TWI825397B - 包含il-2蛋白及cd80蛋白的融合蛋白調配物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種使融合蛋白二聚體之穩定性增強的醫藥調配物，該二聚體包含經修飾的IL-2蛋白及CD80蛋白。包含IL-2蛋白及CD80蛋白的融合蛋白二聚體不僅可因IL-2而活化免疫細胞，而且可因CD80而有效地調控Treg細胞。當根據本發明之調配物應用於包含IL-2蛋白及CD80蛋白的融合蛋白二聚體時，融合蛋白二聚體的穩定性顯著增強，且其可以液體調配物形式使用。因此，可增強融合蛋白二聚體的商業實用性。

Description

包含IL-2蛋白及CD80蛋白的融合蛋白調配物
發明領域
本發明係關於一種使融合蛋白之穩定性增強的液體調配物，該融合蛋白包含IL-2蛋白及CD80蛋白。
發明背景
IL-2，亦稱為T細胞生長因子，係在淋巴球產生、存活及體內恆定方面起主要作用的球形醣蛋白。IL-2具有約15.5kDa至約16kDa之蛋白質尺寸且由133個胺基酸組成。IL-2藉由結合至由三個不同次單元構成之IL-2受體來介導多種免疫作用。另外，IL-2主要由活化T細胞合成，特定言之，由CD4+輔助T細胞合成。IL-2刺激T細胞增殖及分化，且誘導細胞毒性T淋巴球產生及周邊血液淋巴球分化成細胞毒性細胞及淋巴激素活化的殺手細胞。
另外，IL2涉及B細胞之增殖及分化，且促進B細胞合成免疫球蛋白。另外，IL-2刺激自然殺手細胞的產生、增殖及活化。因此，IL-2用作抗癌劑，原因在於其可增加淋巴球群體且增強活體內免疫細胞功能。目前，IL-2療法已批准用於患有轉移腎細胞癌及惡性黑色素瘤的患者。
然而，IL-2的雙重功能在於，其重要作用不僅在於介導免疫細胞數目及其活性增加，而且在於維持免疫耐受性。另外，已報導IL-2就抑制腫瘤 生長而言可能並非最佳的。原因在於，在IL-2存在下，活化誘導的細胞死亡(AICD)可能在所產生的細胞毒性T淋巴球中發生，且IL-2依賴性調控T細胞(Treg細胞)可抑制免疫反應(Imai等人，Cancer Sci 98,416-423,2007)。
另外，已接受IL-2的患者出現嚴重的心血管、肺、腎、肝、胃腸、神經元、皮膚、血液及全身性副作用。因此，已研究多種IL-2突變體，以改善IL-2的治療功效且最小化其副作用(US 5,229,109 B)。然而，仍存在許多問題要解決，以便將IL-2用於藥理學目的。
同時，CD80，亦稱為B7-1，係膜結合蛋白的B7家族成員，該等膜結合蛋白藉由結合至其配位體、藉助於遞送共刺激反應及共抑制反應而參與免疫調控。CD80為表現於T細胞、B細胞、樹突狀細胞及單核球之表面上的跨膜蛋白。已知CD80結合CD28、CTLA4(CD152)及PD-L1。CD80、CD86、CTLA4及CD28參與共刺激-共抑制系統。舉例而言，已知CD80可調控T細胞活性且參與其增殖、分化及存活。
舉例而言，當CD80及CD86與CD28相互作用時，產生共刺激訊息以活化T細胞。最終，CD80結合至表現於活化T細胞表面上之CTLA4且刺激CTLA4上調。因此，在CD80/CD28相互作用引起免疫反應操作之前，CD80抑制T細胞反應。此反饋迴路允許免疫反應得到精調。
另外，已知CD80可結合PD-L1(B7家族另一成員)，此結合的親和力類似於CD28結合PD-L1的親和力。已知PD-L1為程式性死亡-1(PD-1)蛋白的二種配位體之一，且已知PD-L1參與T細胞調控。CD80對PD-L1的結合係可阻斷PD-1/PD-L1相互作用的另一種機制，從而可阻止抑制針對腫瘤的T細胞反應。然而，CD80位準的增加促使CD80結合至CD28，藉此誘導T細胞反應。同時，CD80可結合至CTLA4，藉此抑制T細胞反應。
已證實包含CD80片段、免疫球蛋白Fc及IL-2變異體的融合蛋白 可活化免疫細胞，且同時可控制調控T細胞的免疫細胞調控活性，且從而可有效治療癌症以及感染性疾病(KR 10-2201086 B1)。為了將此類蛋白質有效地應用於癌症疾病及感染性疾病的治療，必需開發出一種具有劑量及投藥優勢的穩定、高濃度蛋白質調配物。
發明概要
本發明人開發出一種使新穎融合蛋白二聚體之穩定性增強的調配物，該新穎融合蛋白二聚體以一個分子包含IL-2蛋白及CD80蛋白，藉此完成本發明。
為了達成上述目標，在本發明的一個態樣中，提供一種包含融合蛋白二聚體的醫藥調配物，該融合蛋白二聚體包含IL-2蛋白及CD80蛋白。
包含IL-2蛋白及CD80蛋白的融合蛋白二聚體不僅可因IL-2而活化免疫細胞，而且可因CD80而有效地調控Treg細胞。為了臨床上使用此類融合蛋白二聚體，必須確保蛋白質製劑的穩定性。當根據本發明的醫藥調配物應用於包含IL-2蛋白及CD80蛋白的融合蛋白二聚體時，融合蛋白二聚體的穩定性顯著增強，且其可以液體調配物形式使用。因此，可增強融合蛋白二聚體的商業實用性。
圖1說明藉由SDS-PAGE偵測所得融合蛋白(GI-101)的結果。
圖2說明融合蛋白(GI-101)之量與吸光度的相關性。
圖3說明藉由尺寸排阻層析(SEC)分析所得融合蛋白(GI-101)的結果。
較佳實施例之詳細說明
包含含有IL-2蛋白及CD80蛋白之融合蛋白的醫藥調配物
在本發明之一個態樣中，提供一種醫藥調配物，其包含：(i)包含IL-2蛋白及CD80蛋白的融合蛋白二聚體，其濃度為3.0mg/mL至5.0mg/mL；(ii)濃度為10mM至30mM的緩衝液；及(iii)濃度為0.155w/w%至0.185w/w%的界面活性劑；其中調配物的pH為6.5至7.5。
在此，醫藥調配物可為液體調配物。
包含IL-2蛋白及CD80蛋白的融合蛋白
除非另有說明，否則如本文所用，術語「IL-2」或「介白素-2」係指獲自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，例如靈長類動物(諸如人類)及嚙齒動物(諸如小鼠及大鼠))的任何野生型IL-2。IL-2可獲自動物細胞，且亦包括獲自能夠產生IL-2之重組細胞的IL-2。另外，IL-2可為野生型IL-2或其變異體。
