用體外和/或體內試驗來測量所有的這些活性，如神經元存活試驗或神經突生長試驗。

例如，在TF-1細胞增殖試驗中，在96孔板中製備樣品(例如，長效NGF多肽)和對照組(例如，載體或蘇肽生^®鼠NGF)的系列稀釋液，然後將TF-1細胞添加到每個孔中，並在37℃、5%CO₂的潮濕培養箱中培養。培養幾天後(例如，3天)，將MTS溶液添加到細胞懸浮液的每個孔中，在37℃、5%CO₂的條件下培養3小時。隨後，在分光光度計中測量490nm和650nm下的吸光度，以說明NGF部分或長效NGF多肽如何促進TF-1細胞增殖。可以根據對照樣本對資料進行標準化處理。示例方法參見實施例4。

細胞信號試驗也可用於測試本文所述的NGF部分或長效NGF多肽的生物活性。各種細胞信號試驗試劑盒可商購獲得，例如，檢測參與信號轉導的酶促反應期間產生的分析物，例如ADP、AMP、UDP、GDP和生長因數，或磷酸酶試驗，用於量化總的信號蛋白和磷酸化形式的信號蛋白。例如，在將細胞與本文所述的NGF部分或長效NGF多肽共培養後，為了確定特定激酶是否具有活性，將細胞裂解物在放射性磷酸鹽存在的條件下暴露於酶的已知底物中。通過電泳分離產物(經過或未經過免疫沉澱)，然後將凝膠暴露於X射線膠片以確定蛋白質是否包含同位素。在一些實施例中，本文所述的NGF部分或長效NGF多肽在細胞上的生物活性通過免疫組織化學測定以定位信號蛋白。例如，可以使用針對信號蛋白本身或處於啟動狀態的信號蛋白的抗體。這些抗體具有識別表位，包括磷酸鹽或其它啟動構象。在一些實施例中，可通過將螢光蛋白基因，例如，綠色螢光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，整合到編碼所研究蛋白質的基因載體中，從而跟蹤特定信號蛋白的移動(例如，信號分子的核易位)。在一些實施例中，本文所述NGF部分或長效NGF多肽在細胞上的生物活性通過western blot檢測。例如，所有酪氨酸磷酸化蛋白(或其它磷酸化氨基酸，例如絲氨酸或蘇氨酸)都可以用抗磷酸化酪氨酸抗體(或抗其它磷酸化氨基酸的抗體)在按時間順序刺激後獲得的細胞裂解液的Western blot中檢測。在一些實施例中，本文所述NGF部分或長效NGF多肽在細胞上的生物活性可通過免疫沉澱測定。例如，針對特定信號蛋白或所有酪氨酸磷酸化蛋白的一抗與微珠交聯。與本文所述的NGF部分或長效NGF多肽孵育後的細胞在含有蛋白酶抑制劑的緩衝液中裂解，然後與抗體包被的微珠孵育。使用SDS電泳分離蛋白質，然後通過所述的Western blot步驟鑒定蛋白質。在一些實施例中，還可使用谷胱甘肽S-轉移酶(Glutathione S-transferases,GST)結合或“pull-down”分析，以確定蛋白質-蛋白質(例如，信號蛋白)的直接相互作用。

例如，可以測量RAS/ERK1/2信號以反映NGF在促進細胞生長方面的生物活性，例如，通過使用本領域已知的任何合適的方法使ERK1/2磷酸化。例如，測量ERK1/2磷酸化可使用該分子磷酸化狀態的特異性抗體(可選地結合流式細胞術分析)。例如，將雞胚胎背根神經節(dorsal root ganglions，DRGs)或TF-1細胞與本文所述的NGF部分或長效NGF多肽在37℃下孵育。孵育後，立即固定細胞以保持磷酸化狀態和滲透性。用抗磷酸化ERK1/2的抗體對細胞進行染色，例如，使用Alexa488偶聯的抗ERK1/2 pT202/pY204(BD Biosciences)，並通過流式細胞術進行分析。PI 3-激酶信號也可以使用本領域已知的任何適當的方法來測量，以反映NGF的生物活性。例如，可以使用對磷酸化S6核糖體蛋白具有特異性的抗體來測量PI 3-激酶信號轉導(可選擇結合流式細胞術分析)。

本文所述的NGF部分或長效NGF多肽的生物活性也可通過體內或體外實驗反映，例如，通過測量指示細胞的增殖，通過測量信號轉導的誘導或抑制，通過測量組織體積和/或重量等。

例如，在SCG體內生長試驗中，樣品(例如，長效NGF多肽)和對照組(例如，PBS或蘇肽生^®鼠NGF)可通過單次注射或多次注射的方式皮下注射到新生大鼠頸部。注射幾天後，處死這些大鼠進行SCG分離。SCG可以稱重並記錄形態，以研究NGF部分或長效NGF多肽在促進SCG體內生長中的生物活性。示例方法參見實施例5。

在背根神經節生長試驗中，可將雞胚背根神經節(例如，8日齡)添加到含有不同濃度的樣品(例如，長效NGF多肽)或對照組(例如，PBS或蘇肽生^®鼠NGF)的培養基中，並在5%CO₂和37℃的飽和濕度培養箱中培養，例如，24小時。監測背根神經節的生長情況，其可以反映NGF部分或長效NGF多肽在促進背根神經節生長中的生物活性。如果實驗中包括NGF標準品，也可以計算樣品的特定生物活性，以AU/mg表示。待測樣品的比活度(AU/mg)=對照品的比活度(AU/ml)×[樣品的預稀釋係數×該稀釋點下相應對照品的比活度(AU/ml)/對照品的實際比活度(AU/ml)]。示例方法參見WO2017157326的實施例5。

在一些實施例中，本文所述NGF部分(或長效NGF多肽)包含突變或修飾(例如，翻譯後修飾)，與野生型NGF(或包含野生型NGF的多肽)相比保留/增強/降低了其生物活性。在一些實施例中，本文所述經突變或修飾的NGF部分或長效NGF多肽與野生型NGF(或包含野生型NGF的多肽)相比，具有相似(例如，相等)或至少為2倍(例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、5000或10000倍或更多)的生物活性(例如，促進細胞生長)。在一些實施例中，本文所述長效NGF多肽與NGF部分(例如長效NGF多肽的相應NGF部分)相比，具有相似 (例如，相等)或至少為1.1倍(例如至少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍或更多)的生物活性。

藥代動力學(PK)

藥代動力學(PK)是指藥物(例如，本文所述的NGF部分或長效NGF多肽)在向受試者施用後的吸收、分佈、代謝和排泄。可用於確定臨床效用的藥代動力學參數包括但不限於血清/血漿濃度、隨時間變化的血清/血漿濃度、最大血清/血漿濃度(C_max)、達到最大濃度的時間(T_max)、半衰期(t_1/2)、給藥間隔內濃度-時間曲線下的面積(AUC_τ)等。

用於獲得藥物，例如，本文所述的NGF部分或長效NGF多肽或對照藥物(例如，蘇肽生^®鼠NGF)的PK曲線的技術是本領域已知的。參見Heller et al.,Annu Rev Anal Chem,11,2018；和Ghandforoush Sattari et al.,J Amino Acids,Article ID 346237,Volume 2010。在一些實施例中，在個體的血液、血漿或血清樣本中測量如本文所述的NGF部分或長效NGF多肽的PK曲線。在一些實施例中，使用質譜技術(例如，LC-MS/MS或ELISA)測量個體中如本文所述的NGF部分或長效NGF多肽的PK曲線。可通過本領域已知的任何方法在PK曲線上進行PK分析，例如，非室間分析，使用PKSolver V2軟體(Zhang Y.et al.,“PKSolver：An add-in program for pharmacokinetic and pharmacodynamic data analysis in Microsoft Excel,”Comput Methods Programs Biomed.2010；99(3)：306-1)。示例方法參見實施例6。

“C”表示受試者血漿、血清或任何合適的體液或組織中的藥物(例如，NGF部分或長效NGF多肽)濃度，通常表示為每單位體積的品質，例如納克/毫升。為方便起見，血清或血漿中的藥物濃度在本文中稱為“血清濃度”或“血漿濃度”。給藥後任何時間(例如，NGF部分或長效NGF多肽，例如靜脈注射、腹腔注射或皮下注射)的血清/血漿濃度稱為C_time或C_t。給藥期間的最大血清/血漿藥物濃度被稱為C_max；C_min是指給藥間隔結束時的最小血清/血漿藥物濃度；C_ave指給藥間隔期間的平均濃度。

術語“生物利用度”是指藥物(例如，NGF部分或長效NGF多肽)通過體循環，從而進入作用部位的程度或速率。

“AUC”是血清/血漿濃度-時間曲線下的面積，被認為是對生物利用度最可靠的測量方式，如給藥間隔內濃度-時間曲線下的面積(AUCτ)，“總暴露”或“一段時間內的總藥物暴露”(AUC_0-last或AUC_0-inf)，給藥後t時間的濃度-時間曲線下的面積(AUC_0-t)等。

血清/血漿濃度峰值時間(T_max)是給藥(例如，NGF部分或長效NGF多肽)後達到血清/血漿濃度(C_max)峰值的時間。

半衰期(t_1/2)是指在血漿或血清(或其它生物基質)中測得的藥物濃度(例如，NGF部分或長效NGF多肽)降至其在特定時間點的濃度或量的一半所需的時間。例如，靜脈給藥後，由於藥物的分佈和消除，血漿或血清中的藥物濃度下降。在靜脈給藥後血漿或血清藥物濃度隨時間變化的曲線中，第一階段或快速下降階段被認為主要是由於分佈導致，而後期的下降通常較慢，主要是由於消除導致，儘管這兩個過程在這兩個階段都會發生。分佈被認為是在足夠的時間後完成的。一般來講，消除半衰期由血漿/血清濃度-時間曲線的終末期或消除(主要)階段決定。參見Michael Schrag和Kelly Regal，“臨床前藥物開發毒理學綜合指南”的“第3章-藥代動力學和毒代動力學”，2013。

在一些實施例中，本文所述長效NGF多肽具有至少5小時的半衰期(例如，靜脈注射、皮下注射或肌肉注射，如給人類注射)，如至少為6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250或300小時中的任一個，或更長。在一些實施例中，本文所述長效NGF多肽具有5小時至300小時的半衰期(例如，靜脈注射，如給人類注射)，例如8小時至100小時、10小時至60小時、15小時至60小時或20小時至58小時中的任何一個。在一些實施例中，本文所述的長效NGF多肽以單次給藥的方式給藥，如單次靜脈注射或輸注、單次肌肉注射或單次皮下注射。在一些實施例中，本文所述的長效NGF多肽的迴圈半衰期約為55小時。

在一些實施例中，NGF部分的半衰期為1小時至2.5小時，如1.5小時至2.4小時。在一些實施例中，本文所述的長效NGF多肽的迴圈半衰期至少為相應的NGF部分(即，包含長效NGF多肽中包含的NGF部分而無Fc融合)或野生型NGF的迴圈半衰期的5倍，例如至少約為相應NGF部分或野生型NGF的迴圈半衰期的6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100倍中的任何一個，或以上。

致痛活性

NGF是公認的疼痛靶點，因為它能導致動物和人類疼痛。尤其在成人中，NGF能促進中樞和外周神經元亞群的健康和存活(Huang和Reichardt,Ann.Rev.Neurosci.24：677-736(2001))。NGF也有助於調節這些神經元的功能特性，並能夠對被稱為傷害感受器的感覺疼痛受體的敏感性或興奮性進行強直性控制(Priestley et al.,Can.J.Physiol.Pharmacol.80：495-505(2002)；Bennett,Neuroscientist 7：13-17(2001))。傷害感受器感知並向中樞神經系統傳遞各種有害的刺激，從而產生疼痛感(傷害感受)。NGF受體位於傷害感受器上。在受傷和炎症組織中NGF的表達增加，並在人的疼痛狀態下上調。NGF誘導的傷害感受/疼痛由高親和力NGF受體trkA(酪氨酸受體激酶A)介導(Sah et al.,Nat.Rev.Drug Disc.2：460-72(2003))。

廣義上的“疼痛”是指一種經驗現象，對於體驗疼痛的個體而言具有高度的主觀性，並且受個體心理狀態的影響，包括環境和文化背景。“生理上的”疼痛通常與協力廠商可感知的刺激有關，這種刺激是造成實際或潛在組織損傷的原因。從這個意義上講，根據國際疼痛研究協會(International Association the Study of Pain,IASP)的說法，可以認為疼痛是一種“與實際或潛在組織損傷相關的感覺和情感體驗，或用此類損傷的術語來描述”。然而，一些疼痛的例子沒有可察覺的原因。例如，精神性疼痛，包括在沒有任何引起可感知疼痛的證據的情況下，患有心理障礙的人因精神因素或有時會持續出現可感知的疼痛的綜合徵引起的先前存在的生理疼痛的加劇。

疼痛包括傷害性疼痛、神經病理性/神經源性疼痛、突發性疼痛、痛覺超敏、痛覺過敏、感覺過敏、觸物感痛、感覺異常、痛覺過度、幻肢痛、精神性疼痛、痛覺缺失、神經痛、神經炎。其它分類包括惡性疼痛、心絞痛疼痛和/或原發性疼痛、複雜區域疼痛綜合征I、複雜區域疼痛綜合征II。疼痛的類型和症狀不必相互排斥。這些術語的定義與IASP一致。

傷害性疼痛是由外周神經元中的特殊傷害感受器對傷害性刺激作出應答，並將傷害性刺激編碼為動作電位而引起的。傷害感受器通常位於Aδ纖維和(多模)C纖維上，是遊離的神經末梢，終止於皮膚下方、肌腱、關節和身體器官。背根神經節(DRG)神經元為外周和脊髓之間提供溝通的場所。信號經過脊髓處理，到腦幹和丘腦部位，最後到達大腦皮層，在那裡它通常(但不總是)引起疼痛感。傷害性疼痛可由多種化學、熱、生物(例如，炎症)或機械事件引起，這些事件有可能刺激或損傷身體組織，通常高於傷害感受器中的引起傷害感受活動所需的某種最小強度閾值。

神經病理性疼痛通常是外周或中樞神經系統功能異常導致的，分別引起外周或中樞神經病理性疼痛。IASP將神經性疼痛定義為神經系統原發性病變或功能障礙引發或導致的疼痛。神經病理性疼痛通常涉及神經系統的實際損傷，尤其是在慢性病中。炎性傷害性疼痛通常是組織損傷和由此引起的炎症過程導致的。神經病理性疼痛可在任何可觀察到的組織損傷明顯癒合後(例如，數月或數年)仍持續存在。

在神經病理性疼痛情況下，受影響區域的感覺資訊處理過程可能會變得異常，並且通常不會引起疼痛的無害刺激(例如，熱刺激、觸摸/壓力刺激)可能會導致疼痛(即，痛覺超敏)，或有害刺激可能會引起對正常疼痛刺激的過度疼痛感知(即，痛覺過敏)。此外，正常刺激可能會引起類似於電刺痛或電擊或“發麻”的感覺(即，感覺異常)和/或不愉快的感覺(即，感覺障礙)。突發性疼痛是先前存在的慢性疼痛的加重。痛覺過敏是一種疼痛綜合征，由對刺激的異常疼痛反應引起。在大多數情況下，刺激是重複的，伴隨著疼痛閾值增加，所述疼痛閾值被認為是患者能夠識別為疼痛的最小疼痛體驗。

神經病理性疼痛的例子包括觸覺性痛覺超敏(例如，神經損傷後誘發的)、神經痛(例如，皰疹後(或帶狀皰疹後)神經痛、三叉神經痛)、反射性交感神經營養不良/燒灼痛(神經創傷)、癌症疼痛(例如，癌症本身或炎症等相關條件引起的疼痛，或由於化療、手術或放療等治療)、假肢痛、嵌壓性神經痛(例如，腕管綜合征)和神經病變，如外周神經病變(例如，糖尿病、愛滋病、長期飲酒、接觸其它毒素(包括許多化療)、維生素缺乏症，以及其它各種疾病)。神經病理性疼痛包括由於各種原因(例如，外科手術、傷口、帶狀皰疹、糖尿病性神經病變、腿或手臂截肢、癌症等)導致的神經損傷後神經系統的病理性手術所引起的疼痛。與神經病理性疼痛相關的疾病包括創傷性神經損傷、中風、多發性硬化、脊髓空洞症、脊髓損傷和癌症

引起疼痛的刺激通常會引起炎症反應，而炎症反應本身也會導致疼痛。在一些情況下，疼痛似乎是由傷害性和神經性因素的複雜混合因素引起的。例如，慢性疼痛通常包括炎性傷害性疼痛或神經性疼痛，或兩者的混合。最初的神經系統功能障礙或損傷可能觸發炎症介質的神經釋放和隨後的神經病理性炎症。例如，偏頭痛可以表現為神經性疼痛和傷害性疼痛的混合。此外，肌筋膜疼痛可能繼發於來自肌肉的痛覺輸入，但異常的肌肉活動可能是神經系統疾病導致的。

在一些實施例中，本文所述的長效NGF多肽在受試者中減少或沒有致痛活性，如與無Fc融合的相應NGF部分相比，與野生型NGF相比，或與本文未描述的其它NGF-Fc融合蛋白相比(以下稱為“對照NGF構建體”)。在一些實施例中，疼痛是急性疼痛、短期疼痛、持續性或慢性傷害性疼痛、或持續性或慢性神經病理性疼痛。在一些實施例中，與對照NGF構建體(例如，野生型β-NGF)相比，本文所述長效NGF多肽引起的疼痛至少減少10%，如與對照NGF構建體相比，疼痛至少減少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、80%、90%、95%或100%中的任一個。在一些實施例中，本文所述長效NGF多肽在給受試者施用時不會引起疼痛。

可通過本領域已知的任何方法測量致痛活性，如WO2017157325、WO2017157326和CN108727486A中所述，其全部內容通過引用併入本文。在一些實施例中，通過痛閾測量疼痛，痛閾越高，疼痛越小。

