TW202200608A - 包含ｉｌ－２蛋白及ｃｄ８０蛋白片段的融合蛋白或其變異體及其用途 - Google Patents

包含ｉｌ－２蛋白及ｃｄ８０蛋白片段的融合蛋白或其變異體及其用途 Download PDF

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Abstract

本發明係關於一種包含經修飾之IL-2蛋白及CD80蛋白片段的融合蛋白二聚體或其變異體。該包含IL-2蛋白及CD80蛋白片段的融合蛋白或其變異體不僅可因IL-2而活化免疫細胞，而且可因CD80而有效地調控Treg細胞。因此，該融合蛋白可有效地攻擊癌細胞，且因此可有效地用於治療癌症或感染性疾病。

Description

包含IL-2蛋白及CD80蛋白片段的融合蛋白或其變異體及其用途
發明領域
本發明係關於一種包含IL-2蛋白及CD80蛋白片段的融合蛋白或其變異體及其用途。特定言之，本發明係關於一種具有免疫增強功效之用於治療癌症之新穎融合蛋白。
發明背景
介白素2 (IL-2)，亦稱為T細胞生長因子(TCGF)，係在淋巴球產生、存活及體內恆定方面起主要作用之球形醣蛋白。IL-2具有15.5 kDa至16 kDa之蛋白質尺寸且由133個胺基酸組成。IL-2藉由結合至由三個不同次單元構成之IL-2受體來介導多種免疫作用。
另外，IL-2主要由活化T細胞合成，特定言之，由CD4+輔助T細胞合成。IL-2刺激T細胞增殖及分化，且誘導細胞毒性T淋巴球(CTL)產生及周邊血液淋巴球分化成細胞毒性細胞及淋巴激素活化的殺手細胞(LAK細胞)。
此外，IL-2涉及B細胞之增殖及分化，促進藉由B細胞之免疫球蛋白合成且刺激自然殺手細胞(NK細胞)之產生、增殖及活化。因此，IL-2用作抗癌劑，原因在於其可增加淋巴球群體且增加活體內免疫細胞功能。目前，IL-2之療法已批准用於患有轉移腎細胞癌及惡性黑色素瘤的患者。
然而，IL-2在免疫反應中的雙重功能在於，其重要作用不僅在於介導免疫細胞數目及其活性增加，而且在於維持免疫耐受性。另外，已報導IL-2在抑制腫瘤生長方面可不為最佳的。原因在於，在IL-2存在下，活化誘導的細胞死亡(AICD)可藉由所產生的細胞毒性T淋巴球進行，且IL-2依賴性調控T細胞(Treg細胞)可抑制免疫反應(Imai等人,Cancer Sci 98, 416-423, 2007)。
另外，已接受使用IL-2之免疫療法的患者出現嚴重的心血管、肺、腎、肝、胃腸、神經元、皮膚、血液及全身性副作用。因此，已研究多種IL-2突變體，以改善IL-2的治療功效且最小化其副作用(US 5,229,109 B)。然而，仍存在許多問題要解決，以便將IL-2用於藥理學目的。
同時，CD80，亦稱為B7-1，是膜結合蛋白之B7家族成員，該等膜結合蛋白藉由結合至其配位體、藉助於遞送共刺激反應及共抑制反應而涉及免疫調節。CD80為表現於T細胞、B細胞、樹突狀細胞及單核球之表面上的跨膜蛋白。已知CD80結合CD28、CTLA4 (CD152)及PD-L1。CD80、CD86、CTLA4及CD28涉及共刺激-共抑制系統。舉例而言，其調控T細胞活性且涉及T細胞之增殖、分化及存活。
舉例而言，當CD80及CD86與CD28相互作用時，產生共刺激信號以活化T細胞。最終，CD80結合至表現於活化T細胞表面上之CTLA4且刺激CTLA4上調。因此，在CD80/CD28相互作用引起免疫反應操作之前，CD80抑制T細胞反應。此反饋環允許免疫反應得到精調。
另外，已知CD80結合PD-L1 (另一種B7家族成員)，此結合的親和力類似於CD28結合PD-L1的親和力。已知PD-L1為程式性死亡-1 (PD-1)蛋白之二種配位體之一，且已知PD-L1涉及T細胞調控。CD80對PD-L1之結合是可阻斷PD-1/PD-L1相互作用的另一種機制，從而可阻止抑制針對腫瘤的T細胞反應。同時，然而，CD80位準增加引起CD80結合至CD28，使得CTLA4經誘導，由此誘導或抑制T細胞反應。
發明概要技術難題
本發明人已研究研發安全且有效之IL-2。因此，本發明人已發現一種在一個分子中包含IL-2蛋白及CD80蛋白片段的新穎融合蛋白或其變異體可活化免疫細胞且有效調節Treg細胞，藉此完成本發明。問題之解決方案
為實現以上目標，在本發明之一個態樣中，提供一種包含IL-2蛋白及CD80蛋白片段或其變異體的融合蛋白。
在本發明之另一個態樣中，提供一種藉由使融合蛋白中之二者結合而獲得的融合蛋白二聚體。
在本發明之又一個態樣中，提供一種編碼融合蛋白之聚核苷酸。
在本發明之再一個態樣中，提供一種包含聚核苷酸之載體。
在本發明之再一個態樣中，提供一種已引入該載體之經轉型細胞。
在本發明之再一個態樣中，提供一種用於預防或治療癌症或感染性疾病之醫藥組合物，其包含融合蛋白或融合蛋白二聚體作為活性成分。
在本發明之再一個態樣中，提供一種融合蛋白之用途，其用於治療癌症或感染性疾病。
在本發明之再一個態樣中，提供一種融合蛋白之用途，其用於製造用於治療癌症或感染性疾病之藥劑。本發明之作用
包含IL-2蛋白及CD80蛋白片段的融合蛋白或其變異體不僅可因IL-2而活化免疫細胞，而且可因CD80而有效地調控Treg細胞。因此，融合蛋白可有效地攻擊癌細胞，且因此可有效地用於治療癌症或感染性疾病。
較佳實施例之詳細說明用於 進行本發明之 最佳模式 包含IL-2 蛋白及CD80 蛋白片段的融合蛋白或其變異體
在本發明之一個態樣中，提供一種包含IL-2蛋白及CD80蛋白片段或其變異體的融合蛋白。IL-2 蛋白
除非另有說明，否則如本文所用，術語「IL-2」或「介白素-2」係指獲自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，例如靈長類動物(諸如人類)及嚙齒動物(諸如小鼠及大鼠))的任何野生型IL-2。IL-2可獲自動物細胞，且亦包括獲自能夠產生IL-2之重組細胞的IL-2。另外，IL-2可為野生型IL-2或其變異體。
在本說明書中，IL-2或其變異體可用術語「IL-2蛋白」或「IL-2多肽」統一表述。IL-2、IL-2蛋白、IL-2多肽及IL-2變異體特異性結合至例如IL-2受體。此特異性結合可藉由熟習此項技術者已知之方法鑑別。
IL-2之一實施例可具有胺基酸序列SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36。在此，IL-2亦可呈成熟形式。特定言之，成熟IL-2可不含有信號序列，且可具有胺基酸序列SEQ ID NO: 10。在此，IL-2可以根據涵蓋野生型IL-2片段之概念使用，其中野生型IL-2之N端或C端的一部分被截斷。
另外，IL-2之片段可呈如下形式：其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個鄰接胺基酸自具有胺基酸序列SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36之蛋白質之N端截斷。另外，IL-2之片段可呈如下形式：其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個鄰接胺基酸自具有胺基酸序列SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36之蛋白質之C端截斷。
如本文所用，術語「IL-2變異體」係指一種形式，其中全長IL-2或IL-2之上述片段中的一部分胺基酸被取代。亦即，IL-2變異體可具有不同於野生型IL-2或其片段的胺基酸序列。然而，IL-2變異體可具有等於或類似於野生型IL-2的活性。在此，「IL-2活性」可以指例如特異性結合至IL-2受體，該特異性結合可藉由熟習此項技術者已知之方法量測。
特定言之，IL-2變異體可以藉由取代野生型IL-2中之一部分胺基酸獲得。藉由胺基酸取代獲得之IL-2變異體的一個實施例可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第38個、第42個、第45個、第61個及第72個胺基酸中的至少一者來獲得。
特定言之，藉由用另一個胺基酸取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第38個、第42個、第45個、第61個或第72個胺基酸中之至少一者可以獲得IL-2變異體。另外，當IL-2呈胺基酸序列SEQ ID NO: 35之N端部分被截斷的形式時，與胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之位置互補對應之位置處的胺基酸可以用另一個胺基酸取代。舉例而言，當IL-2具有胺基酸序列SEQ ID NO: 35時，可以藉由用另一個胺基酸取代胺基酸序列SEQ ID NO: 35中之第58個、第62個、第65個、第81個或第92個胺基酸中之至少一者來獲得其IL-2變異體。此等胺基酸殘基分別對應於胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第38個、第42個、第45個、第61個及第72個胺基酸殘基。根據一個實施例，可以取代一個、二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸，只要此類IL-2變異體維持IL-2活性。根據另一個實施例，可以取代一至五個胺基酸。
在一個實施例中，IL-2變異體可以呈其中二個胺基酸被取代的形式。特定言之，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第38個及第42個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第38個及第45個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第38個及第61個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第38個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第42個及第45個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第42個及第61個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第42個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第45個及第61個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第45個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第61個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。
此外，IL-2變異體可以呈其中三個胺基酸被取代的形式。特定言之，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第38個、第42個及第45個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第38個、第42個及第61個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第38個、第42個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第38個、第45個及第61個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第38個、第45個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第38個、第61及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第42個、第45個及第61個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第42個、第45個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第45個、第61及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。
另外，IL-2變異體可以呈其中四個胺基酸被取代的形式。特定言之，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第38個、第42個、第45個及第61個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第38個、第42個、第45個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第38個、第45個、第61個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第38個、第42個、第61個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。另外，在一個實施例中，可以藉由取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第42個、第45個、第61個及第72個胺基酸來獲得IL-2變異體。
此外，IL-2變異體可以呈其中五個胺基酸被取代的形式。特定言之，可以藉由用另一個胺基酸取代胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第38個、第42個、第45個、第61個及第72個胺基酸中之每一者來獲得IL-2變異體。
在此，藉由取代引入的「另一個胺基酸」可為選自由以下組成之群的至少一者：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸。然而，就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO: 10中，第38個胺基酸不能被精胺酸取代，第42個胺基酸不能被苯丙胺酸取代，第45個胺基酸不能被酪胺酸取代，第61個胺基酸不能被麩胺酸取代，且第72個胺基酸不能被白胺酸取代。
就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO: 10中，第38個胺基酸精胺酸可以被除精胺酸之外的胺基酸取代。較佳地，就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO: 10中，第38個胺基酸精胺酸可以被丙胺酸取代(R38A)。
就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO: 10中，第42個胺基酸苯丙胺酸可以被除苯丙胺酸之外的胺基酸取代。較佳地，就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO: 10中，第42個胺基酸苯丙胺酸可以被丙胺酸取代(F42A)。
就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO: 10中，第45個胺基酸酪胺酸可以被除酪胺酸之外的胺基酸取代。較佳地，就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO: 10中，第45個胺基酸酪胺酸可以被丙胺酸取代(Y45A)。
就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO: 10中，第61個胺基酸麩胺酸可以被除麩胺酸之外的胺基酸取代。較佳地，就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO: 10中，第61個胺基酸麩胺酸可以被精胺酸(E61R)取代。
就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO: 10中，第72個胺基酸白胺酸可以被除白胺酸之外的胺基酸取代。較佳地，就胺基酸取代以獲得IL-2變異體而言，在胺基酸序列SEQ ID NO: 10中，第72個胺基酸白胺酸可以被甘胺酸取代(L72G)。
特定言之，IL-2變異體可以藉由在胺基酸序列SEQ ID NO: 10中達成至少一種選自由以下組成之群的取代而獲得：R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G。
特定言之，IL-2變異體可以藉由在選自由以下組成之群之位置中之二個、三個、四個或五個位置達成胺基酸取代來獲得：R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G。
另外，IL-2變異體可以呈其中二個胺基酸被取代的形式。特定言之，IL-2變異體可以藉由取代R38A及F42A獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代R38A及Y45A獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代R38A及E61R獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代R38A及L72G獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代F42A及Y45A獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代F42A及E61R獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代F42A及L72G獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代E61R及L72G獲得。