在本說明書中，IL-2或其變異體可用術語「IL-2蛋白」或「IL-2多肽」統一表述。IL-2、IL-2蛋白、IL-2多肽及IL-2變異體特異性結合至例如IL-2受體。此特異性結合可藉由熟習此項技術者已知之方法鑑別。
IL-2之一實施例可具有胺基酸序列SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36。在此，IL-2亦可呈成熟形式。特定言之，成熟IL-2可以不含有訊息序列，且可具有胺基酸序列SEQ ID NO：10。在此，IL-2可以根據涵蓋野生型IL-2片段之概念使用，其中野生型IL-2之N端或C端的一部分被截斷。
另外，IL-2片段可呈如下形式：其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個鄰接胺基酸自具有胺基酸序列SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36之蛋白質之N端 截斷。另外，IL-2片段可呈如下形式：其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個鄰接胺基酸自具有胺基酸序列SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36之蛋白質之C端截斷。
如本文所用，術語「IL-2變異體」係指一種形式，其中全長IL-2或IL-2之上述片段中的一部分胺基酸經取代。亦即，IL-2變異體可具有不同於野生型IL-2或其片段的胺基酸序列。然而，IL-2變異體可具有等於或類似於野生型IL-2的活性。在此，「IL-2活性」可以指例如特異性結合至IL-2受體，該特異性結合可藉由熟習此項技術者已知之方法量測。
特定言之，IL-2變異體可以藉由取代野生型IL-2中之一部分胺基酸獲得。藉由胺基酸取代獲得之IL-2變異體的一個實施例可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第38個、第42個、第45個、第61個及第72個胺基酸中的至少一者來獲得。
特定言之，藉由用另一個胺基酸取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第38個、第42個、第45個、第61個或第72個胺基酸中之至少一者可以獲得IL-2變異體。另外，當IL-2呈胺基酸序列SEQ ID NO：35之N端部分被截斷的形式時，與胺基酸序列SEQ ID NO：10中之位置互補對應之位置處的胺基酸可以用另一個胺基酸取代。舉例而言，當IL-2具有胺基酸序列SEQ ID NO：35時，可以藉由用另一個胺基酸取代胺基酸序列SEQ ID NO：35中之第58個、第62個、第65個、第81個或第92個胺基酸中之至少一者來獲得其IL-2變異體。此等胺基酸殘基分別對應於胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第38個、第42個、第45個、第61個及第72個胺基酸殘基。根據一個實施例，可以取代一個、二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸，只要此類IL-2變異體維持IL-2活性。根據另一個實施例，可以取代一至五個胺基酸。
在一個實施例中，IL-2變異體可以呈其中二個胺基酸被取代的形 式。特定言之，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第38個及第42個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第38個及第45個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第38個及第61個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第38個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第42個及第45個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第42個及第61個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第42個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第45個及第61個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第45個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第61個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。
另外，IL-2變異體可以呈其中三個胺基酸被取代的形式。特定言之，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第38個、第42個及第45個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第38個、第42個及第61個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第38個、第42個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第38個、第45個及第61個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第38個、第45個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實 施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第38個、第61及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第42個、第45個及第61個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第42個、第45個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第45個、第61及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。