例如，引起疼痛的活動可以通過要求患者根據一些不同的量表對所經歷的疼痛的品質和強度進行評分來測量。口頭疼痛量表使用詞語來描述無疼痛、輕度疼痛、中度疼痛和重度疼痛的範圍，每一級的分數從0到3。或者，可能會要求患者根據數值疼痛量表從0(無疼痛)到10(最嚴重疼痛)對其疼痛進行評分。在視覺類比量表(VAS)上，垂直或水準線包含從無痛到可能的最嚴重疼痛的文字描述，要求患者在代表其當前疼痛水準的點上標記。McGill疼痛指數使患者能夠從一系列簡短列表中選擇最能描述其疼痛的詞語來描述疼痛的品質和強度，例如捶擊、灼痛、捏痛。使用VAS或數值量表有困難的成年人(例如，FACES面部或非語言患者)可使用其它疼痛量表，例如，行為評定量表。功能性活性評分通過要求患者執行與疼痛區域相關的任務，來反應患者因疼痛而受到阻礙的程度。使用這些類型的量表以改善疼痛評分，例如，與對照NGF構建體相比，疼痛評分的改善潛在地表明測試NGF構建體(例如，本文所述的長效NGF多肽)引起疼痛的副作用減少。

在一些實施例中，可通過熱板法(54-55℃)在小鼠上測試本文所述的長效NGF多肽的致痛活性以確定疼痛閾值。簡單來說，將符合反應條件的小鼠麻醉，然後採用神經鉗夾法建立小鼠坐骨神經損傷模型，而假手術組僅分離坐骨神經，不鉗夾坐骨神經。然後將小鼠分為三組：假手術組、損傷對照組(正常生理鹽水)和實驗組(用本文所述的長效NGF多肽處理，和/或對照NGF，如小鼠β-NGF處理)。每只小鼠的疼痛閾值由舔後腳的潛伏期表示，可在手術前和手術後不同時間點測量。疼痛閾值增加%=(受傷後第10天的疼痛閾值-受傷前的疼痛閾值)×100%/受傷前的疼痛閾值。

本文所述長效NGF多肽的致痛活性也可在小鼠上進行測試，通過測量機械刺激下小鼠的曲爪反應，以確定疼痛閾值。它可以在短期致痛條件下或長期致痛條件下進行測試。簡單來說，向符合反應條件的小鼠皮下注射本文所述的載體或本文所述的長效NGF多肽(或對照NGF，如小鼠β-NGF；可在不同的濃度下)，然後測量注射後在機械刺激下的曲爪反應(例如，在不同時間點)，這反映了治療後的疼痛閾值。

本文所述的長效NGF多肽的致痛活性也可通過行為試驗進行測試。例如，給大鼠關節施用本文所述的載體或長效NGF多肽(或對照NGF，如小鼠β-NGF；可在不同的濃度下)，然後可通過記錄給藥後(例如，在不同時間點)的抬腿維持時間和抬腿次數來檢測樣品是否引起疼痛，以計算抬腿總持續時間。較短的抬腿總時間意味著較少的致痛活性。

穩定性

在一些實施例中，本文所述的長效NGF多肽具有優異的穩定性，例如物理穩定性、化學穩定性和/或生物穩定性。在一些實施例中，本文所述的長效NGF多肽具有優異的熱穩定性，例如高熔解溫度(Tm)和/或高聚集起始溫度(Tagg)。在一些實施例中，本文所述長效NGF多肽在加速應力(例如，高溫)下具有優異的穩定性，例如較少或沒有片段化、聚集體形成和/或聚集體增量。

蛋白質的穩定性，特別是對聚集的敏感性，主要取決於蛋白質分子的構象和膠體穩定性。一般認為，非天然蛋白質聚集的第一步，即最普遍的聚集形式，是分子結構的輕微擾動，例如，蛋白質的部分去折疊，即構象變化。這是由蛋白質的構象穩定性決定的。在第二步中，部分未折疊的分子在擴散和隨機布朗運動的驅動下靠近，形成聚集。第二步主要由分子的膠體穩定性決定(參見Chi et al.,Roles of conformational stability and colloidal stability in the aggregation of recombinant human granulocyte colony stimulating factor.Protein Science,2003 May；12(5)：903-913)。如本文所用，術語“穩定性”通常是指維持生物活性物質(如蛋白質)的完整性或儘量減少其降解、變性、聚集或去折疊。如本文所用，“改良的穩定性”通常意味著，在已知會導致降解、變性、聚集或去折疊的條件下，與對照組蛋白質(例如，其它NGF-Fc融合蛋白)相比，目標蛋白質(例如，本文所述的長效NGF多肽)保持更佳的穩定性。

差示掃描量熱法(Differential scanning calorimetry，DSC)和差示掃描螢光法(differential scanning fluorimetry，DSF)是本領域眾所周知的技術，用於預測蛋白質製劑的穩定性。具體而言，這些技術可用於確定給定製劑中蛋白質的去折疊溫度(Tm)。將給定製劑中蛋白質的高Tm測量值與可用於長期、穩定儲存的更可靠和穩定的蛋白質製劑相關聯是本領域的標準做法。

一種“穩定的”蛋白質(或製劑)，例如，本文所述的長效NGF多肽，基本上在製造過程中和/或儲存時保持其物理穩定性和/或化學穩定性和/或生物活性。本領域有多種用於測量蛋白質穩定性的分析技術，並在Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.(1993)Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90。10：29-90中進行了綜述。例如，在一個實施例中，蛋白質的穩定性根據溶液中單體蛋白質的百分比確定，其中降解(例如，片段化)和/或聚集蛋白質的百分比較低。優選地，蛋白質(或製劑)在室溫(約30℃)或40℃下穩定至少1個月和/或在約2-8℃下穩定至少6個月，或至少1年或至少2年。此外，該蛋白質(或製劑)優選在冷凍(例如-70℃)和融解後穩定，以下稱為“凍/融迴圈”。

一種蛋白質，例如，本文所述的長效NGF多肽，如果在顏色和/或透明度的目視檢查或通過紫外光散射或尺寸排阻色譜法測量時，基本上沒有不穩定跡象，例如聚集、沉澱和/或變性，則這種蛋白質在製劑中“保持其物理穩定性”。聚集是單個蛋白質分子或複合物共價或非共價結合形成聚集體的過程。聚集可以進行到形成可見沉澱的程度。

一種蛋白質，例如，本文所述的長效NGF多肽，如果在給定時間內的化學穩定性使得該蛋白質仍然保持其生物活性(例如，如上文“生物活性”小節所述)，則該蛋白質在製劑中“保持其化學穩定性”。化學穩定性可以通過例如檢測和量化蛋白質的化學變化形式來評估。化學變化可能涉及尺寸改變(例如，剪切)，可使用尺寸排阻色譜法、SDS-PAGE和/或基質輔助鐳射解吸電離/飛行時間質譜(MALDI/TOF MS)進行評估。其它類型的化學變化包括電荷變化(例如，由於脫醯胺或氧化而發生的變化)，例如，可通過離子交換色譜法進行評估。

一種蛋白質，例如，本文所述的長效NGF多肽，如果藥物製劑中的蛋白質對於其預期目的具有生物活性，則該蛋白質在製劑中“保留其生物活性”。例如，如果製劑中蛋白質的生物活性為在製備製劑時顯示的生物活性的30%、20%或10%(在分析誤差範圍內)內，則該蛋白保留了其生物活性。

本領域技術人員已知，蛋白質(例如，本文所述的長效NGF多肽)的穩定性除製劑的組成外還取決於其它特性。例如，穩定性可能受到溫度、壓力、濕度、pH值和外部輻射的影響。蛋白質製劑中蛋白質(例如，本文所述的長效NGF多肽)的穩定性可通過多種方法確定。在一些實施例中，通過尺寸排阻色譜法(SEC)確定蛋白質穩定性。SEC根據分析物(例如，蛋白質等大分子)的流體力學尺寸、擴散係數和表面性質來分離分析物。因此，例如，SEC可將本文所述的天然三維構象的長效NGF多肽與處於各種變性狀態的蛋白質和/或已降解的蛋白質分離。在SEC中，固定相通常由填充在玻璃或鋼柱內緻密的三維琪質中的惰性顆粒組成。流動相可以是純水、水性緩衝液、有機溶劑、它們的混合物或其它溶劑。固定相顆粒具有小孔和/或通道，僅允許小於一定尺寸的物質進入。因此，大顆粒被排除在這些孔隙和通道之外，但較小顆粒從流動相中轉移。顆粒被固定在固定孔隙中的時間在一定程度上取決於它們能滲透到孔隙中的深度。它們從流動相液流中轉移會導致其從色譜柱中洗脫所需的時間更長，因此顆粒之間基於其大小差異而進行分離。參見實施例3所提供的示例方法。

在一些實施例中，SEC與鑒定技術相結合，以鑒定或表徵蛋白質(例如，本文所述的長效NGF多肽)或其片段。蛋白質鑒定和表徵可通過多種技術完成，包括但不限於色譜技術，例如高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)、十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(CE-SDS)、免疫分析、電泳、紫外/可見/紅外光譜、拉曼光譜、表面增強拉曼光譜、質譜、氣相色譜、靜態光散射(Static Light Scattering，SLS)、傅裡葉變換紅外光譜(Fourier-transform infrared spectroscopy，FTIR)、圓二色譜(Circular Dichroism,CD)、尿素誘導蛋白質去折疊技術、固有色氨酸螢光、差示掃描量熱法和/或ANS蛋白結合。

在一些實施例中，樣品製劑(例如，包含本文所述的長效NGF多肽)和對照製劑(例如，包含其它NGF-Fc融合蛋白或標準品)在處理階段之前可選地進行測定，以確定單體的含量，聚集體和/或片段化蛋白(和/或片段增加百分比，聚集體增加百分比等)，如下文實施例3所述。隨後，每種蛋白質製劑都要經歷一個處理階段。例如，每種蛋白質製劑可在特定溫度(例如，40℃、25℃或5℃)下儲存較長時間(例如，3個月、6個月、12個月或更長)。在一些實施例中，蛋白質製劑經受物理應力測試，例如攪拌應力試驗。在一些實施例中，蛋白質製劑經受加速穩定性試驗，例如在加速應力下進行處理，包括高溫(例如，40℃)、高濕度和/或低pH值等。在一些實施例中，蛋白質製劑經歷冷凍和融解迴圈。在一些實施例中，相同蛋白質製劑的樣品接受不同處理，例如，在不同溫度下儲存一段時間。在處理階段之後，對蛋白質製劑進行測定，以確定蛋白質單體、聚集體和/或片段的含量(和/或片段增加百分比，聚集體增加百分比等)。在一些實施例中，在連續加熱下處理蛋白質製劑以測量熔解溫度(Tm)和/或聚集起始溫度(Tagg)，例如將溫度從約20℃升高到約95℃(例如，以約0.3℃/min的加熱速率)。可使用螢光蛋白分析儀，分別在266nm/473nm下通過螢光吸光度和光散射的變化測量Tm和Tagg。Tm越高，熱穩定性越高。Tagg越高，表示越不易發生聚集。在一些實施例中，本文所述的長效NGF多肽具有至少50℃的Tm，如至少為51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃或75℃中的任何一個。在一些實施例中，本文所述的長效NGF多肽具有至少50℃的Tagg，例如至少為51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或85℃中的任何一個。

穩定性，例如組合物或製劑的物理穩定性，可通過本領域眾所周知的方法評估，包括測量樣品的表觀光衰減(吸光度或光密度)。這種光衰減測量與製劑的渾濁度有關。製劑的渾濁度是溶解在溶液中的蛋白質的固有特性，通常通過比濁法測定，並以比濁法濁度單位(nephelometric turbidity unit，NTU)測量。

濁度，例如，作為溶液中一種或多種成分濃度的函數，例如，蛋白質和/或鹽濃度，也被稱為製劑的“乳白色”或“乳白色外觀”。濁度可以通過使用已知濁度的懸浮液生成的標準曲線來計算。確定藥物組合物渾濁度的參考標準可基於歐洲藥典標準(歐洲藥典，第四版，歐洲委員會藥品品質理事會(European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare，EDQM)，斯特拉斯堡，法國)。根據歐洲藥典標準，澄清溶液定義為濁度小於或等於對照懸浮液。根據歐洲藥典標準，該對照懸浮液的濁度約為3。在沒有關聯或非理想效應的情況下，濁度測量可以檢測到瑞利散射，瑞利散射通常隨濃度線性變化。用於評估藥物蛋白質的物理穩定性的其它方法在本領域是公知的，例如，尺寸排阻色譜法或分析性超速離心法。

在一些實施例中，穩定性指含有本文所述的長效NGF多肽的製劑具有低至檢測不到的微粒形成水準。本文所用的短語“低至檢測不到的微粒形成水準”是指通過HIAC分析或目視分析確定，含有小於30個微粒/ml、小於20個微粒/ml、小於15個微粒/ml、小於10個微粒/ml、小於5個微粒/ml、小於2粒/ml或小於1粒/ml的樣品。在一些實施例中，通過HIAC分析或目視分析未檢測到長效NGF多肽製劑中的微粒。

“大量的蛋白質聚集”是指蛋白質製劑中的蛋白質聚集水準顯著高於對照蛋白質製劑中的蛋白質聚集水準。對照蛋白質製劑可以是儲存期之前或處理之前(例如，在經受不穩定條件之前，例如高溫、濕度、pH和/或長期儲存之前)的相同蛋白質製劑。對照蛋白質製劑可以是在相同條件下測試的不同蛋白質製劑(例如，其它NGF-Fc融合蛋白質或無Fc融合的NGF部分)。

“基本無蛋白質聚集”是指本發明的蛋白質(或製劑)，其蛋白質聚集的水準或百分比不顯著高於對照製劑。例如，該短語指蛋白質(或製劑)聚集水準低於15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%或0.1%。蛋白質聚集水準可使用本領域已知的標準技術來確定，如本文實施例3中所述。在一些實施例中，本文所述的長效NGF多肽基本上無蛋白質聚集(例如，在加速穩定性試驗中)。在一些實施例中，長效NGF多肽最多具有15%的蛋白質聚集，例如最多14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0.5%的蛋白質聚集(例如，加速穩定性試驗條件下，例如加熱)。在一些實施例中，本文所述長效NGF多肽沒有蛋白質聚集(例如，在加速穩定性試驗條件下，例如加熱)。在一些實施例中，長效NGF多肽具有不超過15%的聚集體增加，例如不超過14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的聚集體增加(例如，在加速穩定性試驗條件下，例如加速加熱)。在一些實施例中，通過SEC測量穩定性。在一些實施例中，通過CE-SDS測量穩定性。

在一些實施例中，穩定性指本文所述的長效NGF多肽片段化減少。本文所用的術語“低至檢測不到的片段水準”是指含有等於或大於80%、85%、90%、95%、98%或99%的總蛋白質的樣品，例如，在HPSEC確定的單峰中，或在還原毛細管凝膠電泳(rCGE)確定的多峰中(例如，與亞基數量相同的峰)，代表未降解蛋白質或其未降解片段，且不含占總蛋白質的超過5%、超過4%、超過3%、超過2%、超過1%或超過0.5%的其它單峰。本文所用的術語“還原毛細管凝膠電泳”是指在還原條件下的毛細管凝膠電泳，該還原條件足以還原含Fc蛋白質中的二硫鍵，如本文所述的長效NGF多肽。在一些實施例中，長效NGF多肽具有0%至15%的片段，例如0%至12%的片段(例如，在加速穩定性試驗條件下，如加速加熱)。在一些實施例中，長效NGF多肽具有不超過30%的片段，例如不超過29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的片段(例如，在加速穩定性試驗條件下，如加速加熱)。在一些實施例中，長效NGF多肽沒有片段(例如，在加速穩定性試驗條件下，如加速加熱)。在一些實施例中，長效NGF多肽的片段增加不超過30%，如片段增加不超過29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%(例如，在加速穩定性試驗條件下，如加速加熱)。在一些實施例中，長效NGF多肽具有至少75%的主峰，例如至少76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的主峰(例如，在加速穩定性試驗條件下，如加速加熱)。在一些實施例中，通過SEC測量穩定性。在一些實施例中，通過CE-SDS測量穩定性。

長效NGF多肽衍生物

在一些實施例中，本文所涉及的長效NGF多肽可被進一步修飾，以包含本領域已知且容易獲得的額外的非蛋白部分。適於長效NGF多肽衍生物的非蛋白部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧環戊烷、聚-1,3,6-三氧戊烷、乙烯/馬來酸酐共聚物，聚醯胺酸(均聚物或無規共聚物)、葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯基多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由於聚乙二醇丙醛在水中的穩定性，其在製造中可能具有優勢。聚合物可以是任何分子量的，並且可以是支鏈或非支鏈的。連接到長效NGF多肽的聚合物的數量可能不同，如果連接了多個聚合物，則它們可以是相同或不同的分子。一般來說，用於衍生化的聚合物的數量和/或類型可基於以下考慮來確定，包括但不限於待改進的長效NGF多肽的特定性質或功能，長效NGF多肽衍生物是否會在特定條件下用於治療等。

在一些實施例中，本文所述的長效NGF多肽進一步包含標籤，所述標籤選自發色團、螢光團(例如，香豆素、氧雜蒽、菁、芘、硼聚苯並氮雜吲哚、惡嗪及其衍生物)、螢光蛋白(例如GFP、藻膽蛋白及其衍生物)，磷光染料(例如，二氧雜環丁烷、氧雜蒽或碳菁染料、鑭系螯合物)、串聯染料(例如，菁-藻膽蛋白衍生物和氧雜蒽-藻膽蛋白衍生物)、粒子(例如，金簇、膠體金、微球、量子點)、半抗原、酶(例如，過氧化物酶、磷酸酶、糖苷酶、螢光素酶)和放射性同位素(例如，¹²⁵I、³H、¹⁴C、³²P)。

在一些實施例中，長效NGF多肽可被進一步修飾以包含一種或多種生物活性蛋白質、多肽或其片段。如本文所用，“生物活性”或“生物學上的活性”可互換使用，是指在體內顯示生物活性以執行特定功能。例如，它可能意味著與特定生物分子結合，如蛋白質、DNA等，然後促進或抑制該生物分子的活性。在一些實施例中，生物活性蛋白質或其片段包括為預防或治療疾病或症狀作為活性藥物施用給患者的蛋白質和多肽，以及用於診斷目的的蛋白質和多肽，例如用於診斷試驗或體外檢測的酶，以及給患者施用以預防疾病的蛋白質和多肽，例如疫苗。在一些實施例中，生物活性蛋白質或其片段具有免疫刺激/免疫調節、膜轉運或酶活性。在一些實施例中，生物活性蛋白、多肽或其片段為酶、激素、生長因數、細胞因數或其混合物。在一些實施例中，生物活性蛋白質、多肽或片段可特異性識別目標肽(例如抗原或其它蛋白質)。

