KR20230044131A - Pd-1 및 il-15를 포함하는 융합단백질 이량체 및 이의 용도 - Google Patents
Pd-1 및 il-15를 포함하는 융합단백질 이량체 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 PD-1 단백질 및 IL-15 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 일 구체예인 PD-1, IL-15 및 혈중 지속형 Fc를 포함하는 융합단백질은 NK 세포와 같은 면역세포를 활성화시킬 수 있고, 체내 반감기를 효과적으로 증대시킬 수 있다. 따라서, 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 체내의 면역활성을 증가시켜 면역 관문억제제 치료에 반응하지 않는 환자 및 재발 환자들을 위한 항암제로 활용 가능하다.
Description
본 발명은 PD-1 단백질 및 IL-15 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 혈중 반감기가 증대되고 면역증강 효능을 갖는, PD-1, IL-15 및 혈중 지속형 Fc를 포함하는 신규한 융합단백질 이량체 및 이의 암 치료 용도에 관한 것이다.
PD-1(programmed death receptor-1)은 근래 각광받고 있는 면역 체크포인트로서, 주로 T 세포의 활성화 제어에 관여하며 면역 반응의 강도 및 지속 시간을 조절할 수 있다. 정상적인 상황에서, PD-1은 신체 조직의 자가면역관용을 매개 및 유지하고, 염증 반응 과정에서 면역 계통이 과도하게 활성화되어 자가조직을 손상시키는 것을 방지하여, 자가면역성 질병이 발생하지 않도록 하는데 긍정적인 작용을 한다. 그러나, 병리 상황에서, PD-1은 종양 면역 및 다양한 자가면역 질환의 발생 및 발전 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다(Sara Pilotto et.al., Anticancer Agents Med Chem., 15(3):307-313, 2015).
PD-1은 주로 활성화된 T 세포 표면에 발현되며, B 세포, NK 세포, 단핵세포, 수지상세포(DC)에서도 발현된다. PD-1의 리간드인 PD-L1 및 PD-L2는 종양 세포와 활성화된 B 세포 및 T 세포, 수지상세포, 대식세포 상에서 발현된다. PD-1은 이들 리간드와 결합하여 T 세포 세포자멸사를 유도함으로써, 세포의 면역 반응을 약화시킨다. 이에, PD-1/PD-L1 또는 PD-L2의 경로 차단은 많은 유형의 암 연구에서 탐구되고 있는 유망한 치료적 접근법이다(Miguel F. Sanmamed et.al., Cancer J., 20(4):256-261, 2014).
한편, IL-15(Interleukin-15)는 IL-2와 구조적으로 유사한 사이토카인으로, 대식세포, 단핵구, 수지상세포, 섬유아세포 등에서 발현된다. IL-15는 IL-15Rα, IL-2Rβ 및 γc 서브유닛으로 구성된 IL-15의 수용체에 결합하여 생물학적 활성을 나타낸다. 구체적으로, IL-15 및 IL-15Rα는 활성화된 수지상세포에서 함께 발현되고, IL-15/IL-15Rα 복합체 형태로 기능한다. IL-15/IL-15Rα 복합체는 NK 세포 및 T 세포 상의 IL-2Rβ/γc에 결합하여 결과적으로 T 세포 및 NK 세포의 분화 및 증식을 유도한다. 즉, T 세포 및 NK 세포의 지속적인 세포용해 활성(cytolytic activity)으로 면역 억제를 극복하여 종양세포를 효율적으로 사멸시킬 수 있다(Ying Yang et.al., Cancers, 12(12):3586, 2020).
한편, 면역글로불린 Fc의 CH2-CH3 부분에는 항체의 반감기를 길게 해주는 FcRn(protection receptor) 결합부위가 존재한다(한국등록특허 제10-1957431호). FcRn은 MHC class I 관련 단백질로서 혈관 내피세포에서 발현되며 IgG와 알부민에 결합한다. Fc가 없는, 즉 FcRn 결합 부위가 없는 항체 절편의 인체 내 반감기는 2~3시간 내외이나, FcRn 결합부위가 있는 IgG1, IgG2 및 IgG4의 인체 내 반감기는 평균 3주로 타 단백질에 비해 긴 반감기를 갖는다.
Sara Pilotto et.al., Anticancer Agents Med Chem., 15(3):307-313, 2015
Miguel F. Sanmamed et.al., Cancer J., 20(4):256-261, 2014
Ying Yang et.al., Cancers, 12(12):3586, 2020
이에 본 발명자들은 체내 반감기가 증대되고 면역증강 효능이 우수한 항암 치료제를 개발하기 위해 연구한 결과, PD-1, IL-15 및 혈중 지속형 Fc를 포함하는 신규한 융합단백질이 면역세포를 활성화시키고, 항암 활성에는 영향을 주지 않으면서 반감기가 증대된 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적 달성을 위해, 본 발명의 일 측면은, PD-1 단백질 및 IL-15 단백질을 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 융합단백질 두 개가 결합된 융합단백질 이량체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질 또는 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 암질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암질환을 치료하기 위한 상기 융합단백질의 용도를 제공한다.
PD-1, IL-15 및 혈중 지속형 Fc를 포함하는 융합단백질은 PD-1 및 IL-15에 의해 면역세포를 활성화시킬 수 있을 뿐 아니라, 혈중 지속형 Fc에 의해 체내 반감기를 극대화할 수 있다. 따라서, 상기 융합단백질은 효율적으로 암세포를 공격할 수 있으므로, 암질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 수득한 융합단백질(BNS002; PD-1 D-Fc(29)-IL-15, PD-1 D-Fc(41)-IL-15, 및 PD-1 D-Fc(wt)-IL-15)을 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 2는 SEC-HPLC 분석을 수행하여 수득한 융합단백질(BNS002)의 순도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 UV 분광광도계를 이용하여 수득한 융합단백질(BNS002)의 농도를 확인한 것이다.
도 4는 형광(Fluorescence) 및 SLS(Static Light Scattering) 검출기를 이용하여 수득한 융합단백질(BNS002)의 열역학적 안정성을 확인한 것이다.
도 5는 FT-IR(Fourier-transform infrared spectroscopy) 분광광도계를 이용하여 수득한 융합단백질(BNS002)의 구조적 안정성을 확인한 것이다.
도 6은 SEC-MALS(Size Exclusion Chomatography - Multi-Angle Laser Light Scattering) 분석을 통해 수득한 융합단백질(BNS002)의 분자량을 확인한 것이다.
도 7은 수득한 융합단백질(BNS002)과 hPD-L1(human Programmed cell death ligand-1) 간의 결합 친화성을 확인한 결과이다.
도 8은 hPD-1 단백질(human Programmed cell death protein-1)과 hPD-L1 간의 결합 친화성을 확인한 결과이다.
도 9는 수득한 융합단백질(BNS002)과 hPD-L2(human Programmed cell death ligand-2) 간의 결합 친화성을 확인한 결과이다.
도 10은 hPD-1 단백질과 hPD-L2 간의 결합 친화성을 확인한 결과이다.
도 11은 수득한 융합단백질(BNS002)과 hIL-15Rα(human Interleukin-15 receptor alpha) 간의 결합 친화성을 확인한 결과이다.
도 12는 hIL-15 단백질과 hIL-15Rα(human Interleukin-15 receptor alpha) 간의 결합 친화성을 확인한 결과이다.
도 13은 수득한 융합단백질(BNS002)과 hIL-2Rβ(human Interleukin-15 receptor beta) 간의 결합 친화성을 확인한 결과이다.
도 14는 hIL-15 단백질과 hIL-2Rβ(human Interleukin-15 receptor beta) 간의 결합 친화성을 확인한 결과이다.
도 15는 수득한 융합단백질(BNS002)과 hFcRn 리셉터(human neonatal Fc receptor) 간의 결합 친화성을 확인한 결과이다.
도 16은 수득한 융합단백질(BNS002)과 PD-L1 간의 결합 친화성을 ELISA 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 17은 수득한 융합단백질(BNS002)과 PD-L2 간의 결합 친화성을 ELISA 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 18은 수득한 융합단백질(BNS002)과 IL-15Rα 간의 결합 친화성을 ELISA 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 19는 수득한 융합단백질(BNS002)과 IL-2Rβ(Interleukin-2 receptor beta) 간의 결합 친화성을 ELISA 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 20은 수득한 융합단백질(BNS002)과 hFcRn 리셉터 간의 결합 친화성을 LumitTM FcRn binding immunoassay 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 21은 수득한 융합단백질(BNS002)과 IL-15 리셉터 간의 결합 친화성을 PathHunter® eXpress Dimerization Assay 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 22는 수득한 융합단백질(BNS002) 및 IL-15를 각각 말초혈액 단핵세포(PBMC)에 처리하고, 배양시 면역세포가 포함된 PBMC에서 분비되는 IFN-γ의 양을 ELISA 분석을 통해 측정한 결과이다.
도 23은 수득한 융합단백질(BNS002) 및 IL-15 단백질이 CD8+ T 세포의 증식에 미치는 영향을 FACS 분석을 통해 확인한 것이다.
도 24는 수득한 융합단백질(BNS002) 및 IL-15 단백질이 CD4+ T 세포의 증식에 미치는 영향을 FACS 분석을 통해 확인한 것이다.
도 25a는 수득한 융합단백질(BNS002) 및 IL-15 단백질이 NK 세포의 증식에 미치는 영향을 FACS 분석을 통해 확인한 것이다.
도 25b는 수득한 융합단백질(BNS002) 및 IL-15 단백질이 NK 세포의 증식에 미치는 영향을 FACS 분석을 통해 확인한 결과를 그래프화한 것이다.
도 26은 수득한 융합단백질(BNS002)이 이펙터(effector) T 세포에 미치는 영향을 PD-L1/PD-1 차단 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 27은 수득한 융합단백질(BNS002)이 이펙터 T 세포에 미치는 영향을 PD-L2/PD-1 차단 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 28은 파이어플라이 루시퍼라아제(Firefly luciferase) 및 GFP(Green fluorescent protein) 발현 세포주 제작에 이용한 렌티바이러스(lentivirus) 벡터맵을 개략적으로 나타낸 것이다. 여기에서, CMV는 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 유래의 프로모터이고, RSV는 호흡기세포융합바이러스 (Respiratory syncytial virus) 유래의 프로모터이다.
도 29는 본 발명에서 확립한 파이어플라이 루시퍼라아제 및 GFP 발현 인간 흑색종양 세포주(A375-Luc-GFP)의 발광 신호(좌) 및 형광 신호(우)를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 30은 본 발명의 일실시예에 따른 인간 흑색종양 세포주(A375-Luc-GFP)에서 특이적으로 발현하는 PD-L1 및 PD-L2 유전자(좌)와 면역세포를 포함하고 있는 PBMC에서 특이적으로 발현하는 PD-1 유전자(우)의 발현 양상을 역전사(reverse transcription) PCR을 통해 확인한 것이다.
도 31은 수득한 융합단백질(BNS002) 및 IL-15를 각각 공동배양한 인간 흑색종양 세포주(A375-Luc-GFP) 및 말초혈액 단핵세포(PBMC)에 처리하고, 배양시 세포에서 분비되는 IFN-γ의 양을 ELISA 분석을 통해 측정한 결과이다.
도 32는 수득한 융합단백질(BNS002)을 공동배양한 인간 흑색종양 세포주(A375-Luc-GFP) 및 말초혈액 단핵세포(PBMC)에 처리하고, 처리 시간별 암세포 살상 효과를 탈수소효소(Dehydrogenase)인 숙시네이트-테트라졸리움 환원효소(succinate-tetrazolium reductase) 활성 측정을 통해 분석한 것이다.
도 33은 수득한 융합단백질(BNS002)을 공동배양한 인간 흑색종양 세포주(A375-Luc-GFP) 및 말초혈액 단핵세포(PBMC)에 48시간 처리한 후, 암세포 살상 효과를 탈수소효소인 숙시네이트-테트라졸리움 환원효소 활성 측정을 통해 확인한 것이다.
도 34는 수득한 융합단백질(BNS002)을 공동배양한 인간 흑색종양 세포주(A375-Luc-GFP) 및 말초혈액 단핵세포(PBMC)에 농도별로 처리하고, 처리 농도별 암세포 살상 효과를 탈수소효소인 숙시네이트-테트라졸리움 환원효소 활성 측정을 통해 분석한 것이다.
도 35는 수득한 융합단백질(BNS002)의 암세포주(A375-Luc-GFP) 특이적인 항체 의존성 세포 독성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 활성을 확인한 것이다.
도 36은 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서 융합단백질(BNS002)의 항암효과 확인을 위한 투여 및 실험 일정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 37은 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서 융합단백질(BNS002)에 의한 종양 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 38은 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서 융합단백질(BNS002)에 의한 종양 억제 효과에 대한 통계적 유의미성을 확인한 결과이다.
도 39는 수득한 융합단백질(BNS002)에 의한 암조직에서의 면역세포 활성 정도를 확인한 것으로, 상세하게는 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에 융합단백질(BNS002)을 처리하고 35일째 적출한 암조직 내 대식세포, 수지상세포(DC), CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 NK 세포의 활성 정도를 FACS 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 40은 인간 유래 폐암 세포(H460) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002)의 항암효과 확인을 위한 투여 및 실험 일정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 41은 인간 유래 폐암 세포(H460) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002) 투여에 의한 종양 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 42는 인간 유래 폐암 세포(H460) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002) 투여에 의한 종양 억제 효과에 대한 통계적 유의미성을 확인한 결과이다.
도 43은 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002)의 항암효과 확인을 위한 투여 및 실험 일정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 44는 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002) 투여에 의한 농도 의존적 종양 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 45는 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002) 농도별 투여에 따른 체중 변화 정도를 확인한 결과이다.
도 46은 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002 또는 BNS002S)과 대조 약물간의 항암효과 확인을 위한 투여 및 실험 일정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 47은 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002; PD-1 D-Fc-IL-15) 투여에 의한 종양 억제 효과를 비교 대조군인 BNS001D(PD-1 D-Fc) 및 BNS002I(Fc-IL-15) 융합단백질 단독 또는 병용 투여와 비교한 결과이다.
도 48은 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002; PD-1 D-Fc-IL-15) 투여에 의한 체중 변화 정도를 비교 대조군인 BNS001D(PD-1 D-Fc) 및 BNS002I(Fc-IL-15) 융합단백질 단독 또는 병용 투여와 비교한 결과이다.
도 49는 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002; PD-1 D-Fc-IL-15) 투여에 의한 종양 억제 효과를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 50은 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002; PD-1 D-Fc-IL-15) 투여에 의한 체중 변화 정도를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 51은 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002S; PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 투여에 의한 종양 억제 효과를 비교 대조군인 BNS001D(PD-1 D-Fc) 및 BNS002I(Fc-IL-15) 융합단백질 단독 또는 병용 투여와 비교한 결과이다.
도 52는 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002S; PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 투여에 의한 체중 변화 정도를 비교 대조군인 BNS001D(PD-1 D-Fc) 및 BNS002I(Fc-IL-15) 융합단백질 단독 또는 병용 투여와 비교한 결과이다.