另外，IL-2變異體可以呈其中四個胺基酸被取代的形式。特定言之，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第38個、第42個、第45個及第61個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第38個、第42個、第45個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第38個、第45個、第61個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第38個、第42個、第61個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第42個、第45個、第61個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。
另外，IL-2變異體可以呈其中五個胺基酸被取代的形式。特定言之，可以藉由用另一個胺基酸取代胺基酸序列SEQ ID NO：10中之第38個、第42個、第45個、第61個及第72個胺基酸中之每一者來獲得IL-2變異體。
在此，藉由取代引入的「另一個胺基酸」可為選自由以下組成之群的至少一者：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸。然而，就胺基酸取代以獲得IL-2變 異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO：10中，第38個胺基酸不能被精胺酸取代，第42個胺基酸不能被苯丙胺酸取代，第45個胺基酸不能被酪胺酸取代，第61個胺基酸不能被麩胺酸取代，且第72個胺基酸不能被白胺酸取代。
就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO：10中，第38個胺基酸精胺酸可以被除精胺酸之外的胺基酸取代。較佳地，就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO：10中，第38個胺基酸精胺酸可以被丙胺酸取代(R38A)。
就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO：10中，第42個胺基酸苯丙胺酸可以被除苯丙胺酸之外的胺基酸取代。較佳地，就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO：10中，第42個胺基酸苯丙胺酸可以被丙胺酸取代(F42A)。
就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO：10中，第45個胺基酸酪胺酸可以被除酪胺酸之外的胺基酸取代。較佳地，就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO：10中，第45個胺基酸酪胺酸可以被丙胺酸取代(Y45A)。
就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO：10中，第61個胺基酸麩胺酸可以被除麩胺酸之外的胺基酸取代。較佳地，就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO：10中，第61個胺基酸麩胺酸可以被精胺酸(E61R)取代。
就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO：10中，第72個胺基酸白胺酸可以被除白胺酸之外的胺基酸取代。較佳地，就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO：10中，第72個胺基酸白胺酸可以被甘胺酸取代(L72G)。
特定言之，IL-2變異體可以藉由在胺基酸序列SEQ ID NO：10中 達成至少一種選自由以下組成之群的取代而獲得：R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G。
特定言之，IL-2變異體可以藉由在選自由以下組成之群之位置中之二個、三個、四個或五個位置達成胺基酸取代來獲得：R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G。
另外，IL-2變異體可以呈其中二個胺基酸被取代的形式。特定言之，IL-2變異體可以藉由取代R38A及F42A獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代R38A及Y45A獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代R38A及E61R獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代R38A及L72G獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代F42A及Y45A獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代F42A及E6IR獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代F42A及L72G獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代E61R及L72G獲得。