在一些實施例中，可包含在本文所述的長效NGF多肽中的生物活性蛋白質或其片段是抗原結合蛋白質(例如，抗體)。在一些實施例中，可包含在如本文所述的長效NGF多肽中的生物活性蛋白質或其片段是抗體模擬物，其是一種使人聯想到抗體的包含抗原結合域的小型工程蛋白質，(GGeering和Fussenegger,Trends Biotechnol.,33(2)：65-79,2015)。這些分子來自現有的人類支架蛋白，由單一多肽組成。可包含在如本文所述的長效NGF多肽中的抗體模擬物示例可以是但不限於設計的錨蛋白重複蛋白(DARPin；包含3-5個完全合成的錨蛋白重複序列，兩側為N端和C端帽結構域)，一種親和力多聚體(avimer；一種高親和力蛋白質，包含多個A結構域，每個結構域對靶點的親和力較低)，或一種抗凝素(基於脂質支架，具有四個可接近的環，每個環的序列可以隨機)。在一些實施例中，可包含在如本文所述的長效NGF多肽中的生物活性蛋白質或其片段是犰狳重複蛋白(例如，β-連環蛋白、α-導入蛋白、斑珠蛋白、大腸腺瘤性息肉病(APC))，包含犰狳重複單元(特性，重複氨基酸序列的長度約為40個殘基)。每個犰狳重複單元由一對形成髮夾結構的α螺旋組成。多個重複拷貝形成了所述的α螺線管結構。犰狳重複蛋白能夠結合不同類型的肽，依賴於肽主鏈的恒定結合方式，而不需要特定的保守側鏈或與肽的遊離N-或C-末端相互作用。通過殘基識別肽殘基的可能性，再加上重複蛋白的內在模組性，使得犰狳重複蛋白有望成為肽結合通用支架的候選。

III.編碼長效NGF多肽的載體

本發明還涉及編碼本文所述任何長效NGF多肽的分離核酸，包含編碼本文所述任何長效NGF多肽的核酸的載體。還涉及包含編碼本文所述任何長效NGF多肽的核酸的分離宿主細胞(例如，CHO細胞、HEK 293細胞、Hela細胞或COS細胞)，或包含編碼本文所述任何長效NGF多肽的核酸的載體。在一些實施例中，分離的核酸進一步編碼長效NGF多肽N端的信號肽序列(例如，SEQ ID NO：6)。在一些實施例中，分離的核酸進一步編碼長效NGF多肽N端的前導肽序列(例如，SEQ ID NO：5)。在一些實施例中，分離的核酸進一步編碼信號肽序列(例如，SEQ ID NO：6)，後面是長效NGF多肽N端的前導肽序列(例如，SEQ ID NO：5)。

因此，在一些實施例中，涉及一種編碼長效NGF多肽的分離核酸，所述多肽從N端到C端包含NGF部分和Fc部分，其中NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-3中的任一個)，並且所述Fc部分來自IgG1 Fc或IgG4 Fc。在一些實施例中，涉及一種編碼長效NGF多肽的分離核酸，該多肽包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：61-67中的任一氨基酸序列。在一些實施例中，分離的核酸在5'端進一步包含編碼信號肽序列SEQ ID NO：6的核酸序列。在一些實施例中，分離的核酸在5'端進一步包含編碼前導肽序列SEQ ID NO：5的核酸序列。在一些實施例中，分離的核酸(從5'到3')進一步包含編碼信號肽序列SEQ ID NO：6的核酸序列，隨後是位於5'端的編碼前導肽序列SEQ ID NO：5的核酸序列。

在一些實施例中，涉及一種編碼長效NGF多肽的分離核酸，所述多肽包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NOs：34、36、38、40、42、44和46中的任一個。在一些實施例中，涉及一種編碼長效NGF多肽的分離核酸，所述多肽包含(或基本上由......組成、或由......組成)氨基酸序列SEQ ID NOs：34、36、38、40、42、44和46中的任一個，不包含信號肽序列SEQ ID NOs：6。在一些實施例中，涉及一種分離的核酸，所述核酸包含(或基本上由......組成、或由......組成)核酸序列SEQ ID NOs：33、35、37、39、41、43和45中的任一個。

在一些實施例中，包含編碼本文所述任何長效NGF多肽的核酸的載體適於在真核細胞中複製和整合，如哺乳動物細胞(例如，CHO細胞、HEK293細胞、Hela細胞、COS細胞)。在一些實施例中，載體是一種病毒載體。在一些實施例中，載體是非病毒載體，如pTT5。

已經開發出許多基於病毒的系統用於將基因轉移到哺乳動物細胞中。病毒載體的示例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒載體、單純皰疹病毒載體及其衍生物。病毒載體技術是本領域公知的，例如，在Sambrook等(2001,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)中，及其它病毒學和分子生物學手冊中均對其進行了詳述。逆轉錄病毒為基因傳遞系統提供了一個方便的平臺。可使用本領域已知的技術將異源核酸插入載體並包裝在逆轉錄病毒微粒中。然後，可分離重組病毒並在體外或離體條件下將其輸送至工程哺乳動物細胞。許多逆轉錄病毒系統是本領域已知的。在一些實施例中，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體是本領域已知的。在一些實施例中，使用慢病毒載體。在一些實施例中，使用自失活慢病毒載體。例如，攜帶構建體蛋白編碼序列的自失活慢病毒載體可以用本領域已知的實驗方法進行包裝。所得的慢病毒載體可用於使用本領域已知的方法轉導至哺乳動物細胞。來自逆轉錄病毒(如慢病毒)的載體是實現長期基因轉導的合適工具，因為它們允許轉基因長期、穩定地整合並在子代細胞中的繁殖。慢病毒載體也具有低免疫原性，並且可以轉導非增殖細胞。

在一些實施例中，載體是非病毒載體。在一些實施例中，載體是pTT5載體。在一些實施例中，載體是轉座子，例如睡美人(sleeping beauty transposon，SB)轉座子系統或PiggyBac轉座子系統。在一些實施例中，載體是基於聚合物的非病毒載體，包括，例如，聚(乳酸-羥基乙酸共聚物)(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)和聚乳酸(Polylactic Acid，PLA)、聚 (乙烯亞胺)(Polyethylenimine，PEI)和樹枝狀大分子。在一些實施例中，載體是基於陽離子脂質的非病毒載體，如陽離子脂質體、脂質納米乳和固體脂質納米粒(Solid lipid nanoparticles，SLN)。在一些實施例中，載體是基於肽的非病毒基因載體，例如聚-L-賴氨酸。適用於基因組編輯的任何已知非病毒載體都可用於將編碼長效NGF多肽的核酸引入宿主細胞。參見Yin H.et al..,Nature Rev.Genetics(2014)15：521-555；Aronovich EL et al.,“The Sleeping Beauty transposon system：a non-viral vector for gene therapy.”Hum.Mol.Genet.(2011)R1：R14-20和Zhao S.et al.,“PiggyBac transposon vectors：the tools of the human gene editing.”Transl.Lung Cancer Res.(2016)5(1)：120-125，通過引用併入本文。在一些實施例中，通過物理方法將編碼本文所述長效NGF多肽的任何一個或多個核酸或載體引入宿主細胞(例如，CHO、HEK 293、Hela或COS)，包括但不限於電穿孔、聲穿孔、光穿孔、磁轉染、水穿孔。

在一些實施例中，載體包含可選擇的標記基因或報告基因，用於從載體(例如，慢病毒載體、pTT5載體)轉染的宿主細胞群中選擇出表達本文所述的長效NGF多肽的細胞。可選擇的標記和報告基因都可能被適當的調控序列包圍，以使其能夠在宿主細胞中表達。例如，載體可包含轉錄和翻譯終止子、起始序列和用於調節核酸序列表達的啟動子。

可使用本領域已知的任何分子克隆方法，包括，例如，使用限制性內切酶位點和一個或多個可選擇的標記將核酸克隆到載體中。在一些實施例中，核酸可操作地連接到啟動子上。，已經探索出多種用於原核細胞或真核細胞(例如，哺乳動物細胞)中進行基因表達的啟動子，並且本領域已知的任何啟動子都可用於本發明。啟動子大致可分為組成型啟動子或調控型啟動子，如誘導型啟動子。

在一些實施例中，編碼本文所述的長效NGF多肽的核酸可操作地連接到組成型啟動子上。組成型啟動子允許異源基因(也稱為轉基因)在宿主細胞中組成型表達。本文所考慮的啟動子示例包括但不限於巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)啟動子(promoter)、人類延伸因數-1α(human elongation factor 1 alpha,hEF1α)、泛素C啟動子(UbiC)、磷酸甘油激酶啟動子((phosphoglycerate kinase promoter,PGK)、猿猴病毒40早期啟動子(Simian vacuolating virus 40，SV40)、雞β-肌動蛋白啟動子與CMV早期增強子(CAGG)偶聯，羅氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)啟動子、多瘤病毒增強子/單純皰疹胸苷激酶(MC1)啟動子、β肌動蛋白(β-Actin，β-ACT)啟動子、“骨髓增生性肉瘤病毒增強子、陰性對照區缺失、d1587rev引物結合位點取代(MND)”啟動子。大量研究中已廣泛比較了這些組成型啟動子在驅動轉基因表達方面的效率。在一些實施例中，編碼本文所述的長效NGF多肽的核酸可操作地連接到CMV啟動子上。

在一些實施例中，編碼本文所述的長效NGF多肽的核酸可操作地連接到誘導型啟動子。誘導型啟動子屬於調控型啟動子的範疇。誘導型啟動子可被一個或多個條件誘導，如物理條件、宿主細胞的微環境或宿主細胞的生理狀態、誘導劑(即誘導藥劑)或其組合物。在一些實施例中，誘導條件不誘導宿主細胞中內源性基因的表達。在一些實施例中，誘導條件選自：誘導劑、輻射(如電離輻射、光)、溫度(如熱)、氧化還原狀態和宿主細胞的啟動狀態。在一些實施例中，誘導型啟動子可以是NFAT啟動子、TETON^®啟動子或NFκB啟動子。

IV.製備方法

還涉及製備本文所述任何長效NGF多肽的方法。因此，在一些實施例中，涉及一種製備長效NGF多肽的方法，包括：(a)在可有效表達所編碼的長效NGF多肽的條件下，培養包含編碼本文所述任何長效NGF多肽的核酸或載體的宿主細胞(例如，CHO細胞、HEK 293細胞、Hela細胞或COS細胞)；和(b)從所述宿主細胞獲得表達的長效NGF多肽。在一些實施例中，步驟(a)的方法進一步包含產生宿主細胞，所述宿主細胞包含編碼本文所述的長效NGF多肽的核酸或載體。本文所述的長效NGF多肽可使用本領域已知或本文所述的任何方法製備。示例方法參見實施例1。

在一些實施例中，本文所述的長效NGF多肽用真核細胞表達，如哺乳動物細胞。在一些實施例中，本文所述的長效NGF多肽用原核細胞表達。當本文所述的長效NGF多肽用原核細胞表達時，所產生的proNGF-(可選接頭)-Fc部分不能被加工成前導肽序列。因此，當用於原核細胞表達時，可將編碼長效NGF多肽的核酸設計為不含編碼前導肽序列的核酸序列(例如，SEQ ID NO：5)。

原核細胞的重組產物

a)載體構建

可以使用標準重組技術獲得編碼本申請所述的蛋白質構建體的多核酸序列。可以使用核苷酸合成儀或PCR技術合成多核苷酸。一旦獲得編碼多肽的序列，將其插入能夠在原核宿主中複製和表達異源多核苷酸的重組載體中。本領域中已知且可使用的許多載體都可用於本發明。選擇合適的載體主要取決於要插入載體的核酸大小以及載體所轉化的特定宿主細胞。每個載體包含各種成分，這取決於該載體的功能(異源多核苷酸的擴增或表達，或兩者兼有)及該載體與其所在的特定宿主細胞之間的相容性。載體組件通常包括但不限於：複製起始位元點、選擇標記基因、啟動子、核糖體結合位元點(Ribosome-binding site，RBS)、信號序列、異源核酸插入和轉錄終止序列。

一般來說，質粒載體含有來自於與宿主細胞相容物種的複製子和控制序列，，其與這些宿主細胞一起使用。載體通常攜帶一個複製位點，以及能夠在轉化細胞中提供表型選擇的標記序列。例如，大腸桿菌通常使用pBR322轉化，pBR322是一種來源於大腸桿菌的質粒。pBR322包含編碼氨苄青黴素(Ampicillin，Amp)和四環素(tetracycline，Tet)抗性的基因，並因此提供了識別轉化細胞的簡單方法。pBR322、其衍生物或其它細菌質粒或噬菌體也可含有或經修飾後含有可被微生物用於表達內源性蛋白質的啟動子。Carter et al.,U.S.Pat.No.5,648,237詳述了用於表達特定抗體的pBR322衍生物的示例。

此外，包含與宿主微生物相容的複製子和控制序列的噬菌體載體可作為轉化載體與這些宿主細胞一起使用。例如，噬菌體如GEM^TM-11可用於製備重組載體，所述重組載體可用於轉化易感宿主細胞，如大腸桿菌LE392。

啟動子是一段位於順反子上游(5′)的非翻譯調控序列，可調節下游基因表達。原核啟動子通常分為兩類，誘導型和組成型。誘導型啟動子是一種可以回應培養條件改變(例如，營養素的存在或缺乏或溫度的變化)，從而啟動並提高順反子轉錄水準的啟動子。

可被潛在宿主細胞識別的許多啟動子都是公知的。通過限制性內切酶將啟動子從源DNA中移出並將分離的啟動子序列插入本申請的載體中，所選啟動子可操作地連接到編碼多肽的順反子DNA上。天然啟動子序列和許多異源啟動子都可用於指導靶基因的擴增和/或表達。在一些實施例中，利用異源啟動子，因為與天然靶多肽啟動子相比，異源啟動子通常允許更大的轉錄，並且表達靶基因的產量更高。

適用於原核宿主的啟動子包括PhoA啟動子、-半乳糖苷酶和乳糖啟動子系統、色氨酸(Tryptophan，trp)啟動子系統和雜交啟動子，如tac或trc啟動子。然而，在細菌中具有功能的其它啟動子(如其它已知的細菌或噬菌體啟動子)也適用。它們的核酸序列已經公開，從而使技術人員能夠使用接頭或適配子來提供任何所需的限制位元點將它們連接到編碼目標輕鏈和重鏈的順反子上(Siebenlist et al.,(1980)Cell 20：269)。

在一些實施例中，重組載體內的每個順反子都包含一個分泌信號序列組分，該組分直接引導所表達的多肽跨膜轉移。一般來說，信號序列可以是載體的組成部分，也可以是插入載體的靶多肽DNA的一部分。為本發明而選擇的信號序列應為能被宿主細胞識別和加工(即，被信號肽酶切割)的序列。對於不能識別和加工異源多肽固有信號序列的原核宿主細胞，信號序列被原核信號序列所取代，該原核信號序列選自，例如，鹼性磷酸酶、青黴素酶、異戊烯基焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate，IPP)或熱穩定性腸毒素II(heat-stable toxin II，STII)先導物、LamP、PhoE、PelB、OmpA和MBP。

在一些實施例中，生產本申請的蛋白質構建體可發生在宿主細胞的細胞質中，因此不需要在每個順反子內都存在分泌信號序列。在一些實施例中，多肽組分被表達、折疊和組裝以在細胞質內形成蛋白質構建體。某些宿主菌株 (例如，大腸桿菌trxB-菌株)提供有利於二硫鍵形成的細胞質條件，從而允許表達的蛋白質亞基適當折疊和組裝。參見Proba和Pullthun,Gene,159：203(1995)。

b)原核宿主細胞

適於表達本申請的蛋白質的原核宿主細胞包括古細菌和真細菌，如革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌。可用細菌的示例包括大腸桿菌(例如，大腸桿菌)、桿菌(例如，枯草桿菌)、腸桿菌、假單胞菌(例如，銅綠假單胞菌)、鼠傷寒沙門氏菌、粘質沙雷氏菌、克雷伯菌、變形桿菌、志賀菌、根瘤菌、透明顫菌或副球菌。在一些實施例中，使用革蘭氏陰性細胞。在一些實施例中，大腸桿菌細胞作為本發明的宿主。大腸桿菌菌株示例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular and Molecular Biology,vol.2(Washington,D.C.：American Society for Microbiology,1987),pp.1190-1219；ATCC Deposit No.27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 AfhuA(AtonA)ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc fepE)degP41 kan^R的菌株33D3(U.S.Pat.No.5,639,635)。其它菌株及其衍生物，如E.coli 294(ATCC 31446)、E.coli B、E.coli 1776(ATCC 31537)和E.coli RV308(ATCC 31608)也同樣適用。這些例子是說明性的，而不是限制性。構建任何上述提及的已知基因型的細菌衍生物的方法在本領域已知，並在例如Bass et al.,Proteins,8：309-314(1990)中進行了詳述。考慮到複製子在細菌細胞中的可複製性，通常需要選擇合適的細菌。例如，當使用公知的質粒如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410來提供複製子時，大腸桿菌、沙雷氏菌或沙門氏菌適於用作宿主。

通常，宿主細胞應分泌最少量的蛋白水解酶，並需要在細胞培養物中適當加入額外的蛋白酶抑制劑。

c)蛋白生產

用上述表達載體轉化宿主細胞，並在經適當改良的傳統營養培養基中培養，以誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼所需序列的基因。轉化是指將DNA導入原核宿主，使DNA可以作為染色體外的元件或通過染色體整合進行複製。根據所用的宿主細胞，使用適合此類細胞的標準技術進行轉化。採用氯化鈣的鈣處理通常用於含有大量細胞壁屏障的細菌細胞。另一種轉化方法採用聚乙二醇/二甲基亞碸。另一種技術是電穿孔。

用於生產本申請的蛋白質構建體的原核細胞在本領域已知的且適於培養所選宿主細胞的培養基中生長。合適的培養基包括luria broth(LB)和必要的營養補充劑。在一些實施例中，培養基還包含基於表達載體的結構所選擇的選擇劑，以選擇性地允許包含表達載體的原核細胞生長。例如，將氨苄青黴素添加到培養基中，用於表達氨苄青黴素抗性基因的細胞生長。