도 53은 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002S; PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 투여에 의한 종양 억제 효과를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 54는 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002S; PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 투여에 의한 체중 변화 정도를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 55는 인간 유래 폐암 세포(A549) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002 또는 BNS002S)과 대조 약물간의 항암효과 확인을 위한 투여 및 실험 일정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 56은 인간 유래 폐암 세포(A549) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002; PD-1 D-Fc-IL-15) 투여에 의한 종양 억제 효과를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 57은 인간 유래 폐암 세포(A549) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002; PD-1 D-Fc-IL-15) 투여에 의한 체중 변화 정도를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 58은 인간 유래 폐암 세포(A549) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002S; PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 투여에 의한 농도 의존적 종양 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 59는 인간 유래 폐암 세포(A549) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002S; PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 농도별 투여에 따른 체중 변화 정도를 확인한 결과이다.
도 60은 인간 유래 폐암 세포(A549) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002S; PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 투여에 의한 종양 억제 효과를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 61은 인간 유래 폐암 세포(A549) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002S; PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 투여에 의한 체중 변화 정도를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 62는 인간 유래 유방암 세포(MDA-MB-231) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002 또는 BNS002S)과 대조 약물간의 항암효과 확인을 위한 투여 및 실험 일정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 63은 인간 유래 유방암 세포(MDA-MB-231) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002; PD-1 D-Fc-IL-15) 투여에 의한 종양 억제 효과를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 64는 인간 유래 유방암 세포(MDA-MB-231) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002; PD-1 D-Fc-IL-15) 투여에 의한 체중 변화 정도를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 65는 인간 유래 유방암 세포(MDA-MB-231) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002S; PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 투여에 의한 종양 억제 효과를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 66은 인간 유래 유방암 세포(MDA-MB-231) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002S; PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 투여에 의한 체중 변화 정도를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 67은 융합단백질(BNS002) 이량체의 일 실시예를 도식화한 것이다.
도 68은 융합단백질(BNS002S) 이량체의 일 실시예를 도식화한 것이다.
도 2는 SEC-HPLC 분석을 수행하여 수득한 융합단백질(BNS002)의 순도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 UV 분광광도계를 이용하여 수득한 융합단백질(BNS002)의 농도를 확인한 것이다.
도 4는 형광(Fluorescence) 및 SLS(Static Light Scattering) 검출기를 이용하여 수득한 융합단백질(BNS002)의 열역학적 안정성을 확인한 것이다.
도 5는 FT-IR(Fourier-transform infrared spectroscopy) 분광광도계를 이용하여 수득한 융합단백질(BNS002)의 구조적 안정성을 확인한 것이다.
도 6은 SEC-MALS(Size Exclusion Chomatography - Multi-Angle Laser Light Scattering) 분석을 통해 수득한 융합단백질(BNS002)의 분자량을 확인한 것이다.
도 7은 수득한 융합단백질(BNS002)과 hPD-L1(human Programmed cell death ligand-1) 간의 결합 친화성을 확인한 결과이다.
도 8은 hPD-1 단백질(human Programmed cell death protein-1)과 hPD-L1 간의 결합 친화성을 확인한 결과이다.
도 9는 수득한 융합단백질(BNS002)과 hPD-L2(human Programmed cell death ligand-2) 간의 결합 친화성을 확인한 결과이다.
도 10은 hPD-1 단백질과 hPD-L2 간의 결합 친화성을 확인한 결과이다.
도 11은 수득한 융합단백질(BNS002)과 hIL-15Rα(human Interleukin-15 receptor alpha) 간의 결합 친화성을 확인한 결과이다.
도 12는 hIL-15 단백질과 hIL-15Rα(human Interleukin-15 receptor alpha) 간의 결합 친화성을 확인한 결과이다.
도 13은 수득한 융합단백질(BNS002)과 hIL-2Rβ(human Interleukin-15 receptor beta) 간의 결합 친화성을 확인한 결과이다.
도 14는 hIL-15 단백질과 hIL-2Rβ(human Interleukin-15 receptor beta) 간의 결합 친화성을 확인한 결과이다.
도 15는 수득한 융합단백질(BNS002)과 hFcRn 리셉터(human neonatal Fc receptor) 간의 결합 친화성을 확인한 결과이다.
도 16은 수득한 융합단백질(BNS002)과 PD-L1 간의 결합 친화성을 ELISA 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 17은 수득한 융합단백질(BNS002)과 PD-L2 간의 결합 친화성을 ELISA 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 18은 수득한 융합단백질(BNS002)과 IL-15Rα 간의 결합 친화성을 ELISA 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 19는 수득한 융합단백질(BNS002)과 IL-2Rβ(Interleukin-2 receptor beta) 간의 결합 친화성을 ELISA 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 20은 수득한 융합단백질(BNS002)과 hFcRn 리셉터 간의 결합 친화성을 LumitTM FcRn binding immunoassay 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 21은 수득한 융합단백질(BNS002)과 IL-15 리셉터 간의 결합 친화성을 PathHunter® eXpress Dimerization Assay 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 22는 수득한 융합단백질(BNS002) 및 IL-15를 각각 말초혈액 단핵세포(PBMC)에 처리하고, 배양시 면역세포가 포함된 PBMC에서 분비되는 IFN-γ의 양을 ELISA 분석을 통해 측정한 결과이다.
도 23은 수득한 융합단백질(BNS002) 및 IL-15 단백질이 CD8+ T 세포의 증식에 미치는 영향을 FACS 분석을 통해 확인한 것이다.
도 24는 수득한 융합단백질(BNS002) 및 IL-15 단백질이 CD4+ T 세포의 증식에 미치는 영향을 FACS 분석을 통해 확인한 것이다.
도 25a는 수득한 융합단백질(BNS002) 및 IL-15 단백질이 NK 세포의 증식에 미치는 영향을 FACS 분석을 통해 확인한 것이다.
도 25b는 수득한 융합단백질(BNS002) 및 IL-15 단백질이 NK 세포의 증식에 미치는 영향을 FACS 분석을 통해 확인한 결과를 그래프화한 것이다.
도 26은 수득한 융합단백질(BNS002)이 이펙터(effector) T 세포에 미치는 영향을 PD-L1/PD-1 차단 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 27은 수득한 융합단백질(BNS002)이 이펙터 T 세포에 미치는 영향을 PD-L2/PD-1 차단 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 28은 파이어플라이 루시퍼라아제(Firefly luciferase) 및 GFP(Green fluorescent protein) 발현 세포주 제작에 이용한 렌티바이러스(lentivirus) 벡터맵을 개략적으로 나타낸 것이다. 여기에서, CMV는 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 유래의 프로모터이고, RSV는 호흡기세포융합바이러스 (Respiratory syncytial virus) 유래의 프로모터이다.
도 29는 본 발명에서 확립한 파이어플라이 루시퍼라아제 및 GFP 발현 인간 흑색종양 세포주(A375-Luc-GFP)의 발광 신호(좌) 및 형광 신호(우)를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 30은 본 발명의 일실시예에 따른 인간 흑색종양 세포주(A375-Luc-GFP)에서 특이적으로 발현하는 PD-L1 및 PD-L2 유전자(좌)와 면역세포를 포함하고 있는 PBMC에서 특이적으로 발현하는 PD-1 유전자(우)의 발현 양상을 역전사(reverse transcription) PCR을 통해 확인한 것이다.
도 31은 수득한 융합단백질(BNS002) 및 IL-15를 각각 공동배양한 인간 흑색종양 세포주(A375-Luc-GFP) 및 말초혈액 단핵세포(PBMC)에 처리하고, 배양시 세포에서 분비되는 IFN-γ의 양을 ELISA 분석을 통해 측정한 결과이다.
도 32는 수득한 융합단백질(BNS002)을 공동배양한 인간 흑색종양 세포주(A375-Luc-GFP) 및 말초혈액 단핵세포(PBMC)에 처리하고, 처리 시간별 암세포 살상 효과를 탈수소효소(Dehydrogenase)인 숙시네이트-테트라졸리움 환원효소(succinate-tetrazolium reductase) 활성 측정을 통해 분석한 것이다.
도 33은 수득한 융합단백질(BNS002)을 공동배양한 인간 흑색종양 세포주(A375-Luc-GFP) 및 말초혈액 단핵세포(PBMC)에 48시간 처리한 후, 암세포 살상 효과를 탈수소효소인 숙시네이트-테트라졸리움 환원효소 활성 측정을 통해 확인한 것이다.
도 34는 수득한 융합단백질(BNS002)을 공동배양한 인간 흑색종양 세포주(A375-Luc-GFP) 및 말초혈액 단핵세포(PBMC)에 농도별로 처리하고, 처리 농도별 암세포 살상 효과를 탈수소효소인 숙시네이트-테트라졸리움 환원효소 활성 측정을 통해 분석한 것이다.
도 35는 수득한 융합단백질(BNS002)의 암세포주(A375-Luc-GFP) 특이적인 항체 의존성 세포 독성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 활성을 확인한 것이다.
도 36은 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서 융합단백질(BNS002)의 항암효과 확인을 위한 투여 및 실험 일정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 37은 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서 융합단백질(BNS002)에 의한 종양 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 38은 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서 융합단백질(BNS002)에 의한 종양 억제 효과에 대한 통계적 유의미성을 확인한 결과이다.
도 39는 수득한 융합단백질(BNS002)에 의한 암조직에서의 면역세포 활성 정도를 확인한 것으로, 상세하게는 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에 융합단백질(BNS002)을 처리하고 35일째 적출한 암조직 내 대식세포, 수지상세포(DC), CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 NK 세포의 활성 정도를 FACS 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 40은 인간 유래 폐암 세포(H460) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002)의 항암효과 확인을 위한 투여 및 실험 일정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 41은 인간 유래 폐암 세포(H460) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002) 투여에 의한 종양 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 42는 인간 유래 폐암 세포(H460) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002) 투여에 의한 종양 억제 효과에 대한 통계적 유의미성을 확인한 결과이다.
도 43은 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002)의 항암효과 확인을 위한 투여 및 실험 일정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 44는 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002) 투여에 의한 농도 의존적 종양 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 45는 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002) 농도별 투여에 따른 체중 변화 정도를 확인한 결과이다.
도 46은 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002 또는 BNS002S)과 대조 약물간의 항암효과 확인을 위한 투여 및 실험 일정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 47은 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002; PD-1 D-Fc-IL-15) 투여에 의한 종양 억제 효과를 비교 대조군인 BNS001D(PD-1 D-Fc) 및 BNS002I(Fc-IL-15) 융합단백질 단독 또는 병용 투여와 비교한 결과이다.
도 48은 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002; PD-1 D-Fc-IL-15) 투여에 의한 체중 변화 정도를 비교 대조군인 BNS001D(PD-1 D-Fc) 및 BNS002I(Fc-IL-15) 융합단백질 단독 또는 병용 투여와 비교한 결과이다.
도 49는 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002; PD-1 D-Fc-IL-15) 투여에 의한 종양 억제 효과를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 50은 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002; PD-1 D-Fc-IL-15) 투여에 의한 체중 변화 정도를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 51은 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002S; PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 투여에 의한 종양 억제 효과를 비교 대조군인 BNS001D(PD-1 D-Fc) 및 BNS002I(Fc-IL-15) 융합단백질 단독 또는 병용 투여와 비교한 결과이다.
도 52는 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002S; PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 투여에 의한 체중 변화 정도를 비교 대조군인 BNS001D(PD-1 D-Fc) 및 BNS002I(Fc-IL-15) 융합단백질 단독 또는 병용 투여와 비교한 결과이다.
도 53은 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002S; PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 투여에 의한 종양 억제 효과를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 54는 인간 유래 대장암 세포(HCT116) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002S; PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 투여에 의한 체중 변화 정도를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 55는 인간 유래 폐암 세포(A549) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002 또는 BNS002S)과 대조 약물간의 항암효과 확인을 위한 투여 및 실험 일정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 56은 인간 유래 폐암 세포(A549) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002; PD-1 D-Fc-IL-15) 투여에 의한 종양 억제 효과를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 57은 인간 유래 폐암 세포(A549) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002; PD-1 D-Fc-IL-15) 투여에 의한 체중 변화 정도를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 58은 인간 유래 폐암 세포(A549) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002S; PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 투여에 의한 농도 의존적 종양 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 59는 인간 유래 폐암 세포(A549) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002S; PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 농도별 투여에 따른 체중 변화 정도를 확인한 결과이다.
도 60은 인간 유래 폐암 세포(A549) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002S; PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 투여에 의한 종양 억제 효과를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 61은 인간 유래 폐암 세포(A549) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002S; PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 투여에 의한 체중 변화 정도를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 62는 인간 유래 유방암 세포(MDA-MB-231) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002 또는 BNS002S)과 대조 약물간의 항암효과 확인을 위한 투여 및 실험 일정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 63은 인간 유래 유방암 세포(MDA-MB-231) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002; PD-1 D-Fc-IL-15) 투여에 의한 종양 억제 효과를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 64는 인간 유래 유방암 세포(MDA-MB-231) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002; PD-1 D-Fc-IL-15) 투여에 의한 체중 변화 정도를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 65는 인간 유래 유방암 세포(MDA-MB-231) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002S; PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 투여에 의한 종양 억제 효과를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 66은 인간 유래 유방암 세포(MDA-MB-231) 식립 인간화 마우스에서 융합단백질(BNS002S; PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 투여에 의한 체중 변화 정도를 양성대조군인 아테졸리주맙, 펨브로리주맙 및 아벨루맙 투여와 비교한 결과이다.
도 67은 융합단백질(BNS002) 이량체의 일 실시예를 도식화한 것이다.
도 68은 융합단백질(BNS002S) 이량체의 일 실시예를 도식화한 것이다.
PD-1 단백질 및 IL-15 단백질을 포함하는 융합단백질
본 발명의 일 측면은, PD-1 단백질 및 IL-15 단백질을 포함하는 융합단백질을 제공한다.
또한, 상기 융합단백질은 IL-15 결합 단백질을 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 융합단백질은 Fc 영역을 더 포함할 수 있다.
PD-1 단백질 또는 이의 단편
본 명세서에서 사용된 용어, "PD-1(programmed cell death protein 1 또는 programmed death receptor-1)"은 B7-CD28 패밀리(family)에 속하는 상호 억제성 수용체의 일종이며, CD279로도 알려져 있는 면역 체크포인트(immune checkpoint) 단백질이다. PD-1은 활성화된 T 세포, 자연살해 T 세포, B 세포 및 대식세포 표면에서 광범위하게 발현된다. PD-1은 이의 리간드인 PD-L1(programmed cell death ligand-1) 또는 PD-L2(programmed cell death ligand-2)와 결합하면 CD3- 및 CD28-매개된 T 세포 활성화를 억제하는 세포내 신호전달을 유도한다. 상기 T 세포 활성화의 하향조절은 T 세포 증식, IFN-γ 분비, IL-2 분비 등의 감소를 초래한다. PD-1과 다양한 종류의 암세포들(예컨대, 흑색종, 간암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 방광암, 신장암, 췌장암, 유방암, 림프종, 신경교종 등)에서 발현하고 있는 것으로 알려져 있는 이의 리간드인 PD-L1 또는 PD-L2와의 상호작용은 T 세포를 불활성화시켜 암세포가 면역체계의 공격을 피해가는 기작으로 작용한다. 따라서, PD-1과 PD-L1 또는 PD-L2와의 상호작용을 차단하면 종양 미세환경 내의 T 세포를 활성화시켜 종양세포를 제거하게 된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "PD-1", "프로그램된 세포사멸 수용체-1" 또는 "세포예정사 단백질-1"은 달리 언급되지 않는 한, 포유동물, 예를 들어, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)를 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득한 임의의 야생형 PD-1을 의미한다. 상기 PD-1은 동물 세포에서 수득된 것일 수도 있으나, PD-1을 생산할 수 있는 재조합 세포로부터 수득된 것도 포함한다. 또한, 상기 PD-1은 야생형 PD-1 또는 이의 단편일 수 있다.