另外，IL-2變異體可以呈其中三個胺基酸被取代的形式。特定言之，IL-2變異體可以藉由取代R38A、F42A及Y45A獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代R38A、F42A及E61R獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代R38A、F42A及L72G獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代R38A、Y45A及E61R獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代R38A、Y45A及L72G獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代F42A、Y45A及E61R獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代F42A、Y45A及L72G獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代F42A、E61R及L72G獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代Y45A、E61R及L72G獲得。
另外，IL-2變異體可以呈其中四個胺基酸被取代的形式。特定言 之，IL-2變異體可以藉由取代R38A、F42A、Y45A及E61R獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代R38A、F42A、Y45A及L72G獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代R38A、F42A、E61R及L72G獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代R38A、Y45A、E61R及L72G獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代F42A、Y45A、E61R及L72G獲得。
另外，IL-2變異體可以藉由取代R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G獲得。
較佳地，IL-2變異體之一實施例可以在胺基酸序列SEQ ID NO：10中含有選自以下取代組合(a)至(d)的任一者：(a)R38A/F42A
(b)R38A/F42A/Y45A
(c)R38A/F42A/E61R
(d)R38A/F42A/L72G
在此，當IL-2具有胺基酸序列SEQ ID NO：35時，胺基酸取代可以存在於與胺基酸序列SEQ ID NO：10中之位置互補對應的位置處。另外，即使當IL-2為胺基酸序列SEQ ID NO：35之片段時，胺基酸取代亦可存在於與胺基酸序列SEQ ID NO：10中之位置互補對應的位置處。
特定言之，IL-2變異體可以具有胺基酸序列SEQ ID NO：6、22、23或24。
另外，IL-2變異體的特徵可為活體內低毒性。在此，活體內低毒性可為IL-2結合至IL-2受體α鏈(IL-2Rα)所引起的副作用。為了改善IL-2結合至IL-2Rα所引起的副作用，已開發出多種IL-2變異體，且此類IL-2變異體可為美國專利第5,229,109號及韓國專利第1667096號中所揭露之彼等變異體。特定 言之，本申請案中所述的IL-2變異體對IL-2受體α鏈(IL-2Rα)具有弱結合能力且因此活體內毒性低於野生型IL-2。
如本文所用，術語「CD80」，亦稱為「B7-1」，係存在於樹突狀細胞、活化B細胞及單核球中的膜蛋白。CD80提供共刺激訊息為T細胞活化及存活必不可少的。CD80已知為存在於T細胞表面上之二種不同蛋白質CD28及CTLA-4的配位體。CD80係由288個胺基酸構成，且尤其可具有胺基酸序列SEQ ID NO：11。另外，如本文所用，術語「CD80蛋白」係指全長CD80或CD80片段。
如本文所用，術語「CD80片段」係指CD80的分裂形式。另外，CD80片段可為CD80胞外區域。CD80片段之一實施例可藉由自N端排除第1個至第34個胺基酸來獲得，該等胺基酸為CD80之訊息序列。特定言之，CD80片段之一實施例可為由SEQ ID NO：11中之第35個至第288個胺基酸構成的蛋白質。另外，CD80片段之一實施例可為由SEQ ID NO：11中之第35個至第242個胺基酸構成的蛋白質。另外，CD80片段之一實施例可為由SEQ ID NO：11中之第35個至第232個胺基酸構成的蛋白質。另外，CD80片段之一實施例可為由SEQ ID NO：11中之第35個至第139個胺基酸構成的蛋白質。另外，CD80片段之一實施例可為由SEQ ID NO：11中之第142個至第242個胺基酸構成的蛋白質。在一個實施例中，CD80片段可以具有胺基酸序列SEQ ID NO：2。
另外，IL-2蛋白與CD80蛋白可以經由連接子或載體彼此連接。特定言之，IL-2或其變異體與CD80(B7-1)或其片段可以經由連接子或載體彼此連接。在本說明書中，連接子與載體可互換使用。
連接子連接二種蛋白質。連接子之一實施例可以包括1至50個胺基酸、白蛋白或其片段、免疫球蛋白之Fc區域，或其類似物。在此，免疫球蛋白之Fc區域係指一種蛋白質含有免疫球蛋白之重鏈恆定區2(CH2)及重鏈恆定 區3(CH3)，且不含有免疫球蛋白之重鏈及輕鏈可變區及輕鏈恆定區1(CH1)。免疫球蛋白可為IgG、IgA、IgE、IgD或IgM，且較佳可為IgG4。在此，野生型免疫球蛋白G4之Fc區域可以具有胺基酸序列SEQ ID NO：4。