此外，IL-2變異體可以呈其中三個胺基酸被取代的形式。特定言之，IL-2變異體可以藉由取代R38A、F42A及Y45A獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代R38A、F42A及E61R獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代R38A、F42A及L72G獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代R38A、Y45A及E61R獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代R38A、Y45A及L72G獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代F42A、Y45A及E61R獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代F42A、Y45A及L72G獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代F42A、E61R及L72G獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代Y45A、E61R及L72G獲得。
另外，IL-2變異體可以呈其中四個胺基酸被取代的形式。特定言之，IL-2變異體可以藉由取代R38A、F42A、Y45A及E61R獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代R38A、F42A、Y45A及L72G獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代R38A、F42A、E61R及L72G獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代R38A、Y45A、E61R及L72G獲得。另外，在一個實施例中，IL-2變異體可以藉由取代F42A、Y45A、E61R及L72G獲得。
此外，IL-2變異體可以藉由取代R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G獲得。
較佳地，IL-2變異體之一實施例可以在胺基酸序列SEQ ID NO: 10中含有選自以下取代組合(a)至(d)的任一者： (a) R38A/F42A (b) R38A/F42A/Y45A (c) R38A/F42A/E61R (d) R38A/F42A/L72G
在此，當IL-2具有胺基酸序列SEQ ID NO: 35時，胺基酸取代可以存在於與胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之位置互補對應的位置處。另外，即使當IL-2為胺基酸序列SEQ ID NO: 35之片段時，胺基酸取代亦可存在於與胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之位置互補對應的位置處。
特定言之，IL-2變異體可以具有胺基酸序列SEQ ID NO: 6、22、23或24。
另外，IL-2變異體的特徵可為活體內低毒性。在此，活體內低毒性可為IL-2結合至IL-2受體α鏈(IL-2Rα)所引起的副作用。為了改善IL-2結合至IL-2Rα所引起的副作用，已開發出多種IL-2變異體，且此類IL-2變異體可為美國專利第5,229,109號及韓國專利第1667096號中所揭露之彼等變異體。特定言之，本申請案中所述的IL-2變異體對IL-2受體α鏈(IL-2Rα)具有弱結合能力且因此活體內毒性低於野生型IL-2。CD80 蛋白片段或其變異體
如本文所用，術語「CD80」，亦稱為「B7-1」，係存在於樹突狀細胞、活化B細胞及單核球中的膜蛋白。CD80提供共刺激信號為T細胞活化及存活必不可少的。CD80已知為存在於T細胞表面上之二種不同蛋白質CD28及CTLA-4的配位體。CD80係由288個胺基酸構成，且尤其可具有胺基酸序列SEQ ID NO: 11。另外，如本文所用，術語「CD80蛋白」係指全長CD80或CD80片段。
如本文所用，術語「CD80片段」係指CD80的分裂形式。另外，CD80片段可為CD80胞外區域。CD80片段之一實施例可藉由自N端排除第1個至第34個胺基酸來獲得，該等胺基酸為CD80之信號序列。特定言之，CD80片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第35個至第288個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第35個至第242個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第35個至第232個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第35個至第139個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第142個至第242個胺基酸組成的蛋白質。在一個實施例中，CD80片段可以具有胺基酸序列SEQ ID NO: 2。
另外，CD80蛋白片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第35個至第231個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80蛋白片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第35個至第224個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80蛋白片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第35個至第219個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80蛋白片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第35個至第211個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80蛋白片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第35個至第208個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80蛋白片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第35個至第196個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80蛋白片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第35個至第192個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80蛋白片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第35個至第184個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80蛋白片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第35個至第145個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80蛋白片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第41個至第145個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80蛋白片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第46個至第145個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80蛋白片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第55個至第145個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80蛋白片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第61個至第145個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80蛋白片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第61個至第138個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80蛋白片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第78個至第145個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80蛋白片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第61個至第84個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80蛋白片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第61個至第77個胺基酸組成的蛋白質。另外，CD80蛋白片段之一實施例可為由SEQ ID NO: 11中之第112個至第138個胺基酸組成的蛋白質。
另外，CD80蛋白片段之變異體可為包括IgV區域或其片段、IgC區域或其片段或二者之變異CD80多肽。特定言之，CD80蛋白質片段之變異體意謂構成其之胺基酸中之一或多者已被另一胺基酸取代。特定言之，在SEQ ID NO: 2之胺基酸中，在位置4、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、24、25、27、28、29、30、31、33、36、37、38、40、41、42、43、44、47、48、50、52、53、54、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、72、74、76、77、80、81、83、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99、102、103、104、107、108、109、110、114、115、116、117、118、120、121、122、126、127、128、129、130、133、137、140、142、143、144、148、149、152、154、160、162、164、168、169、174、175、177、178、183、185、188、190、192、193或199處之胺基酸可以被另一胺基酸取代。
特定言之，CD80蛋白片段之變異體一或多個胺基酸取代可為V4M、K9E、E10R、V11S、A12G、A12T、A12V、T13N、L14A、S15V、S15F、C16S、C16G、C16L、G17W、H18L、H18R、H18Y、V20L、S21P、V22A、E24G、L25P、Q27R、T28A、T28S、R29C、R29D、R29H、R29V、I30V、Y31F、Y31H、Y31L、Q33H、K36E、K36G、K37E、K37Q、M38I、M38L、M38T、M38V、L40M、T41A、T41G、T41D、T41I、M42T、M43I、M43Q、M43R、M43V、S44P、M47T、N48D、N48I、W50G、E52G、Y53C、K54M、F59L、F59S、D60V、I61N、T62S、N63S、N64S、L65H、S66H、I67F、I67T、V68A、V68M、I69T、L70Q、L70P、L70R、L72P、P74L、D76G、E77G、E77K、Y80N、E81A、E81R、E81V、V83A、V83I、L85I、L85R、K86E、Y87N、E88D、E88G、K89E、K89N、K89R、D90K、D90L、D90N、A91E、A91G、A91S、A91T、F92L、F92N、F92P、F92Y、K93I、K93E、K93Q、K93R、K93V、R94G、R94L、R94F、E95K、H96R、L97R、E99D、E99G、L102S、S103L、S103P、V104A、V104L、D107N、F108L、P109S、P109H、T110A、S114T、D115G、F116S、F116L、E117V、E117G、I118V、I118A、I118T、T120S、S121P、N122S、I126L、I126V、I127T、C128Y、C128R、S129L、S129P、T130A、G133D、P137L、S140T、L142S、E143G、N144D、N144S、L148S、N149D、N149S、N152T、T154I、T154A、E160G、E162G、Y164H、S168G、K169E、K169I、K169S、M174T、M174V、T175A、N177S、H178R、L183H、K185E、H188D、H188Q、R190S、N192D、Q193L、T199S或其保守胺基酸取代。
更特定言之，經取代之變異體可為V4M/L70Q/A91G/T120S/T130A、A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T、A12V/S15F/Y31H/T41G/T130A/P137L/N152T、V20L/L70Q/A91S/T120S/T130A, V22A/L70Q/S121P、E24G/L25P/L70Q/T120S, T28S/L70Q /A91G/E95K/ T120S/T130A、E24G/R29D/ Y31L/Q33H/ K36G/M38I/T41A/ M43R/M47T/ F59L/ E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/H96R、R29D/Y31L/ Q33H/ K36G/ M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S、R29D/Y31L/ Q33H/K36G/ M38I/T41A/M43R/ M47T/E81V/L85R/K89N/ A91T/F92P/K93V/R94L/N149S、R29D/Y31L/ Q33H/K36G/M38I/T41A/ M43R/ M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S、R29D/ Y31L/ Q33H/K36G/ M38I/T41A/M43R/ M47T/E81V/L85R/ K89N/A91T/F92P/ K93V/ R94L/N144S/N149S、R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S、R29H/E52G/L70R/E88G/A91G/T130A、R29H/E52G/T120S/T130A、R29V/ Y31F/ K36G/M38L/M43Q/E81R/V83I/L85I/K89R/D90L/A91E/F92N/K93Q/R94G、R29V/ M43Q/E81R/L85I/K89R/D90L/A91E/F92N/K93Q/R94G、Y31H/ T41G/L70Q/ A91G/T120S/T130A、K36G、K36G/K37Q/M38I/L40M、K36G/K37Q/ M38I/F59L/ E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/E99G/T130A/N149S、K36E/I67T/ L70Q/A91G/T120S/T130A/N152T、K37E/F59S/ L70Q/A91G/T120S/T130A、M38T/ L70Q/E77G/A91G/T120S/T130A/N152T、M38V/T41D/M43I/ W50G/D76G/V83A /K89E/T120S/T130A、T41I/A91G、S44P/L70Q/A91G/T130A、E52G/L70Q/A91G/ T120S/T130A、K54M/A91G/T120S、D60V/A91G/T120S/T130A、N63S/L70Q/ A91G/T120S/T130A、S66H/D90G/T110A/F116L、I67F/L70R/E88G/ A91G/T120S/T 130A、I67T/L70Q/A91G/T120S、V68A/T110A、V68M/L70P/L72P/K86E、L70Q/ A91G/T110A/T120S/T130A、L70Q/E81A/A91G/T120S/I127T/T130A、L70Q/Y87N/ A91G/T130A、L70Q/A91G、L70Q/A91G/E117G/T120S/T130A、L70Q/A91G/ T120S/T130A、L70Q/A91G/T130A、L70Q/A91G/I118A/T20S/T130A、L70R/ A91G/ T120S/T130A、E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R、K89E/T130A、K89R/D90K/ A91G/F92Y/K93R、E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S、K89R/ D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S、A91G、A91G/F92L/F108L/T120S、A91G/ L102S、A91G/S103P、A91G/T120S/T130A、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/ 