除碳源、氮源和無機磷酸鹽源外，任何必要的補充劑也可單獨或作為與其它補充劑或介質(如複合氮源)的混合物以適當的濃度加入。可選地，培養基可包含一種或多種選自谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、硫代甘氨酸、二硫代赤蘚糖醇和二硫蘇糖醇的還原劑。原核宿主細胞在合適的溫度下培養。例如，對於大腸桿菌的生長，優選的溫度範圍為20℃至39℃，更優選的為25℃至37℃，甚至更優選的為30℃。培養基的pH值可以是5到9之間的任何pH值，主要取決於宿主生物。對於大腸桿菌來說，pH值優選為6.8至7.4，且更優選為7.0。

如果在本申請的表達載體中使用誘導型啟動子，則在適合啟動子啟動的條件下誘導蛋白質表達。在本申請的一方面，PhoA啟動子用於控制多肽的轉錄。因此，轉化的宿主細胞在磷酸鹽限制培養基中培養以進行誘導。優選地，磷酸鹽限制培養基為C.R.A.P培養基(參見Simmons et al.,J.Immunol.Methods(2002),263：133-147)。根據所採用的載體結構，可使用本領域已知的多種其它誘導劑，這在本領域是已知的。

本申請所表達的蛋白質構建體分泌到宿主細胞的周質中並從中回收。蛋白質回收通常涉及破壞微生物，通常通過滲透壓休克、超聲處理或裂解等方式。一旦細胞被破壞，可通過離心或過濾去除細胞碎片或整個細胞。例如，可通過親和樹脂色譜法進一步純化蛋白質。或者，蛋白質可以被運輸到培養基中並在其中被分離出來。可從培養基中移除細胞，過濾和濃縮培養基上清液以進一步純化所產生的蛋白質。所表達的多肽可通過聚丙烯醯胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)和Western blot試驗等常用方法進一步分離和鑒定。

或者，通過發酵過程大規模生產蛋白質。各種大規模補料分批發酵程式可用於生產重組蛋白。大規模發酵的容量至少為1000升，最好為1000至100000升。這些發酵罐使用攪拌器葉輪來分配氧氣和營養物質，特別是葡萄糖(首選碳/能源)。小規模發酵通常指發酵罐中的發酵，其容量體積不超過100升，範圍從1升到100升。

在發酵過程中，通常是細胞在合適的條件下生長至所需密度後開始誘導蛋白質表達，例如，在OD₅₅₀約為180-220時，此時細胞處於早期靜止期。根據所採用的載體結構，可使用本領域已知和上文所述的多種誘導劑。細胞在誘導前可以生長較短的時間。細胞通常誘導約12-50小時，儘管可以使用可能更長或更短的誘導時間。

為了提高本申請的蛋白質構建體的產量和品質，可以改良各種發酵條件。例如，為了提高分泌多肽的正確組裝和折疊，可以使用過表達伴侶蛋白的附加載體來共轉化宿主原核細胞，如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD或DsbG)或FkpA(具有伴侶活性的肽脯氨醯順反異構酶)。已證明伴侶蛋白有助於促進細菌宿主細胞中所產生的異源蛋白正確折疊和溶解。Chen et al.,(1999)J Bio Chem 274：19601-19605；Georgiou et al.,U.S.Pat.No.6,083,715；Georgiou et al.,U.S.Pat.No.6,027,888；Bothmann和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275：17100-17105；Ramm和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275：17106-17113；Arie et al.,(2001)Mol.Microbiol.39：199-210。

為了最大限度地減少表達的異源蛋白質(尤其是蛋白水解敏感的蛋白質)的水解，某些缺乏蛋白水解酶的宿主菌株可用於本發明。例如，宿主細胞菌株可經修飾使得編碼已知細菌蛋白酶的基因發生基因突變，如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合物。可以使用一些大腸桿菌蛋白酶缺失菌株，在Joly et al.,(1998),supra；Georgiou et al.,U.S.Pat.No.5,264,365；Georgiou et al.,U.S.Pat.No.5,508,192；Hara et al.,Microbial Drug Resistance,2：63-72(1996)中進行了詳述。

缺乏蛋白水解酶且用過表達一種或多種伴侶蛋白的質粒轉化的大腸桿菌菌株，可在編碼本申請所述的蛋白質構建體的表達系統中作為宿主細胞。

d)蛋白純化

進一步純化本文所生產的蛋白質構建體，以獲得用於進一步分析和使用的基本上均勻的製劑。可採用本領域已知的標準蛋白質純化方法。以下程式為適用的純化程式示例：免疫親和柱或離子交換柱上的分餾、乙醇沉澱、反相液相色譜HPLC、二氧化矽或陽離子交換樹脂(如DEAE)色譜、色譜聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉澱和凝膠過濾，例如，葡聚糖凝膠G-75。

在一些實施例中，固定在固相上的蛋白質A被用於蛋白質構建體的免疫親和純化，所述蛋白質構建體包含本申請所述的Fc區域。蛋白A為來自金黃色葡萄球菌的42kDa表面蛋白，其與含Fc的結構具有很高的結合親和力，例如，本文所述的長效NGF多肽。Lindmark et al.,(1983)J.Immunol.Meth.62：1-1。固定蛋白質A的固相優選包含玻璃或二氧化矽表面的柱子，更優選為可控孔徑玻璃柱或矽酸柱。在某些應用中，色譜柱塗有試劑，如甘油，以防止污染物的非特異性粘附。然後清洗固相以去除非特異性結合到固相的污染物。最後，通過洗脫從固相中回收目標蛋白構建體。

2.真核細胞的重組產物

對於真核表達，載體組分通常包括但不限於下列一個或多個：信號序列、複製起始點、一個或多個標記基因、增強子元件、啟動子和轉錄終止序列。

a)信號序列元件

用於真核宿主的載體還可以是一個插入物，該插入物編碼信號序列或在成熟蛋白或多肽的N端具有特定裂解位點的其它多肽。選擇的異源信號序列優選為由宿主細胞識別和加工(即，被信號肽酶切割)的序列。在哺乳動物細胞表達中，可以獲得哺乳動物信號序列以及病毒分泌先導物，例如，單純皰疹gD信號，都是有用的。該前體區域的DNA在閱讀框中與編碼本申請的蛋白質構建體的DNA連接。

b)複製起始點

一般來說，哺乳動物表達載體不需要複製起始點元件(SV40起點通常僅因其包含早期啟動子而使用)。

c)選擇基因元件

表達和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標記。典型的選擇基因編碼以下蛋白質：(a)對抗生素或其它毒素具有抗藥性的蛋白質，例如，氨苄青黴素、新黴素、甲氨蝶呤或四環素、(b)補體營養缺陷蛋白質或(c)提供複雜培養基無法提供的關鍵營養素的蛋白質，如編碼桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。

選擇方案的一個示例是利用藥物來阻止宿主細胞的生長。那些異源基因成功轉化的細胞產生一種具有抗藥性的蛋白質，從而在選擇方案中存活下來。這種優勢選擇的示例使用藥物新黴素、黴酚酸和潮黴素。

適用於哺乳動物細胞的可選擇的標記的另一個示例是，那些能夠識別有能力攜帶編碼本申請所述蛋白質構建體核酸的細胞的可選擇的標記，如二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和-II，優選為靈長類金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。

例如，用DHFR選擇基因轉化的細胞，首先將所有轉化子培養在含有甲氨蝶呤(Methotrexate，Mtx)的培養基中進行鑒定，甲氨蝶呤是DHFR的競爭性拮抗劑。當使用野生型DHFR時，適用的宿主細胞為缺乏DHFR活性的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系(例如，ATCC CRL-9096)。

或者，用編碼多肽的DNA序列、野生型DHFR蛋白和另一選擇標記，如氨基糖苷3′-磷酸轉移酶(aminoglycoside phosphotransferase，APH)轉化或共轉化的宿主細胞(尤其是含有內源性DHFR的野生型宿主)，可通過在含有選擇標記物的培養基中的細胞生長來選擇，所述選擇標記物例如氨基糖苷類抗生素，例如，卡那黴素、新黴素或G418。參見U.S.Pat.No.4,965,199。

d)啟動子元件

表達和克隆載體通常包含一個啟動子，所述啟動子被宿主識別，並可操作地連接到編碼所需多肽序列的核酸上。幾乎所有真核基因都有一個富含AT的區域，位於轉錄起始點上游約25到30個堿基。在許多基因轉錄起始點上游70到80個堿基處發現的另一個序列為CNCAAT區域，其中N可以是任何核苷酸。在大多數真核生物的3′端有一個AATAAA序列，該序列可能是編碼序列3′端增加多聚A尾的信號。所有這些序列都可以插入到真核表達載體。參見上文“III.編碼長效NGF多肽的載體”一節。

哺乳動物宿主細胞載體中的多肽轉錄受啟動子控制，例如，通過從病毒基因組獲得的啟動子，如多瘤病毒、雞痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、乙型肝炎病毒和最優選的猿猴病毒40(SV40)，來自異源哺乳動物的啟動子，例如，肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子，來自熱休克啟動子，前提是此類啟動子與宿主細胞系統相容。

SV40病毒早期和晚期啟動子作為SV40限制性片段便於獲得，該限制性片段也包含SV40病毒複製起始點。人類巨細胞病毒的即刻早期啟動子作為HindIII E限制性片段便於獲得。U.S.Pat.No.4,419,446中公開了一種使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表達DNA的系統。U.S.Pat.No.4,601,978中詳述了對該系統的改良。參見Reyes et al.,Nature 297：598-601(1982)，關於在單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子控制下人類幹擾素cDNA在小鼠細胞中的表達。或者，可以使用勞斯肉瘤病毒長末端重複序列作為啟動子。

e)增強子元件

高等真核生物對編碼本申請蛋白質構建體DNA的轉錄通常通過在載體中插入增強子序列而增加。在哺乳動物基因中已經發現了許多增強子序列(珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-甲胎蛋白和胰島素)。然而，通常使用的是真核細胞病毒的增強子。示例包括複製起始點末端(100-270bp)的SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、複製起始點末端的多瘤病毒增強子和腺病毒增強子。參見Yaniv,Nature 297：17-18(1982)，關於啟動真核生物啟動子的增強元件。增強子可在多肽編碼序列的5′或3′處拼接到載體上，但優選位於啟動子的5′處。

f)轉錄終止元件

真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或其它多細胞生物的有核細胞)中使用的表達載體也包含轉錄終止和穩定mRNA所必需的序列。這些序列通常可從真核或病毒DNA或cDNA的5′端非翻譯區獲得，偶爾為3′端。這些區域包含核苷酸片段，所述核苷酸片段在編碼多肽的mRNA的未翻譯部分作為多聚腺苷酸片段被轉錄。一個合適的轉錄終止元件為牛生長激素多聚腺苷酸區域。參見WO94/11026和其中所公開的表達載體。

g)宿主細胞的選擇和轉化

用於克隆或表達本文所述載體中的DNA的合適宿主細胞包括本文所述的高等真核細胞，包括脊椎動物宿主細胞。脊椎動物細胞的培養繁殖(組織培養)已成為常規程式。有用的哺乳動物宿主細胞系示例為SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；來源於猴腎組織的COS成纖維細胞樣細胞系；人類胚胎腎系(293或293細胞亞克隆，用於懸浮培養生長，Graham et al.,J.Gen Virol.36：59(1977))；乳倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠塞爾托力氏細胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC-ccl2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC-ccl34)；水牛-大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TR1細胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC5細胞；FS4細胞和人類肝癌細胞系(Hep G2)。

用上述表達載體或克隆載體轉化宿主細胞以產生蛋白質結構，並在經適當改良的常規營養培養基中培養，以誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼所需序列的基因。

h)培養宿主細胞

用於生產本申請的蛋白質構建體的宿主細胞可在多種培養基中培養。商用培養基，如Ham's F10(Sigma)、最小基本培養基((Minimum Essential Medium，MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco's修飾的Eagle's Medium((Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)，Sigma)適合培養宿主細胞。此外，Ham et al.,Meth.Enz.58：44(1979)、Barnes et al.,Anal.Biochem.102：255(1980)、U.S.Pat.No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655或5,122,469、WO 90/03430、WO 87/00195或U.S.Pat.Re.30,985所述的任何培養基都可用作宿主細胞的培養基。這些培養基中的任何一種都可以根據需要補充激素和/或其它生長因數(如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因數)、鹽(如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩衝液(如HEPE)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如慶大黴素^TM藥物)、微量元素(定義為通常最終濃度在微摩爾範圍記憶體在的無機化合物)和葡萄糖或等效能源。任何其它必要的補充劑也可在本領域技術人員已知的適當濃度下加入。培養條件，如溫度、pH等，是那些先前宿主細胞表達所使用過的條件，並且對於普通技術人員來說顯而易見。

i)蛋白純化

當使用重組技術時，本發明的蛋白質構建體可在細胞內、周質中產生，或直接分泌到培養基中。如果蛋白質構建體在細胞內產生，第一步是通過離心或超濾去除微粒碎片(即宿主細胞或裂解片段)。Carter et al.,Bio/Technology 10：163-167(1992)詳述了分離分泌到大腸桿菌周質中的抗體的程式。簡而言之，細胞體在醋酸鈉(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺醯氟(phenylmethylsulfonyl fluorid，PMSF)存在的條件下融解約30分鐘。細胞碎片可通過離心去除。當蛋白質構建體分泌到培養基中，此類表達系統的上清液通常首先使用市面上的蛋白質濃縮篩檢程式進行濃縮，例如，Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置。蛋白酶抑制劑如PMSF可包含在上述任何步驟中，以抑制蛋白質水解，且可包含抗生素以防止外來污染物的生長。

可以使用例如羥基磷灰石色譜、凝膠電泳、透析和親和色譜法來純化從細胞中製備的蛋白質組合物，其中親和色譜法是優選的純化技術。蛋白質A作為親和配體的適用性取決於在含Fc蛋白構建體中存在的任何免疫球蛋白Fc結構域的種類和亞型。蛋白質A可用於純化基於含1、2或4重鏈的人類免疫球蛋白的含Fc蛋白質(Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。推薦蛋白質G用於所有小鼠亞型和人類3型(Guss et al.,EMBO J.5：15671575(1986))。連接親和配體的基質通常是瓊脂糖，但也有其它基質。與瓊脂糖相比，機械穩定的基質(如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯基)苯)可以實現更快的流速和更短的處理時間。Bakerbond ABXTMresin可用於純化包含C_H3結構域的蛋白質構建體(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)。其它蛋白質純化技術也同樣適用，如離子交換柱分餾、乙醇沉澱、反相液相色譜HPLC、矽膠層析、肝素SEPHAROSE^TM色譜、陰離子或陽離子交換樹脂(如聚天冬氨酸柱)、色譜聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沉澱，取決於要回收的蛋白質構建體。

在任何初步純化步驟之後，可以對包含目標蛋白質構建體和污染物的混合物進行低pH疏水相互作用色譜，洗脫緩衝液pH值為約2.5-4.5，優選地，在低鹽濃度下進行(例如，從0-0.25M鹽)。

V.藥物組合物

進一步涉及包含本文所述任何長效NGF多肽的藥物組合物，和可選的藥學上可接受的載體和/或輔料。因此，在一些實施例中，涉及一種包含長效NGF多肽的藥物組合物，所述長效NGF多肽從N端到C端包含NGF部分和Fc部分，所述NGF部分包含SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列，且所述Fc部分來自IgG1 Fc或IgG4 Fc，以及可選的一種藥學上可接受的載體。藥物組合物可以通過將本文所述的具有所需純度的長效NGF多肽與可選的藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))混合製備，成凍幹製劑或水溶液的形式。

可通過將凍幹的長效NGF多肽溶解在稀釋劑中，使蛋白質均勻分散，從而製備重組製劑。適於在本申請中使用的醫藥上可接受的(對人體施用安全且無毒)稀釋劑示例包括但不限於無菌水、注射用抑菌水(Bacteriostatic Water for Injection，BWFI)、pH緩衝溶液(例如，磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水，林格溶液或葡萄糖溶液，或鹽和/或緩衝劑的水溶液。

在一些實施例中，藥物組合物包含本文所述的長效NGF多肽的同質群體。同質群體表示長效NGF多肽彼此完全相同，例如，相同的長效NGF多肽結構、相同的NGF部分、相同的接頭(如果有)和相同的Fc部分。在一些實施例中，藥物組合物中至少70%(如至少為75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的任何一個)的長效NGF多肽是同質的。

在一些實施例中，藥物組合物基本上由(例如，由......組成)本文所述的長效NGF多肽和可選的藥學上可接受的載體組成。在一些實施例中，藥物組合物不包含任何proNGF-Fc或PrepoNGF-Fc融合蛋白。在一些實施例中，藥物組合物最多包含5%(如最多為4%、3%、2%或1%中的任何一個)的proNGF-Fc或prepoNGF-Fc融合蛋白。在一些實施例中，藥物組合物不包含任何宿主細胞(例如CHO)蛋白質。

藥物組合物優選為穩定的，其中所含蛋白質在儲存時基本上保持其物理和化學穩定性和完整性。本領域有各種用於測量蛋白質穩定性的分析技術，並在Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)中進行了綜述。穩定性可以在選定的溫度和選定的時間段內進行測量。對於加速篩選，可將製劑在40℃下保存2周至1個月，在此期間測量穩定性。如果製劑在2-8℃下儲存，通常製劑應在30℃或40℃下穩定至少1個月，和/或在2-8℃下穩定至少2年。如果製劑在30℃下儲存，通常製劑應在30℃下穩定至少2年，和/或在40℃下穩定至少6個月。例如，儲存期間的聚集程度可作為蛋白質穩定性的指標。在一些實施例中，本文所述的長效NGF多肽的穩定製劑中可包含少於10%(優選少於5%)的本文所述的長效NGF多肽聚集體。