PD-1은 288개의 아미노산으로 이루어진 I형 막 단백질이며, 구조는 세포외 IgV 유사 도메인(IgV-like domain), 막관통영역(transmembrane domain) 및 세포질 도메인(cytoplasmic domain)으로 구성된다. 상기 PD-1의 아미노산 서열은 GenBank accession NO. NP_005009.2 또는 UniProtkB No. Q15116에 기재된 것일 수 있다(마우스 PD-1의 아미노산 서열은 Genbank accession No. NP_032824.1 참조). 또한, 상기 PD-1을 코딩하는 서열로서 PDCD1(programmed cell death 1) 유전자는 GenBank accession NO. NM_005018.3에 기재된 서열 중 CDS(coding sequence)에 해당하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다(마우스 서열은 GenBank accession No. NM_008798.3 참조).
본 명세서에서 "PD-1 단백질"은 전장(full-length) PD-1 또는 PD-1 단편을 의미한다. 본 명세서에서는 PD-1 혹은 이의 단편을 총칭하여 "PD-1 단백질"의 용어로 표현하기도 한다. PD-1, PD-1 단백질 및 PD-1 단편은 예를 들어 PD-1의 리간드인 PD-L1 또는 PD-L2에 특이적으로 결합한다. 이 특이적인 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 확인할 수 있다.
PD-l의 리간드인 PD-L1 및 PD-L2는 암세포 표면에 발현되는 단백질로, PD-L1은 B7-H1 또는 CD274로도 알려져 있고, PD-L2는 B7-DC 또는 CD273으로도 알려져 있다. PD-L1 또는 PD-L2가 T 세포에 존재하는 PD-1과 결합하면, 면역 체크포인트(immune checkpoint) 기능을 변화시켜 T 세포의 기능을 억제한다. 즉, PD-1과 PD-L1 또는 PD-L2의 상호작용에 의해 T 세포 기능이 억제되고, 궁극적으로 암세포는 면역세포의 공격을 회피하게 된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "PD-1 단편"이란, PD-1의 절단형을 의미한다. 또한, 상기 PD-1 단편은 PD-1의 세포외도메인일 수 있다. PD-1 단편의 일 구체예로는 PD-1의 신호서열인 N-말단으로부터 1번째 내지 24번째의 아미노산이 제외된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 PD-1 단편의 일 구체예는 서열번호 18의 25번째 내지 288번째의 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 또한, 상기 PD-1 단편의 일 구체예는 서열번호 18번의 25번째 내지 170번째 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 또한, 상기 PD-1 단편의 일 구체예는 서열번호 18의 25번째 내지 150번째 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 또한, 상기 PD-1 단편의 일 구체예는 서열번호 18의 25번째 내지 144번째 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 상기 일 실시예로 PD-1 단편은 서열번호 2 또는 39의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 PD-1 단편의 일 구체예는 서열번호 31의 25번째 내지 169번째의 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 상기 일 실시예로 PD-1 단편은 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
IL-15 또는 이의 변이체
본 명세서에서 사용된 용어, "IL-15" 또는 "인터루킨-15(interleukin-15)"는 IL-2와 구조적으로 유사한 사이토카인으로, 4개의 α-헬릭스 구조를 가지는 패밀리에 속한다. IL-15는 대식세포, 단핵구(monocyte), 수지상세포, 섬유아세포 등에서 발현된다. IL-15는 IL-15Rα(IL-15 receptor alpha), IL-2Rβ(IL-2 receptor beta; IL-15Rβ 또는 CD122로도 알려짐) 및 γc(CD132로도 알려짐) 서브유닛으로 구성된 IL-15의 수용체에 결합하여 생물학적 활성을 나타낸다. 구체적으로, IL-15 및 IL-15Rα는 활성화된 수지상세포에서 함께 발현되고, IL-15/IL-15Rα 복합체 형태로 기능한다. IL-15/IL-15Rα 복합체는 NK 세포 및 T 세포 상의 IL-2Rβ/γc에 결합하여 결과적으로 T 세포 및 NK 세포의 분화 및 증식을 유도한다. 즉, T 세포 및 NK 세포의 지속적인 세포용해 활성(cytolytic activity)으로 면역 억제를 극복하여 종양세포를 효율적으로 사멸시킬 수 있다. 또한, IL-15는 B 세포에 의한 면역글로불린 합성 유도 및 림프구 항상성(lymphoid homeostasis) 조절을 촉진한다. 더욱이, IL-15는 IL-2Rβ 및 IL-2Rγ 수용체를 IL-2와 공유하지만, IL-2Rα(CD25) 수용체에는 결합하지 않아 면역을 억제하는 조절 T 세포(regulatory T cells, Treg)를 활성화하지 않는 장점이 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "IL-15" 또는 "인터루킨-15"는 달리 언급되지 않는 한, 포유동물, 예를 들어, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)를 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득한 임의의 야생형 IL-15를 의미한다. 상기 IL-15는 동물 세포에서 수득된 것일 수도 있으나, IL-15를 생산할 수 있는 재조합 세포로부터 수득된 것도 포함한다. 또한, 상기 IL-15는 야생형 IL-15, 동종형(isoform), 또는 이의 변이체일 수 있다.
IL-15는 신호 펩타이드 길이가 상이한 두 개의 IL-15 동종형이 존재하지만, 이 두 개의 동종형은 동일한 성숙형 IL-15를 생성한다. IL-15 동종형은 48개 아미노산의 긴 신호 펩타이드가 존재하는 IL-15 LSP(Isoform IL-15-S48AA; Interlekin-15 isoform 1 preproprotein, Homo sapiens, GenBank accession No. NP_000576.1)가 있고, 21개 아미노산의 짧은 신호 펩타이드가 존재하는 IL-15 SSP(Isoform IL-15-S21AA; Interleukin-15 isofrom 2 preproprotein, Homo sapiens, GenBank accession No. NP_751915.1)가 있다. 상기 두 개의 IL-15 동종형은 N-말단의 신호 서열 사이에 11개의 아미노산(CFSAGLPKTEA)을 공유하고 있으며, 세포내 이동(intracellular trafficking)에 차이가 있으나 동일한 성숙형 IL-15를 생성한다. 상기 IL-15 LSP 동종형은 골지체, 초기 엔도좀 및 소포체(ER)에서 분비되는 반면, IL-15 SSP 동종형은 분비되지 않고 세포질 및 핵에 존재한다.
IL-15는 시그널 펩타이드 및 성숙 폴리펩타이드로 이루어지며, 이의 아미노산 서열은 GenBank accession No. NP_000576.1, NP_751915.1, CAA71044.1 또는 UniProtkB No. P40933에 기재된 것일 수 있다(마우스 IL-15의 아미노산 서열은 Genbank accession No. NP_001241676.1 참조). 또한, 상기 IL-15를 코딩하는 서열로서 IL-15 유전자는 GenBank accession NO. NM_000585.5, NM_172175.3 또는 Y09908.1에 기재된 서열 중 CDS(coding sequence)에 해당하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다(마우스 서열은 GenBank accession No. NM_001254747.1 참조).
구체적으로, IL-15는 136개의 아미노산으로 이루어지며, 아미노산 잔기 1(Met) 내지 22(Ala)의 분비신호 서열, 아미노산 잔기 23(Asn) 내지 136(Ser)의 성숙 폴리펩타이드로 이루어질 수 있다. 또한, IL-15는 162개의 아미노산으로 이루어지며, 아미노산 잔기 1(Met) 내지 48(Ala)의 분비신호 서열, 아미노산 잔기 49(Asn) 내지 162(Ser)의 성숙 폴리펩타이드로 이루어질 수 있다. 또한, IL-15는 135개의 아미노산으로 이루어지며, 아미노산 잔기 1(Met) 내지 21(Ala)의 분비신호 서열, 아미노산 잔기 22(Asn) 내지 135(Ser)의 성숙 폴리펩타이드로 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 "IL-15 단백질"은 전장(full-length) IL-15, IL-15 단편 또는 IL-15 변이체를 의미한다. 본 명세서에서는 IL-15, IL-15 단편, 혹은 이의 변이체를 총칭하여 "IL-15 단백질" 혹은 "IL-15 폴리펩티드"의 용어로 표현하기도 한다. IL-15, IL-15 단백질, IL-15 폴리펩티드, 및 IL-15 변이체는 예를 들어 IL-15Rα 또는 IL-2Rβ에 특이적으로 결합한다. 이 특이적인 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 확인할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, 상기 IL-15의 일 구체예는 서열번호 19, 20, 21 또는 32의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 이때, 상기 IL-15는 성숙된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 성숙된 IL-15는 신호서열을 포함하지 않는 것일 수 있으며, 서열번호 6 또는 24의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 이때, 상기 IL-15는 야생형 IL-15의 N-말단 또는 C-말단의 일부가 결실된(truncated) 단편을 포함하는 개념으로 이용될 수 있다.
또한, 상기 IL-15의 단편은 서열번호 19의 아미노산 서열을 가지는 단백질의 N 말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개 또는 22개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다. 또한, 상기 IL-15의 단편은 서열번호 19의 아미노산 서열을 가지는 단백질의 C 말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개 또는 22개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다.
또한, 상기 IL-15의 단편은 서열번호 20의 아미노산 서열을 가지는 단백질의 N 말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개 또는 48개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다. 또한, 상기 IL-15의 단편은 서열번호 20의 아미노산 서열을 가지는 단백질의 C 말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개 또는 48개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다.
또한, 상기 IL-15의 단편은 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 단백질의 N 말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 21개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다. 또한, 상기 IL-15의 단편은 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 단백질의 C 말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 21개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다.
또한, 상기 IL-15의 단편은 서열번호 32의 아미노산 서열을 가지는 단백질의 N 말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개 또는 48개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다. 또한, 상기 IL-15의 단편은 서열번호 32의 아미노산 서열을 가지는 단백질의 C 말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개 또는 48개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "IL-15 변이체"는 전장(full-length) IL-15 또는 상술한 IL-15의 단편의 아미노산 일부가 치환된 형태를 의미한다. 즉, IL-15 변이체는 야생형 IL-15 또는 이의 단편과 다른 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러나, 상기 IL-15 변이체는 야생형 IL-15와 동등하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 여기에서, "IL-15 활성"은 예를 들어 IL-15Rα 또는 IL-2Rβ에 특이적으로 결합하는 것을 의미할 수 있으며, 이 특이적 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 측정할 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-15 변이체는 야생형 IL-15의 아미노산 일부가 결실 및/또는 치환된 것일 수 있다. 아미노산 결실 및/또는 치환에 의한 IL-15 변이체의 일 구체예로는 미국등록특허 제10,450,359호에 개시된 바와 같이, 서열번호 19의 아미노산 서열에서 1(Met) 내지 22(Ala)의 분비신호 서열을 결실시키고, 성숙한 114개의 아미노산 펩타이드의 72번째 위치에서 Asn(N)을 Asp(D)로 또는 Asn(N)을 Ala(A)로 아미노산 치환시킨 것일 수 있다. 또한, 서열번호 20의 아미노산 서열에서 1(Met) 내지 48(Ala)의 분비신호 서열을 결실시키고, 성숙한 114개의 아미노산 펩타이드의 72번째 위치에서 Asn(N)을 Asp(D)로 또는 Asn(N)을 Ala(A)로 아미노산 치환시킨 것일 수 있다. 또한, 서열번호 21의 아미노산 서열에서 1(Met) 내지 21(Ala)의 분비신호 서열을 결실시키고, 성숙한 114개의 아미노산 펩타이드의 72번째 위치에서 Asn(N)을 Asp(D)로 또는 Asn(N)을 Ala(A)로 아미노산 치환시킨 것일 수 있다. 상기 IL-15 변이체는 야생형 IL-15와 비교하여 IL-15의 활성이 유지되거나 개선된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
또한, 상기 PD-1 단백질 및 상기 IL-15 단백질은 링커 혹은 캐리어(carrier)에 의해 결합된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 PD-1 또는 이의 단편 및 상기 IL-15 또는 이의 변이체는 링커 혹은 캐리어에 의해 결합된 것일 수 있다. 본 명세서에서 링커와 캐리어는 호환적으로 사용되기도 한다.
링커
상기 링커는 두 개의 단백질을 연결시켜준다. 링커의 일 구체예로는 1개 내지 50개의 아미노산, 알부민 또는 이의 단편, 또는 면역글로불린의 Fc 도메인 등을 포함할 수 있다. 이때, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CH1)은 포함하지 않는 단백질을 의미한다. 상기 면역글로불린은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM 일 수 있으며, 바람직하게는 IgG1일 수 있다. 이때, 야생형 면역글로불린 G1의 Fc 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인 뿐만 아니라, Fc 도메인 변이체일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어 "Fc 도메인 변이체"는 야생형 Fc 도메인의 당쇄 형태(glycosylation pattern)와 다르거나, 야생형 Fc 도메인에 비해 증가된 당쇄, 야생형 Fc 도메인에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거된(deglycosylated) 형태일 수 있다. 또한 무당쇄(aglycosylated) Fc 도메인도 포함된다. Fc 도메인 혹은 변이체는 배양조건 혹은 호스트의 유전자 조작을 통해 조정된 숫자의 시알산(sialic acid), 퓨코실화(fucosylation), 당화(glycosylation)를 갖도록 한 것일 수 있다.
또한, 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린의 Fc 도메인의 당쇄를 변형시킬 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 면역글로불린은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역이 혼합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 상기 Fc 도메인의 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다. 상기 Fc 도메인 변이체의 일 구체예로는 서열번호 14의 아미노산 서열에서 Q81R, M198L, L79G, T136S, L138A, Y177V, Q81R/M198L, L79G/M198L, T136S/L138A/Y177V 또는 Q81R/T136S/L138A/Y177V/M198L의 치환이 일어난 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 Fc 도메인 변이체의 일 구체예로는 서열번호 4, 10, 55, 88 또는 97의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 아미노산 치환에 의한 Fc 도메인 변이체의 일 구체예로는 한국등록특허 제10-1957431호에 개시된 바와 같이, FcRn(neonatal Fc receptor)에 대한 결합 및 해리를 조정하는 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인 변이체일 수 있으며, 이는 특히, 낮은 pH에서 FcRn에 대한 증가된 결합 친화도(binding affinity)를 나타내고, 높은 pH에서 실질적으로 변화된 결합을 나타내지 않은 Fc 변이체, 또는 그의 기능적 변이체를 포함할 수 있다.