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T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E/M174T、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/N48D/F59L/ E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D、H18R/R29D/Y31L/Q33H/K36G/K37E/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E/H188D、R29D/Y31L/ Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/E143G/K169E/M174V/H188D、R29D/I30V/ Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/ M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/ K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/K169E、R29D/Y31L/ Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/ L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/K169E/H188D、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/F108L/I118V/T120S/T130A/K169E/H188D、R29D/Y31L/Q33H/K36G/ M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/N149D/K169E/H188D、H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/ M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E/H188D、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/ K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/C128Y/T130A/H188D、H18L/ R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/E99D/T130A、H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/ M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/I61N/E81V/L85R/K89N/ A91T/F92P/K93V/R94F/V104A/I118V/T120S/I126V/T130A、R29D/Y31L/Q33H/ K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/I118V/T120S/T130A、H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/ L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/L142S/H188D、C16S/H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T110A/I118V/H188D、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/ T41A/M43R/M47T/A91G/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D、R29D/Y31L/Q33H/ K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/D76G/A91G/S103L/I118V/T120S/I127T/T130A、Y53C/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/ K169E、T62S/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/ K169E、Y53C/L70Q/D90G/T130A/N149D/N152T/H188D、H18L/R29D/Y31L/ Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D或H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/ M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/N149S。
另外，CD80變異體之實施例可為選自由以下各者組成之群中的任一者：A12T、H18L、V20L、R29H、Y31H、K36G、T41G、T41I、M43V、E52G、F59L、D60V、N63S、I67T、L70Q、L70R、E77K、E81A、Y87N、E88D、E88G、K89E、K89R、D90K、D90N、L40M、A91G、A91S、F92Y、K93R、D107N、P109S、S114T、E117G、I118A、I118T、I118V、T120S、I127T、T130A、N144D、K169E、N177S及T199S，及其保守胺基酸取代。
特定言之，變異體之一或多個胺基酸取代可為A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T、V20L/L70Q/A91S/T120S/T130A、V20L/L70Q/A91S/I118V/T120S/T130A、R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/ D90N/A91G/P109S、K36G, K36G/L40M、T41I/A91G、E52G/L70/A91G/T120S/ T130A、E52G/L70Q/A91G/D107N/I118V/T120S/T130A/K169E、D60V/A91G/ T120S/T130A、D60V/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E、N63S/L70Q/A91G/ T120S/T130A、N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V/T120S/T130A、I67T/L70Q/A91G/ T120S、I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S、L70Q/E81A/A91G/T120S/I127T/T130A、L70Q/E81A/A91G/I118V/T120S/I127T/T130A、L70Q/Y87N/A91G/T130A、L70Q/ A91G、L70Q/A91G/N144D、L70Q/A91G/E117G/T120S/T130A、L70Q/A91G/ E117G/I118V/T120S/T130A、L70Q/A91G/I118A/T120S/T130A、L70Q/A91G/ I118A/T120S/T130A/K169E、L70Q/A91G/T120S/T130A、L70R/A91G/T120S/ T130A、L70R/A91G/I118V/T120S/T130A/T199SL70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/ K169E、E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R、K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R、E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S或K89R/D90K/A91G/F92Y/ K93R/N122S/N177S。
另外，CD80變異體之一或多個胺基酸取代可選自由以下組成之群：A12G、A12T、H18L、S21P、V22A、T28A、R29D、R29H、Y31H、Y31L、Q33H、K36G、M38I、M38L、L40M、T41A、T41G、M42T、M43R、M43V、M47T、N48I、F59L、N64S、I67T、V68A、V68M、L70Q、E77K、E81V、L85R、Y87N、E88D、E88G、K89E、K89N、K89R、D90K、D90N、A91G、A91T、F92P、F92Y、K93E、K93V、R94F、R94L、L97R、S103L、S103P、V104L、P109H、P109S、D115G、E117V、I118T、I118V、T120S、N122S、I126L、T130A、G133D、S140T、N144S、L148S、N149S、S168G、K169I、K169S、N177S、L183H、H188Q、R190S及Q193L，及其保守胺基酸取代。
特定言之，CD80變異體之一或多個胺基酸取代可為A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/ T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/ M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S, R29D/Y31L/ Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S、R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S、K36G、K36G /L40M、I67T/L70Q/A91G/T120S、I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S、E88D/K89R/ D90K/A91G/F92Y/K93R、K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R、A91G、R29D/Y31L/ Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/ K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/ T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/ F92P/K93V/R94L/N149S、R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/ P109S、K36G、K36G/L40M、I67T/L70Q/A91G/T120S、I67T/L70Q/A91G/I118V/ T120S、E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R、K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R、A91G、H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/ K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D、R29D/Y31L/ Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/N149S/R190S、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/ E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/E117V/I118T/N149S/S168G/H188Q、V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/ M47T/N64S/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/I118T/T130A/N149S/K169I、V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/ K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/D115G/I118T/T130A/G133D/N149S、T28A/R29D/ Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/V104L/T130A/N149S、H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/ M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L97R/N149S/H188Q、K89E/ T130A、K89E/K93E/T130A、S21P/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/ M47T/N48I/V68A/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/S21P/N48I/V68A/P109H/I126L/K169I、H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/ V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A、H18L/R29D/Y31L/ Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/N149S、A12G/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68A/ E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L97R/T130A/L183H、R29D/Y31L/ Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/S140T/N149S/K169S、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/ M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S/K169I/Q193L、V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/ A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/ T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/ F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S/K169I或R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/ T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/T130A/N149S/K169I。
另外，CD80變異體之一或多個胺基酸取代可選自由以下組成之群：A12T、H18L、K36G、L40M、M43V、F59L、E77K、E88D、K89R、D90K、A91G、F92Y、K93R、P109S、I118T、N112S、N177S及其保守胺基酸取代。
Specifically, one or more amino acid substitutions of the CD80 variant may be A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T、K36G、K36G/L40M、E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R、K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R、E88D/ K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S或K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/ N122S/N177S。
另外，CD80變異體之一或多個胺基酸取代可選自由以下組成之群：V4M、R29H、Y31H、K36G、L40M、T41G、E52G、I67T、V68A、L70Q、Y87N、E88D、E88G、K89E、K89R、D90K、D90N、A91G、F92Y、K93R、D107N、P109S、T110A、I118V、T120S、T130A、N144D及K169E，及其保守胺基酸取代。