在一些實施例中，藥物組合物具有至少15天的保質期，如至少20天、1個月、2個月、3個月、6個月、1年、2年、3年或更長的保質期，例如，在2-25℃(如2-8℃)下。如本文所用，“保質期”是指當藥物製劑在特定儲存條件下儲存時，例如2-8℃，藥物製劑中的活性成分如治療性蛋白質(例如，本文所述的長效NGF多肽)發生最小降解(例如，不超過5%降解，如不超過4%、3%，或2%降解)的儲存期。用於評估蛋白質或製劑穩定性的示例性技術包括尺寸排阻色譜(SEC)-HPLC以檢測，例如，聚集、反相液相色譜(RP)-HPLC以檢測，例如，蛋白質片段、離子交換HPLC以檢測，例如，蛋白質電荷變化、質譜、螢光光譜、圓二色(CD)光譜、傅裡葉變換紅外光譜(FT-IR)和拉曼光譜以檢測蛋白質構象變化。所有這些技術均可單獨或組合使用，以評估藥物製劑中蛋白質的降解情況，並確定該製劑的保質期。在一些實施例中，當本發明的藥物製劑儲存在2-8℃時，在至少15天內(例如，至少20天、1個月、2個月、3個月、6個月、1年、2年、3年或更長的時間)表現出不超過5%(例如，不超過4%、3%、2%或1%)的降解(例如，片段化、聚集或去折疊)。

可接受的載體、賦形劑或穩定劑在所用的劑量和濃度下對受試者無毒，包括緩衝液、抗氧化劑包括抗壞血酸、蛋氨酸、維生素E、焦亞硫酸鈉；防腐劑、等滲劑(如氯化鈉)、穩定劑、金屬絡合物(例如，鋅-蛋白質絡合物)；螯合劑，如EDTA和/或非離子表面活性劑。

生理上可接受的載體示例包括緩衝液，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲銨；苯紮氯銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰茶二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少於10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、雙糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子，如鈉；金屬絡合物(例如，鋅-蛋白質絡合物)；和/或非離子表面活性劑，如吐溫^TM、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)和PLURONICS^TM。

緩衝液用於將pH值控制在優化治療效果的範圍內，尤其是在穩定性依賴於pH值的情況下。緩衝液最好以約50mM至約250mM的濃度範圍存在。適用於本申請的緩衝液包括有機酸和無機酸及其鹽。例如，檸檬酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽、葡萄糖酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、醋酸鹽。此外，緩衝液可包括組氨酸和三甲胺鹽，如Tris。

添加防腐劑以阻止微生物生長，並且通常在0.2%-1.0%(w/v)範圍記憶體在。例如，添加防腐劑可促進多次使用(多劑量)製劑的生產。適用於本申請的防腐劑包括十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲銨；苯紮氯銨(例如，氯化物、溴化物、碘化物)、苄索氯銨；硫柳汞、苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇、3-戊醇和間甲酚。

張力劑，有時稱為“穩定劑”，用於調節或維持組合物中液體的張力。當與大的帶電生物分子(如蛋白質)一起使用時，它們通常被稱為“穩定劑”，因為它們可以與氨基酸側鏈的帶電基團相互作用，從而降低分子間和分子內相互作用的可能性。考慮到其它成分的相對含量，張力劑可以以0.1%到25%(按重量計)之間的任何量存在，優選為1%到5%。優選的張力劑包括多元糖醇，優選為三元或高糖醇，如甘油、赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。

其它賦形劑包括以下一種或多種製劑：(1)填充劑、(2)溶解度增強劑、(3)穩定劑和(4)防止變性或粘附在容器壁上的製劑。此類賦形劑包括：多元糖醇(如上所述)；氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等；有機糖或糖醇，如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌醇、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、環己醇(如肌醇)、聚乙二醇；含硫還原劑，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量蛋白質，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或其它免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；單糖(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖)；雙糖(例如，乳糖、麥芽糖、蔗糖)；三糖，如棉子糖；和多糖，如糊精或葡聚糖。

非離子表面活性劑或洗滌劑(也稱為“潤濕劑”)的存在有助於溶解蛋白質，並保護蛋白質免於攪動引起的聚集，這也允許製劑暴露於剪切表面應力下，而不會導致活性蛋白變性。非離子表面活性劑的存在範圍為0.05mg/ml至1.0mg/ml，優選為0.07mg/ml至0.2mg/ml。

合適的非離子表面活性劑包括聚山梨酯(20、40、60、65、80等)、聚草氨酸酯(184、188等)、PLURONIC^®多元醇、TRITON^®、聚氧乙烯山梨醇酐單醚(吐溫^®-20、吐溫^®-80等)、月桂糖醇400、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50和60、單硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素和羧甲基纖維素。可使用的陰離子洗滌劑包括十二烷基硫酸鈉、磺基琥珀酸二辛酯鈉和磺酸二辛酯鈉。陽離子洗滌劑包括苯紮氯銨或苄索氯銨。

為了使藥物組合物可用於體內給藥，它們必須是無菌的。可通過無菌濾膜過濾使藥物組合物無菌。所述藥物組合物通常放置在具有無菌接入口的容器中，例如，具有可被皮下注射針刺穿的塞子的靜脈注射溶液袋或小瓶。

可製備緩釋製劑。緩釋製劑的合適示例包括含有拮抗劑的固體疏水聚合物的半滲透基質，其基質以成形制品的形式，例如，薄膜或微膠囊。緩釋基質的示例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯基醇))、聚乳酸(U.S.Pat.No.3,773,919)，L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯共聚物，不可降解乙烯-醋酸乙烯酯，可降解乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的注射微球)和聚-D-(-)-3-羥丁酸。

根據所治療的特定適應症的需要，本文所述的藥物組合物還可以包含不止一種活性化合物，優選為具有互補活性，不會對彼此產生不利影響的化合物。此類分子以適當的數量組合在一起以達到預期目的。

活性成分也可以被包裹在例如，通過凝膠技術或介面聚合製備的微膠囊中，例如，膠體給藥系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠囊)中或在粗乳液中的羥甲基纖維素微膠囊或明膠微膠囊和聚甲基丙烯酸甲酯微膠囊。Remington's Pharmaceutical Sciences公開了這些技術。

在一些實施例中，藥物組合物裝在一次性使用的小瓶中，如一次性密封小瓶。在一些實施例中，藥物組合物裝在可多次使用的小瓶中。在一些實施例中，藥物組合物散裝在容器中。在一些實施例中，藥物組合物是冷凍保存的。

VI.疾病的治療方法

本文所述的長效NGF多肽及其組合物(例如，藥物組合物)可用於多種用途，例如診斷、分子檢測和治療。在一些實施例中，涉及了一種治療個體(例如，人類)疾病(例如，NGF相關疾病，如神經系統疾病)的方法，包括向個體施用有效劑量的本文所述任何長效NGF多肽或其藥物組合物。本文所用的術語“NGF相關疾病”是指因NGF受體信號傳導受損引起或與之相關的任何疾病或紊亂(如由於NGF數量不足和/或結合親和力降低)，或需要NGF生物活性進行治療的疾病或紊亂(如治療時需要神經元生長、維持、增殖和/或存活的傷害/損傷)。在一些實施例中，長效NGF多肽(或其藥物組合物)通過靜脈注射、肌肉注射或皮下注射給藥。

因此，在一些實施例中，涉及一種治療個體(例如，人類)疾病(例如，NGF相關疾病，如神經系統疾病(例如，糖尿病神經性病變、阿爾茨海默症或神經營養性角膜炎)或非神經系統疾病(例如，卵巢早衰或生精障礙))的方法，包含向個體施用有效劑量的長效NGF多肽(或其藥物組合物)，所述長效NGF多肽從N端到C端包含NGF部分和Fc部分，其中NGF部分包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：1-4中的任一氨基酸序列 (例如，SEQ ID NOs：1-3中的任一個)，並且其中所述Fc部分來自IgG1 Fc或IgG4 Fc。在一些實施例中，涉及一種治療個體(例如，人類)疾病(例如，NGF相關疾病，例如神經系統疾病(例如，糖尿病神經性病變、阿爾茨海默症或神經營養性角膜炎)或非神經系統疾病(例如，卵巢早衰或生精障礙))的方法，包含向個體施用有效劑量的長效NGF多肽(或其藥物組合物)，所述NGF多肽(或藥物組合物)包含(或基本上由......組成、或由......組成)SEQ ID NOs：61-67中的任一氨基酸序列。在一些實施例中，長效NGF多肽(或其藥物組合物)通過靜脈注射、肌肉注射或皮下注射給藥。

本文所述方法適用於治療神經系統疾病(neurological disease)和非神經系統疾病(non-neurological disease)。

神經系統疾病包括神經系統疾病(nervous system disease)。神經系統疾病是指與中樞和/或外周神經系統的神經元變性或損傷相關的疾病。神經系統疾病的具體示例包括但不限於阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、中風、肌萎縮側索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、面神經炎、顱腦或脊髓損傷、急性腦血管病、腦萎縮、外周神經病變和其它以神經元壞死或缺失為特徵的疾病，無論是中樞神經元、外周神經元還是運動神經元，除了由外傷、燒傷、腎功能衰竭、損傷或化學品/藥物引起的神經損傷，如由化學品或藥物引起的急性腦血管中樞神經損傷。神經系統疾病還包括與某些疾病相關的外周神經病變，如與糖尿病、愛滋病或化療相關的神經病變。在一些實施例中，神經系統疾病選自多發性梗死性癡呆、血管性癡呆、由酒精中毒引起的器質性腦疾病引起的認知障礙、阿爾茨海默病、帕金森病、癲癇、多發性硬化症、亨廷頓舞蹈病、唐氏綜合征、神經性耳聾、梅尼埃病、中風、ALS、貝爾氏麻痹、涉及脊髓肌萎縮的疾病、涉及癱瘓的疾病、外周神經病變、創傷所致神經損傷、燒傷所致神經損傷、腎功能障礙所致神經損傷、損傷所致神經損傷、化療毒副作用所致神經損傷、手術導致的神經損傷、缺血導致的神經損傷、感染導致的神經損傷、代謝疾病導致的神經損傷以及營養缺乏導致的神經損傷。在一些實施例中，神經系統疾病是從糖尿病外周神經病變、毒素誘導外周神經病變、化療誘導外周神經病變、HIV相關外周神經病變和影響運動神經元的外周神經病變組成的組中選擇的外周神經病變。在一些實施例中，神經系統疾病選自新生兒缺氧缺血性腦病、腦癱、重症肌病、神經性耳聾、喉返神經損傷、創傷性腦損傷、牙神經損傷、腦卒中、唐氏綜合征、ALS，多發性硬化、脊髓肌萎縮、彌漫性腦損傷、胸腺發育不良、視神經挫傷、濾泡發育不良、脊髓損傷、青光眼、神經營養性角膜炎、視神經損傷、視神經脊髓炎、視網膜相關疾病、尿失禁、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、癡呆、，高血壓腦出血神經功能障礙、腦小血管疾病、急性缺血性中風、角膜內皮營養不良、糖尿病足潰瘍、神經源性皮膚潰瘍、壓瘡、神經營養性角膜潰瘍、糖尿病角膜潰瘍和黃斑裂孔。

非神經系統疾病包括脾臟萎縮、脾挫傷、卵巢儲備減少、卵巢早衰(POF)、卵巢過度刺激綜合征、卵巢殘餘綜合征、卵巢卵泡發育不良、生精障礙(例如，少精子症(oligozoospermia或oligospermia)、弱精子症、少弱精子症、無精子症、畸形精子症、少弱畸精子症(oligoasthenoteratozoospermia，OAT綜合征))、缺血性潰瘍、應激性潰瘍、類風濕性潰瘍、肝纖維化、角膜潰瘍、燒傷、口腔潰瘍和腿部靜脈潰瘍。

在一些實施例中，治療疾病(例如，NGF相關疾病，如神經系統疾病(例如，糖尿病神經性病變、阿爾茨海默症或神經營養性角膜炎)或非神經系統疾病(例如，卵巢早衰或生精障礙))的方法具有以下一種或多種生物活性：(i)支持神經元存活；(ii)促進神經突生長；(iii)增強神經化學分化；(iv)促進胰腺β細胞增殖；(v)誘導先天性和/或獲得性免疫；(vi)修復受損的神經細胞(例如，角膜神經)和/或防止損傷(例如，在神經營養性角膜炎中)；(vii)促進卵泡細胞的增殖和/或雌激素分泌；(viii)促進傷口癒合(例如，在糖尿病神經性病變中)；(ix)改善患有神經退行性疾病(例如，阿爾茨海默病)的受試者的空間認知、記憶和/或學習能力；(x)治療和/或預防神經退行性病變；(xi)治療睾丸生精小管萎縮、生精小管生精障礙和/或附睾管細胞碎片；(xii)挽救精子數量和/或活力的降低，或增加精子數量和/或活力(例如，在生精障礙中)；(xiii)預防/逆轉卵泡數量和/或功能的降低，或提高卵泡數量和/或功能(例如，在卵巢早衰中)；和/或(xiv)延長患者生存期。在一些實施例中，由本文所述的長效NGF多肽或藥物組合物介導的支援神經元存活的方法可實現至少40%、 50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高的神經元存活率。在一些實施例中，由本文所述的長效NGF多肽或藥物組合物介導的促進神經突生長的方法可促進至少2倍(包括例如，至少為3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50倍或更多倍)的神經突生長。在一些實施例中，由本文所述的長效NGF多肽或藥物組合物介導的增強神經化學分化的方法可增強至少2倍(包括例如，至少為3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50倍或更多倍)的神經化學分化。在一些實施例中，由本文所述的長效NGF多肽或藥物組合物介導的促進胰腺β細胞增殖的方法可促進至少2倍(包括例如，至少為3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50倍或更多倍)的胰腺β細胞增殖。在一些實施例中，由本文所述的長效NGF多肽或藥物組合物介導的誘導排卵的方法可增強至少2倍(包括例如，至少為3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50倍或更多倍)的排卵。在一些實施例中，由本文所述的長效NGF多肽或藥物組合物介導的誘導先天性和/或獲得性免疫的方法可誘導至少1.1倍(包括例如，至少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50倍或更多倍)的先天性和/或獲得性免疫。在一些實施例中，由本文所述的長效NGF多肽或藥物組合物介導的修復和/或預防神經元損傷的方法可修復和/或預防至少5%(包括例如，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多)的神經元損傷或具有至少1.1倍(包括例如，至少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50倍或更多倍)的修復和/或預防效果。在一些實施例中，由本文所述的長效NGF多肽或藥物組合物介導的促進卵巢顆粒細胞增殖和/或雌激素分泌的方法可促進至少1.1倍(包括例如，至少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50倍或更多倍)的卵巢顆粒細胞增殖和/或雌激素分泌。在一些實施例中，由本文所述的長效NGF多肽或藥物組合物介導的促進傷口癒合的方法可促進至少1.1倍(包括例如，至少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50倍或更多倍)的傷口癒合。在一些實施例中，由本文所述的長效NGF多肽或藥物組合物介導的改善患有神經退行性疾病(例如，阿爾茨海默症) 患者的空間認知、記憶和/或學習能力的方法可改善至少1.1倍(包括例如，至少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50倍或更多倍)的空間認知、記憶和/或學習能力。在一些實施例中，由本文所述的長效NGF多肽或藥物組合物介導的治療和/或預防神經退行性病變的方法可治療和/或預防至少5%(包括例如，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多)的神經退行性病變。在一些實施例中，由本文所述的長效NGF多肽或藥物組合物介導的治療睾丸生精小管萎縮、生精小管生精障礙和/或附睾管細胞碎片的方法可治療至少5%(包括例如，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多)的睾丸生精小管萎縮、生精小管生精障礙和/或附睾管細胞碎片。在一些實施例中，由本文所述的長效NGF多肽或藥物組合物介導的挽救精子數量和/或活力的降低的方法可挽救至少5%(包括例如，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多)的精子數量和/或活力的降低。在一些實施例中，由本文所述的長效NGF多肽或藥物組合物介導的增加精子數量和/或活力的方法可提高至少5%(包括例如，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%或更多)的精子數量和/或活力。在一些實施例中，由本文所述的長效NGF多肽或藥物組合物介導的挽救卵泡數量和/或功能的降低的方法可挽救至少5%(包括例如，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多)的卵泡數量和/或功能的降低。在一些實施例中，由本文所述的長效NGF多肽或藥物組合物介導的提高卵泡數量和/或功能的方法可提高至少5%(包括例如，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%或更多)的卵泡數量和/或功能。在一些實施例中，由本文所述長效NGF多肽或藥物組合物介導的延長個體(例如，人類)生存期的方法可將個體的生存期延長至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24個月或2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更長時間中的任何一個。

本文所述的長效NGF多肽或其藥物組合物的給藥方式可以以任何方便的方式進行，包括通過注射或輸液。給藥途徑依照已知和公認的方法，如通過單次或多次推注或以適當方式長時間輸液。長效NGF多肽或其藥物組合物可經口、皮下、靜脈、腦內、鼻內、經皮、腹腔內、肌肉內、肺內、陰道、直腸、眼內、局部、經動脈、皮內、節內、空腔內、或髓內、鞘內、腦室內、腦內、脊髓內、鞘內、病灶內或眼內給藥。在一些實施例中，全身施用長效NGF多肽或其藥物組合物。在一些實施例中，通過輸注(如靜脈輸注)向個體施用長效NGF多肽或其藥物組合物。免疫治療所用的輸注技術在本領域已知(參見Rosenberg et al.,New Eng.J.of Med.319：1676(1988))。在一些實施例中，通過皮內或皮下(即在皮膚下)注射向個體施用長效NGF多肽或其藥物組合物。對於皮下注射，可使用注射器注射長效NGF多肽或其藥物組合物。然而，還有其它用於長效NGF多肽或其藥物組合物給藥的裝置，如注射裝置；注射筆；自動注射器裝置、無針裝置；和皮下貼片給藥系統。在一些實施例中，通過靜脈注射施用長效NGF多肽或其藥物組合物。在一些實施例中，將長效NGF多肽或其藥物組合物直接注射到大腦或脊柱中。在一些實施例中，將長效NGF多肽或其藥物組合物局部施用於損傷或傷害部位，如直接施用於傷口組織。在一些實施例中，通過緩釋或延長釋放技術施用長效NGF多肽或其藥物組合物。

本發明的藥物組合物的劑量和所需藥物濃度可根據特定用途而變化。確定合適的給藥劑量或給藥途徑完全屬於普通技術人員的技術範圍。動物實驗為確定人類治療的有效劑量提供了可靠的指導。可以依據Mordenti,J.和Chappell,W.“The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics,”In Toxicokinetics and New Drug Development,Yacobi et al.,Eds,Pergamon Press,New York 1989,pp.42-46中的原則進行有效劑量的種間類推。