상기 Fc 도메인 변이체는 pH 5.6 내지 6.2(바람직하게는 pH 5.8 내지 6.0)에서 FcRn에 대한 결합 친화도가 야생형 Fc 도메인과 비교하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상 증가되거나, 야생형 Fc 도메인 보다 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상 또는 100배 이상 증가될 수 있다.
상기 Fc 도메인 변이체는 pH 7.0 내지 7.8(바람직하게는 pH 7.2 내지 7.6)에서 FcRn(neonatal Fc receptor)으로부터 해리(dissociation)되는 정도가 야생형 Fc 도메인과 비교하여 동일하거나 실질적으로 변화되지 않을 수 있다.
또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 야생형과 비교하여 반감기(Half-life)가 증가된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 Fc 도메인 변이체의 반감기는 야생형 Fc 도메인과 비교하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상 증가되거나, 야생형 Fc 도메인 보다 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상 또는 10배 이상 증가될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "FcRn(neonatal Fc receptor)" 또는 "신생아 Fc 수용체"는 MHC class I 관련 단백질로서 혈관 내피세포에서 발현되며 IgG와 알부민에 결합한다. 특징적인 점은 IgG와 FcRn 사이의 결합이 pH가 약산성일 때 강하며, 중성 pH에서는 결합력이 없다는 점이다. 따라서, 세포흡수작용(pinocytosis) 또는 내포작용(endocytosis)에 의해 세포내로 들어오는 IgG는 pH 6.0 조건의 엔도좀(endosome)에서 Fc 감마 수용체(FcγR)의 일종인 FcRn에 강하게 결합하여 분해성 리소좀(degradative lysosome) 경로를 회피할 수 있으며, 다시 세포막으로 순환하면 IgG는 pH 7.4인 혈류 내에서 FcRn으로부터 급속하게 해리된다. 이러한 수용체-매개 재순환 메커니즘(receptor mediated recycling mechanism)에 의해 FcRn은 리소좀에서 IgG의 분해를 효과적으로 차단하여 IgG의 반감기를 연장하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "Fc 감마 수용체(FcγR)"는 IgG에 대한 Fc 수용체로서, FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16)로 크게 세 종류가 있다. Fc 수용체는 면역글로불린과 결합하고 결합한 항체가 항원과의 결합 부위와 독립적으로 여러가지 생물학적 기능을 수행하게 하는 분자로, 각종 세포와 조직의 표면에 분포하고 있다. Fc 수용체는 세포독성, 항체 매개성 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC), 사이토카인 등 매개물의 분비, 탐식작용, 산화작용의 개시, 항체 생산의 조절 등에 관여한다.
융합단백질은 Fc 도메인을 링커(혹은 캐리어)로 하여 이의 N-말단과 C-말단에 각각 PD-1과 IL-15 단백질이 연결되거나 혹은 IL-15와 PD-1이 연결된 구조를 가질 수 있다. Fc 도메인의 N-말단 혹은 C-말단과 PD-1 혹은 IL-15의 연결은 임의적으로 링커 펩타이드에 의해 이루어질 수 있다.
IL-15 결합 단백질
상기 PD-1 단백질 또는 이의 단편 및 IL-15 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질은 추가적으로 IL-15 결합 단백질을 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "IL-15 결합 단백질"은 IL-15에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 펩타이드 일 수 있다. 이때, 상기 IL-15 결합 단백질의 일 구체예는 "IL-15Rα의 스시 도메인"일 수 있다. 상기 IL-15Rα의 세포외 영역의 부분에 상응하는 상기 스시 도메인은 IL-15에 대한 결합을 위해 필요하다. IL-15Rα의 상기 스시 도메인은 포유류 IL-15Rα의 스시 도메인, 바람직하게는 영장류 IL-15Rα의 스시 도메인, 더 바람직하게는 인간 IL-15Rα의 스시 도메인이다. 상기 IL-15Rα의 스시 도메인의 일 구체예는 서열번호 95의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 IL-15Rα의 스시 도메인은 상기 서열번호 95의 단편일 수 있다(ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPP(서열번호 95)).
융합단백질 구조
구체적으로, 상기 융합단백질은 하기 구조식 I 내지 IV로 이루어진 그룹 중 어느 하나일 수 있다:
N'-A-[L1]n-Fc 도메인-[L2]m-B-[L3]l-S-C' I
N'-A-[L1]n-Fc 도메인-[L2]m-S-[L3]l-B-C' II
N'-S-[L3]l-B-[L1]n-Fc 도메인-[L2]m-A-C' III
N'-B-[L3]l-S-[L1]n-Fc 도메인-[L2]m-A-C' IV
이때, 상기 구조식 I 내지 IV에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 A는 PD-1 단백질 또는 이의 단편이고,
상기 B는 IL-15 단백질 또는 이의 변이체이며,
상기 S는 IL-15 결합 단백질이며,
상기 L1, L2 및 L3은 각각 펩타이드 링커이고,
상기 n, m 및 l은 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
이때, PD-1 단백질 또는 이의 단편, IL-15 단백질 또는 이의 변이체, IL-15 결합 단백질, 펩타이드 링커, 및 Fc 도메인은 상술한 바와 같다.
구체적으로, 상기 융합단백질의 구조에서 IL-15 결합 단백질이 제거된 형태는 구조식 V 또는 VI 일 수 있다:
N'-A-[L1]n-Fc 도메인-[L2]m-B-C' V
N'-B-[L1]n-Fc 도메인-[L2]m-A-C' VI
이때, 상기 구조식 V 및 VI에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 A는 PD-1 단백질 또는 이의 단편이고,
상기 B는 IL-15 단백질 또는 이의 변이체이며,
상기 L1 및 L2은 각각 펩타이드 링커이고,
상기 n 및 m은 각각 독립적으로, O 또는 1이다. 이때, PD-1 단백질 또는 이의 단편, IL-15 단백질 또는 이의 변이체, 펩타이드 링커, 및 Fc 도메인은 상술한 바와 같다.
바람직하게는, 상기 융합단백질은 구조식 V로 이루어진 것일 수 있다. 상기 PD-1 단백질 및 상기 IL-15 단백질은 각각 상술한 바와 같다. 일 구체예에 따르면, PD-1 단백질은 야생형 PD-1의 N-말단 혹은 C-말단으로부터 연속적으로 약 24개까지의 아미노산 잔기가 결실된(truncated) 단편일 수 있다. IL-15 단백질은 야생형 IL-15의 N-말단 혹은 C-말단으로부터 연속적으로 약 21개 내지 48개까지의 아미노산 잔기가 결실된(truncated) 단편일 수 있다. 혹은 IL-15 단백질은 IL-15의 단편의 아미노산 일부가 결실 및/또는 치환된 IL-15 변이체일 수 있다.
구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 8, 12, 16, 26, 29, 33, 37, 41, 46, 49, 57, 60, 77, 80, 83, 90 또는 93의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또 다른 구체예에 따르면, 융합단백질은 서열번호 8, 12, 16, 26, 29, 33, 37, 41, 46, 49, 57, 60, 77, 80, 83, 90 또는 93의 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 혹은 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이때, 동일성은, 예를 들어, 퍼센트 상동성, NCBI(National Center of Biotechnology Information)의 BlastN software와 같은 상동성 비교 소프트웨어를 통해 결정될 수 있다.
상기 PD-1 단백질과 Fc 도메인의 사이에는 펩타이드 링커 L1이 포함될 수 있다. 상기 펩타이드 링커 L1은 5 내지 80개의 연속된 아미노산, 20 내지 60개의 연속된 아미노산, 또는 25 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 30 내지 40개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 펩타이드 링커 L1은 30개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 펩타이드 링커 L1은 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 1개, 2개 또는 3개의 시스테인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커 L1은 면역글로불린의 힌지에서 유래된 것일 수 있다. 일 구체예에서는, 상기 펩타이드 링커 L1이 서열번호 3 또는 43의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
상기 펩타이드 링커 L2 또는 L3은 1 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 3 내지 30개의 연속된 아미노산, 또는 5 내지 15개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 펩타이드 링커 L2 또는 L3은 (G4S)n(이때, n은 1 내지 10의 정수)이거나 이를 포함할 수 있다. 이때, (G4S)n에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 일 구체예에서는, 상기 펩타이드 링커 L2가 서열번호 5, 44 또는 62의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다. 일 구체예에서는, 상기 펩타이드 링커 L3은 서열번호 96의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 PD-1 단백질 또는 이의 단편, 및 상기 IL-15 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질 두 개가 결합된 융합단백질 이량체를 제공한다.
상기 PD-1 또는 이의 단편 및 IL-15 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질은 상술한 바와 같다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 PD-1 단백질 또는 이의 단편, 상기 IL-15 단백질 또는 이의 변이체, 및 IL-15 결합 단백질을 포함하는 융합단백질 두 개가 결합된 융합단백질 이량체를 제공한다.
상기 PD-1 또는 이의 단편, IL-15 단백질 또는 이의 변이체, 및 IL-15 결합 단백질를 포함하는 융합단백질은 상술한 바와 같다.
이때, 이량체를 구성하는 융합단백질 간의 결합은 링커 내에 존재하는 시스테인에 의해 이황화 결합에 의해 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이량체를 구성하는 융합단백질은 동일한 것일 수도 있으나, 서로 상이한 융합단백질일 수 있다. 바람직하게는, 상기 이량체는 동형이량체(homodimer)인 것일 수 있다. 상기 이량체를 구성하는 융합단백질의 일 실시예는 서열번호 8, 12, 16, 26, 29, 33, 37, 41, 46, 49, 57, 60, 77, 80, 83, 90 또는 93의 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 또 다른 측면은, PD-1 단백질 및 IL-15 단백질을 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9, 13, 17, 27, 30, 35, 38, 42, 47, 50, 58, 61, 78, 81, 84, 91 또는 94의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 PD-1 단백질 및 IL-15 단백질을 포함하는 융합단백질은 상술한 바와 같다. 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오티드 합성법 등을 들 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9, 13, 17, 27, 30, 35, 38, 42, 47, 50, 58, 61, 78, 81, 84, 91 또는 94와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 동일성을 가지는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 신호서열(signal sequence) 또는 리더 서열(leader sequence)을 코딩하는 핵산을 추가적으로 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "신호서열"은 목적 단백질의 분비를 지시하는 신호펩타이드를 의미한다. 상기 신호펩타이드는 숙주세포에서 번역된 후에 절단된다. 구체적으로, 상기 신호서열은 ER(endoplasmic reticulum) 막을 관통하는 단백질의 이동을 개시하는 아미노산 서열이다. 일 실시예로, 상기 신호서열은 서열번호 1 또는 22의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
신호서열은 당업계에 그 특징이 잘 알려져 있으며, 통상 16 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하나, 그보다 더 많거나 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 신호 펩타이드는 기본 N-말단 영역, 중심의 소수성 영역, 및 보다 극성인(polar) C-말단 영역의 세 영역으로 구성된다. 중심 소수성 영역은 미성숙 폴리펩타이드가 이동하는 동안 막지질 이중층을 통하여 신호서열을 고정시키는 4 내지 12개의 소수성 잔기를 포함한다.
개시 이후에, 신호서열은 흔히 신호 펩티다아제(signal peptidases)로 알려진 세포 효소에 의하여 ER의 루멘(lumen) 내에서 절단된다. 이때, 상기 신호서열은 tPa(tissue Plasminogen Activation), HSV gDs(signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D), 또는 성장 호르몬(growth hormone)의 분비신호서열일 수 있다. 바람직하게, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포에서 사용되는 분비 신호서열을 사용할 수 있다. 또한, 상기 신호서열은 야생형 PD-1 및/혹은 IL-15에 포함된 신호서열을 사용하거나, 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하여 사용할 수 있다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적재된 벡터
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 숙주세포에 도입되어 숙주세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있다. 또는 상기 벡터는 에피좀으로서 자발적으로 복제될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 상기 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 벡터는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등)이 될 수 있다. 상기 벡터는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
본 명세서에서 사용된 용어, 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현"은, DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 융합단백질 생산물 또는 이의 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다. 유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(cytomegalovirus) 프로모터, 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호서열을 포함할 수 있다.
융합단백질을 발현하는 형질전환된 세포
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 벡터가 도입된 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
상기 형질전환 세포의 숙주세포로서, 원핵세포, 진핵세포, 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 상기 원핵세포의 일 예로는 대장균을 사용할 수 있다. 또한, 진핵세포의 일 예로는 효모를 사용할 수 있다. 또한, 상기 포유동물 세포로 CHO 세포, F2N 세포, CSO 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, HEK 293 세포 또는 HEK293T 세포 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
또한, 숙주세포로 발현벡터를 도입하는 경우, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 융합단백질의 치료제로서의 특성을 최적하거나 기타 다른 목적을 위해 숙주세포가 갖고 있는 당화(glycosylation) 관련 유전자를 당업자에게 알려져 있는 방법을 통해 조작하여 융합단백질의 당쇄 패턴(예를 들어, 시알산, 퓨코실화, 당화)을 조정할 수 있다.
융합단백질 생산 방법
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계를 포함하는 PD-1 단백질 및 IL-15 단백질을 포함하는 융합단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 생산방법은 i) 상기 형질전환 세포를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 ii) 상기 배양물로부터 융합단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 형질전환 세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch 또는 repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
융합단백질 또는 이의 이량체의 용도
본 발명의 또 다른 측면은, PD-1 단백질 및 IL-15 단백질을 포함하는 융합단백질 또는 상기 융합단백질 두 개가 결합된 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 암질환 치료 또는 예방용, 및/또는 치료효과(efficacy)를 증가시킬 수 있는 약학 조성물을 제공한다.
상기 PD-1 단백질 및 IL-15 단백질을 포함하는 융합단백질 또는 상기 융합단백질 두 개가 결합된 융합단백질 이량체는 상술한 바와 같다.
상기 암은 대장암, 흑색종, 위암, 간암, 폐암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 방광암, 신장암, 담낭암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 암질환 치료용 또는 예방용 약학 조성물에서 그 유효성분은 항암 활성을 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량% 내지 20.0 중량% 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 항암 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "치료"는 치료학적 처리 및 예방적 처리를 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 이때, 예방은 개체의 병리학적 상태 또는 질환을 완화시키거나 감소시키는 의미로 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 용어 "치료"는 인간을 포함한 포유류에서 질환을 치료하기 위한 적용이나 어떠한 형태의 투약을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 질환 또는 질환의 진행을 억제하거나 늦추는 것을 포함하며; 손상되거나, 결손된 기능을 회복시키거나, 수리하여, 질환을 부분적이거나 완전하게 완화시키거나; 또는 비효율적인 프로세스를 자극하거나; 심각한 질환을 완화하는 의미를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "효능(efficacy)"은 1년, 5년, 또는 10년과 같이 일정 기간에 걸쳐 생존 또는 질병이 없는 상태에서 생존(disease-free survival)과 같은 하나 이상의 파라미터에 의해 결정될 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 파라미터는 개체에서 적어도 하나의 종양의 크기가 억제되는 것을 포함할 수 있다.