特定言之，CD80變異體之一或多個胺基酸取代可為V4M/L70Q/A91G/T120S/T130A、V4M/L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E、R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S、K36G、K36G/L40M, E52G/L70Q/A91G/T120S/T130A、E52G/L70Q/A91G/D107N/I118V/T120S/T130A/ K169E、I67T/L70Q/A91G/T120S、I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S,V68A/T110A、L70Q/A91G、L70Q/A91G/N144D、L70Q/A91G/T120S/T130A、L70Q/A91G/I118V/ T120S/T130A/K169E、L70Q/A91G/T130A、K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R、E88D/ K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R、A91G/I118V/T120S/T130A、A91G/T120S/T130A或I69T/L70Q/A91G/T120S。
另外，CD80變異體之一或多個胺基酸取代可選自由以下組成之群：K36G、L40M、E52G、L70Q、E88D、K89R、D90K、A91G、F92Y、K93R、D107N、I118V、T120S、T130A、N144D及K169E，及其保守胺基酸取代。
特定言之，CD80變異體之一或多個胺基酸取代可為K36G、K36G/L40M、E52G/L70Q/A91G/T120S/T130A、E52G/L70Q/A91G/D107N/I118V/ T120S/T130A/K169E、L70Q/A91G、L70Q/A91G/N144D、L70Q/A91G/T120S/ T130A、L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E、E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/ K93R或K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R。
另外，CD80變異體之一或多個胺基酸取代可選自由以下組成之群：R29H、Y31H、K36G、L40M、T41G、I67T、L70Q、Y87N E88D、E88G、K89E、K89R、D90N、D90K、A91G、F92Y、K93R、P109S、I118V、T120S及其保守胺基酸取代。
特定言之，CD80變異體之一或多個胺基酸取代可為R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S、K36G、K36G/L40M、I67T/L70Q/A91G/T120S、I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S、E88D/K89R/D90K/ A91G/F92Y/K93R或K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R。
另外，CD80變異體之一或多個胺基酸取代可選自由以下組成之群：K36G、L40M、E88D、K89R、D90K、A91G、F92Y、K93R及其保守胺基酸取代。
特定言之，CD80變異體之一或多個胺基酸取代可為K36G、K36G/L40ME88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R或K89R/D90K/A91G/F92Y/ K93R。
另外，CD80變異體之一或多個胺基酸取代可選自由以下組成之群：R29D、R29H、Y31H、Y31L、Q33H、K36G、M38I、T41A、T41G、M42T、M43R、M47T、N63S、I67T、L70Q、E81A、E81V、L85R、Y87N、E88G、K89E、K89N、D90N、A91G、A91T、F92P、K93V、R94L、P109S、S114T、I118T、I118V、T120S、I127T、T130A、N144S、L148S及N149S，及其保守胺基酸取代。
特定言之，CD80變異體之一或多個胺基酸取代可為N63S/L70Q/A91G/T120S/T130A、N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V/T120S/T130A或L70Q/Y87N/A91G/T120S/I127T/T130A。
另外，CD80變異體之一或多個胺基酸取代可選自由以下組成之群：N63S、L70Q、E81A、Y87N、A91G、S114T、I118V、T120S、I127T及T130A，及其保守胺基酸取代。
特定言之，CD80變異體之一或多個胺基酸取代可為R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/ M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S、R29D/Y31L/ Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/ K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S、R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/ D90N/A91G/P109S、N63S/L70Q/A91G/T120S/T130A、N63S/L70Q/A91G/S114T/ I118V/T120S/T130A、I67T/L70Q/A91G/T120S、I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S或L70Q/Y87N/A91G/T120S/I127T/T130A。
另外，CD80變異體之一或多個胺基酸取代可選自由以下組成之群：R29D、R29H、Y31H、Y31L、Q33H、K36G、M38I、T41A、T41G、M42T、M43R、M47T、I67T、L70Q、E81V、L85R、Y87N、E88G、K89E K89N、D90N、A91G、A91T、F92P、K93V、R94L、P109S、I118T、I118V、T120S、N144S、L148S及N149S，及其保守胺基酸取代。
特定言之，CD80變異體之一或多個胺基酸取代可為R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/ M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S、R29D/Y31L/ Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/ K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S、R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/ D90N/A91G/P109S、I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S或I67T/L70Q/A91G/T120S。
另外，CD80變異體之一或多個胺基酸取代可選自由以下組成之群：L70Q、Y87N、A91G及T120S，及其保守胺基酸取代。
在CD80變異體之一個實施例中，CD80蛋白片段之變異體為其中至少一個胺基酸被另一胺基酸取代之變異體。特定言之，CD80蛋白片段之變異體可為選自由以下組成之群的任一者：K89E/T130A、K89E/K93E/T130A、H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L97R/T130A/N149S、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/ M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/A12G/V68A/L97R/T130A/L183H、A12G/H18L/V22A/N64S/V68M/T130A及A12G/H18L/V22A/N64S/ V68M/T130A。
另外，IL-2蛋白與CD80蛋白可以經由連接子或攜載體彼此連接。特定言之，IL-2或其變異體與CD80 (B7-1)或其片段可以經由連接子或載體彼此連接。在本說明書中，連接子與攜載體可互換使用。
連接子連接二種蛋白質。連接子之一實施例可以包括1至50個胺基酸、白蛋白或其片段、免疫球蛋白之Fc區域，或其類似物。在此，免疫球蛋白之Fc區域係指一種蛋白質含有免疫球蛋白之重鏈恆定區2 (CH2)及重鏈恆定區3 (CH3)，且不含有免疫球蛋白之重鏈及輕鏈可變區及輕鏈恆定區1 (CH1)。免疫球蛋白可為IgG、IgA、IgE、IgD或IgM，且較佳可為IgG4。在此，野生型免疫球蛋白G4之Fc區域可以具有胺基酸序列SEQ ID NO: 4。
另外，免疫球蛋白之Fc區域可為Fc區域變異體以及野生型Fc區域。另外，如本文所用，術語「Fc區域變異體」可以指在糖基化模式方面不同於野生型Fc區域、糖基化高於野生型Fc區域或糖基化低於野生型Fc區域的形式；或去糖基化形式。另外，其中包括去糖基化Fc區域。Fc區域或其變異體可以經由培養條件或宿主基因操控加以調適以具有經調整之數目個唾液酸、岩藻糖基化，或糖基化。
另外，可以藉由習知方法(諸如化學方法、酶方法，及使用微生物的基因工程方法)修改免疫球蛋白Fc區域的糖基化。另外，Fc區域變異體可呈免疫球蛋白IgG、IgA、IgE、IgD及IgM之各別Fc區的混合形式。另外，Fc區域變異體可以呈其中Fc區域之一些胺基酸被其他胺基酸取代的形式。Fc區域變異體之一實施例可以具有胺基酸序列SEQ ID NO: 12。
融合蛋白可以具有如下結構：其中使用Fc區域作為連接子(或攜載體)，將CD80蛋白與IL-2蛋白或IL-2蛋白與CD80蛋白分別連接至連接子或攜載體的N端及C端。Fc區域與CD80或IL-2之N端或C端之間的鍵聯可以任擇地藉由連接肽達成。
特定言之，融合蛋白可以由以下結構式(I)或(II)組成： N'-X-[連接子(1)]n -Fc區域-[連接子(2)]m -Y-C'  (I) N'-Y-[連接子(1)]n -Fc區域-[連接子(2)]m -X-C'  (II) 此處，在該等結構式(I)及(II)中， N'為該融合蛋白之N端， C'為該融合蛋白之C端， X為CD80蛋白， Y為IL-2蛋白， 該等連接子(1)及(2)為肽連接子，及 n及m各自獨立地為0或1。
較佳地，融合蛋白可以由結構式(I)組成。IL-2蛋白如上文所述。另外，CD80片段或其變異體如上文所述。根據一個實施例，IL-2蛋白可為相較於野生型IL-2具有一至五個胺基酸取代的IL-2變異體。CD80片段或其變異體可為藉由自野生型CD80之N端或C端截斷至多約34個鄰接胺基酸殘基而獲得的片段。或者，CD80蛋白可為具有結合至T細胞表面受體CTLA-4及CD28之活性的胞外免疫球蛋白樣區域。另外，CD80片段之變異體如上文所述。
特定言之，融合蛋白可以具有胺基酸序列SEQ ID NO: 9、26、28或30。根據另一個實施例，融合蛋白包括與胺基酸序列SEQ ID NO: 9、26、28或30具有85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的多肽。在此，一致性為例如同源性百分比，且可經由同源性比較軟體測定，諸如美國國家生技資訊中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)的BlastN軟體。
肽連接子(1)可納入CD80蛋白與Fc區域之間。肽連接子(1)可以由5至80個鄰接胺基酸、20至60個鄰接胺基酸、25至50個鄰接胺基酸或30至40個鄰接胺基酸組成。在一個實施例中，肽連接子(1)可以由30個胺基酸組成。另外，肽連接子(1)可以含有至少一個半胱胺酸。特定言之，肽連接子(1)可以含有一個、二個或三個半胱胺酸。另外，肽連接子(1)可衍生自免疫球蛋白之鉸鏈。在一個實施例中，肽連接子(1)可為由胺基酸序列SEQ ID NO: 3組成的肽連接子。
肽連接子(2)可以由1至50個鄰接胺基酸、3至30個鄰接胺基酸或5至15個鄰接胺基酸組成。在一個實施例中，肽連接子(2)可為(G4S)n (其中n為整數1至10)。在此，在(G4S)n 中，n可為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一個實施例中，肽連接子(2)可為由胺基酸序列SEQ ID NO: 5組成的肽連接子。
在本發明之另一個態樣中，提供一種由二種融合蛋白結合而獲得的二聚體，該二種融合蛋白各自包含IL-2蛋白及CD80蛋白片段或其變異體。包含IL-2或其變異體及CD80蛋白片段或其變異體之融合蛋白如上文所述。
在此，構成二聚體之融合蛋白之間的結合可以藉由(但不限於)二硫鍵達成，該二硫鍵係由存在於連接子中的半胱胺酸形成。構成二聚體的融合蛋白可為彼此相同或不同的融合蛋白。二聚體較佳可為均二聚體。構成二聚體之融合蛋白之一實施例可為具有胺基酸序列SEQ ID NO: 9的蛋白質。編碼融合蛋白之聚核苷酸
在本發明之又一個態樣中，提供一種聚核苷酸，其編碼包含IL-2蛋白及CD80蛋白片段或其變異體的融合蛋白。包含IL-2蛋白及CD80蛋白片段或其變異體之融合蛋白如上文所述。在聚核苷酸中，一或多個核苷酸可藉由取代、缺失、插入或其組合改變。當藉由化學合成製備核苷酸序列時，可使用此項技術中熟知之合成方法，諸如Engels及Uhlmann (Angew Chem IntEd Eng., 37: 73-127, 1988))中所述之彼等方法。此類方法可包括三酯、亞磷酸酯、胺基亞磷酸酯及H-磷酸鹽方法、PCR及其他自引子方法、固體載體上之寡核苷酸合成及其類似方法。
聚核苷酸可進一步含有編碼信號序列或前導序列之核酸。如本文所用，術語「信號序列」係指引導靶蛋白之分泌的信號肽。信號肽在宿主細胞中轉譯且隨後裂解。特定言之，信號序列為引發蛋白質跨越內質網(ER)膜之遷移的胺基酸序列。在一個實施例中，信號序列可具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1。
信號序列因其特徵而為此項技術中所熟知。此類信號序列通常含有16至30個胺基酸殘基，且可含有比此類胺基酸殘基更多或更少的胺基酸殘基。習知信號肽係由三個區組成：即鹼性N端區、中心疏水區及較極性之C端區。中心疏水區含有4至12個疏水性殘基，其在不成熟多肽之遷移期間經由膜脂質雙層固定信號序列。
在起始之後，信號序列在ER之內腔中藉由通常稱為信號肽酶之細胞酶裂解。在此，信號序列可為tPa (組織纖維蛋白溶酶原活化因子)、HSV gD (單純疱疹病毒醣蛋白D之信號序列)或生長激素之分泌信號序列。較佳地，可使用包括哺乳動物及其類似物之高級真核細胞中所用的分泌信號序列。另外，可使用包括於野生型IL-2及/或CD80中之信號序列，或可使用已經被在宿主細胞中具有高表現頻率之密碼子取代的信號序列。具有編碼融合蛋白之聚核苷酸的載體
在本發明之再一個態樣中，提供一種包含聚核苷酸之載體。
載體可引入宿主細胞中以與宿主細胞之基因體重組且插入宿主細胞之基因體中。另外，載體理解為含有作為游離基因體自主複製之聚核苷酸序列的核酸。載體包括線性核酸、質體、噬質體、黏質體、RNA載體、病毒載體及其類似物。病毒載體之實例包括(但不限於)反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒。
特定言之，載體可包括質體DNA、噬菌體DNA及其類似物；及商業上研發之質體(pUC18、pBAD、pIDTSAMRT-AMP及其類似物)、大腸桿菌衍生之質體（E. coli -derived plasmids） (pYG601BR322、pBR325、pUC118、pUC119及其類似物)、枯草芽孢桿菌衍生之質體（Bacillus subtilis -derived plasmids） (pUB110、pTP5及其類似物）、酵母菌衍生之質體（YEp13、YEp24、YCp50及其類似物)、噬菌體DNA (Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λ gt10, λ gt11, λ ZAP及其類似物）、動物病毒載體(反轉錄病毒、腺病毒、痘瘡病毒及其類似物）、昆蟲病毒載體（桿狀病毒及其類似物）。因為載體展現不同表現位準及視宿主細胞而定之蛋白質修飾，所以較佳地選擇及使用最適於該目的之宿主細胞。
如本文所用，術語靶蛋白之「基因表現」或「表現」應理解為意謂DNA序列之轉錄、mRNA轉錄物之轉譯及融合蛋白產物或其片段之分泌。適用表現載體可為RcCMV (Invitrogen，Carlsbad)或其變異體。表現載體可進一步含有用於促進哺乳動物細胞中之靶基因之連續轉錄的人類巨細胞病毒(CMV)啟動子，及用於增加轉錄之後的RNA之穩定性位準的牛生長激素聚腺苷酸化信號序列。表現融合蛋白之經轉型細胞
在本發明之再一個態樣中，提供一種已引入該載體之經轉型細胞。用於經轉型細胞之宿主細胞可包括(但不限於)原核細胞、真核細胞及哺乳動物、植物、昆蟲、真菌或細菌來源之細胞。大腸桿菌可用作原核細胞之實例。另外，酵母可用作真核細胞之實例。另外，對於哺乳動物細胞，可使用CHO細胞、F2N細胞、CSO細胞、BHK細胞、波韋氏黑色素瘤細胞（Bowes melanoma cells）、HeLa細胞、911細胞、AT1080細胞、A549細胞、HEK 293細胞、HEK293T細胞或其類似物。然而，哺乳動物細胞不限於此，且可使用熟習此項技術者已知可用作哺乳動物宿主細胞之任何細胞。
另外，對於將表現載體引入宿主細胞中，可使用CaCl2 沈澱、Hanahan法，其功效已藉由使用在CaCl2 沈澱中之諸如二甲亞碸(DMSO)之還原劑、電穿孔、磷酸鈣沈澱、原生質體融合、使用碳化矽纖維之攪動、土壤桿菌（Agrobacterium）介導之轉化、使用PEG、硫酸聚葡萄糖、Lipofectamine-之轉化或乾式/抑制劑介導之轉化或類似者而提高功效。
如上文所描述，為使融合蛋白作為治療劑之特性最佳化或為任何其他目的，融合蛋白之糖基化模式（例如唾液酸、岩藻糖基化、糖基化）可經由熟習此項技術者已知之方法，藉由操控宿主細胞所具有之糖基化相關基因來調節。產生融合蛋白之方法