當使用長效NGF多肽或其藥物組合物在體內給藥時，根據給藥途徑和哺乳動物類型，正常劑量可在0.01μg/kg至10mg/kg哺乳動物體重之間變化。在本申請的範圍內，不同的製劑將對不同的治療和不同的疾病有效，並且旨在治療特定器官或組織的給藥方式可能與針對另一器官或組織的方式不同。此外，劑量可通過一次或多次單獨給藥或持續輸注給藥。對於幾天或更長時間的重複給藥，根據病情，治療持續到疾病症狀達到預期的抑制程度為止。然而，其它劑量方案可能有用。這種治療的進展很容易通過常規技術和分析進行監測。在一些實施例中，以0.01μg/kg至10mg/kg的劑量施用長效NGF多肽或其藥物組合物，如0.01μg/kg至1μg/kg、1μg/kg至100μg/kg、100μg/kg至500μg/kg、500μg/kg至1mg/kg、1mg/kg至10mg/kg或0.01μg/kg至1mg/kg中的任何一種。在一些實施例中，以每個個體(例如，人類)0.01μg至1000μg的劑量施用長效NGF多肽或其藥物組合物，如每個個體0.01μg至1μg、1μg至500μg、500μg至1000μg、1μg至300μg、或100μg至1000μg中的任何一種。

在一些實施例中，一次性施用長效NGF多肽或其藥物組合物(例如，團注法)。在一些實施例中，多次施用長效NGF多肽或其藥物組合物(如2、3、4、5、6或更多次)。如果多次施用，則可通過相同或不同的途徑進行，並可在相同部位或其它部位進行。長效NGF多肽或其藥物組合物可每日施用一次至每年施用一次。兩次給藥之間的間隔可以是24小時到一年中的任意時間。間隔也可能是不規則的(例如，隨腫瘤進展)。在一些實施例中，給藥計畫中無中斷。特定患者的最佳劑量和治療方案可以由醫學領域的技術人員通過監測患者的疾病體征並相應地進行調整以確定。在一些實施例中，本文所述的長效NGF多肽或其藥物組合物每天施用一次(每日施用)、每2天一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每週一次、每10天一次、每2週一次、每3週一次、每4週一次、每月一次，每2個月一次、每3個月一次、每4個月一次、每5個月一次、每6個月一次、每7個月一次、每8個月一次、每9個月一次或每年一次。在一些實施例中，長效NGF多肽或其藥物組合物每3天施用一次。在一些實施例中，長效NGF多肽或其藥物組合物每週施用一次。在一些實施例中，長效NGF多肽或其藥物組合物每月施用一次。在一些實施例中，長效NGF多肽或其藥物組合物每天滴注一次。在一些實施例中，長效NGF多肽或其藥物組合物每天滴注3次。在一些實施例中，長效NGF多肽或其藥物組合物每天滴注5次。

在一些實施例中，長效NGF多肽或其藥物組合物是分劑量給藥的，例如2、3、4、5或更多劑量中的任一個。在一些實施例中，分劑量給藥超過1周、1個月、2個月、3個月或更長時間。在一些實施例中，劑量被等分。在一些實施例中，分劑量為總劑量的20%、30%和50%。在一些實施例中，連續的分劑量給藥之間的間隔為1天、2天、3天、1周、2周、3周、1個月、3個月、6個月或更長。對於幾天或更長時間的重複給藥，根據病情，治療持續到疾病症狀出現預期的抑制程度為止。然而，其它劑量方案可能有用。這種治療的進展很容易通過常規技術和分析進行監測。

VII.製品及試劑盒

進一步涉及包含本文所述任何長效NGF多肽的試劑盒、單位劑量和製品。在一些實施例中，涉及包含本文所述的任一種藥物組合物的試劑盒，並且優選地提供其使用說明，如用於治療本文所述的疾病(例如，神經系統疾病)。

本發明的試劑盒包括一個或多個包含本文所述的長效NGF多肽的容器，例如，用於治療疾病。例如，包含描述施用長效NGF多肽以治療疾病(如神經系統疾病)的說明書。試劑盒可能進一步包含基於識別個體是否患有疾病和疾病階段來選擇適合治療的個體(例如，人類)的描述。與長效NGF多肽的使用相關的說明通常包括關於預期治療的劑量、給藥計畫和給藥途徑的資訊。容器可以是單位劑量、散裝包裝(例如，多劑量包裝)或亞單位劑量。本發明的試劑盒中提供的說明通常是標籤或藥品說明書上的書面說明(例如，試劑盒中包括的紙張)，但機器可讀說明(例如，存儲在磁片或光碟上的說明)也是可以接受的。本申請的試劑盒採用合適的包裝。合適的包裝包括但不限於小瓶、瓶子、罐子、軟包裝(例如，密封的聚酯薄膜或塑膠袋)等。還考慮與特定裝置結合使用的包裝，如輸液裝置如微型泵。試劑盒可具有無菌接入埠(例如，容器可為靜脈注射溶液袋或具有可被皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。該組合物中的至少一種活性劑是如本文所述的長效NGF多肽。容器可進一步包含第二種醫藥活性劑。試劑盒可選擇性地提供附加組份，如緩衝液和解釋資訊。一般來說，試劑盒包含一個容器和容器上或與容器相關的標籤或藥品說明書。

因此，本申請還涉及製品，包括小瓶(如密封小瓶)、瓶、罐、軟包裝等。該製品包含容器和容器上或與容器相關的標籤或藥品說明書。合適的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由多種材料製成，如玻璃或塑膠。一般來說，容器容納的組合物可有效治療本文所述疾病或紊亂(如神經系統疾病)，並且可具有無菌接入埠(例如，容器可為靜脈注射溶液袋或具有可被皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。標籤或藥品說明書表明該組合物用於治療個體的特定病症。標籤或藥品說明書進一步包含向個體施用組合物的說明。標籤可能會注明重構和/或使用的說明。容納藥物組合物的容器可以是多次使用的小瓶，允許重構製劑重複施用(例如，2-6次施用)。藥品說明書是指通常包含在治療產品商業包裝中的說明書，其中包含有關使用此類治療產品的適應症、用法、劑量、給藥、禁忌症和/或警告資訊。此外，製品可能進一步包含第二容器，包含藥學可接受的緩衝液，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格溶液和葡萄糖溶液。從商業和用戶角度來看，可能進一步包括其它需要的材料，包括其它緩衝液、稀釋劑、篩檢程式、針頭和注射器。

試劑盒或製品包括多個單位劑量的藥物組合物和使用說明書，包裝數量足以在藥房中儲存和使用，例如，醫院藥房和複方藥房。

實施例

以下實施例旨在純粹作為本發明的示例，因此不應被視為以任何方式限制本發明。以下實施例和詳述是以說明的方式提供的，而非限制的方式。

實施例1：製備NGF多肽

構建質粒

構建質粒以preproNGF-Fc融合蛋白2-118-L3Fc10-M1-5(SEQ ID NO：34)為例。其它preproNGF-Fc融合蛋白和對照prepro-mNGF118(SEQ ID NO：47)使用相同方法進行質粒構建，其中，對照prepro-mNGF118為帶有F12E突變並在β-NGF部分C端截短兩個氨基酸(Arg-Ala)的preproNGF。FD-G4Fc(見CN105273087A)和WM-G24Fc(見CN106008722A)構建體作為對照。NGF-1-15M7(rhNGF-Fc1)、NGF-L3Fc10M7-5(rhNGF-Li-Fc1)、2-1-15M7(rhNGF-(F12E)-Fc1)和NGF-4-12PAA(rhNGF-Fc4)的構建如WO2017157325所述。不同NGF多肽的結構見表1，Fc部分的序列比對見圖1A-1F。

表1 NGF多肽結構

合成編碼各種preproNGF-Fc融合蛋白(例如，“2-118-L3Fc10-M1-5”)或prepro-mNGF118對照的核酸並將其克隆到pSC-T載體中(例如，“pSC-2-118-L3Fc10-M1-5”)(由上海傑瑞生物工程有限公司北京分公司合成和克隆)。分別用帶有HindIII和XhoI限制性酶切位點的PCR引物擴增編碼各種preproNGF-Fc融合蛋白或prepro-mNGF118對照的核酸，然後將PCR產物亞克隆到內源性真核表達載體pTT5中(例如，“pTT5-2-118-L3Fc10-M1-5”)。

重組蛋白的表達

用攜帶編碼各種preproNGF-Fc融合蛋白(例如，pTT5-2-118-L3Fc10-M1-5)或prepro-mNGF118對照的核酸的真核表達載體pTT5轉染293F細胞，37℃、8% CO2、120rpm培養5天。收集包含表達蛋白的上清。

重組蛋白的純化

表達的NGF-Fc融合蛋白首先通過蛋白A親和純化進行粗純化，然後，基於不同的疏水性，使用HiTrap^TM Butyl HP柱(GE Healthcare)進一步將其從宿主蛋白中分離。然後使用Superdex 200凝膠過濾柱(GE Life Sciences)去除殘餘聚集物，以獲得純化的成熟NGF-Fc融合蛋白。成熟的mNGF118對照首先通過HiTrap^TM Butyl HP柱(GE Healthcare)純化，然後通過Superdex 200凝膠過濾柱(GE Life Sciences)純化。經SDS-PAGE鑒定，這些蛋白的純度在90%以上。

實施例2：成熟NGF-Fc融合蛋白的熱穩定性研究

用螢光蛋白分析儀UNcle(Uncheed Labs)測量樣品加熱過程中在266nm/473nm下螢光吸光度和光散射的變化，以分別計算樣品的熔解溫度(Tm)和聚集起始溫度(Tagg)。初始溫度設置為20℃，結束溫度設置為95℃，加熱速率為0.3℃/min。每個樣品重複測量3次。結果匯總在表2中。

熔解溫度(Tm)

如表2所示，在所有包含IgG4衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白中(FD-G4Fc、WM-G24Fc、NGF-4-12PAA和2-118-L3G4-BM)，甚至在所有測試的成熟NGF-Fc融合蛋白中，2-118-L3G4-BM顯示出最高的熔解溫度(Tm)，即最佳的熱穩定性。

在所有包含IgG1衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白中，2-118-L3Fc10-M1-5顯示出較低的Tm(即，較差的熱穩定性)，而其它蛋白則顯示出相似的Tm。

聚集起始溫度(Tagg)

如表2所示，與包含IgG4衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白相比，包含IgG1衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3Fc10-M1-5除外) 顯示出更高的Tagg。這表明包含IgG1衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白在加熱過程中更不易聚集。

在所有包含IgG4衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白中，2-118-L3G4-BM表現出最高的Tagg，表明其在加熱過程中的抗聚集性優於其它IgG4衍生Fc融合構建體。

在所有包含IgG1衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白中，2-118-L3Fc10-M1-5表現出最低的Tagg(加熱過程中抗聚集性最差)，NGF-1-15M7和2-1-15M7表現出相對低的Tagg，而其餘IgG1衍生Fc融合構建體顯示出高且相似的Tagg。

實施例3：成熟NGF-Fc融合蛋白的加速穩定性試驗

成熟NGF-Fc融合蛋白用PBS稀釋至終濃度為2mg/ml，並在40℃下孵育。在孵育期的第0天(圖中為“0小時”)、第3天、第7天、第9天和第14天分別採樣，並儲存在-80℃。通過尺寸排阻色譜法(SEC)和十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(CE-SDS)檢測樣品的降解和聚集情況。

尺寸排阻色譜法(SEC)檢測方法

當分子通過填充在柱中的樹脂時，SEC通過分子的不同尺寸將其分離。蛋白質樣品在4℃下、10000g離心5分鐘。用PBS重懸沉澱。將80-100μl樣品轉移到384孔板上，在Waters® ACQUITY UPLC® H-Class Bio Tunable UV(TUV)檢測儀上進行檢測，進樣體積為20μl，波長為280nm，流速為0.25ml/min，總執行時間為17分鐘。流動相緩衝液含有100mM PB(80mM Na2HPO4，20mM NaH2PO4)，300mM NaCl，10%乙腈，pH 7.2。

如表3和圖3A-3D所示，在所有包含IgG4衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白中，2-118-L3G4-BM和FD-G4Fc在聚集體增加和片段生成方面表現出優於WM-G24Fc和NGF-4-12PAA的穩定性。在加速應力過程中，NGF-4-12PAA顯示出非常明顯的片段化，片段百分比達到49.59%(圖3A)，而2-118-L3G4-BM和FD-G4Fc的片段百分比低於2.1%。WM-G24Fc不僅聚集體顯著增加(聚集體百分比達到49.15%)，而且在加速應力過程中，也出現了明顯的片段化(圖3C)。2-118-L3G4-BM和FD-G4Fc的單體百分比均在85%以上，而WM-G24Fc和NGF-4-12PAA的單體百分比隨時間推移顯著降低。與2-118-L3G4-BM相比，FD-G4Fc在加速應力過程中顯示出更多的聚集體形成和片段化，這表明與FD-G4Fc相比，2-118-L3G4-BM具有更好的抗片段化和抗聚集活性。

如表3和圖3E-3M所示，在所有包含IgG1衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白中，2-118-L3Fc10-M3-5、2-118-L3Fc10-M5-5、2-118-L3Fc10-M7-5和NGF-118-L3Fc10-M3-5在加速應力過程中比其它IgG1衍生Fc融合蛋白顯示出更佳的穩定性，檢測不到的片段形成(0%)和更少的聚集體增量。2-118-L3Fc10-M1-5也表現出比例如NGF-1-15M7、NGF-L3Fc10M7-5和2-1-15M7等IgG1衍生Fc融合蛋白更好或與之相當的穩定性。

十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(CE-SDS)檢測方法

在毛細管電泳中，根據電泳遷移率在毛細管中分離樣品，電泳遷移率隨分子的電荷和大小變化。首先，在離心管中混合40μl 1×樣品緩衝液和10μl蛋白質樣品，以獲得50μl蛋白質終濃度為0.4μg/μl的混合液。向混合液中加入1μl重構的25×內標(Internal Standard)，然後加入2.5μl 250mM碘乙醯胺。將整個混合液渦旋並在70℃下培養10分鐘，冷卻後，充分混合並離心。將50μl處理好的樣品上清液轉移到96孔板中。將96孔板在1000g下離心10分鐘，然後將其置於Maurice系統(ProteinSimple)中根據標準實驗方法進行CE-SDS檢測。

如表4和圖4A-4D所示，在所有包含IgG4衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白中，在加速應力期間，NGF-4-12PAA和WM-G24Fc顯示出非常明顯的片段化；2-118-L3G4-BM的片段化程度最低。這與SEC的結果一致。在FD-G4Fc(圖4B)的主峰右側出現聚集體峰，但2-118-L3G4-BM(圖4D)未出現聚集體峰。綜上所述，與其它IgG4衍生Fc融合蛋白相比，2-118-L3G4-BM在加速應力期間具有更佳的穩定性，這與SEC結果一致。

如表4和圖4E-4M所示，在所有包含IgG1衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白中，2-118-L3Fc10M7-5、NGF-118-L3Fc10-M3-5和2-118-L3Fc10-M3-5，在加速應力期間穩定性最佳，未出現明顯的片段峰(見圖4I、4J和4M)，第14天樣品的片段增量為0%。2-118-L3Fc10-M5-5片段增量較少(第14天，片段增量為5.8%)，也具有較好的穩定性。相比之下，其它包含IgG1衍生Fc片段的NGF-Fc融合蛋白(例如，NGF-L3Fc10M7-5)更容易形成片段。

根據SEC和CE-SDS結果總結：1)在所有包含IgG4衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白中，2-118-L3G4-BM顯示出比FD-G4Fc更佳的加速穩定性，並且顯著優於WM-G24Fc和NGF-4-12PAA的加速穩定性；2)在所有包含IgG1衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白中，2-118-L3Fc10-M3-5、NGF-118-L3Fc10-M3-5和2-118-L3Fc10M7-5與所有其它構建體相比，顯示出最佳的加速穩定性，隨後是2-118-L3Fc10M5-5；3)相對而言，與包含IgG4衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白相比，包含IgG1衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白，在加速應力條件下，顯示出更好的抗聚集特性。

實施例4：評估NGF-Fc融合蛋白生物活性的TF-1細胞增殖試驗

利用TF-1細胞增殖試驗測試不同NGF-Fc融合蛋白的生物活性。

TF-1細胞是一種因數依賴型人類紅細胞白血病細胞系。將TF-1細胞重懸於基本培養基中(RPMI 1640培養基+10%FBS)，以獲得含有5.0×104個細胞/ml的懸浮液，備用。製備蘇肽生®鼠NGF(標準對照)標準品溶液，製備各種NGF-Fc融合蛋白的測試溶液以及mNGF118(突變體β-NGF 118aa)和rhNGF(重組人類野生型β-NGF 120個氨基酸，SEQ ID NO：4，如實施例1中所述製備和純化)對照溶液，使最終的蛋白在預先標記的96孔板中為 200U/ml×100μl/孔。然後，將100μl 5.0×104個細胞/ml的TF-1細胞懸浮液加入到含有標準對照(蘇肽生®鼠NGF)、待測試NGF-Fc融合蛋白或對照溶液的96孔板的每個孔中，在37℃、5%CO2的潮濕培養箱中培養72小時。將CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega,Cat#G3581)中的20μl分析溶液加入細胞懸浮液的每個孔中，在37℃、5%CO2下培養3小時。使用分光光度計，在490nm和650nm下測量孔板的吸光度。記錄資料並與標準NGF對照(蘇肽生®鼠NGF)進行歸一化處理。

如圖5A，在所有包含IgG1衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白(甚至在所有NGF構建體中，包括rhNGF、mNGF118和蘇肽生®鼠NGF)，2-118-L3Fc10-M3-5表現出最高的生物活性；在加速穩定性試驗中(見實施例3)，2-118-L3Fc10-M3-5在三種最穩定的構建體中(2-118-L3Fc10-M3-5、NGF-118-L3Fc10-M3-5和2-118-L3Fc10M7-5)，也具有最高的生物活性。如圖5B所示，所有包含IgG4衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白，均具有促進TF-1細胞增殖的生物活性，並且2-118-L3G4-BM表現出與標準對照蘇肽生®鼠NGF相當的生物活性。