생체이용률과 같은 약동학적 파라미터(Pharmacokinetic parameters) 및 클리어런스율(clearance rate)과 같은 기본적인 파라미터(underlying parameters)도 효능에 영향을 줄 수 있다. 따라서, "향상된 효능" (예를 들어, 효능의 개선)은 향상된 약동학적 파라미터 및 향상된 효능에 기인할 수 있으며, 시험 동물 또는 인간 대상체에서 클리어런스율 및 종양 성장을 비교하거나, 생존, 재발율 또는 질병이 없는 상태에서 생존과 같은 파라미터를 비교하여 측정될 수 있다.
여기서 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 구체예에서 치료학적으로 유효한 양은 암을 치료하는데 효과적인 약물의 양을 의미한다.
이때, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.01 ㎍/kg 내지 10 g/kg 범위, 또는 0.01 mg/kg 내지 1 g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본원 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
상기 약학 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다. 본원의 약학 조성물은 유효성분 이외에, 항암 활성의 상승·보강을 위하여 이미 안전성이 검증되고 항암 활성에 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암질환을 치료하기 위한 PD-1 단백질 및 IL-15 단백질을 포함하는 융합단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암질환의 치료효과를 향상(enhance)시키기 위한 PD-1 단백질 및 IL-15 단백질을 포함하는 융합단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암질환 치료용 약제를 제조하기 위한 PD-1 단백질 및 IL-15 단백질을 포함하는 융합단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, PD-1 단백질 및 IL-15 단백질을 포함하는 융합단백질 또는 상기 융합단백질 두 개가 결합된 융합단백질 이량체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암질환을 치료하는 방법, 및/또는 치료효과를 향상시키는 방법을 제공한다.
상기 개체는 암질환을 앓고 있는 개체일 수 있다. 또한 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다. 상기 PD-1 단백질 및 IL-15 단백질을 포함하는 융합단백질 또는 상기 융합단백질 두 개가 결합된 융합단백질 이량체는 상술한 바와 같다.
상기 융합단백질 또는 융합단백질 이량체의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 융합단백질 또는 융합단백질 이량체는 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
융합단백질 또는 이의 이량체를 포함하는 세포 배양 배지
본 발명의 또 다른 측면은, PD-1 단백질 및 IL-15 단백질을 포함하는 융합단백질 또는 상기 융합단백질 두 개가 결합된 융합단백질 이량체를 포함하는 세포 배양 배지를 제공한다.
이때, 상기 세포는 T 세포 또는 자연살해세포 일 수 있다. 상기 세포 배양용 배지는 세포 배양용 배지에 PD-1 단백질 및 IL-15 단백질을 포함하는 융합단백질 또는 상기 융합단백질 두 개가 결합된 융합단백질 이량체가 첨가된 배지일 수 있다. 상기 세포 배양용 배지는 아미노산(amino acids), 당류(sugars), 무기염(inorganic salts) 및 비타민으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 세포 배양용 배지는 아미노산, 당류, 무기염 및 비타민을 모두 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "세포 배양용 배지"는 세포를 배양하기 위해 사용된 배지를 의미하며, 구체적으로 면역세포, 보다 구체적으로 CD4+ 또는 CD8+ T 세포; 또는 NK 세포를 배양하기 위한 배지를 의미한다. 시험관 내에서(in vitro) 세포 성장 및 생존을 위해 세포가 필요로 하는 성분을 함유하거나, 세포 성장 및 생존을 돕는 성분을 함유한다. 구체적으로, 상기 성분은 비타민, 필수 또는 비필수 아미노산, 및 미량 원소일 수 있다. 상기 배지는 세포, 바람직하게는 진핵세포, 더 바람직하게는 T 세포 또는 NK 세포 배양에 사용되는 배지일 수 있다.
이하, 본원 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본원 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본원 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
I. 융합단백질 제조: BNS002
제조예 1. hPD-1 D-Fc(29)-hIL-15의 제조
인간 PD-1 단편, 지속형 Fc(29) 도메인 및 IL-15를 포함한 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 1), PD-1 단편(서열번호 2), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3), Fc(29) 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 IL-15(서열번호 6)를 N-말단부터 상기 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 7)을 코딩하는 염기서열(서열번호 9)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 GenScript사의 Gene Synthesis 서비스를 통해 합성하여 pcDNA3.4 TOPO 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 도입하였다.
상기 발현벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-STM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 상기 발현벡터로 CHO 세포에 형질감염 후 제조사의 Max Protocol로 9일 동안 배양한 후 배양액을 회수하고 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질(서열번호 8)을 "hPD-1 D-Fc(29)-hIL-15" 또는 "BNS002(29)"로 칭하고, 이와 같이 PD-1 및 IL-15를 포함하는 융합단백질 이량체를 "BNS002"로 통칭하였다.
회수한 배양액 내 융합단백질은 Protein A Resin(MabSelect SureTM; Cytiva)이 포함된 친화성 크로마토그래피(Affinity Chromatography)를 이용하여 1차 정제하였다. Buffer A(20 mM Sodium Phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.1)로 융합단백질을 결합 및 Resin 세척 후, Buffer B(100 mM Citrate, pH 3.0)로 결합된 융합단백질만을 용출하였다. 용출된 융합단백질은 1 M Tris-HCl(pH 9.0) 버퍼로 중화(pH 7.0)하였고, 원심분리 필터(Amicon Ultra-15, Merck)를 이용하여 농축 및 PBS로 버퍼 교환을 수행하였다. 버퍼 교환된 융합단백질은 HiLoad® 26/600 Superdex® 200 pg 칼럼(Cytiva)을 이용한 크기배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography)를 수행하여 2차 정제하였다. 분리 정제된 융합단백질은 Cedex Bio HT Analyzer(Roche)의 IGGHB 분석법으로 정량하고, SDS-PAGE 및 SEC-HPLC 분석을 수행하여 순도를 분석하였다(도 1 및 도 2).
제조예 2. hPD-1 D-Fc(41)-hIL-15의 제조
인간 PD-1 단편, 지속형 Fc(41) 도메인 및 IL-15를 포함한 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 1), PD-1 단편(서열번호 2), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3), Fc(41) 도메인(서열번호 10), 링커(서열번호 5) 및 IL-15(서열번호 6)를 N-말단부터 상기 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 11)을 코딩하는 염기서열(서열번호 13)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 GenScript사의 Gene Synthesis 서비스를 통해 합성하여 pcDNA3.4 TOPO 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 도입하였다.
상기 발현벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-STM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 상기 발현벡터로 CHO 세포에 형질감염 후 제조사의 Max Protocol로 9일 동안 배양한 후 배양액을 회수하고 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질(서열번호 12)을 "hPD-1 D-Fc(41)-hIL-15" 또는 "BNS002(41)"로 칭하고, 이와 같이 PD-1 및 IL-15를 포함하는 융합단백질 이량체를 "BNS002"로 통칭하였다.
융합단백질 정제 및 회수는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 분리 정제된 융합단백질은 Cedex Bio HT Analyzer(Roche)의 IGGHB 분석법으로 정량하고, SDS-PAGE 및 SEC-HPLC 분석을 수행하여 순도를 분석하였다(도 1 및 도 2).
제조예 3. hPD-1 D-Fc(wt)-hIL-15의 제조
인간 PD-1 단편, 지속형 Fc(wt) 도메인 및 IL-15를 포함한 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 1), PD-1 단편(서열번호 2), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3), Fc(wt) 도메인(서열번호 14), 링커(서열번호 5) 및 IL-15(서열번호 6)를 N-말단부터 상기 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 15)을 코딩하는 염기서열(서열번호 17)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 GenScript사의 Gene Synthesis 서비스를 통해 합성하여 pcDNA3.4 TOPO 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 도입하였다.
상기 발현벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-STM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 상기 발현벡터로 CHO 세포에 형질감염 후 제조사의 Max Protocol로 9일 동안 배양한 후 배양액을 회수하고 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질(서열번호 16)을 "hPD-1 D-Fc(wt)-hIL-15" 또는 "BNS002(wt)"로 칭하고, 이와 같이 PD-1 및 IL-15를 포함하는 융합단백질 이량체를 "BNS002"로 통칭하였다.
융합단백질 정제 및 회수는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 분리 정제된 융합단백질은 Cedex Bio HT Analyzer(Roche)의 IGGHB 분석법으로 정량하고, SDS-PAGE 및 SEC-HPLC 분석을 수행하여 순도를 분석하였다(도 1 및 도 2).
제조예 4. mPD-1 D-Fc(29)-mIL-15의 제조
마우스 PD-1 단편, 지속형 Fc(29) 도메인 및 IL-15를 포함한 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 22), PD-1 단편(서열번호 23), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3), Fc(29) 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 IL-15(서열번호 24)을 N-말단부터 상기 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 25)을 코딩하는 염기서열(서열번호 27)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 GenScript사의 Gene Synthesis 서비스를 통해 합성하여 pcDNA3.4 TOPO 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 도입하였다.
상기 발현벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-STM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 상기 발현벡터로 CHO 세포에 형질감염 후 제조사의 Max Protocol로 11일 동안 배양한 후 배양액을 회수하고 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질(서열번호 26)을 "mPD-1 D-Fc(29)-mIL-15" 또는 "mBNS002(29)"로 칭하고, 이와 같이 mPD-1 및 mIL-15를 포함하는 융합단백질 이량체를 "BNS002"로 통칭하였다. 융합단백질 정제 및 회수는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
제조예 5. mPD-1 D-Fc(wt)-mIL-15의 제조
마우스 PD-1 단편, 지속형 Fc(wt) 도메인 및 IL-15를 포함한 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 22), PD-1 단편(서열번호 23), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3), Fc(wt) 도메인(서열번호 14), 링커(서열번호 5) 및 IL-15(서열번호 24)을 N-말단부터 상기 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 28)을 코딩하는 염기서열(서열번호 30)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 GenScript사의 Gene Synthesis 서비스를 통해 합성하여 pcDNA3.4 TOPO 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 도입하였다.
상기 발현벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-STM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 상기 발현벡터로 CHO 세포에 형질감염 후 제조사의 Max Protocol로 11일 동안 배양한 후 배양액을 회수하고 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질(서열번호 29)을 "mPD-1 D-Fc(wt)-mIL-15" 또는 "mBNS002(wt)"로 칭하고, 이와 같이 PD-1 및 IL-15를 포함하는 융합단백질 이량체를 "BNS002"로 통칭하였다. 융합단백질 정제 및 회수는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
제조예 6. hPD-1 D-Fc(29)-mIL-15의 제조
인간 PD-1 단편, 지속형 Fc(29) 도메인 및 마우스 IL-15를 포함한 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 1), PD-1 단편(서열번호 2), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3), Fc(29) 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 마우스 IL-15(서열번호 24)을 N-말단부터 상기 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 36)을 코딩하는 염기서열(서열번호 38)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 GenScript사의 Gene Synthesis 서비스를 통해 합성하여 pcDNA3.4 TOPO 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 도입하였다.
상기 발현벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-STM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 상기 발현벡터로 CHO 세포에 형질감염 후 제조사의 Max Protocol로 11일 동안 배양한 후 배양액을 회수하고 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질(서열번호 37)을 "hPD-1 D-Fc(29)-mIL-15"로 칭하고, 이와 같이 PD-1 및 IL-15를 포함하는 융합단백질 이량체를 "BNS002"로 통칭하였다. 융합단백질 정제 및 회수는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
제조예 7. hPD-1 ECD-Fc(29)-hIL-15의 제조
인간 PD-1 단편, 지속형 Fc(29) 도메인 및 IL-15를 포함한 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 1), PD-1 단편(서열번호 39), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3), Fc(29) 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 IL-15(서열번호 6)을 N-말단부터 상기 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 40)을 코딩하는 염기서열(서열번호 42)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 GenScript사의 Gene Synthesis 서비스를 통해 합성하여 pcDNA3.4 TOPO 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 도입하였다.
상기 발현벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-STM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 상기 발현벡터로 CHO 세포에 형질감염 후 제조사의 Max Protocol로 11일 동안 배양한 후 배양액을 회수하고 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질(서열번호 41)을 "hPD-1 ECD-Fc(29)-hIL-15"로 칭하고, 이와 같이 PD-1 및 IL-15를 포함하는 융합단백질 이량체를 "BNS002"로 통칭하였다. 융합단백질 정제 및 회수는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
제조예 8. hIL-15-Fc(29)-hPD-1 D의 제조
인간 IL-15 단편, 지속형 Fc(29) 도메인 및 PD-1 단편을 포함한 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 22), IL-15(서열번호 6), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 43), Fc(29) 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 44) 및 PD-1 단편(서열번호 2)을 N-말단부터 상기 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 45)을 코딩하는 염기서열(서열번호 47)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 GenScript사의 Gene Synthesis 서비스를 통해 합성하여 pcDNA3.4 TOPO 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 도입하였다.
상기 발현벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-STM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 상기 발현벡터로 CHO 세포에 형질감염 후 제조사의 Max Protocol로 11일 동안 배양한 후 배양액을 회수하고 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질(서열번호 46)을 "hIL-15-Fc(29)-hPD-1 D"로 칭하고, 이와 같이 PD-1 및 IL-15를 포함하는 융합단백질 이량체를 "BNS002"로 통칭하였다. 융합단백질 정제 및 회수는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
제조예 9. hIL-15-Fc(29)-hPD-1 ECD의 제조
인간 IL-15 단편, 지속형 Fc(29) 도메인 및 PD-1 단편을 포함한 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 22), IL-15(서열번호 6), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 43), Fc(29) 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 44) 및 PD-1 단편(서열번호 39)을 N-말단부터 상기 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 48)을 코딩하는 염기서열(서열번호 50)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 GenScript사의 Gene Synthesis 서비스를 통해 합성하여 pcDNA3.4 TOPO 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 도입하였다.
상기 발현벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-STM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 상기 발현벡터로 CHO 세포에 형질감염 후 제조사의 Max Protocol로 11일 동안 배양한 후 배양액을 회수하고 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질(서열번호 49)을 "hIL-15-Fc(29)-hPD-1 ECD"로 칭하고, 이와 같이 PD-1 및 IL-15를 포함하는 융합단백질 이량체를 "BNS002"로 통칭하였다. 융합단백질 정제 및 회수는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
제조예 10. hPD-1 D-Fc(29, H)-hIL-15의 제조
인간 PD-1 단편, 지속형 Fc(29, H) 도메인 및 IL-15를 포함한 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 1), PD-1 단편(서열번호 2), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3), Fc(29, H) 도메인(서열번호 55), 링커(서열번호 5) 및 IL-15(서열번호 6)을 N-말단부터 상기 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 56)을 코딩하는 염기서열(서열번호 58)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 GenScript사의 Gene Synthesis 서비스를 통해 합성하여 pcDNA3.4 TOPO 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 도입하였다.