另外，免疫球蛋白之Fc區域可為Fc區域變異體以及野生型Fc區域。另外，如本文所用，術語「Fc區域變異體」可以指在糖基化模式方面不同於野生型Fc區域、糖基化高於野生型Fc區域或糖基化低於野生型Fc區域的形式；或去糖基化形式。另外，其中包括去糖基化Fc區域。Fc區域或其變異體可以經由培養條件或宿主基因操控加以調適以具有經調整之數目個唾液酸、岩藻糖基化，或糖基化。
另外，可以藉由習知方法(諸如化學方法、酶方法，及使用微生物的基因工程方法)修改免疫球蛋白Fc區域的糖基化。另外，Fc區域變異體可呈免疫球蛋白IgG、IgA、IgE、IgD及IgM之各別Fc區的混合形式。另外，Fc區域變異體可以呈其中Fc區域之一些胺基酸被其他胺基酸取代的形式。Fc區域變異體之一實施例可以具有胺基酸序列SEQ ID NO：12。
融合蛋白可以具有如下結構：其中使用Fc區域作為連接子(或載體)，將CD80蛋白與IL-2蛋白或IL-2蛋白與CD80蛋白分別連接至連接子或載體的N端及C端。Fc區域與CD-80或IL-2之N端或C端之間的鍵聯可以任擇地藉由連接肽達成。
特定而言，融合蛋白可以由以下結構式(I)或(II)組成：N'-X-[連接子(1)]n-Fc區域-[連接子(2)]m-Y-C' (I)
N'-Y-[連接子(1)]n-Fc區域-[連接子(2)]m-X-C' (II)
在此，在結構式(I)及(II)中，N'為該融合蛋白之N端，C'為該融合蛋白之C端， X為CD80蛋白，Y為IL-2蛋白，連接子(1)及(2)為肽連接子，且n及m各自獨立地為0或1；較佳地，融合蛋白可以由結構式(I)組成。IL-2蛋白如上文所述。另外，CD80蛋白如上文所述。根據一個實施例，IL-2蛋白可為相較於野生型IL-2具有一至五個胺基酸取代的IL-2變異體。CD80蛋白可為藉由自野生型CD80之N端或C端截斷至多約34個鄰接胺基酸殘基而獲得的片段。或者，CD蛋白可為具有結合至T細胞表面受體CTLA-4及CD28之活性的細胞外免疫球蛋白樣區域。
特定而言，融合蛋白可以具有胺基酸序列SEQ ID NO：9、26、28或30。根據另一個實施例，融合蛋白包括與胺基酸序列SEQ ID NO：9、26、28或30具有85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的多肽。在此，一致性為例如同源性百分比，且可經由同源性比較軟體測定，諸如美國國家生技資訊中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)的BlastN軟體。
肽連接子(1)可納入CD80蛋白與Fc區域之間。肽連接子(1)可以由5至80個鄰接胺基酸、20至60個鄰接胺基酸、25至50個鄰接胺基酸或30至40個鄰接胺基酸組成。在一個實施例中，肽連接子(1)可以由30個胺基酸組成。另外，肽連接子(1)可以含有至少一個半胱胺酸。特定言之，肽連接子(1)可以含有一個、二個或三個半胱胺酸。另外，肽連接子(1)可衍生自免疫球蛋白之鉸鏈。在一個實施例中，肽連接子(1)可為由胺基酸序列SEQ ID NO：3組成的肽連接子。
肽連接子(2)可以由1至50個鄰接胺基酸、3至30個鄰接胺基酸 或5至15個鄰接胺基酸組成。在一個實施例中，肽連接子(2)可為(G4S)n(其中n為整數1至10)。在此，在(G4S)n中，n可為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一個實施例中，肽連接子(2)可為由胺基酸序列SEQ ID NO：5組成的肽連接子。
在本發明之另一個態樣中，提供一種由二種融合蛋白結合而獲得的二聚體，該二種融合蛋白各自包含IL-2蛋白及CD80蛋白。包含IL-2或其變異體及CD80或其片段的融合蛋白如上文所述。
在此，構成二聚體之融合蛋白之間的結合可以藉由(但不限於)二硫鍵達成，該二硫鍵係由存在於連接子中的半胱胺酸形成。構成二聚體的融合蛋白可為彼此相同或不同的融合蛋白。二聚體較佳可為均二聚體。構成二聚體之融合蛋白之一實施例可為具有SEQ ID NO：9之胺基酸序列的蛋白質。
醫藥調配物
在本發明之一個態樣中，提供一種包含融合蛋白二聚體的醫藥調配物，該融合蛋白二聚體包含IL-2蛋白及CD80蛋白。
如本文所用，術語「醫藥調配物」係指以允許活性成分之生物活性明確有效的形式存在的製劑，且不含有在調配物所投予之個體中產生副作用的成分。
術語「個體」可為哺乳動物，諸如人類、犬、牛、馬、豬、綿羊、山羊、貓、小鼠、兔及大鼠，且較佳可為人類、犬或貓。
如本文所用，術語「醫藥調配物」係指使用適合水溶劑(諸如水或水性/油性混合物(例如水醇混合物))的醫藥調配物。調配物可以維持穩定性，諸如化學或物理穩定性、生物活性。
術語「穩定性」係指一種維持恆定狀態的特性，且大體上關於使生物活性物質(諸如蛋白質、肽或生物活性巨分子)的降解、變性、聚集或去摺疊 最小化。
同時，調配物可為液體調配物。液體調配物為水性溶液或懸浮液，且可在室溫下穩定地維持，在儲存期間冷藏(例如2℃至8℃)或冷凍(例如-20℃或-70℃)。
本發明之醫藥調配物可非經腸投予。在此，非經腸投藥可以藉由諸如皮下投藥、靜脈內投藥、黏膜投藥及肌肉內投藥等方法執行。在本發明之一實施例中，調配物較佳可藉由靜脈內注射投予。