在本發明之再一個態樣中，提供一種產生融合蛋白之方法，該融合蛋白包含IL-2蛋白及CD80蛋白片段或其變異體，該方法包含培養經轉型細胞。特定言之，生產方法可包含i)培養經轉型細胞以獲得培養物；及ii)自培養物回收融合蛋白。
培養經轉型細胞可使用此項技術中熟知之方法進行。特定言之，培養物可在分批製程中進行或在饋料分批或反覆饋料分批製程中連續進行。融合蛋白或其二聚體之用途
在本發明之再一個態樣中，提供一種用於治療或預防癌症或感染性疾病之醫藥組合物，該組合物包含以下作為活性成分：融合蛋白，其包含IL-2蛋白及CD80蛋白片段或其變異體；或融合蛋白二聚體，其中二個融合蛋白經連接。
包含IL-2蛋白及CD80蛋白片段或其變異體的融合蛋白或其中二個融合蛋白結合的融合蛋白二聚體如上文所述。
癌症可選自由以下組成之群：胃癌、肝癌、肺癌、大腸直腸癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰臟癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、喉癌、急性骨髓性白血病、腦腫瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、頭頸癌、唾液腺癌及淋巴瘤。另外，感染性疾病為選自由以下組成之群的任一者：B型肝炎、C型肝炎、人類乳突狀瘤病毒(HPV)感染、巨細胞病毒感染、病毒性呼吸道疾病及流感。
醫藥組合物之較佳劑量視以下而定：患者的狀況及體重、疾病嚴重度、藥物形式、投與路徑及持續時間，且可由熟習此項技術者適當地選擇。在本發明之用於治療或預防癌症或感染性疾病之醫藥組合物中，視應用、劑型、摻合目的及其類似者而定，活性成分可以任何量(有效量)含有於其中，只要活性成分可展現抗癌活性或對感染性疾病之治療作用即可。按組合物之總重量計，其習知有效量經測定在0.001重量%至20.0重量% (以重量計)範圍內。在此，術語「有效量」係指能夠誘導抗癌效果或感染性疾病治療效果之活性成分的量。熟習此項技術者可在常識範圍內以實驗方式測定此類有效量。
如本文所用，術語「治療」可用於意謂治療性療法與預防性療法二者。在此，預防可用於意謂緩解或減輕個體之病理性病狀或疾病。在一個實施例中，術語「治療」包括用於治療哺乳動物(包括人類)之疾病的應用或任何投與形式二者。另外，術語包括抑制或減緩疾病或疾病惡化；且包括如下含義：恢復或修復受損或消失之功能，使得疾病部分地或完全地緩解；刺激低效製程；或緩解嚴重的疾病。
如本文所用，術語「功效」係指可藉由一或多種參數測定的能力，例如一定時段(諸如一年、五年或十年)的生存率或無疾病生存率。另外，參數可包括抑制個體中之至少一個腫瘤的尺寸。
藥物動力學參數(諸如生物可用性)及基礎參數(諸如清除率)亦可影響功效。因此，「增強之功效」(例如功效改善)可歸因於增強的藥物動力學參數及改善的功效，且可藉由比較測試動物或人類個體中之清除率與腫瘤生長，或藉由比較諸如生存率、復發率或無病生存率之參數來量測。
如本文所用，術語「治療有效量」或「醫藥學上有效的量」係指有效地預防或治療所討論之疾病之化合物或組合物的量，其足以適用於醫學治療之合理益處/風險比治療疾病且不引起副作用。有效量的位準可根據包括以下的因素測定：患者的健康狀況、疾病的類型及嚴重度、藥物活性、患者對藥物的敏感性、投與模式、投與時間、投與途徑及排出速率、治療持續時間、配方或同時使用的藥物，以及醫學領區域中熟知的其他因素。在一個實施例中，治療有效量意謂有效治療癌症之藥物的量。
在此，醫藥組合物可進一步包含醫藥學上可接受之載劑。醫藥學上可接受之載劑可為任何載劑，只要該載劑為適用於遞送至患者之無毒物質即可。蒸餾水、酒精、脂肪、蠟及惰性固體可作為載劑包含在內。醫藥組合物中亦可含有醫藥學上可接受之佐劑(緩衝劑、分散劑)。
特定言之，除活性成分之外，亦可藉由包括醫藥學上可接受之載劑、使用此項技術中已知的習知方法將醫藥組合物製備成非經腸調配物，此可視其投與途徑而定。在此，術語「醫藥學上可接受」意謂與所施用之個體(指定)可適應的毒性相比，載劑不具有更大的毒性，同時不抑制活性成分的活性。
當醫藥組合物被製備成非經腸調配物時，其可根據此項技術中已知之方法、使用適合載劑製備成呈注射劑、經皮貼片、鼻吸入劑或栓劑形式的製劑。在製備成注射劑的情況下，可使用無菌水、乙醇、多元醇(諸如丙三醇或丙二醇)或其混合物作為適合載劑；且較佳地可使用等張溶液，諸如林格氏溶液（Ringer's solution）、含有三乙醇胺的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)，或無菌注射用水，及5%右旋糖，或其類似物。醫藥組合物之配方在此項技術中已知，且可具體地提及Remington's Pharmaceutical Sciences (第19版, 1995)及其類似參考文獻。此文件視為本說明書的一部分。
醫藥組合物的較佳劑量可在每天0.01 μg/kg至10 g/kg或0.01 mg/kg至1 g/kg範圍內，此視患者的狀況、體重、性別、年齡、患者之嚴重度及投藥途徑而定。劑量可一天投與一次或可分成一天若干次。此類劑量在任何態樣中不應解釋為限制本發明之範疇。
可施用(指定)醫藥組合物的個體為哺乳動物及人類，尤其較佳地為人類。除活性成分之外，本申請案之醫藥組合物可進一步含有任何化合物或天然提取物，其已得到安全驗證且已知具有抗癌活性或對感染性疾病具有治療作用，從而增強或強化抗癌活性。
在本發明之再一個態樣中，提供一種包含IL-2蛋白及CD80蛋白片段或其變異體之融合蛋白用於治療癌症或感染性疾病的用途。
在本發明之再一個態樣中，提供一種包含IL-2蛋白及CD80片段或其變異體的融合蛋白用於增強癌症或感染性疾病的治療效果的用途。
在本發明之再一個態樣中，提供一種包含IL-2蛋白及CD80蛋白片段或其變異體之融合蛋白之用於製造治療癌症或感染性疾病的藥劑的用途。
在本發明之再一個態樣中，提供一種用於治療癌症或感染性疾病之方法，及/或一種用於增強癌症或感染性疾病之治療效果的方法，其包含向個體投與包含IL-2蛋白及CD80蛋白片段或其變異體之融合蛋白或其中二個融合融合蛋白連接的融合蛋白二聚體。
該個體可為患有癌症或感染性疾病之個體。另外，個體可為哺乳動物，較佳地為人類。包含IL-2蛋白及CD80蛋白片段或其變異體的融合蛋白或其中二個融合蛋白結合的融合蛋白二聚體如上文所述。
融合蛋白或融合蛋白二聚體的投與途徑、劑量及投與頻率可依據患者的狀況及副作用之存在或不存在而變，且因此，融合蛋白或融合蛋白二聚體可以各種方式及量向個體投與。熟習此項技術者可在適當範圍內選擇最佳投與方法、劑量及投與頻率。另外，融合蛋白或融合蛋白二聚體可與已知對所治療疾病具有治療效果之其他藥物或生理學活性物質組合投與，或可調配成與其他藥物一起之組合調配物形式。
由於IL-2活性，因此在本發明的一個實施例中，融合蛋白可活化免疫細胞，諸如自然殺手細胞。因此，融合蛋白可有效地用於癌症或感染性疾病。特定言之，已鑑定與野生型相比，具有二個至五個胺基酸取代的IL-2變異體，尤其是在選自由胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G組成之群之位置中的二個、三個、四個或五個位置含有胺基酸取代的IL-2變異體，對IL-2受體α鏈具有弱結合能力且相對於習知IL-2的藥理學副作用，因此展現改良的特徵。因此，此類IL-2變異體當單獨或以融合蛋白形式使用時，可降低血管(或毛細血管)滲漏症候群(VLS)之發病率，該症候群為IL-2之習知問題。用於進行本發明之模式
在下文中，將藉助於以下實例更詳細地描述本發明。然而，以下實例僅用於說明本發明，且本發明之範疇不限於此。製備實例1. 製備hCD80 變異體-Fc-IL-2 變異體：GI-101_P1 至GI-101_P35 製備實例 1.1.hCD80 變異體-Fc-IL-2 變異體 表現載體之構造
為了產生包含人類CD80變異體、Fc區域及IL-2變異體的融合蛋白，經由ThermoFisher Scientific的Invitrogen GeneArt基因合成服務來合成總計35個聚核苷酸。特定言之，聚核苷酸含有編碼融合蛋白之核苷酸序列，該融合蛋白自N端依序含有信號肽、CD80蛋白片段、Ig鉸鏈、Fc區域、連接子及具有二個胺基酸取代的IL-2變異體(2M) (R38A、F42A)。將聚核苷酸插入pcDNA3_4載體中。
hCD80變異體-Fc-IL-2變異體(GI-101_P1至GI-101_P35)融合蛋白之構造概述於表1中。 [表1]
編碼 編號 構造
第1API (hCD80變異體) 第1連接子 IgG Fc 第2連接子 第2API (hIL2v_2M)
GI-101_P1 V區域-環-C區域(A-B-C-D-E-F-G) 固定 固定 固定 固定
GI-101_P2 V區域-環-C區域(A-B-C-D-E-F-)
GI-101_P3 V區域-環-C區域(A-B-C-D-E-F)
GI-101_P4 V區域-環-C區域(A-B-C-D-E-)
GI-101_P5 V區域-環-C區域(A-B-C-D-E)
GI-101_P6 V區域-環-C區域(A-B-C-D-)
GI-101_P7 V區域-環-C區域(A-B-C-D)
GI-101_P8 V區域-環-C區域(A-B-C-)
GI-101_P9 V區域(A-B-a1 -C-C'-C''-a2 D-E-a3 E-F-G-)
GI-101_P10 V區域(-B-a1 -C-C'-C''-a2 D-E-a3 E-F-G-)
GI-101_P11 V區域(B-a1 -C-C'-C''-a2 D-E-a3 E-F-G-)
GI-101_P12 V區域(a1 -C-C'-C''-a2 D-E-a3 E-F-G-)
GI-101_P13 V區域(C-C'-C''-a2 D-E-a3 E-F-G-)
GI-101_P14 V區域(C-C'-C''-a2 D-E-a3 E-F-G)
GI-101_P15 V區域(C'-C''-a2 D-E-a3 E-F-G-)
GI-101_P16 V區域(C-C'-C'')
GI-101_P17 V區域(C-C')
GI-101_P18 V區域(F-G)
GI-101_P19 固定 固定 固定 - 固定
GI-101_P20 EAAAK
GI-101_P21 (EAAAK)2
GI-101_P22 (EAAAK)4
GI-101_P23 (GGGGS)2
GI-101_P24 (GGGGS)4
GI-101_P25 - 固定
GI-101_P26 EAAAK
GI-101_P27 (EAAAK)2
GI-101_P28 (EAAAK)4
GI-101_P29 GGGGS
GI-101_P30 (GGGGS)2
GI-101_P31 (GGGGS)4
GI-101_P32 固定 缺失 (GGGGS)1
GI-101_P33 (GGGGS)8
GI-101_P34 (GGGGS)1 缺失  
GI-101_P35 (GGGGS)8
製備實例 1.2. 純化 hCD80 變異體-Fc-IL-2 變異體
將製備實例1.1.中製備之載體引入CHO細胞（Expi-CHOTM）中以表現各融合蛋白。引入載體之後，在37℃、125 rpm及5% CO2 濃度之環境中進行培養7天。接著收集培養物且自其純化融合蛋白。經純化之融合蛋白命名為「GI-101_P1至GI-101_P35」。製備實例 1.2.1. 純化 GI-101_P1 至 GI-101_P31
使用含有BAKEROND™ PROchievA™之層析純化GI-101_P1至GI-101_P31。融合蛋白在50 mM NaPi、50 mM NaCl、pH 7的條件下與其結合。其後，在50 mM NaPi、500 mM NaCl、pH 7 (或200 mM甘胺酸、300 mM NaCl，pH 5)的條件下進行洗滌。隨後，在100或200 mM甘胺酸、300 mM NaCl、pH 3 (或100 mM甘胺酸、300 mM NaCl、500 mM精胺酸、pH 4)的條件下進行溶離。將0.3 N NaOH置於收集管中，且隨後收集融合蛋白。
隨後，量測214 nm波長下的吸光度，使用TSKgel G3000SWXL管柱(TOSOH Bioscience)、經由尺寸排阻層析獲得高度濃縮的融合蛋白。經分離及純化之融合蛋白在還原(R)或非還原(NR)條件下經受SDS-PAGE，且其藉由用庫馬斯藍(Coomassie Blue)染色鑑別(圖52至82）。另外，使用尺寸排阻層析獲得的結果說明於圖85至117中。製備實例1.2.2. 純化 GI-101_P32 至 GI-101_P35
使用含有BAKEROND™XWP 500 PolyQuat-35之層析進行初級純化。融合蛋白在50 mM Tris、pH 8的條件下與其結合。此後，溶離在50 mM Tris、500 mM NaCl，pH 8的條件下進行。將0.5 N NaOH置於收集管中，且隨後收集融合蛋白。其後，使用含有BAKEROND™XWP 500 PolyHi-Propyl-35之層析進行二次純化。融合蛋白在50 mM Tris、1.0或1.2 M AmSO4 ，pH 7.5 （或50 mM Tris、1.0 M AmSO4 、500 mM精胺酸，pH 7.5）的條件下與其結合。
其後，溶離在50 mM Tris，pH 7.5 (或50 mM Tris，500 mM精胺酸，pH 7.5)的條件下進行。將0.5 N NaOH置於收集管中，且隨後收集融合蛋白。隨後，量測214 nm波長下的吸光度，使用TSKgel G3000SWXL管柱(TOSOH Bioscience)、經由尺寸排阻層析獲得高度濃縮的融合蛋白。在此，經分離及純化之融合蛋白在還原(R)或非還原(NR)條件下經受SDS-PAGE，且其藉由用庫馬斯藍染色鑑別(圖83至86）。另外，使用尺寸排阻層析獲得的結果說明於圖118至121中。製備實例2. 製備hCD80 變異體-Fc-IL-2 變異體(2M) ：GI-101_P36 至GI-101_P42 製備實例2.1. 構造hCD80 變異體-Fc-IL-2 變異體(2M) 表現載體
為了產生包含人類CD80變異體、Fc區域及IL-2變異體的融合蛋白，經由ThermoFisher Scientific的Invitrogen GeneArt基因合成服務來合成總計6個聚核苷酸。特定言之，聚核苷酸含有編碼融合蛋白之核苷酸序列，該融合蛋白自N端起含有信號肽、CD80蛋白片段、Ig鉸鏈、Fc區域、連接子及具有二個胺基酸取代之IL-2變異體(2M) (R38A及F42A)。將聚核苷酸插入pcDNA3_4載體中。
hCD80變異體-Fc-IL-2變異體(2M) (GI-101_P36至GI-101_P42)融合蛋白之構造概述於表2中。 [表2]
編碼 編號 構造
第1 API (hCD80變異體) 第1連接子 IgG Fc 第2連接子 第2 API (hIL2v_2M)
GI-101_P36 K89E、T130A 固定 固定 固定 固定
GI-101_P37 K89E、K93E、T130A
GI-101_P38 H18L、R29D、Y31L、Q33H、K36G、M38I、 T41A、M43R、M47T、E81V、L85R、K89N、 A91T、F92P、K93V、R94L、L97R、T130A、 N149S
GI-101_P39 R29D、Y31L、Q33H、K36G、M38I、T41A、 M43R、M47T、E81V、L85R、K89N、A91T、 F92P、K93V、R94L、A12G、V68A、L97R、 T130A、L183H
GI-101_P40 A12G、H18L、V22A、N64S、V68A、T130A
GI-101_P41 A12G、H18L、V22A、N64S、V68M、T130A
GI-101_P42 V區域
製備實例2.2. 純化 hCD80 變異體-Fc-IL-2 變異體 (2M)
將製備實例2.1.中製備之載體引入CHO細胞（Expi-CHOTM）中以表現各融合蛋白。引入載體之後，在37℃、125 rpm及5% CO2 濃度之環境中進行培養7天。接著收集培養物且自其純化融合蛋白。經純化之融合蛋白命名為「GI-101_P36至GI-101_P42」。
使用含有BAKEROND™PROchievA™之層析純化GI-101_P36至GI-101_P42。融合蛋白在50 mM NaPi、50 mM NaCl、pH 7的條件下與其結合。其後，在50 mM NaPi、500 mM NaCl、pH 7 (或200 mM甘胺酸、300 mM NaCl，pH 5)的條件下進行洗滌。隨後，在100或200 mM甘胺酸、300 mM NaCl、pH 3 (或100 mM甘胺酸、300 mM NaCl、500 mM精胺酸、pH 4)的條件下進行溶離。將0.3 N NaOH置於收集管中，且隨後收集融合蛋白。隨後，量測214 nm波長下的吸光度，使用TSKgel G3000SWXL管柱(TOSOH Bioscience)、經由尺寸排阻層析獲得高度濃縮的融合蛋白。在此，經分離及純化之融合蛋白在還原(R)或非還原(NR)條件下經受SDS-PAGE，且其藉由用庫馬斯藍染色鑑別(圖157）。製備實例3. 製備hCD80 變異體-Fc-IL-2 變異體(3M) ：GI-101_P43 至GI-101_P49 製備實例3.1. 構造hCD80 變異體-Fc-IL-2 變異體(3M) 表現載體
為了產生包含人類CD80變異體、Fc區域及IL-2變異體的融合蛋白，經由ThermoFisher Scientific的Invitrogen GeneArt基因合成服務來合成總計6個聚核苷酸。特定言之，聚核苷酸含有編碼融合蛋白之核苷酸序列，該融合蛋白自N端起含有信號肽、CD80蛋白片段、Ig鉸鏈、Fc區域、連接子及具有三個胺基酸取代之IL-2變異體(3M) (R38A、F42A及Y45A)。將聚核苷酸插入pcDNA3_4載體中。
hCD80-Fc-IL-2變異體(GI-101_P43至GI-101_P49)融合蛋白之構造概述於表3中。 [表3]
編碼 編號 構造
第1 API (hCD80變異體) 第1連接子 IgG Fc 第2連接子 第2 API (hIL2v_3M)
GI-101_P43 K89E、T130A 固定 固定 固定 固定
GI-101_P44 K89E、K93E、T130A