상기 발현벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-STM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 상기 발현벡터로 CHO 세포에 형질감염 후 제조사의 Max Protocol로 11일 동안 배양한 후 배양액을 회수하고 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질(서열번호 57)을 "hPD-1 D-Fc(29, H)-hIL-15"로 칭하고, 이와 같이 PD-1 및 IL-15를 포함하는 융합단백질 이량체를 "BNS002"로 통칭하였다. 융합단백질 정제 및 회수는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
제조예 11. hPD-1 D-Fc(29, H)-mIL-15의 제조
인간 PD-1 단편, 지속형 Fc(29, H) 도메인 및 마우스 IL-15 단편을 포함한 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 1), PD-1 단편(서열번호 2), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3), Fc(29, H) 도메인(서열번호 55), 링커(서열번호 5) 및 IL-15(서열번호 24)을 N-말단부터 상기 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 59)을 코딩하는 염기서열(서열번호 61)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 GenScript사의 Gene Synthesis 서비스를 통해 합성하여 pcDNA3.4 TOPO 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 도입하였다.
상기 발현벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-STM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 상기 발현벡터로 CHO 세포에 형질감염 후 제조사의 Max Protocol로 11일 동안 배양한 후 배양액을 회수하고 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질(서열번호 60)을 "hPD-1 D-Fc(29, H)-mIL-15"로 칭하고, 이와 같이 PD-1 및 IL-15를 포함하는 융합단백질 이량체를 "BNS002"로 통칭하였다. 융합단백질 정제 및 회수는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
제조예 12. hPD-1 ECD-Fc(wt)-hIL-15의 제조
인간 PD-1 단편, 지속형 Fc(wt) 도메인 및 IL-15를 포함한 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 1), PD-1 단편(서열번호 39), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3), Fc(wt) 도메인(서열번호 14), 링커(서열번호 5) 및 IL-15(서열번호 6)을 N-말단부터 상기 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 76)을 코딩하는 염기서열(서열번호 78)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 GenScript사의 Gene Synthesis 서비스를 통해 합성하여 pcDNA3.4 TOPO 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 도입하였다.
상기 발현벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-STM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 상기 발현벡터로 CHO 세포에 형질감염 후 제조사의 Max Protocol로 11일 동안 배양한 후 배양액을 회수하고 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질(서열번호 77)을 "hPD-1 ECD-Fc(wt)-hIL-15"로 칭하고, 이와 같이 PD-1 및 IL-15를 포함하는 융합단백질 이량체를 "BNS002"로 통칭하였다. 융합단백질 정제 및 회수는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
제조예 13. hIL-15-Fc(wt)-hPD-1 D의 제조
인간 IL-15 단편, 지속형 Fc(wt) 도메인 및 PD-1 단편을 포함한 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 22), IL-15(서열번호 6), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 43), Fc(wt) 도메인(서열번호 14), 링커(서열번호 44) 및 PD-1 단편(서열번호 2)을 N-말단부터 상기 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 79)을 코딩하는 염기서열(서열번호 81)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 GenScript사의 Gene Synthesis 서비스를 통해 합성하여 pcDNA3.4 TOPO 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 도입하였다.
상기 발현벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-STM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 상기 발현벡터로 CHO 세포에 형질감염 후 제조사의 Max Protocol로 11일 동안 배양한 후 배양액을 회수하고 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질(서열번호 80)을 "hIL-15-Fc(wt)-hPD-1 D"로 칭하고, 이와 같이 PD-1 및 IL-15를 포함하는 융합단백질 이량체를 "BNS002"로 통칭하였다. 융합단백질 정제 및 회수는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
제조예 14. hIL-15-Fc(wt)-hPD-1 ECD의 제조
인간 IL-15 단편, 지속형 Fc(wt) 도메인 및 PD-1 단편을 포함한 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 22), IL-15(서열번호 6), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 43), Fc(wt) 도메인(서열번호 14), 링커(서열번호 44) 및 PD-1 단편(서열번호 39)을 N-말단부터 상기 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 82)을 코딩하는 염기서열(서열번호 84)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 GenScript사의 Gene Synthesis 서비스를 통해 합성하여 pcDNA3.4 TOPO 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 도입하였다.
상기 발현벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-STM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 상기 발현벡터로 CHO 세포에 형질감염 후 제조사의 Max Protocol로 11일 동안 배양한 후 배양액을 회수하고 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질(서열번호 83)을 "hIL-15-Fc(wt)-hPD-1 ECD"로 칭하고, 이와 같이 PD-1 및 IL-15를 포함하는 융합단백질 이량체를 "BNS002"로 통칭하였다. 융합단백질 정제 및 회수는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
제조예 15. hPD-1 D-Fc(wt, H)-hIL-15의 제조
인간 PD-1 단편, 지속형 Fc(wt, H) 도메인 및 IL-15를 포함한 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 1), PD-1 단편(서열번호 2), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3), Fc(wt, H) 도메인(서열번호 88), 링커(서열번호 5) 및 IL-15(서열번호 6)을 N-말단부터 상기 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 89)을 코딩하는 염기서열(서열번호 91)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 GenScript사의 Gene Synthesis 서비스를 통해 합성하여 pcDNA3.4 TOPO 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 도입하였다.
상기 발현벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-STM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 상기 발현벡터로 CHO 세포에 형질감염 후 제조사의 Max Protocol로 11일 동안 배양한 후 배양액을 회수하고 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질(서열번호 90)을 "hPD-1 D-Fc(wt, H)-hIL-15"로 칭하고, 이와 같이 PD-1 및 IL-15를 포함하는 융합단백질 이량체를 "BNS002"로 통칭하였다. 융합단백질 정제 및 회수는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
제조예 16. hPD-1 D-Fc(wt, H)-mIL-15의 제조
인간 PD-1 단편, 지속형 Fc(wt, H) 도메인 및 마우스 IL-15 단편을 포함한 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 1), PD-1 단편(서열번호 2), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3), Fc(wt, H) 도메인(서열번호 88), 링커(서열번호 5) 및 마우스 IL-15 단편(서열번호 24)을 N-말단부터 상기 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 92)을 코딩하는 염기서열(서열번호 94)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 GenScript사의 Gene Synthesis 서비스를 통해 합성하여 pcDNA3.4 TOPO 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 도입하였다.
상기 발현벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-STM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 상기 발현벡터로 CHO 세포에 형질감염 후 제조사의 Max Protocol로 11일 동안 배양한 후 배양액을 회수하고 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질(서열번호 93)을 "hPD-1 D-Fc(wt, H)-mIL-15"로 칭하고, 이와 같이 PD-1 및 IL-15를 포함하는 융합단백질 이량체를 "BNS002"로 통칭하였다. 융합단백질 정제 및 회수는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
제조예 17. PD-1D-Fc-IL-15Rα/IL-15(BNS002S)의 제조
인간 PD-1 단편, 지속형 Fc(29) 도메인 및 IL-15Rα/IL-15를 포함한 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 1), PD-1 단편(서열번호 2), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3), Fc(29) 도메인(서열번호 4), 링커 1(서열번호 5), IL-15Rα(서열번호 95), 링커 4(서열번호 96) 및 IL-15(서열번호 6)을 N-말단부터 상기 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 34)을 코딩하는 염기서열(서열번호 35)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 코스모진텍사의 Gene Synthesis 서비스를 통해 합성하여 pcDNA3.4 TOPO 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 도입하였다.
상기 발현벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-STM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 상기 발현벡터로 CHO 세포에 형질감염 후 제조사의 Max Protocol로 8일 동안 배양한 후 배양액을 회수하고 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질(서열번호 33)을 "hPD-1 D-Fc-hIL-15Rα/hIL-15"로 칭하고, 이와 같이 PD-1 및 IL-15Rα/IL-15를 포함하는 융합단백질 이량체를 "BNS002S"로 통칭하였다.
회수한 배양액 내 융합단백질은 Protein A Resin(KANEKA)이 포함된 친화성 크로마토그래피(Affinity Chromatography)를 이용하여 1차 정제하였다. DPBS 버퍼로 융합단백질을 결합 및 Resin 세척 후, 0.1 M 글리신(Glycine) 버퍼(pH 3.3)로 결합된 융합단백질만을 용출하였다. 용출된 융합단백질은 하루 동안 DPBS 버퍼로 투석하여 버퍼 교환하였고, HiLoad® 16/600 Superdex® 200 pg 칼럼(Cytiva)을 이용한 크기 배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography)를 수행하여 2차 정제하였다. 분리 정제된 융합단백질은 NanoDrop을 이용하여 정량하고, SDS-PAGE 및 SEC-HPLC 분석을 수행하여 순도를 분석하였다.
제조예 18. BNS001D(PD-1 D-Fc)의 제조
인간 PD-1 단편과 지속형 Fc(29) 도메인을 포함한 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 1), PD-1 단편(서열번호 2), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3), Fc(29)K 도메인(서열번호 97)을 N-말단부터 상기 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 98)을 코딩하는 염기서열(서열번호 100)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 코스모진텍사의 Gene Cloning 서비스를 통해 pcDNA3.4 TOPO 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 도입하였다.
상기 발현벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-STM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 상기 발현벡터로 CHO 세포에 형질감염 후 제조사의 Max Protocol로 11일 동안 배양한 후 배양액을 회수하고 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질(서열번호 99)을 "hPD-1 D-Fc"로 칭하고, 이와 같이 PD-1 및 Fc를 포함하는 융합단백질 이량체를 "BNS001D"로 통칭하였다. 융합단백질 정제 및 회수는 상기 제조예 17과 동일한 방법으로 수행하였다.
제조예 19. BNS002I(Fc-IL-15)의 제조
지속형 Fc(29) 도메인과 인간 IL-15 단편을 포함한 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 22), Ig 힌지(서열번호 57), Fc(29) 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 IL-15(서열번호 6)을 N-말단부터 상기 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 52)을 코딩하는 염기서열(서열번호 54)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 코스모진텍사의 Gene Cloning를 통해 pcDNA3.4 TOPO 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 도입하였다.
상기 발현벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-STM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 상기 발현벡터로 CHO 세포에 형질감염 후 제조사의 Max Protocol로 10일 동안 배양한 후 배양액을 회수하고 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질(서열번호 53)을 "Fc-IL-15"로 칭하고, 이와 같이 Fc 및 IL-15를 포함하는 융합단백질 이량체를 "BNS002I"로 통칭하였다. 융합단백질 정제 및 회수는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
II. BNS002 융합단백질의 순도 분석
실험예 1. SEC-HPLC 분석
분리 정제된 융합단백질에 대한 순도 확인을 위해, SEC-HPLC 실험을 수행하였다. UV 검출기를 가진 Waters Alliance HPLC 시스템으로 크기 배제 HPLC(high performance liquid chromatography)를 수행하였다. 컬럼(TSK G3000 SWXL, 5 ㎛ SEC column)은 Tosoh Bioscience로부터 구입하였다. 100 mM NaPi, 150 mM NaCl(pH 7.0)를 이동상으로 사용하였다. 100% 등용매(isocratic) 이송 조건에서 0.5 mL/분 유속으로 시간에 따른 280 nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 융합단백질의 순도를 분석하였다(도 2).
분리 정제된 BNS002 융합단백질은 98% 이상의 순도를 가짐을 확인하였다(도 2).
III. BNS002 융합단백질의 농도 분석
실험예 2. 농도 분석
융합단백질을 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL 농도가 되도록 희석하였다. UV 분광광도계(Little lunatic, Unchained Labs)를 이용하여 파장범위 230 nm~400 nm 영역에서 UV 흡광도를 측정하였다. 각 농도의 융합단백질을 0.2 mg/mL 농도가 되도록 희석한 후 산 가수분해를 진행하였다. 가수분해된 아미노산을 유도체화 시키고, Waters ACQUITY UPLC 시스템으로 UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography)를 수행하였다. 컬럼은 AccQ-Tag Ultra RP 컬럼(2.1 mm×100 mm, 1.7 ㎛, 130Å)을 사용하였다. 이동상 A는 5% AccQ-tag A 용매, 이동상 B는 AccQ-tag B 용매를 사용하여 A:B 초기 비율을 99.9:0.1로 시작하였고, 7.5분까지 40.4:59.6 비율의 구배 시스템(gradient system)을 수행하였다. 시료 주입량은 1 ㎕이었으며, 0.7 mL/분 유속이었고, 컬럼 온도는 55℃였다. 데이터 시스템은 Enpower 3 Software를 이용하였고, 시료 전처리 단계에서 넣어준 표준액(I.S.)으로 데이터를 적합화하였다.
분리 정제된 BNS002 융합단백질의 흡광도에 따른 함량을 확인하여 흡광계수(Extinction coefficinet)를 결정하였다. 흡광계수로 융합단백질의 농도를 확인하여 1.99 mg/mL의 농도로 융합단백질이 포함된 것을 확인하였다(도 3).
IV. BNS002 융합단백질의 물성 분석
실험예 3. 열역학적 안정성 분석
분리 정제된 융합단백질에 대한 열역학적 안정성 확인을 위해, 형광(Fluorescence), 광산란(Static Light Scattering, SLS), 동적 광산란(Dynamic Light Scattering, DLS) 검출기를 가진 UNCHAINED LABS UNcle 분광광도계 시스템으로 Tm, Tagg & Tonset 분석을 수행하였다. 융합단백질을 초순수를 이용하여 버퍼를 교환하고 UNCHAINED LABS Little Lunatic 장비를 이용하여 분석에 필요한 단백질 농도의 1.25배가 되도록 시료를 준비하였다. 초순수를 이용하여 준비된 시료 1.25×와 제제 버퍼(formulation buffer) 5×를 희석하였다. 준비된 시료를 Uni(UNCHAINED LABS)에 로딩(loading)하고 15~95℃까지 266 nm 파장에서 Fluorescence & SLS 검출기로 Tm, Tagg & Tonset를 측정하였다. UNCHAINED LABS 소프트웨어 Uncle Analysis V4.01을 이용하여 데이터를 분석하였다.
분리 정제된 BNS002 융합단백질에 대한 열역학적 안정성은 도 4에 나타난 바와 같이 측정되었다.
실험예 4. 구조적 안정성 분석
분리 정제된 융합단백질에 대한 구조적 안정성 확인을 위해, FT-IR 분광광도계(Thermo Nicolet IS50, Single-Bounce ATR Diamond Crystal attached)를 이용하여 이차구조 분석을 수행하였다. 융합단백질을 10 mg/mL의 농도가 되도록 시료를 준비하였다. FT-IR 장비의 분석 조건은 상 분해능(phase resolution)은 4 cm-1로, 데이터 간격(data spacing)은 1 cm-1로 설정하여 500~4000 cm-1 구간에서 128번 반복 측정하였다. 융합단백질 이차구조 함량을 분석하기 위해 1700~1600 cm-1 구간의 제로 오더(zero order) FT-IR 스펙트럼 데이터를 이용하였다. 이때, ATR 샘플링 악세서리(ATR sampling accessory)를 이용하여 분석함에 따라, 초기에 획득한 FT-IR 스펙트럼 데이터에 대해 ATR 보정(correction)을 하고, 보정 후 확보한 차감된 스펙트럼(subtracted spectrum)에서 2300 cm-1 부위의 수증기 밴드(water vapor band)를 제거하였다. 또한, 기준선 보정(baseline correction)과 11-포인트(point) 사비츠키-골레이 함수(Savitzky-Golay function)로 피팅(fitting)하여 최종 제로 오더 FT-IR 스펙트럼을 확보하였다. FT-IR 분석을 통해 확보한 제로 오더 FT-IR 스펙트럼 중 1700~1600 cm-1 구간의 데이터를 선형-맞춤 함수(linear-fit function)로 계산하여 이차 미분 스펙트럼(second derivative spectrum)을 확보하였다. 이차 미분 스펙트럼에서 피크(peak)들을 추출하였으며, 추출된 피크들을 가우시안 함수(Gaussian function)로 피팅(fitting)하였다. 피크의 크기와 위치는 3% 사이의 허용오차(tolerance)로 조절하여 최종 추출된 스펙트럼(extracted spectrum)을 확보하였다. 이차 미분 스펙트럼에서 추출된 피크에 대하여 파수(wavenumber)에 따라 이차구조를 할당하였으며 할당된 피크에 대하여 피크 면적을 계산하여 각 시료에서의 이차구조 함량을 계산하였다.