醫藥調配物中之融合蛋白二聚體的濃度可為3.0mg/mL至5.0mg/mL。另外，融合蛋白二聚體可以具有3.0mg/mL至4.8mg/mL的濃度、3.0mg/mL至4.6mg/mL的濃度、3.0mg/mL至4.4mg/mL的濃度、3.0mg/mL至4.2mg/mL的濃度、3.2mg/mL至4.8mg/mL的濃度、3.2mg/mL至4.6mg/mL的濃度、3.2mg/mL至4.4mg/mL的濃度、3.2mg/mL至4.2mg/mL的濃度、3.4mg/mL至4.8mg/mL的濃度、3.4mg/mL至4.6mg/mL的濃度、3.4mg/mL至4.4mg/mL的濃度、3.4mg/mL至4.2mg/mL的濃度、3.6mg/mL至4.8mg/mL的濃度、3.6mg/mL至4.6mg/mL的濃度、3.6mg/mL至4.4mg/mL的濃度、3.6mg/mL至4.2mg/mL的濃度、3.8mg/mL至4.8mg/mL的濃度、3.8mg/mL至4.6mg/mL的濃度、3.8mg/mL至4.4mg/mL的濃度、3.8mg/mL至4.2mg/mL的濃度，或3.9mg/mL至4.1mg/mL的濃度。特定而言，融合蛋白二聚體的濃度可為4.0mg/mL。
另外，緩衝液可為組胺酸緩衝液。在此，組胺酸的濃度可為10mM至30mM。另外，組胺酸可以具有10mM至28mM的濃度、10mM至26mM的濃度、10mM至24mM的濃度、10mM至22mM的濃度、10mM至21mM的濃度、12mM至28mM的濃度、12mM至26mM的濃度、12mM至24mM的濃度、12mM至22mM的濃度、12mM至21mM的濃度、14mM至28mM的濃度、14mM至26mM的濃度、14mM至24mM的濃度、14mM至22mM 的濃度、14mM至21mM的濃度、16mM至28mM的濃度、16mM至26mM的濃度、16mM至24mM的濃度、16mM至22mM的濃度、16mM至21mM的濃度、18mM至28mM的濃度、18mM至26mM的濃度、18mM至24mM的濃度、18mM至22mM的濃度、18mM至21mM的濃度、19mM至28mM的濃度、19mM至26mM的濃度、19mM至24mM的濃度、19mM至22mM的濃度，或19mM至21mM的濃度。特定而言，組胺酸的濃度可為20mM。
另外，醫藥調配物的pH可為6.5至7.5。另外，醫藥調配物之pH可為6.5至7.3、6.5至7.2、6.5至7.1、6.7至7.3、6.7至7.2、6.7至7.1、6.8至7.3、6.8至7.2、6.8至7.1、6.9至7.3、6.9至7.2，或6.9至7.1。醫藥調配物之pH較佳可為7.0。
另外，醫藥調配物中的界面活性劑可以包括選自由以下組成之群的任一者：聚山梨醇酯(例如：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯28、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81及聚山梨醇酯85)；泊洛沙姆(poloxamer)(例如：泊洛沙姆181、泊洛沙姆188及泊洛沙姆407)；聚乙二醇(PEG)；以及其組合。醫藥調配物較佳可以包括二種界面活性劑。
另外，調配物中可包括濃度為0.065w/w%至0.2w/w%的界面活性劑。另外，調配物中可包括濃度為0.155w/w%至0.185w/w%的界面活性劑。在一個實施例中，界面活性劑可為泊洛沙姆188。在此，調配物中可包括濃度為0.065w/w%至0.075w/w%的界面活性劑。另外，在一個實施例中，界面活性劑可為聚山梨醇酯80。在此，調配物中可包括濃度為約0.09w/w%至約0.11w/w%的界面活性劑。較佳地，調配物中可包括泊洛沙姆188及聚山梨醇酯80，且其可分別以0.065w/w%至0.075w/w%的濃度及0.09w/w%至約0.11w/w%的濃度包括在內。特定而言，調配物中可包括濃度分別為0.07w/w%及0.1w/w%的泊洛沙姆188及聚山梨醇酯80。
另外，醫藥調配物可以進一步包含胺基酸。胺基酸可為選自由以下組成之群的任一者：精胺酸、組胺酸、離胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、半胱胺酸、硒半胱胺酸、甘胺酸、脯胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸。
在此，胺基酸的濃度可為10mg/mL至30mg/mL。另外，胺基酸可以具有10mg/mL至25mg/mL的濃度、10mg/mL至20mg/mL的濃度、10mg/mL至18mg/mL的濃度、10mg/mL至16mg/mL的濃度、12mg/mL至25mg/mL的濃度、12mg/mL至20mg/mL的濃度、12mg/mL至18mg/mL的濃度、12mg/mL至16mg/mL的濃度、14mg/mL至25mg/mL的濃度、14mg/mL至20mg/mL的濃度、14mg/mL至18mg/mL的濃度，或14mg/mL至16mg/mL的濃度。特定而言，胺基酸的濃度可為15mg/mL。
在一個實施例中，胺基酸可為精胺酸，且較佳可為精胺酸-HCl。在此，精胺酸可以14mg/mL至16mg/mL的濃度包括在內，且較佳可以15mg/mL的濃度包括在內。
另外，醫藥調配物可以進一步包含糖。糖可為選自由以下組成之群的任一者：蔗糖、山梨糖醇、丙三醇、海藻糖及甘露糖醇。在此，糖可以120mg/mL至180mg/mL的濃度包括在內。
另外，糖可以具有120mg/mL至170mg/mL的濃度、120mg/mL至160mg/mL的濃度、120mg/mL至155mg/mL的濃度、130mg/mL至170mg/mL的濃度、130mg/mL至160mg/mL的濃度、130mg/mL至155mg/mL的濃度、135mg/mL至170mg/mL的濃度、135mg/mL至160mg/mL的濃度、135mg/mL至155mg/mL的濃度、140mg/mL至170mg/mL的濃度、140mg/mL至160mg/mL的濃度、140mg/mL至155mg/mL的濃度、145mg/mL至170mg/mL的濃度、145mg/mL至160mg/mL的濃度，或145mg/mL至155mg/mL的濃度。
在一個實施例中，糖可為蔗糖，且蔗糖的濃度可為150mg/mL。