GI-101_P45 H18L、R29D、Y31L、Q33H、K36G、M38I、T41A、M43R、M47T、E81V、L85R、K89N、 A91T、F92P、K93V、R94L、L97R、T130A、N149S
GI-101_P46 R29D、Y31L、Q33H、K36G、M38I、T41A、M43R、M47T、E81V、L85R、K89N、A91T、F92P、K93V、R94L、A12G、V68A、L97R、T130A、L183H
GI-101_P47 A12G、H18L、V22A、N64S、V68A、T130A
GI-101_P48 A12G、H18L、V22A、N64S、V68M、T130A
GI-101_P49 V區域
製備實例 3.2. 純化 hCD80 變異體-Fc-IL-2 變異體 (3M)
將製備實例3.1.中製備之載體引入CHO細胞（Expi-CHOTM）中以表現各融合蛋白。引入載體之後，在37℃、125 rpm及5% CO2 濃度之環境中進行培養7天。接著收集培養物且自其純化融合蛋白。經純化之融合蛋白命名為「GI-101_P43至GI-101_P49」。
使用含有BAKEROND™PROchievA™之層析純化GI-101_P43至GI-101_P49。融合蛋白在50 mM NaPi、50 mM NaCl、pH 7的條件下與其結合。其後，在50 mM NaPi、500 mM NaCl、pH 7 (或200 mM甘胺酸、300 mM NaCl，pH 5)的條件下進行洗滌。隨後，在100或200 mM甘胺酸、300 mM NaCl、pH 3 (或100 mM甘胺酸、300 mM NaCl、500 mM精胺酸、pH 4)的條件下進行溶離。將0.3 N NaOH置於收集管中，且隨後收集融合蛋白。隨後，量測214 nm波長下的吸光度，使用TSKgel G3000SWXL管柱(TOSOH Bioscience)、經由尺寸排阻層析，獲得高度濃縮的融合蛋白。在此，經分離及純化之融合蛋白在還原(R)或非還原(NR)條件下經受SDS-PAGE，且其藉由用庫馬斯藍染色鑑別(圖157）。實驗實例1. 鑑別hCTLA-4 與GI-101_P1 至GI-101_P35 之間的結合親和力
Ni-NTA生物感測器(載有鎳的Tris-NTA，ForteBio，18-5101)預先在96孔微量培養盤(GreinerBio-one，目錄號：655209)中用200 μl 1X Ni-NTA動力學緩衝液(10X動力學緩衝液，ForteBio，18-1042)進行水合。連接至生物感測器的配位體(CTLA-4蛋白、人類CTLA-4/CD152，His標籤，Acro，CT4-H5229)用1X Ni-NTA動力學緩衝液稀釋至1 μg/ml之濃度。連接至配位體之融合蛋白(GI-101_P1至GI-101_P35)用1X動力學緩衝液稀釋至100 nM之濃度。將80 μl各試劑置於384孔微量培養盤(GreinerBio-one，目錄號：781209)中且設置程式。
因此，如圖120至156中分別所說明來量測hCTLA-4與GI-101_P1至GI-101_P35之間的結合親和力。實驗實例2. 鑑別hIL-2 β 受體與GI-101_P1 至GI-101_P35 之間的結合親和力
Ni-NTA生物感測器(載有鎳的Tris-NTA，ForteBio，18-5101)預先在96孔微量培養盤(GreinerBio-one，目錄號：655209)中用200 μl 1X Ni-NTA動力學緩衝液(10X動力學緩衝液，ForteBio，18-1042)進行水合。連接至生物感測器的配位體(人類IL-2 Rβ/CD122蛋白，His標籤，Acro，CD2-H5221)用1X Ni-NTA動力學緩衝液稀釋至2 μg/ml之濃度。連接至配位體之融合蛋白(GI-101_P1至GI-101_P35)用1X動力學緩衝液稀釋至100 nM之濃度。將80 μl各試劑置於384孔微量培養盤(GreinerBio-one，目錄號：781209)中且設置程式。
因此，如圖122至156中分別所說明來量測hIL-2β受體與GI-101_P1至GI-101_P35之間的結合親和力。實驗實例3. 鑑別hCTLA-4 與GI-101_P36 至GI-101_P49 之間的結合親和力
Ni-NTA生物感測器(載有鎳的Tris-NTA，ForteBio，18-5101)預先在96孔微量培養盤(GreinerBio-one，目錄號：655209)中用200 μl 1X Ni-NTA動力學緩衝液(10X動力學緩衝液，ForteBio，18-1042)進行水合。連接至生物感測器的配位體(CTLA-4蛋白、人類CTLA-4/CD152，His標籤，Acro，CT4-H5229)用1X Ni-NTA動力學緩衝液稀釋至1 μg/ml之濃度。連接至配位體之融合蛋白(GI-101_P36至GI-101_P47)用1X動力學緩衝液稀釋至100 nM之濃度。將80 μl各試劑置於384孔微量培養盤(GreinerBio-one，目錄號：781209)中且設置程式。
因此，如圖158至170中分別所說明來量測hCTLA-4與GI-101_P36至GI-101_P49之間的結合親和力。實驗實例4. 鑑別hPD-L1 與GI-101_P36 至GI-101_P49 之間的結合親和力
Ni-NTA生物感測器(載有鎳的Tris-NTA，ForteBio，18-5101)預先在96孔微量培養盤(GreinerBio-one，目錄號：655209)中用200 μl 1X Ni-NTA動力學緩衝液(10X動力學緩衝液，ForteBio，18-1042)進行水合。連接至生物感測器的配位體(PD-L1蛋白、人類PD-L1/B7-H1蛋白，His標籤Acro，PD1-H5229)用1X Ni-NTA動力學緩衝液稀釋至1 μg/ml之濃度。連接至配位體之融合蛋白(GI-101_P36至GI-101_P49)用1X動力學緩衝液稀釋至100 nM之濃度。將80 μl各試劑置於384孔微量培養盤(GreinerBio-one，目錄號：781209)中且設置程式。
因此，如圖158至170中分別所說明來量測hPD-L1與GI-101_P36至GI-101_P49之間的結合親和力。實驗實例5. 鑑別hIL-2 β 受體與GI-101_P36 至GI-101_P49 之間的結合親和力
Ni-NTA生物感測器(載有鎳的Tris-NTA，ForteBio，18-5101)預先在96孔微量培養盤(GreinerBio-one，目錄號：655209)中用200 μl 1X Ni-NTA動力學緩衝液(10X動力學緩衝液，ForteBio，18-1042)進行水合。連接至生物感測器的配位體(人類IL-2 Rβ/CD122蛋白，His標籤，Acro，CD2-H5221)用1X Ni-NTA動力學緩衝液稀釋至2 μg/ml之濃度。連接至配位體之融合蛋白(GI-101 P1至GI-101 P35)用1X動力學緩衝液稀釋至100 nM之濃度。將80 μl各試劑置於384孔微量培養盤(GreinerBio-one，目錄號：781209)中且設置程式。
因此，如圖158至170中分別所說明來量測hIL-2β受體與GI-101_P36至GI-101_P49之間的結合親和力。
(無)
圖1說明GI-101_P1及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 38、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P1：SEQ ID NO: 39)。
圖2說明GI-101_P2及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 40、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P2：SEQ ID NO: 41)。
圖3說明GI-101_P3及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 42、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P3：SEQ ID NO: 43)。
圖4說明GI-101_P4及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 44、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P4：SEQ ID NO: 45)。
圖5說明GI-101_P5及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 46、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P5：SEQ ID NO: 47)。
圖6說明GI-101_P6及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 48、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P6：SEQ ID NO: 49)。
圖7說明GI-101_P7及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 50、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P7：SEQ ID NO: 51)。
圖8說明GI-101_P8及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 52、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P8：SEQ ID NO: 53)。
圖9說明GI-101_P9及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 54、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P9：SEQ ID NO: 55)。
圖10說明GI-101_P10及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 56、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P10：SEQ ID NO: 57)。
圖11說明GI-101_P11及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 58、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P11：SEQ ID NO: 59)。
圖12說明GI-101_P12及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 60、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P12：SEQ ID NO: 61)。
圖13說明GI-101_P13及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 62、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P13：SEQ ID NO: 63)。
圖14說明GI-101_P14及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 64、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P14：SEQ ID NO: 65)。
圖15說明GI-101_P15及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 66、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P15：SEQ ID NO: 67)。
圖16說明GI-101_P16及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 68、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P16：SEQ ID NO: 69)。
圖17說明GI-101_P17及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 70、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P17：SEQ ID NO: 71)。
圖18說明GI-101_P18及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 72、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P18：SEQ ID NO: 73)。
圖19說明GI-101_P19及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 74、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P19：SEQ ID NO: 75)。
圖20說明GI-101_P20及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 74、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 76、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P20：SEQ ID NO: 77)。
圖21說明GI-101_P21及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 74、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 78、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P21：SEQ ID NO: 79)。
圖22說明GI-101_P22及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 74、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 80、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P22：SEQ ID NO: 81)。
圖23說明GI-101_P23及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 74、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 82、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P23：SEQ ID NO: 83)。
圖24說明GI-101_P24及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 74、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 84、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P24：SEQ ID NO: 85)。
圖25說明GI-101_P25及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 74、連接子1：SEQ ID NO: 86、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P25：SEQ ID NO: 87)。
圖26說明GI-101_P26及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 74、連接子1：SEQ ID NO: 88、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P26：SEQ ID NO: 89)。
圖27說明GI-101_P27及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 74、連接子1：SEQ ID NO: 90、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P27：SEQ ID NO: 91)。
圖28說明GI-101_P28及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 74、連接子1：SEQ ID NO: 92、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P28：SEQ ID NO: 93)。
圖29說明GI-101_P29及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 74、連接子1：SEQ ID NO: 94、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P29：SEQ ID NO: 95)。
圖30說明GI-101_P30及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 74、連接子1：SEQ ID NO: 96、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P30：SEQ ID NO: 97)。