분리 정제된 BNS002 융합단백질에 대한 이차구조 분석은 도 5에 나타난 바와 같이 측정되었다.
실험예 5. 분자량 분석
분리 정제된 융합단백질의 분자량 확인을 위해, TSK G3000 SWXL, 5 ㎛ SEC 컬럼(Tosoh Bioscience, LLC) 및 UFLC Shimadzu LC-20AD 펌프(Shimadzu co.)를 이용하여 40분 동안 0.5 mL/분 유속으로 각 시료 100 ㎕를 분리하였다. 100 mM NaPi, 150 mM NaCl(pH 6.8)를 시료 전개 버퍼로 사용하였다. HPLC 분리 후, Dawn® Heleos II MALS 검출기 662 nm 파장 및 옵티랩 티-렉스(Optilab T-rEx®) 굴절 지수 검출기(Wyatt) 658 nm 파장을 이용하여 분석하였다. 아스트라(Astra) 소프트웨어(Wyatt) ver 6.1.5를 이용하여 데이터를 분석하였다.
분리 정제된 BNS002 융합단백질에 대한 SEC-MALS(Size Exclusion Chomatography - Multi-Angle Laser Light Scattering) 분석은 도 6에 나타난 바와 같이 측정되었다.
V. BNS002 융합단백질과 리간드 또는 리셉터 간의 동력학적 결합 친화성 확인
BNS002 융합단백질과 리간드의 동력학적 결합 친화성을 확인하기 위해 Biacore T200(GE Healthcare)를 이용하여 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 분석으로 결합 친화성을 측정하였다.
실험예 6. hPD-L1 리간드와 BNS002 융합단백질 간의 결합 친화성 확인
PD-L1 리간드는 C2H3NaO2(pH 4.0, pH 5.5)에 3~4 ㎍/mL까지 희석하고, HBS-EP, pH 7.4로 사전 활성화시킨 CM5 센서 칩(GE Healthcare) 상에 아민 커플링을 사용하여 약 1000 RU까지 고정시켰다. 0.78 nM부터 400 nM까지 다양한 농도 범위의 HBS-EP, pH 7.4로 제조한 BNS002 융합단백질 희석액을 흘려서 센서그램을 기록하였다. BNS002 융합단백질과 PD-L1 리간드 간의 결합은 4분의 결합기와 10분의 해리기와 함께 30 ㎕/분의 유속에서 측정하였다. 각 실행 사이에 10 mM NaOH를 주입하여 센서 칩 표면을 재생시켰다. 데이터 분석 소프트웨어(Ver3.2)를 이용하여 결합 동역학을 분석하고 1:1 바인딩 모델을 이용하여 데이터를 적합화하였다.
그 결과, hPD-L1 리간드와 BNS002 융합단백질 간의 결합 친화성이 도 7에 나타난 바와 같이 측정되었다.
실험예 7. hPD-L1 리간드와 hPD-1 단백질 간의 결합 친화성 확인
BNS002 융합단백질과 hPD-L1 리간드 간의 결합 친화성의 강도를 확인하기 위해, hPD-1 단백질과 hPD-L1 리간드 사이의 결합 친화성과 비교하였다. PD-L1 리간드는 C2H3NaO2(pH 4.0, pH 5.5)에 3~4 ㎍/mL까지 희석하고, HBS-EP, pH 7.4로 사전 활성화시킨 CM5 센서 칩(GE Healthcare) 상에 아민 커플링을 사용하여 약 1000 RU까지 고정시켰다. 0.78 nM부터 400 nM까지 다양한 농도 범위의 HBS-EP, pH 7.4로 제조한 hPD-1 단백질 희석액을 흘려서 센서그램을 기록하였다. hPD-L1 리간드와 hPD-1 단백질 간의 결합은 4분의 결합기와 10분의 해리기와 함께 30 ㎕/분의 유속에서 측정하였다. 각 실행 사이에 10 mM NaOH를 주입하여 센서 칩 표면을 재생시켰다. 데이터 분석 소프트웨어(Ver3.2)를 이용하여 결합 동역학을 분석하고 1:1 바인딩 모델을 이용하여 데이터를 적합화하였다.
그 결과, hPD-L1 리간드와 hPD-1 단백질 간의 결합 친화성이 도 8에 나타난 바와 같이 측정되었다. BNS002 융합단백질과 hPD-L1 리간드 간의 결합 친화성이 hPD-1 단백질과 hPD-L1 리간드 간의 결합 친화성과 유사한 것으로 확인되었다.
실험예 8. hPD-L2 리간드와 BNS002 융합단백질 간의 결합 친화성 확인
PD-L2 리간드는 C2H3NaO2(pH 4.0, pH 5.5)에 3~4 ㎍/mL까지 희석하고, HBS-EP, pH 7.4로 사전 활성화시킨 CM5 센서 칩(GE Healthcare) 상에 아민 커플링을 사용하여 약 1000 RU까지 고정시켰다. 0.78 nM부터 400 nM까지 다양한 농도 범위의 HBS-EP, pH 7.4로 제조한 BNS002 융합단백질 희석액을 흘려서 센서그램을 기록하였다. BNS002 융합단백질과 PD-L2 리간드 간의 결합은 4분의 결합기와 10분의 해리기와 함께 30 ㎕/분의 유속에서 측정하였다. 각 실행 사이에 10 mM NaOH를 주입하여 센서 칩 표면을 재생시켰다. 데이터 분석 소프트웨어(Ver3.2)를 이용하여 결합 동역학을 분석하고 1:1 바인딩 모델을 이용하여 데이터를 적합화하였다.
그 결과, hPD-L2 리간드와 BNS002 융합단백질 간의 결합 친화성이 도 9에 나타난 바와 같이 측정되었다.
실험예 9. hPD-L2 리간드와 hPD-1 단백질 간의 결합 친화성 확인
BNS002 융합단백질과 hPD-L2 리간드 간의 결합 친화성의 강도를 확인하기 위해, hPD-1 단백질과 hPD-L2 리간드 사이의 결합 친화성과 비교하였다. PD-L2 리간드는 C2H3NaO2(pH 4.0, pH 5.5)에 3~4 ㎍/mL까지 희석하고, HBS-EP, pH 7.4로 사전 활성화시킨 CM5 센서 칩(GE Healthcare) 상에 아민 커플링을 사용하여 약 1000 RU까지 고정시켰다. 0.78 nM부터 400 nM까지 다양한 농도 범위의 HBS-EP, pH 7.4로 제조한 hPD-1 단백질 희석액을 흘려서 센서그램을 기록하였다. hPD-L2 리간드와 hPD-1 단백질 간의 결합은 4분의 결합기와 10분의 해리기와 함께 30 ㎕/분의 유속에서 측정하였다. 각 실행 사이에 10 mM NaOH를 주입하여 센서 칩 표면을 재생시켰다. 데이터 분석 소프트웨어(Ver3.2)를 이용하여 결합 동역학을 분석하고 1:1 바인딩 모델을 이용하여 데이터를 적합화하였다.
그 결과, hPD-L2 리간드와 hPD-1 단백질 간의 결합 친화성이 도 10에 나타난 바와 같이 측정되었다. BNS002 융합단백질과 hPD-L2 리간드 간의 결합 친화성이 hPD-1 단백질과 hPD-L2 리간드 간의 결합 친화성과 유사한 것으로 확인되었다.
실험예 10. hIL-15Rα와 BNS002 융합단백질 간의 결합 친화성 확인
hIL-15Rα(human Interleukin-15 receptor alpha)는 C2H3NaO2(pH 4.0, pH 5.5)에 3~4 ㎍/mL까지 희석하고, HBS-EP, pH 7.4로 사전 활성화시킨 CM5 센서 칩(GE Healthcare) 상에 아민 커플링을 사용하여 약 1000 RU까지 고정시켰다. 50 nM부터 1600 nM까지 다양한 농도 범위의 HBS-EP, pH 7.4로 제조한 BNS002 융합단백질 희석액을 흘려서 센서그램을 기록하였다. BNS002 융합단백질과 hIL-15Rα 간의 결합은 4분의 결합기와 10분의 해리기와 함께 30 ㎕/분의 유속에서 측정하였다. 각 실행 사이에 10 mM NaOH를 주입하여 센서 칩 표면을 재생시켰다. 데이터 분석 소프트웨어(Ver3.2)를 이용하여 결합 동역학을 분석하고 1:1 바인딩 모델을 이용하여 데이터를 적합화하였다.
그 결과, hIL-15 리셉터와 BNS002 융합단백질 간의 결합 친화성이 도 11에 나타난 바와 같이 측정되었다.
실험예 11. hIL-15Rα와 hIL-15 단백질 간의 결합 친화성 확인
BNS002 융합단백질과 hIL-15Rα 간의 결합 친화성의 강도를 확인하기 위해, hIL-15 단백질과 hIL-15Rα 간의 결합 친화성과 비교하였다. hIL-15Rα는 C2H3NaO2(pH 4.0, pH 5.5)에 3~4 ㎍/mL까지 희석하고, HBS-EP, pH 7.4로 사전 활성화시킨 CM5 센서 칩(GE Healthcare) 상에 아민 커플링을 사용하여 약 1000 RU까지 고정시켰다. 12.5 nM부터 200 nM까지 다양한 농도 범위의 HBS-EP, pH 7.4로 제조한 hIL-15 단백질 희석액을 흘려서 센서그램을 기록하였다. hIL-15Rα와 hIL-15 단백질 간의 결합은 4분의 결합기와 10분의 해리기와 함께 30 ㎕/분의 유속에서 측정하였다. 각 실행 사이에 10 mM NaOH를 주입하여 센서 칩 표면을 재생시켰다. 데이터 분석 소프트웨어(Ver3.2)를 이용하여 결합 동역학을 분석하고 1:1 바인딩 모델을 이용하여 데이터를 적합화하였다.
그 결과, hIL-15Rα와 hIL-15 단백질 간의 결합 친화성이 도 12에 나타난 바와 같이 측정되었다. BNS002 융합단백질과 hIL-15Rα 간의 결합 친화성은 169 ~ 296 nM로 확인되었으나, hIL-15 단백질과 hIL-15Rα 간의 결합 친화성은 확인되지 않았다.
실험예 12. hIL-2Rβ와 BNS002 융합단백질 간의 결합 친화성 확인
hIL-2Rβ(human Interleukin-15 receptor beta)는 C2H3NaO2(pH 4.0, pH 5.5)에 3~4 ㎍/mL까지 희석하고, HBS-EP, pH 7.4로 사전 활성화시킨 CM5 센서 칩(GE Healthcare) 상에 아민 커플링을 사용하여 약 1000 RU까지 고정시켰다. 50 nM부터 1600 nM까지 다양한 농도 범위의 HBS-EP, pH 7.4로 제조한 BNS002 융합단백질 희석액을 흘려서 센서그램을 기록하였다. BNS002 융합단백질과 hIL-2Rβ 간의 결합은 4분의 결합기와 10분의 해리기와 함께 30 ㎕/분의 유속에서 측정하였다. 각 실행 사이에 10 mM NaOH를 주입하여 센서 칩 표면을 재생시켰다. 데이터 분석 소프트웨어(Ver3.2)를 이용하여 결합 동역학을 분석하고 1:1 바인딩 모델을 이용하여 데이터를 적합화하였다.
그 결과, hIL-2Rβ와 BNS002 융합단백질 간의 결합 친화성이 도 13에 나타난 바와 같이 측정되었다.
실험예 13. hIL-2Rβ와 hIL-15 단백질 간의 결합 친화성 확인
BNS002 융합단백질과 hIL-2Rβ 간의 결합 친화성의 강도를 확인하기 위해, hIL-15 단백질과 hIL-2Rβ 간의 결합 친화성과 비교하였다. hIL-2Rβ는 C2H3NaO2(pH 4.0, pH 5.5)에 3~4 ㎍/mL까지 희석하고, HBS-EP, pH 7.4로 사전 활성화시킨 CM5 센서 칩(GE Healthcare) 상에 아민 커플링을 사용하여 약 1000 RU까지 고정시켰다. 0.39 nM부터 200 nM까지 다양한 농도 범위의 HBS-EP, pH 7.4로 제조한 hIL-15 단백질 희석액을 흘려서 센서그램을 기록하였다. hIL-2Rβ와 hIL-15 단백질 간의 결합은 4분의 결합기와 10분의 해리기와 함께 30 ㎕/분의 유속에서 측정하였다. 각 실행 사이에 10 mM NaOH를 주입하여 센서 칩 표면을 재생시켰다. 데이터 분석 소프트웨어(Ver3.2)를 이용하여 결합 동역학을 분석하고 1:1 바인딩 모델을 이용하여 데이터를 적합화하였다.
그 결과, hIL-2Rβ와 hIL-15 단백질 간의 결합 친화성이 도 14에 나타난 바와 같이 측정되었다. BNS002 융합단백질과 hIL-2Rβ 간의 결합 친화성은 hIL-15 단백질과 hIL-2Rβ 간의 결합 친화성보다 200배 정도 낮은 것으로 확인되었다.
실험예 14. hFcRn 리셉터와 BNS002 융합단백질 간의 결합 친화성 확인
hFcRn 리셉터는 C2H3NaO2(pH 5.0)에 5 ㎍/mL까지 희석하고, 20 mM 인산염(phosphate), 150 mM NaCl, pH 6.0 및 pH 7.4로 사전 활성화시킨 CM5 센서 칩(GE Healthcare) 상에 아민 커플링을 사용하여 약 1000 RU까지 고정시켰다. 3.125 nM부터 400 nM까지 다양한 농도 범위의 20 mM 인산염, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20, pH 6.0으로 제조한 융합단백질 희석액을 흘려서 센서그램을 기록하였다. 융합단백질 결합은 4분의 결합기와 10분의 해리기와 함께 30 ㎕/분의 유속에서 측정하였다. 각 실행 사이에 50 mM NaOH를 주입하여 센서 칩 표면을 재생시켰다. 데이터 분석 소프트웨어(Ver3.2)를 이용하여 결합 동역학을 분석하고 1:1 바인딩 모델을 이용하여 데이터를 적합화하였다.