在本發明的一個實施例中，醫藥調配物可以包含：(i)包含IL-2蛋白及CD80蛋白、濃度為3.0mg/mL至5.0mg/mL的融合蛋白二聚體；(ii)濃度為10mM至30mM的組胺酸；(iii)濃度為0.065w/w%至0.075w/w%的泊洛沙姆188；(iv)濃度為0.09w/w%至0.11w/w%的聚山梨醇酯80；(v)濃度為10mg/mL至30mg/mL的精胺酸；以及(vi)濃度為120mg/mL至180mg/mL的蔗糖，其中醫藥調配物之pH可為6.5至7.5。
醫藥調配物可以儲存於選自由以下組成之群的容器中：小瓶、藥筒、注射器及自動注射器。
另外，儲存調配物的容器可以在室溫下、在2℃至8℃下或在25℃至40℃下儲存，直至投予需要治療之個體。
個體可為哺乳動物，諸如人類、犬、牛、馬、豬、綿羊、山羊、貓、小鼠、兔及大鼠，且較佳可為人類。
調配物可以藉由非經腸投藥投予，諸如皮下投藥、靜脈內投藥、黏膜投藥、肌肉內投藥或腹膜內投藥，但不限於此。其較佳可靜脈內投予。
用於實施本發明之方式
在下文中，將藉助於以下實例更詳細地描述本發明。然而，以下實例僅用於說明本發明，且本發明之範圍不限於此。
製備實例1. 製備hCD80-Fc-IL-2變異體(2M)：GI-101
為了產生包含人類CD80片段、Fc區域及IL-2變異體的融合蛋白二聚體，經由ThermoFisher Scientific的Invitrogen GeneArt基因合成服務來合成聚核苷酸。特定而言，聚核苷酸含有編碼融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)，該融合蛋白自N端依序含有訊息肽(SEQ ID NO：1)、CD80片段(SEQ ID NO：2)、與連接子結合的Ig鉸鏈(SEQ ID NO：3)、Fc區域(SEQ ID NO：4)、連接子(SEQ ID NO：5)，及具有二個胺基酸取代的IL-2變異體(2M)(R38A、F42A)(SEQ ID NO：6)。將聚核苷酸插入pcDNA3_4載體中。另外，將載體引入CHO細胞(Expi-CHOTM)中以表現SEQ ID NO：9之融合蛋白。載體引入之後，在37℃、125RPM及8%CO2之條件下培養7天。接著收集培養物且自其純化融合蛋白。經純化之融合蛋白稱為「GI-101」。
使用含有MabSelect SuRe蛋白質A樹脂的層析進行純化。融合蛋白在25mM Tris及25mM NaCl及pH 7.4的條件下與其結合。接著使用100mM NaCl及100mM乙酸(pH 3)進行溶離。將pH 9之20% 1M Tris-HCl置於收集管中，且接著收集融合蛋白二聚體。就所收集的融合蛋白二聚體而言，緩衝液經由透析與PBS緩衝液交換16小時。
隨後，隨時間量測280nm波長下的吸光度，使用TSKgel G3000SWXL管柱(TOSOH Bioscience)、經由尺寸排阻層析獲得高度濃縮的融合蛋白二聚體。在此，在還原性(R)或非還原性(NR)條件下對經分離及純化之融合蛋白二聚體進行SDS-PAGE，且用庫馬斯藍(Coomassie Blue)染色以檢查其純度(圖1)。當用NanoDrop檢測時，已鑑別出所含融合蛋白二聚體的濃度為2.78mg/ml(圖2)。另外，使用尺寸排阻層析分析獲得的結果提供於圖3中。
實例1. 最佳緩衝液/pH條件的評價
為了確定含有CD80蛋白與IL-2蛋白之融合蛋白二聚體(GI-101)之液體調配物的最佳緩衝液/pH，篩選總共八種緩衝液/pH。執行穩定性測試(40℃，2週)以選擇最佳緩衝液/pH。
緩衝液/pH篩選樣品在40℃下儲存2週，且接著使用尺寸排阻層析(SEC)分析樣品。為了鑑別GI-101蛋白質的尺寸排阻分佈，使用HPLC(Waters，e2695及Thermo scientific，Ultimate 3000)執行SEC。使用214nm之層析圖計算單體面積%。
在調配物開發期間，SEC分佈用於旨在最大化單體%。緩衝液/pH篩選的穩定性測試結果概述於表1中。含有組胺酸緩衝液pH 7.0的樣品#6展現的變化小於其他樣品。
Figure 110109829-A0305-02-0022-1
基於穩定性測試資料，組胺酸緩衝液pH 7.0確定為GI-101的緩衝液。
Figure 110109829-A0305-02-0022-2
實例2. 賦形劑篩選測試
實例2.1. 賦形劑篩選
為了確定用於含有GI-101之液體調配物的賦形劑，在實例1中所選的緩衝液/pH(組胺酸緩衝液，pH 7.0)條件下執行賦形劑篩選測試。
針對8種不同賦形劑[聚山梨醇酯80、泊洛沙姆188、精胺酸-HCl(L-精胺酸單鹽酸鹽)、L-甲硫胺酸、D-甘露糖醇、山梨糖醇、蔗糖及二水合D-(+)-海藻糖]，藉由在5種不同測試條件下執行而獲得的Tm & Tagg、SEC及目測顆粒測試結果在統計學上加以分析，選擇泊洛沙姆188、精胺酸-HCl及蔗糖作為賦形劑。
[表3]
Figure 110109829-A0305-02-0023-3
實例2.2. 篩選最佳賦形劑濃度
根據實例2.1.，選擇泊洛沙姆188、精胺酸-HCl及蔗糖作為含有GI-101之液體調配物的賦形劑。
藉由改變各種賦形劑的濃度、在16種條件下執行篩選測試，以便找到三種賦形劑組合之最佳濃度。
實例2.2.1. 熱穩定測試(40℃，2週)
十六種賦形劑篩選測試樣品在40℃下儲存2週，且接著經由蛋白質濃度(A280)及SEC測試對樣品加以分析。結果示於表4中。
Figure 110109829-A0305-02-0023-4
實例2.2.2. RSM及模擬結果
使用反應表面模型(RSM)確定各種賦形劑的最佳濃度。藉由調節各種賦形劑的濃度可在預測分析器中發現最佳反應。在藉由預測分析器預測的結果中，將蔗糖濃度設定為150mg/mL之最佳值，其為實驗之最大值。因此，僅精胺酸-HCl及泊洛沙姆188濃度藉由模擬設定。各種賦形劑之預測最佳濃度 範圍顯示於表5中。
Figure 110109829-A0305-02-0024-5
實例2.3. 最終穩定性測試(4週)
基於表5中之各種賦形劑的最佳濃度範圍，得到表6中之最終候選調配物。對表6中之候選調配物進行最終4週穩定性測試。