實施例5：多種NGF-Fc融合蛋白在大鼠體內的生物活性試驗

頸上神經節(SCG)是由大約30000個神經元組成的組織，是對NGF最敏感的組織之一，尤其是在產前和產後發育期間。在TF-1細胞增殖試驗中(見實施例4)，包含IgG1-或IgG4-衍生Fc片段的某些NGF-Fc融合蛋白具有非常高的生物活性。將各種NGF-Fc融合蛋白注射到大鼠SCG中，並在注射後不同時間點測量SCG大小，以評估NGF-Fc融合蛋白在體內促進SCG生長的活性。

新生Sprague-Dawley(SD)大鼠頸部皮下注射各種NGF-Fc融合蛋白或NGF對照(蘇肽生®鼠NGF或突變體NGF118)，然後處死大鼠，分離SCG。PBS注射液作為陰性對照。如圖6A所示，NGF對照蛋白(蘇肽生®鼠NGF或突變體NGF118)或PBS在第0天、第1天、第2天和第3天每天注射一次，然後在第4天獲得SCG。2-118-L3Fc10-M3-5或2-118-L3G4-BM在第0 天以相同劑量單次注射，然後在第4天獲得SCG。簡而言之，斷頭後，將大鼠頭部固定在手術臺上，用棉球吸幹血液，首先定位氣管和枕骨大孔，然後定位氣管斜後側的頸動脈鞘組織，用微型鑷子將其取出，放入含有PBS的培養皿中，然後在解剖顯微鏡下分離SCG。用紙巾去除分離的SCG表面的多餘液體，然後將SCG置於乾淨的表面皿上測量重量。SCG的形態如圖6B所示。記錄的資料採用Student t檢驗進行分析。**表示與PBS處理組相比具有顯著差異；n.s.表示與PBS處理組相比“無顯著差異”。如圖6C所示，在2nM給藥劑量下，突變體β-NGF 118aa(mNGF118)、蘇肽生®鼠NGF和2-118-L3Fc10-M3-5與PBS陰性對照組相比，對SCG的生長沒有顯著的促進作用，無統計學上的顯著差異。而2-118-L3G4-BM與PBS對照組相比，顯著促進SCG生長(**p<0.01)。在5nM給藥劑量下，無論NGF對照組(蘇肽生®鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)，與PBS處理組相比，均顯著促進體內SCG生長(**p<0.01)，並且4種測試的NGF蛋白之間在促進SCG生長的活性方面沒有顯著差異(n.s.表示p>0.05)(圖6D)。因此，即使在劑量為2nM時，與蘇肽生®鼠NGF或突變體β-NGF 118aa(mNGF118)相比，單次皮下注射2-118-L3G4-BM在促進體內SCG生長方面也能表現出優異的活性。而在較高劑量(5nM)時，用2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5單次處理，在促進SCG生長方面表現出相似的活性。

實施例6：各種NGF多肽在大鼠體內的藥代動力學(PK)研究

我們將各種NGF構建體注射到成年大鼠體內，以檢測其PK曲線。

24只雄性SD大鼠(6-8周齡，約250g-300g/只)隨機分為3組(每組8只)，分別肌肉注射235μg/kg的2-118-L3Fc10-M3-5、2-118-L3G4-BM或mNGF118(無Fc融合的突變體β-NGF 118個氨基酸)。在注射前(0小時)或注射後1小時、4小時、8小時、24小時、48小時、72小時、120小時、168小時、216小時和288小時，分別採集眼眶後靜脈血150μl。采血後分離血漿，然後用Human NGF Matched ELISA Antibody Pair Set(Sino Biological,SEK11050)檢測NGF含量。在Y軸繪製450nm-630nm下標準品的平均ODs值，在X軸繪製標準品的濃度，以生成標準曲線線性方程，要求R2>0.98。然後根據標準曲線線性方程計算不同樣本的血漿濃度。使用GraphPad Prism 5.0繪製樣品濃度與時間的半對數圖，使用Phoenix WinNonlin 6.2進行PK分析，使用GraphPad Prism 5.0繪製半衰期散點圖。

如圖7A所示，單次肌肉注射後，與無Fc融合的mNGF118對照組相比，NGF-Fc融合蛋白隨著時間的推移顯示出更高的血漿濃度；單次肌肉注射後，與2-118-L3Fc10-M3-5相比，2-118-L3G4-BM隨著時間的推移顯示出相似的血漿濃度。如圖7B所示，2-118-L3G4-BM的半衰期(55小時)與2-118-L3Fc10-M3-5的半衰期(55小時)幾乎相同，兩者都比無Fc融合的mNGF118對照組(半衰期1.75小時)長得多(約31倍)。這些結果進一步解釋了為什麼單劑量2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5在體內促進SCG生長方面顯示出與持續注射無Fc融合的NGF對照組(蘇肽生®鼠NGF或mNGF118)相似的活性(見圖6D)。

WO2017157325的表2詳述了wtNGF120(即“rhNGF”，人類野生型β-NGF 120個氨基酸，SEQ ID NO：4)、NGF-1-15M7(rhNGF-Fc1)、NGF-L3Fc10M7-5(rhNGF-Li-Fc1)、2-1-15M7(rhNGF-(F12E)-Fc1)和NGF-4-12PAA(rhNGF-Fc4)的半衰期，並在表5進行了匯總。本實驗中測試的mNGF118的半衰期(1.75小時)與WO2017157325中測試的wtNGF120的半衰期(1.8小時)相似。如表5所示，NGF-1-15M7(rhNGF-Fc1)、NGF-L3Fc10M7-5(rhNGF-Li-Fc1)和2-1-15M7(rhNGF-(F12E)-Fc1)構建體在體內的半衰期比無Fc融合的wtNGF120或mNGF118對照組延長了17倍以上；也比NGF-4-12PAA(rhNGF-Fc4)多1.4倍。這裡測試的2-118-L3G4-BM(55小時)的半衰期與2-118-L3Fc10-M3-5(55小時)的半衰期幾乎相同，都是無Fc融合的wtNGF120或mNGF118對照組的31倍左右，也比所有先前測試的含有IgG1-或IgG4-衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白長得多。

實施例7：NGF-Fc融合蛋白促進糖尿病神經性病變的傷口癒合

糖尿病神經性病變是糖尿病常見的慢性併發症之一，其患者表現為傷口癒合緩慢，並且在局部會出現不同程度的感染、潰瘍和炭疽，甚至有截肢的風險。本實施例闡述了對NGF-Fc融合蛋白在糖尿病神經性病變動物模型中的治療效果的研究(例如，通過對傷口癒合的評估)。

CD-1小鼠從北京維通利華實驗動物技術有限公司獲得。採用標準方法構建糖尿病動物模型(例如，參見Graiani G.et al.,Nerve growth factor promotes reparative angiogenesis and inhibits endothelial apoptosis in cutaneous wounds of Type 1 diabetic mice.Diabetologia.2004,47(6)：1047-54)。糖尿病誘導4周後，麻醉小鼠，通過一次性皮膚打孔設備在肩胛骨間獲得左右各一塊全層直徑為4mm的皮膚傷口。50μg/ml蘇肽生®鼠NGF、mNGF118或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3Fc10-M3-5或2-118-L3G4-BM)在右側傷口給藥，劑量為20μl/次。等體積的PBS注射液在左側傷口處給藥(作為陰性對照)。PBS、蘇肽生®鼠NGF或mNGF118在第0天(小鼠背部打孔後)、第1天、第2天和第3天每天給藥一次。2-118-L3Fc10-M3-5或2-118-L3G4-BM在第0天以相同劑量單次給藥。在打孔後立即測量傷口面積，記為第0天傷口面積，並在第4天和第7天測量傷口面積並計算傷口癒合率。記錄的資料採用Student t檢驗進行分析，使用GraphPad Prism 8.0.1繪製柱狀圖。

如圖8所示，與第4天相比，所有組在第7天的傷口癒合均得到改善；與PBS陰性對照相比，蘇肽生®鼠NGF、mNGF118和NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)均顯著促進糖尿病傷口癒合(p<0.01)。具體而言，在第4天PBS處理組的傷口平均面積約為蘇肽生®鼠NGF、mNGF118或NGF-Fc融合蛋白處理組的1.3倍。上述結果表明，蘇肽生®鼠NGF、mNGF118或NGF-Fc融合蛋白均可以有效改善糖尿病小鼠傷口癒合緩慢的缺陷。此外，在第7天時，施用NGF-Fc融合蛋白的糖尿病小鼠傷口癒合率高於蘇肽生®鼠NGF和mNGF118處理組。這表明NGF-Fc融合蛋白具有優於NGF(例如，蘇肽生®鼠NGF或mNGF118)的體內治療效果

實施例8：NGF-Fc融合蛋白對阿爾茨海默症的治療效果

阿爾茨海默症是以進行性記憶力減退為主要臨床表現的中樞神經系統退行性疾病，多發於老年，發病機制複雜。本實施例闡述了NGF-Fc融合蛋白在體內對AD治療效果的研究(例如，通過對動物行為學變化的評估)。

採用Wistar大鼠，通過標準方法構建AD動物模型(例如，參見Wenk GL,Harrington CA,Tucker DA,et al.Basal forebrain neurons and memory：a biochemical,histological and behavioural study of differential vulnerability to ibotenate and quisqualate.Behav Neurosci,1992,106：909-923.)。簡而言之，對Wistar大鼠立體定位注射鵝膏蕈氨酸(IBO)。注射IBO 2天后，麻醉AD模型大鼠並取仰臥位。150μg/ml的NGF(蘇肽生®鼠NGF或mNGF118實驗組)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)通過鼻腔給藥，總劑量為100μl/次。施用相同體積PBS的AD模型大鼠作為陰性對照。NGF或PBS每天給藥1次，連續給藥7天。NGF-Fc融合蛋白僅在第1天單次給藥。在第7天通過露臺水迷宮實驗評估大鼠的行為學變化。簡而言之，採用Morriss水迷宮裝置，實驗前需訓練大鼠爬上露臺，實驗當天記錄大鼠的尋台時間(潛伏期；從入水到爬上露臺所需的時間)及撤掉露臺後在120s內跨過原露臺位置的次數。記錄的資料採用Student t檢驗進行分析。

如表6所示，與陰性對照組相比，蘇肽生®鼠NGF、mNGF118或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)處理的AD模型大鼠的尋台時間明顯縮短(*p<0.05)，穿越平臺次數明顯增多(*p<0.05)。因此，本文所述的NGF和NGF-Fc融合蛋白均可有效提高AD模型大鼠的空間認知、記憶和學習能力。此外，與NGF(蘇肽生®鼠NGF或mNGF118)處理的大鼠相比，2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5處理的AD模型大鼠似乎具有更短的尋台時間和更高頻率的穿越平臺次數。這些資料表明NGF-Fc融合蛋白對於AD具有優異的體內治療效果。

實施例9：NGF-Fc融合蛋白對卵巢早衰的治療效果

卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)是指卵巢功能衰竭所致的40歲前自然閉經，常伴隨雌激素水準下降、卵泡生成素水準升高及促性腺激素水準升高，其病因和機理較為複雜。本實施例闡述了通過體外人卵巢顆粒樣腫瘤細胞系(human granulosa-like tumor cell line,KGN)增殖試驗和KGN雌激素分泌試驗以及POF模型大鼠對NGF-Fc融合蛋白治療POF的治療效果的研究。

對於KGN增殖試驗，在試驗前一天向96孔板中每孔加入100ul的KGN懸液(1×104細胞/mL)。試驗前，更換不含血清的DMEM培養基。更換培養基後，實驗組孔中分別加入蘇肽生®鼠NGF、mNGF118或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)，使其在培養基中的終濃度為10μg/mL，陰性對照組在更換培養基後不做任何處理。每組4個複孔，48h後，每孔加入10uLCCK-8(日本同仁化學研究所，#CK04)以測定活細胞。孵育1h 後，測量450nm處的吸光值，記錄的資料採用Student t檢驗進行分析，使用GraphPad Prism 8.0.1繪製柱狀圖。

如圖9A所示，與PBS陰性對照組相比，NGF(蘇肽生®鼠NGF或mNGF118)及NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)均明顯促進了KGN增殖(p<0.05)。相對而言，與經NGF處理的KGN相比，經NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)處理的KGN表現出略高的增殖率。

對於KGN雌激素分泌試驗，在24孔板中接種1×105細胞/孔(細胞的匯合度約為80%)，隨後更換無血清培養基。更換培養基後，實驗組孔分別加入蘇肽生®鼠NGF、mNGF118或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)，使其在培養基中的終濃度為10μg/ml。陰性對照組在更換培養基後不做任何處理。每組4個複孔，孵育18h後，洗兩遍，使用2.2×10-8M的睾酮(北京索萊寶科技有限公司，#IT0110)和0.01IU/ml的綿羊卵泡刺激素(美國NHPP公司，Ovine FSH)處理24h後，取上清稀釋1.6倍，使用R&D Systems生產的雌激素測定試劑盒(KGE014)，測量450nm處的吸光值，並計算分泌的雌激素濃度，記錄的資料採用Student t檢驗進行分析，使用GraphPad Prism 8.0.1繪製柱狀圖。

如圖9B所示，與陰性對照組相比，NGF(蘇肽生®鼠NGF或mNGF118)及NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)均明顯促進了KGN雌激素分泌(p<0.05)。相對而言，與經NGF處理的KGN相比，經NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)處理的KGN表現出略高的雌激素分泌。

去氧乙烯基環己烯(VCD)可選擇性破壞雌鼠卵巢內的原始卵泡和初級卵泡，而對次級卵泡和竇卵泡無影響，從而導致雌鼠POF。為進一步研究NGF-Fc融合蛋白在體內對POF的治療效果，對SD大鼠連續兩周腹腔注射VCD以構建POF大鼠模型(例如，參見Muhammad FS et al.,Effects of 4-vinylcyclohexene diepoxide on peripubertal and adult Sprague-Dawley rats：ovarian,clinical,and pathologic outcomes[J].Comp Med,2009,59(1)：46-59.)。開始建立模型時即進行NGF給藥，記為第1天。採用皮下注射的給藥方式，NGF(蘇肽生®鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)實驗組的注射劑量為10μg/kg bw，相同體積的無菌生理鹽水作為陰性對照。蘇肽生®鼠NGF、mNGF118或無菌生理鹽水隔天給藥一次，NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)每週給藥一次。42天后，將所有大鼠安樂死，對卵巢組織固定後進行常規石蠟包埋、切片並進行H&E(蘇木精和伊紅)染色並對各級卵泡計數。記錄的資料採用Student t檢驗進行分析，使用GraphPad Prism 8.0.1繪製柱狀圖。

如圖9C所示，與陰性對照組相比，蘇肽生®鼠NGF、mNGF118和NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)均明顯提高了初級卵泡的數量(p<0.05)，說明它們在逆轉POF引起的初級卵泡數量減少方面具有優異的效果。與陰性對照組相比，蘇肽生®鼠NGF、mNGF118或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)處理的POF大鼠模型也表現出更高的原始卵泡和次級卵泡數量。

實施例10：NGF-Fc融合蛋白對少弱精子症的治療效果

少弱精子症主要表現為精子數量減少和/或精子活力下降。精子是由睾丸曲細精管內具有增殖能力的生殖細胞經過一系列分裂分化形成的，熱應激可影響增殖細胞分裂、分化和精子形成。本實施例闡述了在小鼠生精障礙模型中NGF-Fc融合蛋白對少弱精子症(少精子症和弱精子症)治療效果的研究。

本實驗採用C57BL/6JSHjh小鼠(購自上海吉輝實驗動物飼養有限公司)。對於實驗組，採用腹股溝皮下注射的給藥方式，分別注射20μg/kg bw/次的NGF(蘇肽生®鼠NGF或mNGF118)或60μg/kg bw/次的NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)。正常對照組或生精障礙模型對照組注射等體積0.9%氯化鈉注射液。首次給藥(NGF、NGF-Fc融合蛋白或氯化鈉)當天為第1天。為構建小鼠睾丸熱應激所致的生精障礙動物模型，在首次給藥4小時後麻醉小鼠，待小鼠睾丸下降到陰囊後，將生精障礙模型對照組、 NGF實驗組和NGF-Fc融合蛋白實驗組小鼠下腹(後肢、尾和陰囊)浸入42℃恒溫水浴30分鐘，將正常對照組小鼠下腹(後肢、尾和陰囊)浸入25℃恒溫水浴30分鐘。蘇肽生®鼠NGF或mNGF118隔天給藥一次，2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5每週給藥2次。正常對照組或模型對照組注射等體積0.9%氯化鈉注射液，隔天給藥1次。共計給藥5周。在給藥後第37天安樂死小鼠，取左側附睾尾稱重並放入37℃預熱的M199培養液中，剪碎並放入培養箱中37℃孵育5分鐘，吸取精子懸液，用M199培養液按1：6稀釋，混勻後，取稀釋液，採用TOX IVOS精子分析儀檢測精子數和精子活力。記錄的資料採用Student t檢驗進行分析。

如表7所示，生精障礙模型對照組的精子數量和精子活力均顯著低於正常對照組，表明動物模型構建成功。與生精障礙模型對照組相比，NGF(蘇肽生®鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3Fc10-M3-5和2-118-L3G4-BM)實驗組小鼠的精子數量和精子活力均顯著升高。由此可見，皮下注射NGF或NGF-Fc融合蛋白可有效挽救生精障礙(如弱精子症、少精子症和少弱精子症)中的精子數量減少和精子活力降低。

為進一步研究NGF和NGF-Fc的治療效果，取上述安樂死小鼠的右側睾丸和附睾，稱重後用10%中性福馬林固定、包埋、切片並進行H&E染色，以評價其組織病理學病變。如表8所示，NGF(蘇肽生®鼠NGF或mNGF118)和NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3Fc10-M3-5和2-118-L3G4-BM)對熱應激所致的睾丸生精小管萎縮、生精小管生精障礙及附睾管細胞碎片症狀表現出明顯的治療作用。

此外，NGF-Fc融合蛋白表現出與NGF相當甚至更優的治療效果(精子數量、精子活力、組織病理學)。

實施例11：NGF-Fc融合蛋白對神經營養性角膜炎的治療效果

神經營養性角膜炎是一種由角膜上皮癒合障礙引起的變性疾病，主要特徵表現為角膜敏感性降低。本實施例闡述了在神經營養性角膜炎大鼠模型中NGF-Fc融合蛋白對神經營養性角膜炎的治療效果的研究(例如，通過角膜螢光素鈉染色試驗和角膜神經長度測量)