圖31說明GI-101_P31及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 74、連接子1：SEQ ID NO: 98、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P31：SEQ ID NO: 99)。
圖32說明GI-101_P32及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 74、連接子：SEQ ID NO: 100、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P32：SEQ ID NO: 101)。
圖33說明GI-101_P33及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 74、連接子：SEQ ID NO: 102、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P33：SEQ ID NO: 103)。
圖34說明GI-101_P34及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 74、連接子：SEQ ID NO: 104、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P34：SEQ ID NO: 105)。
圖35說明GI-101_P35及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 74、連接子：SEQ ID NO: 106、IL2V：SEQ ID NO: 6、GI101_P35：SEQ ID NO: 107)。
圖36說明GI-101_P36至GI-101_P42，其包括CD80之變異體及包含二種變異之IL-2。
圖37說明GI-101_P36及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 108、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6)。
圖38說明GI-101_P37及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 109、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6)。
圖39說明GI-101_P38及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 110、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6)。
圖40說明GI-101_P39及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 111、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6)。
圖41說明GI-101_P40及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 112、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6)。
圖42說明GI-101_P41及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 113、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6)。
圖43說明GI-101_P42及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 114、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 6)。
圖44說明GI-101_P43至GI-101_P49，其包括CD80之變異體及包含三種變異之IL-2。
圖45說明GI-101_P43及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 108、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 115)。
圖46說明GI-101_P44及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 109、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 115)。
圖47說明GI-101_P45及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 110、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 115)。
圖48說明GI-101_P46及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 111、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 115)。
圖49說明GI-101_P47及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 112、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 115)。
圖50說明GI-101_P48及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 113、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 115)。
圖51說明GI-101_P49及其肽序列之組分(CD80：SEQ ID NO: 114、連接子1：SEQ ID NO: 3、Fc：SEQ ID NO: 4、連接子2：SEQ ID NO: 5、IL2V：SEQ ID NO: 115)。
圖52說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P1融合蛋白而獲得的結果。
圖53說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P2融合蛋白而獲得的結果。
圖54說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P3融合蛋白而獲得的結果。
圖55說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P4融合蛋白而獲得的結果。
圖56說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P5融合蛋白而獲得的結果。
圖57說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P6融合蛋白而獲得的結果。
圖58說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P7融合蛋白而獲得的結果。
圖59說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P8融合蛋白而獲得的結果。
圖60說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P9融合蛋白而獲得的結果。
圖61說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P10融合蛋白而獲得的結果。
圖62說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P11融合蛋白而獲得的結果。
圖63說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P12融合蛋白而獲得的結果。
圖64說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P13融合蛋白而獲得的結果。
圖65說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P14融合蛋白而獲得的結果。
圖66說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P15融合蛋白而獲得的結果。
圖67說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P16融合蛋白而獲得的結果。
圖68說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P17融合蛋白而獲得的結果。
圖69說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P18融合蛋白而獲得的結果。
圖70說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P19融合蛋白而獲得的結果。
圖71說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P20融合蛋白而獲得的結果。
圖72說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P21融合蛋白而獲得的結果。
圖73說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P22融合蛋白而獲得的結果。
圖74說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P23融合蛋白而獲得的結果。
圖75說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P24融合蛋白而獲得的結果。
圖76說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P25融合蛋白而獲得的結果。
圖77說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P26融合蛋白而獲得的結果。
圖78說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P27融合蛋白而獲得的結果。
圖79說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P28融合蛋白而獲得的結果。
圖80說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P29融合蛋白而獲得的結果。
圖81說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P30融合蛋白而獲得的結果。
圖82說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P31融合蛋白而獲得的結果。
圖83說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P32融合蛋白而獲得的結果。
圖84說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P33融合蛋白而獲得的結果。
圖85說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P34融合蛋白而獲得的結果。
圖86說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P35融合蛋白而獲得的結果。
圖87說明藉由經尺寸排阻層析（size exclusion chromatography，SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P1融合蛋白而獲得的結果。
圖88說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P2融合蛋白而獲得的結果。
圖89說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P3融合蛋白而獲得的結果。
圖90說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P4融合蛋白而獲得的結果。
圖91說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P5融合蛋白而獲得的結果。
圖92說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P6融合蛋白而獲得的結果。
圖93說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P7融合蛋白而獲得的結果。
圖94說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P8融合蛋白而獲得的結果。
圖95說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P9融合蛋白而獲得的結果。
圖96說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P10融合蛋白而獲得的結果。
圖97說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P11融合蛋白而獲得的結果。
圖98說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P12融合蛋白而獲得的結果。
圖99說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P13融合蛋白而獲得的結果。
圖100說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P14融合蛋白而獲得的結果。
圖101說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P15融合蛋白而獲得的結果。
圖102說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P16融合蛋白而獲得的結果。
圖103說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P17融合蛋白而獲得的結果。
圖104說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P18融合蛋白而獲得的結果。
圖105說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P19融合蛋白而獲得的結果。
圖106說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P20融合蛋白而獲得的結果。
圖107說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P21融合蛋白而獲得的結果。
圖108說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P22融合蛋白而獲得的結果。
圖109說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P23融合蛋白而獲得的結果。
圖110說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P24融合蛋白而獲得的結果。
圖111說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P25融合蛋白而獲得的結果。
圖112說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P26融合蛋白而獲得的結果。
圖113說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P27融合蛋白而獲得的結果。
圖114說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P28融合蛋白而獲得的結果。
圖115說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P29融合蛋白而獲得的結果。
圖116說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P30融合蛋白而獲得的結果。
圖117說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P31融合蛋白而獲得的結果。
圖118說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P32融合蛋白而獲得的結果。
圖119說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P33融合蛋白而獲得的結果。
圖120說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P34融合蛋白而獲得的結果。
圖121說明藉由經尺寸排阻層析（SEC）分析根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P35融合蛋白而獲得的結果。