Figure 110109829-A0305-02-0024-6
在總共五種不同條件下測試候選調配物之穩定性。製備樣品之後立即執行釋放測試(t=0)，且候選樣品分別在5℃(長期條件)、-70℃(長期第二條件)、25℃(加速條件)及40℃(苛刻條件)下儲存4週。特定言之，在40℃穩定性測試(苛刻條件)之情況下，在2週時間點獲取額外樣品以便鑑別變化傾向。在各條件下儲存4週之後，樣品經由SEC、蛋白質濃度(A280)及pH測試加以分析。GI-101候選調配物的最終穩定性測試結果顯示於表7中。
Figure 110109829-A0305-02-0024-7
作為穩定性測試之結果，候選調配物在-70℃、5℃及25℃之條件下展現穩定狀態。根據此結果，GI-101的最終調配物確定為8mg/mL GI-101、20mM組胺酸緩衝液(pH 7.0)、0.07w/w%泊洛沙姆188、15mg/mL精胺酸-HCl及150mg/mL蔗糖。
Figure 110109829-A0305-02-0025-8
實例3. 聚山梨醇酯80添加測試
在使用實例2.3.所確定之候選調配物製備GI-101原料藥的方法中，發現可見顆粒，且另外開發調配物。經鑑別，當存在於原料藥中的聚矽氧藉由物理應力結合至蛋白質而形成聚矽氧-蛋白質複合物時，出現可見顆粒。由於在製備原料藥之方法中對移除聚矽氧或減緩物理應力存在限制，因此為了解決問題，開發新調配物來抑制聚矽氧-蛋白質複合物形成。已報導泊洛沙姆188在抑制聚矽氧-蛋白質複合物形成方面上為效率低下的界面活性劑，且基於此，添加聚山梨醇酯80(PS80)作為界面活性劑來進行實驗。
特定而言，藉由將聚山梨醇酯80根據濃度(0w/w%、0.02w/w%、0.04w/w%、0.06w/w%、0.08w/w%及0.1w/w%)添加至GI-101 DS(4mg/mL的GI-101、20mM組胺酸緩衝液(pH 7.0)、0.07w/w%泊洛沙姆188、15mg/mL精胺酸-HCl及150mg/mL蔗糖)中來進行測試。為了增強長期穩定性，將GI-101濃度調節至4mg/mL。
實例3.1. 可視顆粒觀測
針對各種條件測試三個管中之每一者，且即使僅在三個管之一中觀測到顆粒時，亦將其標記為O(亦即，『顆粒觀測』)(表9)。
Figure 110109829-A0305-02-0025-9
Figure 110109829-A0305-02-0026-10
在添加有0.08w/w%或更多PS80的樣品中，直至第4週才觀測到顆粒。在第3週觀測到顆粒之樣品的情況下，第4週時不進行實驗。
實例3.2. 品質影響的評價
為了研究添加聚山梨醇酯80(PS80)對品質的影響，量測添加有0.1w/w% PS80之樣品的蛋白質濃度、電荷變化及純度。作為觀測添加有0.1w/w% PS80之樣品長達4週的結果，鑑別出品質得以維持。各種條件的量測結果顯示於表10中。
[表10]
Figure 110109829-A0305-02-0027-11
考慮到添加高濃度的PS80有效地減少可見顆粒，因此PS80的濃度確定為0.1w/w%。藉由組合此等結果，確定GI-101的最終調配物組成，如下表11中所示。
Figure 110109829-A0305-02-0027-12
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Figure 12_A0101_SEQ_0055
(無)

Claims (13)

  1. 一種醫藥調配物，其包含：(i)濃度為3.0mg/mL至5.0mg/mL的一融合蛋白二聚體，其包含一IL-2蛋白及一CD80蛋白，其中該融合蛋白二聚體包含兩個單體，每一個單體具有胺基酸序列SEQ ID NO：9、26、28或30；(ii)濃度為10mM至30mM的組胺酸；(iii)濃度為0.155w/w%至0.185w/w%的界面活性劑；(iv)濃度為10mg/mL至30mg/mL的精胺酸；以及(v)濃度為120mg/mL至180mg/mL的蔗糖；其中該調配物的pH為6.5至7.5；其中所述界面活性劑為聚山梨醇酯80與泊洛沙姆188。
  2. 如請求項1之醫藥調配物，其中該融合蛋白二聚體的濃度為3.6mg/mL至4.4mg/mL。
  3. 如請求項1之醫藥調配物，其中該組胺酸的濃度為20mM。
  4. 如請求項1之醫藥調配物，其中該調配物的pH為6.8至7.2。
  5. 如請求項4之醫藥調配物，其中該調配物之pH為7.0。
  6. 如請求項1之醫藥調配物，其中該泊洛沙姆188的濃度為0.065w/w%至0.075w/w%，並且該聚山梨醇酯80的濃度為0.09w/w%至0.11w/w%。
  7. 如請求項1之醫藥調配物，其中該精胺酸之濃度為14mg/mL至16mg/mL。
  8. 如請求項7之醫藥調配物，其中該精胺酸之濃度為15mg/mL。
  9. 如請求項1之醫藥調配物，其中該蔗糖之濃度為140mg/mL 至160mg/mL。
  10. 如請求項9之醫藥調配物，其中該蔗糖之濃度為150mg/mL。
  11. 一種醫藥調配物，其包含：(i)濃度為3.0mg/mL至5.0mg/mL的一融合蛋白二聚體，其包含一IL-2蛋白及一CD80蛋白，其中該融合蛋白二聚體包含兩個單體，每一個單體具有胺基酸序列SEQ ID NO：9、26、28或30；(ii)濃度為10mM至30mM的組胺酸；(iii)濃度為0.065w/w%至0.075w/w%的泊洛沙姆188；(iv)濃度為0.09w/w%至0.11w/w%之聚山梨醇酯80；(v)濃度為10mg/mL至30mg/mL的精胺酸；以及(vi)濃度為120mg/mL至180mg/mL的蔗糖，其中該調配物的pH為6.5至7.5。
  12. 如請求項11之醫藥調配物，其中該調配物係靜脈內投予。
  13. 如請求項11之醫藥調配物，其中該調配物係用於預防或治療癌症或一感染性疾病。
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