為構建神經營養性角膜炎動物模型，採用3日齡SD大鼠，單次皮下注射8mg/ml的辣椒素溶液(上海麥克林生化科技有限公司，#C10831884)，劑量為50μl/只。辣椒素注射兩周後，60μg/ml的NGF(蘇肽生®鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3Fc10-M3-5或2-118-L3G4-BM)以滴眼形式雙眼給藥，每天給藥6次，每次間隔約2小時，20μl/眼/次。相同體積的0.9%氯化鈉溶液以相同頻率施用，作為陰性對照。給藥第1天記為D1。連續給藥2周，於D15每組給藥1次。

隨後進行角膜螢光素鈉染色以評估NGF-Fc融合蛋白的治療效果。角膜螢光素鈉染色評分可直觀展現角膜的完整性和破損程度。完整角膜不會著色，只有出現破損的角膜才會著色，並且評分越高角膜破損程度越高。簡而言之，將螢光素鈉溶液(3μL，0.5%)滴入動物眼睛染色1.5min。隨後每隔約10s使用1.25mL的無菌生理鹽水沖洗動物結膜囊，連續3次。每次沖洗完畢後用面紙吸幹動物眼周的殘餘生理鹽水。染色後5min，使用裂隙燈(+鈷藍濾光片)觀察眼表、拍照並評分。使用改良後的NEI螢光染色分級法為評分標準。具體而言，每個眼角膜分為5個區域(1-中央區、2-上方、3-顳側、4-鼻側、5-下方)，每個區域染色評分最高8分。其中0分表示未見著色，1分表示點狀著色面積為對應區域面積的1%~25%，2分表示點狀著色面積為對應區域面積的 26%~50%，3分表示點狀著色面積為對應區域面積的51%~75%，4分表示點狀著色面積為對應區域面積的76%~100%，若著色區緻密和/或可見明顯融合，依著色區占對應區域的面積大小進一步給予1、2、3、4分的額外附加分，即著色面積為1%~25%給予1分的附加分、著色面積為26%~50%給予2分的附加分、著色面加為51%~75%給予3分的附加分、著色面積為76%~100%給予4分的附加分。每眼總分最高40分。於第0天(第一次處理前)、第4天、第8天和第14天共測量4次。計算每眼角膜螢光素鈉染色總分。記錄的資料SPSS13.0進行處理，使用GraphPad Prism 8.0.1繪製柱狀圖。

如圖10A所示，NGF(蘇肽生®鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)處理的實驗組神經營養性角膜炎大鼠模型的角膜螢光素鈉染色評分均顯著低於陰性對照組(在第4天和第8天時p<0.01；在第14天時p<0.001)，表明NGF(蘇肽生®鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)可明顯恢復損傷角膜的完整性。相對而言，與NGF處理的角膜相比，NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)處理的角膜顯示出略低的角膜螢光素鈉染色評分。

進一步進行角膜神經計數試驗以研究其治療效果。在第15天，給藥1小時後將大鼠安樂死，取右眼眼球，沿角膜緣取下角膜，沖洗，鋪平，染色並固定於載玻片上。光學顯微鏡下(×200倍)觀察角膜神經纖維形態，將角膜從中央放射狀均分為4瓣，從4瓣角膜上各選取一個清晰且角膜神經最多的視野進行拍照，測量每個視野中角膜神經的長度，以4個視野的角膜神經長度的均值作為最終結果。採用SPSS13.0對資料進行處理，使用GraphPad Prism 8.0.1繪製柱狀圖。

如圖10B所示，NGF(蘇肽生®鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)處理的神經營養性角膜炎大鼠模型的平均角膜神經長度顯著長於(p<0.05)陰性對照組。具體而言蘇肽生®鼠NGF、mNGF118、、2-118-L3G4-BM和2-118-L3Fc10-M3-5)處理的平均角膜神經長度分別約為陰性對照組的1.14倍、1.14倍、1.21倍和1.18倍。上述實驗結果表明，NGF(蘇肽生®鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)均可有效改善神經營養性角膜炎對角膜神經所造成的損傷。

序列表

SEQ ID NO：1(突變型人類β-NGF,118aa)

SEQ ID NO：2(突變型人類β-NGF,120aa)

SEQ ID NO：3(野生型人類β-NGF,118aa)

SEQ ID NO：4(野生型人類β-NGF,120aa)

SEQ ID NO：5(NGF多肽，103aa)

SEQ ID NO：6(NGF信號肽，18aa)

MSMLFYTLITAFLIGIQA

SEQ ID NO：7(人類野生型IgG1 Fc IGHG1*05)

SEQ ID NO：8(人類野生型IgG1 Fc IGHG1*03，自然變體)

SEQ ID NO：9(修飾的IgG1 Fc M1[N297A相對於IGHG1*03])

SEQ ID NO：10(修飾的IgG1 Fc M1-5[N297A相對於IGHG1*03,N’5aa截斷])

SEQ ID NO：11(修飾的IgG1 Fc M3[L234A+L235A+P331S相對於IGHG1*03])

SEQ ID NO：12(修飾的IgG1 Fc M3-5[L234A+L235A+P331S相對於IGHG1*03,N’5aa截斷])

SEQ ID NO：13(修飾的IgG1 Fc M5[L234A+L235E+G237A+A330S+P331S相對於IGHG1*03])

SEQ ID NO：14(修飾的IgG1 Fc M5-5[L234A+L235E+G237A+A330S+P331S相對於IGHG1*03,N’5aa截斷])

SEQ ID NO：15(修飾的IgG1 Fc M7[E233P+L234V+L235A+G236del+A327G+A330S+P331S相對於IGHG1*03])

SEQ ID NO：16(修飾的IgG1 Fc M7-5[E233P+L234V+L235A+G236del+A327G+A330S+P331S相對於IGHG1*03,N’5aa截短])

SEQ ID NO：17(人類野生型IgG4 Fc)

SEQ ID NO：18(修飾的IgG4 Fc[S228P+F234A+L235A])

SEQ ID NO：19(修飾的IgG4 Fc-FD)

SEQ ID NO：20(修飾的IgG2/4 Fc)

SEQ ID NO：21(FD-G4Fc核酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(野生型118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG4 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：22(FD-G4Fc的氨基酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(野生型118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG4 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：23(WM-G24Fc的核酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(野生型118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG2/4 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：24(WM-G24Fc的氨基酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(野生型118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG2/4 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：25(NGF-1-15M7的核酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(野生型120aa)加粗、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：26(NGF-1-15M7的氨基酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(野生型120aa)加粗、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：27(NGF-L3Fc10M7-5的核酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(野生型120aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：28(NGF-L3Fc10M7-5的氨基酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方 框中、β-NGF(野生型120aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：29(2-1-15M7的核酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(突變體120aa)加粗、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：30(2-1-15M7的氨基酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(突變體120aa)加粗、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：31(NGF-4-12PAA的核酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(野生型120aa)加粗、修飾的IgG4 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：32(NGF-4-12PAA的氨基酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(野生型120aa)加粗、修飾的IgG4 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：33(2-118-L3Fc10-M1-5的核酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(突變體118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：34(2-118-L3Fc10-M1-5的氨基酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(突變體118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：35(2-118-L3Fc10-M3-5的核酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(突變體118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：36(2-118-L3Fc10-M3-5的氨基酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(突變體118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：37(NGF-118-L3Fc10-M3-5的核酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(野生型118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：38(NGF-118-L3Fc10-M3-5的氨基酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(野生型118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：39(2-L3Fc10-M3-5的核酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(突變體120aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：40(2-L3Fc10-M3-5的氨基酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(突變體120aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：41(2-118-L3Fc10-M5-5的核酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(突變體118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：42(2-118-L3Fc10-M5-5的氨基酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(突變體118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：43(2-118-L3Fc10M7-5的核酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(突變體118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：44(2-118-L3Fc10M7-5的氨基酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(突變體118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：45(2-118-L3G4-BM的核酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(突變體118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG4 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：46(2-118-L3G4-BM的氨基酸序列；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(突變體118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG4 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：47(突變型人類preproNGF,239aa；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(突變體118aa)加粗)

SEQ ID NO：48(突變型人類preproNGF,241aa；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(突變體120aa)加粗)

SEQ ID NO：49(野生型人類preproNGF,239aa；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(野生型118aa)加粗)

SEQ ID NO：50(野生型人類preproNGF,241aa；信號肽為斜體、前導肽在方框中、β-NGF(野生型120aa)加粗)

SEQ ID NO：51(突變型人類proNGF,221aa；前導肽在方框中、β-NGF(突變體118aa)加粗)

SEQ ID NO：52(突變型人類proNGF,223aa；前導肽在方框中、β-NGF(突變體120aa)加粗)

SEQ ID NO：53(野生型人類proNGF,221aa；前導肽在方框中、β-NGF(野生型118aa)加粗)

SEQ ID NO：54(野生型人類proNGF,223aa；前導肽在方框中、β-NGF(野生型120aa)加粗)

SEQ ID NO：55(成熟FD-G4Fc的氨基酸序列；β-NGF(野生型118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG4 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：56(成熟WM-G24Fc的氨基酸序列；β-NGF(野生型118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG2/4 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：57(成熟NGF-1-15M7的氨基酸序列；β-NGF(野生型120aa)加粗、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：58(成熟NGF-L3Fc10M7-5的氨基酸序列；β-NGF(野生型120aa) 加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：59(成熟2-1-15M7的氨基酸序列；β-NGF(突變體120aa)加粗、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：60(成熟NGF-4-12PAA的氨基酸序列；β-NGF(野生型120aa)加粗、修飾的IgG4 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：61(成熟2-118-L3Fc10-M1-5的氨基酸序列；β-NGF(突變體118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：62(成熟2-118-L3Fc10-M3-5的氨基酸序列；β-NGF(突變體118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：63(成熟NGF-118-L3Fc10-M3-5的氨基酸序列；β-NGF(野生型118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：64(成熟2-L3Fc10-M3-5的氨基酸序列；β-NGF(突變體120aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：65(成熟2-118-L3Fc10-M5-5的氨基酸序列；β-NGF(突變體118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：66(成熟2-118-L3Fc10M7-5的氨基酸序列；β-NGF(突變體118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG1 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：67(成熟2-118-L3G4-BM的氨基酸序列；β-NGF(突變體118aa)加粗、接頭加底線、修飾的IgG4 Fc為斜體加粗)

SEQ ID NO：68(接頭)

GGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO：69(接頭)

GGGGGGSGGGGSGGGGSA

SEQ ID NO：70(接頭；n為至少是1的整數)

(GGGGS)_n

SEQ ID NO：71(接頭)

GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO：72(接頭)

KTGGGSGGGS

SEQ ID NO：73(接頭；n為至少是1的整數)

(G)_n

SEQ ID NO：74(接頭；n為至少是1的整數)

(GS)_n

SEQ ID NO：75(接頭；n為至少是1的整數)

(GGS)_n

SEQ ID NO：76(接頭；n為至少是1的整數)

(GGGS)_n

SEQ ID NO：77(接頭；n為至少是1的整數)

(GGS)_n(GGGS)_n

SEQ ID NO：78(接頭；n為至少是1的整數)

(GSGGS)_n

SEQ ID NO：79(接頭；n為至少是1的整數)

(GGSGS)_n

SEQ ID NO：80(接頭)

GSGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO：81(接頭)

GGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO：82(接頭)

GGGSGGSGGS

SEQ ID NO：83(接頭)

GGSGGSGGSGGSGGG

SEQ ID NO：84(接頭)

GGSGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO：85(接頭)

GGSGGSGGSGGSGGSGGS

SEQ ID NO：86(接頭)

GG

SEQ ID NO：87(接頭)

GGSG

SEQ ID NO：88(接頭)

GGSGG

SEQ ID NO：89(接頭)

GSGSG

SEQ ID NO：90(接頭)

GSGGG

SEQ ID NO：91(接頭)

GGGSG

SEQ ID NO：92(接頭)

GSSSG

SEQ ID NO：93(接頭)

GGSGGS

SEQ ID NO：94(接頭)

SGGGGS

SEQ ID NO：95(接頭)

GGGGS

SEQ ID NO：96(接頭；n為至少是1的整數)

(GA)_n

SEQ ID NO：97(接頭)

GRAGGGGAGGGG

SEQ ID NO：98(接頭)

GRAGGG

SEQ ID NO：99(接頭)

ASTKGP

Claims

一種長效神經生長因數(NGF)多肽，從N端到C端包含NGF部分和Fc部分，所述NGF部分包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，所述Fc部分來自包含胺基酸序列SEQ ID NO：7或8的IgG1 Fc，並且所述Fc在相對於SEQ ID NO：7或8的位置上包含突變，所述位置選自E233、L234、L235、G236、G237、A327、A330和P331中的一個或多個。
如請求項1所述的長效NGF多肽，所述NGF部分通過多肽接頭與Fc部分融合。
如請求項2所述的長效NGF多肽，所述多肽接頭包含SEQ ID NOs：68-72中的任一胺基酸序列。
如請求項2或3所述的長效NGF多肽，所述多肽接頭包含胺基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：70)，且所述n為1、2、3、4、5或6中的任何一個。
如請求項1至4中任一所述的長效NGF多肽，所述Fc部分相對於SEQ ID NO：8包含突變，所述突變選自E233P、L234V、L234A、L235A、L235E、G236del、G237A、A327G、A330S和P331S中的一個或多個。
如請求項1至5中任一項所述的長效NGF多肽，所述Fc部分進一步缺失胺基酸序列SEQ ID NO：7或8的前5個胺基酸。
如請求項1至6中任一項所述的長效NGF多肽，所述Fc部分相對於SEQ ID NO：8的包含L234A、L235A和P331S突變。
如請求項7所述的長效NGF多肽，所述Fc部分包含胺基酸序列SEQ ID NO：11或12。
如請求項7所述的長效NGF多肽，所述長效NGF多肽包含SEQ ID NOs：62-64中的任一胺基酸序列。
如請求項1至6中任一項所述的長效NGF多肽，所述Fc部分相對於SEQ ID NO：8包含E233P、L234V、L235A、G236del、A327G、A330S和P331S突變。
如請求項10所述的長效NGF多肽，所述Fc部分包含胺基酸序列SEQ ID NO：15或16。
如請求項11所述的長效NGF多肽，所述長效NGF多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：66。
如請求項1至6中任一項所述的長效NGF多肽，所述Fc部分相對於SEQ ID NO：8包含L234A、L235E、G237A、A330S和P331S突變。
如請求項13所述的長效NGF多肽，所述Fc部分包含胺基酸序列SEQ ID NO：13或14。
如請求項14所述的長效NGF多肽，所述長效NGF多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：65。
如請求項1至6中任一項所述的長效NGF多肽，所述Fc部分相對於SEQ ID NO：8包含N297A突變。
如請求項16所述的長效NGF多肽，所述Fc部分包含胺基酸序列SEQ ID NO：9或10。
如請求項17所述的長效NGF多肽，所述長效NGF多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：61。
如請求項1至18中任一項所述的長效NGF多肽，當通過靜脈注射、肌肉注射、眼內或皮下注射為人類個體給藥時，所述長效NGF多肽的半衰期至少為10小時。
如請求項1至19中任一項所述的長效NGF多肽，與包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：3或4的NGF部分的NGF多肽相比，所述長效NGF多肽引起更少的疼痛。
一種編碼請求項1至20中任一項所述長效NGF多肽的核酸。
一種包含請求項21所述核酸的載體。
一種包含請求項22所述載體的宿主細胞。
一種藥物組合物，包含請求項1至20中任一項所述長效NGF多肽，以及藥學上可接受的載體和/或輔料。
一種請求項1至20任一項所述的長效NGF多肽、請求項21所述的核酸、請求項22所述的載體、請求項23所述的宿主細胞、請求項24所述的藥物組合物在製備用於治療NGF相關疾病藥物中的用途。
如請求項25所述的用途，所述NGF相關疾病為神經系統疾病。
如請求項26所述的用途，所述神經系統疾病選自由新生兒缺氧缺血性腦病、腦癱、危重症肌病、神經性耳聾、喉返神經損傷、創傷性腦損傷、牙神經損傷、腦卒中、唐氏綜合征、肌萎縮性脊髓側索硬化症，多發性硬化、脊髓性肌萎縮、彌漫性腦損傷、胸腺發育不良、視神經挫傷、濾泡發育不良、脊髓損傷、青光眼、神經營養性角膜炎、視神經損傷、視神經脊髓炎、視網膜相關疾病、尿失禁、阿爾茨海默症、帕金森病、亨廷頓病、癡呆、高血壓腦出血神經功能障礙、腦小血管疾病、急性缺血性中風、角膜內皮營養不良、糖尿病神經性病變、糖尿病足潰瘍、神經源性皮膚潰瘍、壓瘡、神經營養性角膜潰瘍、糖尿病性角膜潰瘍和黃斑裂孔所組成的組中。
如請求項26或27所述的用途，所述神經系統疾病為糖尿病神經性病變、阿爾茨海默症或神經營養性角膜炎。
如請求項25所述的用途，所述NGF相關疾病為非神經系統疾病。
如請求項29所述的用途，所述非神經系統疾病選自由脾萎縮、脾挫傷、卵巢儲備功能下降、卵巢早衰、卵巢過度刺激綜合征、卵巢殘餘綜合征、卵巢卵泡發育不良、生精障礙(如少精子症、弱精子症、少弱精子症)、缺血性潰瘍、應激性潰瘍、類風濕性潰瘍、肝纖維化、角膜潰瘍、燒傷、口腔潰瘍和下肢靜脈潰瘍所組成的組中。
如請求項29或30所述的用途，所述非神經系統疾病為卵巢早衰或生精障礙。
如請求項25至31中任一項所述的用途，所述藥物組合物以每個個體0.01μg至1000μg的劑量給藥。
如請求項25至32中任一項所述的用途，所述藥物組合物以每週一次或每月一次的給藥頻率給藥。
如請求項25至33中任一項所述的用途，所述藥物組合物通過口服、皮下、靜脈、腦內、鼻內、經皮、腹膜內、肌肉內、肺內、陰道、直腸、眼內或局部方式給藥。