圖122說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P1融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖123說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P2融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖124說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P3融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖125說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P4融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖126說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P5融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖127說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P6融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖128說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P7融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖129說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P8融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖130說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P9融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖131說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P10融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖132說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P11融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖133說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P12融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖134說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P13融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖135說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P14融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖136說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P15融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖137說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P16融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖138說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P17融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖139說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P18融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖140說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P19融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖141說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P20融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖142說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P21融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖143說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P22融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖144說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P23融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖145說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P24融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖146說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P25融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖147說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P26融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖148說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P27融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖149說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P28融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖150說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P29融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖151說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P30融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖152說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P31融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖153說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P32融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖154說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P33融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖155說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P34融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖156說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P35融合蛋白與CTLA-4或IL-2Rβ之間的結合親和力。
圖157說明藉由使用SDS-PAGE鑑別根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P36至GI-101_P49融合蛋白而獲得的結果。
圖158說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P36融合蛋白與IL-2Rβ、CTLA-4或PD-L1之間的結合親和力。
圖159說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P37融合蛋白與IL-2Rβ、CTLA-4或PD-L1之間的結合親和力。
圖160說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P38融合蛋白與IL-2Rβ、CTLA-4或PD-L1之間的結合親和力。
圖161說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P39融合蛋白與IL-2Rβ、CTLA-4或PD-L1之間的結合親和力。
圖162說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P40融合蛋白與IL-2Rβ、CTLA-4或PD-L1之間的結合親和力。
圖163說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P41融合蛋白與IL-2Rβ、CTLA-4或PD-L1之間的結合親和力。
圖164說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P42融合蛋白與IL-2Rβ、CTLA-4或PD-L1之間的結合親和力。
圖165說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P43融合蛋白與IL-2Rβ、CTLA-4或PD-L1之間的結合親和力。
圖166說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P44融合蛋白與IL-2Rβ、CTLA-4或PD-L1之間的結合親和力。
圖167說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P45融合蛋白與IL-2Rβ、CTLA-4或PD-L1之間的結合親和力。
圖168說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P46融合蛋白與IL-2Rβ、CTLA-4或PD-L1之間的結合親和力。
圖169說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P47融合蛋白與IL-2Rβ、CTLA-4或PD-L1之間的結合親和力。
圖170說明根據本發明之一個實施例獲得之GI-101_P49融合蛋白與IL-2Rβ、CTLA-4或PD-L1之間的結合親和力。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
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(無)

Claims (32)

  1. 一種融合蛋白，其包含一IL-2蛋白及一CD80蛋白片段或一其變異體。
  2. 如請求項1之融合蛋白，其中該IL-2蛋白及該CD80蛋白片段或其變異體經由一連接子彼此結合。
  3. 如請求項1之融合蛋白，其中該IL-2蛋白具有胺基酸序列SEQ ID NO: 10。
  4. 如請求項1之融合蛋白，其中該IL-2蛋白為一IL-2變異體。
  5. 如請求項4之融合蛋白，其中該IL-2變異體係藉由取代選自胺基酸序列SEQ ID NO: 10中之第38個、第42個、第45個、第61個及第72個胺基酸中之至少一者來獲得。
  6. 如請求項4之融合蛋白，其中該IL-2變異體係藉由在胺基酸序列SEQ ID NO: 10中達成選自由以下組成之群的至少一種取代來獲得：R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G。
  7. 如請求項4之融合蛋白，其中該IL-2變異體係藉由在胺基酸序列SEQ ID NO: 10中達成選自以下取代組合(a)至(d)中之任一者來獲得： (a) R38A/F42A (b) R38A/F42A/Y45A (c) R38A/F42A/E61R (d) R38A/F42A/L72G。
  8. 如請求項4之融合蛋白，其中該IL-2變異體具有胺基酸序列SEQ ID NO: 6、22、23或24。
  9. 如請求項1之融合蛋白，其中該CD80具有胺基酸序列SEQ ID NO: 11。
  10. 如請求項1之融合蛋白，其中該CD80蛋白片段由胺基酸序列SEQ ID NO: 11中的第35個至第242個胺基酸組成。
  11. 如請求項1之融合蛋白，其中該CD80蛋白片段為CD80之V區域。
  12. 如請求項1之融合蛋白，其中該CD80蛋白片段之該變異體為其中至少一個胺基酸被另一胺基酸取代之變異體。
  13. 如請求項1之融合蛋白，其中該CD80蛋白片段之該變異體係藉由選自由以下組成之群的任一取代組合來獲得：K89E/T130A、K89E/K93E/T130A、H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/ E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L97R/T130A/N149S、R29D/Y31L/ Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/A12G/V68A/L97R/T130A/L183H、A12G/H18L/V22A/N64S/V68M/T130A及A12G/H18L/V22A/N64S/V68M/T130A。
  14. 如請求項2之融合蛋白，其中該連接子為一白蛋白或一免疫球蛋白之一Fc區域。
  15. 如請求項14之融合蛋白，其中該Fc區域為一野生型或一其變異體。
  16. 如請求項14之融合蛋白，其中該Fc區域具有胺基酸序列SEQ ID NO: 4。
  17. 如請求項15之融合蛋白，其中該Fc區域之該變異體具有胺基酸序列SEQ ID NO: 12。
  18. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白由以下結構式(I)或(II)組成： N'-X-[連接子(1)]n-Fc區域-[連接子(2)]m-Y-C' (I) N'-Y-[連接子(1)]n-Fc區域-[連接子(2)]m-X-C' (II) 在該結構式(I)及(II)中， N'為該融合蛋白之N端， C'為該融合蛋白之C端， X為該CD80蛋白片段或其變異體， Y為該IL-2蛋白， 該等連接子(1)及(2)為肽連接子，及 n及m各自獨立地為0或1。
  19. 如請求項18之融合蛋白，其中該連接子(1)為由胺基酸序列SEQ ID NO: 3組成的一肽連接子。
  20. 如請求項18之融合蛋白，其中該連接子(2)為由胺基酸序列SEQ ID NO: 5組成的一肽連接子。
  21. 如請求項18之融合蛋白，其中該融合蛋白由該結構式(I)組成。
  22. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白與胺基酸序列SEQ ID NO: 9、26、28或30具有85%或更高的一序列一致性。
  23. 一種融合蛋白二聚體，其中如請求項1至22中任一項之融合蛋白中之二個彼此結合。
  24. 如請求項23之融合蛋白二聚體，其中該融合蛋白二聚體為一均二聚體。
  25. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至22中任一項之融合蛋白。
  26. 如請求項25之聚核苷酸，其中該聚核苷酸與SEQ ID NO: 8、25、27或29之核苷酸序列具有85%或更高的一序列一致性。
  27. 一種載體，其包含如請求項25之聚核苷酸。
  28. 一種轉型細胞，其中已引入如請求項25之載體。
  29. 一種用於預防或治療癌症或一感染性疾病之醫藥組合物，其包含如請求項1至22中任一項之融合蛋白或如請求項23或24之融合蛋白二聚體作為一活性成分。
  30. 如請求項29之醫藥組合物，其中該醫藥組合物進一步包含一醫藥學上可接受之載劑。
  31. 如請求項29之醫藥組合物，其中該癌症為選自由以下組成之群的任一者：胃癌、肝癌、肺癌、大腸直腸癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰臟癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、喉癌、急性骨髓性白血病、腦腫瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、頭頸癌、唾液腺癌及淋巴瘤。
  32. 如請求項29之醫藥組合物，其中該感染性疾病為選自由以下組成之群的任一者：B型肝炎、C型肝炎、人類乳突狀瘤病毒感染、巨細胞病毒感染、病毒性呼吸道疾病及流感。
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