그 결과, hFcRn 리셉터와 BNS002 융합단백질 간의 결합 친화성이 도 15에 나타난 바와 같이 측정되었다. BNS002 융합단백질 중 PD-1 D-Fc(29)-IL-15와 PD-1 D-Fc(41)-IL-15 단백질이 PD-1 D-Fc(wt)-IL-15 단백질보다 hFcRn 리셉터에 대한 결합 친화성 강한 것으로 확인되었다.
VI. BNS002 융합단백질과 리간드 또는 리셉터 간의 면역학적 결합 친화성 확인
BNS002 융합단백질과 리간드의 결합 친화성을 확인하기 위해, 면역학적 분석으로 결합 친화성을 측정하였다.
실험예 15. ELISA를 통한 BNS002 융합단백질과 PD-L1 리간드 간의 결합 친화성 확인
100 ng/mL 농도의 PD-L1-Fc 리간드를 0.1 mL씩 96웰 플레이트(High binding plate, corning, #CT9018)에 4℃ 온도 조건, 16시간 동안 고정화한 후 250 ㎕의 블로킹 버퍼(blocking buffer)로 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 블로킹 후 300 ㎕의 세척 버퍼(wash buffer)로 세척 과정을 4회 진행하였다. 그 다음, 연속적으로 희석(serially dilution)된 BNS002 융합단백질을 50 ㎕씩 소분한 후 시료 희석액(sample diluent)을 50 ㎕씩 넣었다. 25 ng/mL로 희석한 검출 항체(비오틴화된 염소 항-인간 IL-15 항체(Biotinylated Goat anti-human IL-15 Ab))를 50 ㎕/웰(well)씩 첨가하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 플레이트를 400 ㎕의 세척 버퍼(washing buffer)로 4회 세척하고, 남은 용액은 완전히 제거하였다. 1× 분석 버퍼(assay buffer)를 이용하여 1:200 비율로 희석한 스트렙트아비딘-HRP(streptavidin-HRP) 100 ㎕를 웰에 첨가하고, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 플레이트를 400 ㎕의 세척 버퍼로 4회 세척하고, 남은 용액은 완전히 제거하였다. TMB 용액 100 ㎕를 각 웰에 처리한 후 빛을 차단한 상온에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 정지 용액(stop solution)을 100 ㎕씩 웰에 첨가하여 플레이트 리더기(파장: 450 nm)로 흡광도를 측정하였다. 이때, 각 실험은 모두 중복(duplicate)으로 진행하였다.
ELISA 분석 결과, BNS002 융합단백질과 PD-L1 리간드 간의 결합 친화성이 도 16에 나타난 바와 같이 측정되었다.
실험예 16. ELISA를 통한 BNS002 융합단백질과 PD-L2 리간드 간의 결합 친화성 확인
100 ng/mL 농도의 PD-L2-Fc 리간드를 0.1 mL씩 96웰 플레이트(High binding plate, corning, #CT9018)에 4℃ 온도 조건, 16시간 동안 고정화한 후 250 ㎕의 블로킹 버퍼로 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 블로킹 후 300 ㎕의 세척 버퍼로 세척 과정을 4회 진행하였다. 그 다음, 연속적으로 희석된 BNS002 융합단백질을 50 ㎕씩 소분한 후 시료 희석액을 50 ㎕씩 넣었다. 25 ng/mL로 희석한 검출 항체(비오틴화된 염소 항-인간 IL-15 항체(Biotinylated Goat anti-human IL-15 Ab))를 50 ㎕/웰(well)씩 첨가하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 플레이트를 400 ㎕의 세척 버퍼로 4회 세척하고, 남은 용액은 완전히 제거하였다. 1× 분석 버퍼를 이용하여 1:200 비율로 희석한 스트렙트아비딘-HRP(streptavidin-HRP) 100 ㎕를 웰에 첨가하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 플레이트를 400 ㎕의 세척 버퍼로 4회 세척하고, 남은 용액은 완전히 제거하였다. TMB 용액 100 ㎕를 각 웰에 처리한 후 빛을 차단한 상온에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 정지 용액을 100 ㎕씩 웰에 첨가하여 플레이트 리더기(파장: 450 nm)로 흡광도를 측정하였다. 이때, 각 실험은 모두 중복(duplicate)으로 진행하였다.
ELISA 분석 결과, BNS002 융합단백질과 PD-L2 리간드 간의 결합 친화성이 도 17에 나타난 바와 같이 측정되었다.
실험예 17. ELISA를 통한 BNS002 융합단백질과 IL-15Rα 간의 결합 친화성 확인
100 ng/mL 농도의 IL-15Rα를 0.1 mL씩 96웰 플레이트(High binding plate, corning, #CT9018)에 4℃ 온도 조건, 16시간 동안 고정화한 후 250 ㎕의 블로킹 버퍼로 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 블로킹 후 300 ㎕의 세척 버퍼로 세척 과정을 4회 진행하였다. 그 다음, 연속적으로 희석된 BNS002 융합단백질을 50 ㎕씩 소분한 후 시료 희석액을 50 ㎕씩 넣었다. 25 ng/mL로 희석한 검출 항체(비오틴화된 염소 항-인간 PD-1 항체(Biotinylated Goat anti-human PD-1 Ab))를 50 ㎕/웰(well)씩 첨가하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 플레이트를 400 ㎕의 세척 버퍼로 4회 세척하고, 남은 용액은 완전히 제거하였다. 1× 분석 버퍼를 이용하여 1:200 비율로 희석한 스트렙트아비딘-HRP(streptavidin-HRP) 100 ㎕를 웰에 첨가하고, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 플레이트를 400 ㎕의 세척 버퍼로 4회 세척하고, 남은 용액은 완전히 제거하였다. TMB 용액 100 ㎕를 각 웰에 처리한 후 빛을 차단한 상온에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 정지 용액을 100 ㎕씩 웰에 첨가하여 플레이트 리더기(파장: 450 nm)로 흡광도를 측정하였다. 이때, 각 실험은 모두 중복(duplicate)으로 진행하였다.
ELISA 분석 결과, BNS002 융합단백질과 IL-15Rα 간의 결합 친화성이 도 18에 나타난 바와 같이 측정되었다.
실험예 18. ELISA를 통한 BNS002 융합단백질과 IL-2Rβ 간의 결합 친화성 확인
100 ng/mL 농도의 IL-2Rβ를 0.1 mL씩 96웰 플레이트(High binding plate, corning, #CT9018)에 4℃ 온도 조건, 16시간 동안 고정화한 후 250 ㎕의 블로킹 버퍼로 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 블로킹 후 300 ㎕의 세척 버퍼로 세척 과정을 4회 진행하였다. 그 다음, 연속적으로 희석된 BNS002 융합단백질을 50 ㎕씩 소분한 후 시료 희석액을 50 ㎕씩 넣었다. 25 ng/mL로 희석한 검출 항체(비오틴화된 염소 항-인간 PD-1 항체(Biotinylated Goat anti-human PD-1 Ab))를 50 ㎕/웰(well)씩 첨가하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 플레이트를 400 ㎕의 세척 버퍼로 4회 세척하고, 남은 용액은 완전히 제거하였다. 1× 분석 버퍼를 이용하여 1:200 비율로 희석한 스트렙트아비딘-HRP(streptavidin-HRP) 100 ㎕를 웰에 첨가하고, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 플레이트를 400 ㎕의 세척 버퍼로 4회 세척하고, 남은 용액은 완전히 제거하였다. TMB 용액 100 ㎕를 각 웰에 처리한 후 빛을 차단한 상온에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 정지 용액을 100 ㎕씩 웰에 첨가하여 플레이트 리더기(파장: 450 nm)로 흡광도를 측정하였다. 이때, 각 실험은 모두 중복(duplicate)으로 진행하였다.
ELISA 분석 결과, BNS002 융합단백질과 IL-2Rβ 간의 결합 친화성이 도 19에 나타난 바와 같이 측정되었다.
실험예 19. FcRn 결합 면역분석법을 통한 BNS002 융합단백질과 hFcRn 리셉터 간의 결합 친화성 확인
BNS002 융합단백질의 hFcRn(human neonatal Fc receptor)에 대한 효과 기능(effect function)을 나타낼 수 있는 hFcRn에 대한 결합력을 측정하기 위해, Promega사의 LumitTM FcRn binding immunoassay kit를 사용하여 분석을 진행하였다. hFcRn이 pH-의존적 결합력을 가지고 있다고 알려져 있으므로, BNS002 융합단백질들을 pH 조정 버퍼(adjustment buffer)를 사용하여 pH 6.0으로 보정하고, FcRn 분석 버퍼(assay buffer)로 농도별로 희석하여 준비하였다. 키트 내 Tracer-LgBit 용액을 각 웰에 25 ㎕씩 분주하고, 농도별로 희석한 BNS002 융합단백질들을 각 웰에 25 ㎕씩 분주하였다. 이후, 키트 내 hFcRn-SmBiT 용액을 각 웰에 50 ㎕씩 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시키고, LumitTM FcRn Detection reagent를 각 웰에 25 ㎕씩 첨가하여 5분 동안 반응시켰다. 반응시킨 후, Synergy Neo2 (BioTek)를 이용하여 분석하였다.
LumitTM FcRn binding immunoassay 분석 결과, BNS002 융합단백질과 FcRn 리셉터 간의 결합 친화성이 도 20에 나타난 바와 같이 측정되었다.
VII. 세포-기반 분석(Cell-based assay)을 통한 BNS002 융합단백질과 IL-15 리셉터 간의 결합 친화성 확인
실험예 20. BNS002 융합단백질과 IL-15 리셉터 간의 세포기반 결합 친화성 확인
BNS002 융합단백질의 IL-15 리셉터에 대한 결합 친화성 측정은 PathHunter®eXpress Dimerization Assay Kit(Eurofins)를 사용하였고, 액체질소에 보관중인 PathHunter® eXpress Dimerization Cells을 데워진 세포 플레이팅 시약(Cell Plating Reagent)을 이용하여 해동하였다. 해동한 세포를 96웰 플레이트(SPL)에 100 ㎕씩 분주하고, BNS002 융합단백질을 농도별로 처리한 후 PathHunter® Flash Detection reagent를 각 웰에 110 ㎕씩 처리하였다. 처리 후, 상온 및 암(dark) 조건하에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, Synergy Neo2(BioTek)를 이용하여 화학발광(chemiluminescence)을 측정하였다. 측정값을 기반으로 융합단백질에 대한 EC50(Half maximal effective concentration; 약물이 투여되었을 때 해당 약물이 나타낼 수 있는 최대 효과의 절반 정도를 보일 수 있는 약물의 농도) 값을 확인하였다.
PathHunter® eXpress Dimerization Assay 측정 결과, BNS002 융합단백질과 IL-15 리셉터 간의 결합 친화성이 도 21에 나타난 바와 같이 측정되었다.
VIII. BNS002 융합단백질의 면역 활성 확인
실험예 21. BNS002 융합단백질에 의한 IFN-γ 생산량 확인
실험예 21.1. PBMC의 배양
인간에서 분리한 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 활성 배양하기 위해 PBMC 해동 전 날, T75 플라스크에 항-CD3 항체(OKT3, 1 ㎍/㎖, invitrogen)와 항-CD28 항체(CD28.2, 1 ㎍/㎖, Invitrogen)를 배양 배지(RPMI1640 배지: FBS 10%, 페니실린/스트렙토마이신 200 ㎕ 함유)에 함께 처리하여 4℃에서 밤새 코팅하였다. 다음날, PBMC를 37℃에서 천천히 해동하고 1,500 rpm으로 4℃에서 5분간 원심분리한 후 RPMI1640 배양 배지(FBS 10%, 페니실린/스트렙토마이신 200 ㎕, 항-CD3/항-CD28 항체(각 1 ㎍/㎖))로 재현탁하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 이때, 항-CD3/항-CD28 항체(각 1 ㎍/㎖)를 처리하거나 처리하지 않은 조건에서 BNS002 융합단백질과 IL-15를 처리하여, 인큐베이터에서 3일 동안 배양하였다.
실험예 21.2. ELISA 분석을 통한 인간 IFN-γ 분비량 확인
상기 실험예 21.1.에서 각 시료들을 처리하고 배양한 세포의 배양 상층액에 분비된 인간 IFN-γ의 양은 인간 IFN-γ ELISA kit(Biolegend, cat No.430103)를 사용하여 측정하였다. 항-인간-IFN-γ 항체를 ELISA 플레이트에 넣고, 4℃에서 밤새 반응시켜 코팅하였다. 이후, 1% BSA가 첨가된 PBS 용액으로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 세척 버퍼(PBS 중 0.05% Tween-20)로 세척한 후, 표준 용액 및 각각의 시료들을 2배 희석하여 넣은 후 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 플레이트를 세척하여 2차 검출 항체(detection antibody)를 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 세척한 후, 아비딘-HRP(Avidin-HRP) 용액을 첨가하여 실온에서 30분간 반응시키고, 기질 용액을 넣어 상온 및 암(dark) 조건하에서 20분간 발색 반응을 유도하였다. 마지막으로, H2S04을 넣어 발색 반응을 중지시키고, Synergy Neo2(BioTek)로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 농도 계산을 하였다.
그 결과, BNS002 융합단백질을 처리한 세포에서 IL-15 단백질을 처리한 세포보다 IFN-γ 분비량이 통계적으로 유의미하게 증가한 것을 확인하였다(도 22).
실험예 22. BNS002 융합단백질이 CD8+ T 세포의 증식에 미치는 영향 확인
인간에서 분리한 PBMC를 37℃에서 해동하고, 1,500 rpm으로 4℃에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후 부유액을 제거하고, RPMI1640 배양 배지(FBS 10%, 페니실린/스트렙토마이신 200 ㎕, BNS002 융합단백질, IL-15 단백질 (각 10 ㎍/㎖))로 재현탁하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양이 끝난 PBMC를 차가운 PBS(Sigma, pH 7.4)로 2번 세척하고 원심분리한 후, 100 ㎕당 106개의 세포(106개 세포/100 ㎕)가 되도록 PBS(1% FBS 함유)로 1.5 ㎖용 마이크로 튜브에서 재현탁시켰다. 이후, 상온에서 30분간 항-CD8-PE-Texas Red(1:100, invitrogen, cat No. MHCD0817)로 염색하였다. V-바텀 96웰 플레이트에 각 웰 당 30 ㎕ 분주 후, 유세포 분석법(Flow Cytometry)으로 CD8+ T 세포들 중 라벨링되지 않은 세포들의 비율 정도를 측정함으로써 이 세포들의 증식 정도를 확인하였다.
그 결과, BNS002 융합단백질은 IL-15 단백질과 유사한 정도의 CD8+ T 세포의 증식을 활성화시키는 것을 확인하였다(도 23).
실험예 23. BNS002 융합단백질이 CD4+ T 세포의 증식에 미치는 영향 확인
인간에서 분리한 PBMC를 37℃에서 해동하고, 1,500 rpm으로 4℃에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후 부유액을 제거하고, RPMI1640 배양 배지(FBS 10%, 페니실린/스트렙토마이신 200 ㎕, BNS002 융합단백질, IL-15 단백질 (각 10 ㎍/㎖))로 재현탁하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양이 끝난 PBMC를 차가운 PBS(Sigma, pH 7.4)로 2번 세척하고 원심분리한 후, 100 ㎕당 106개의 세포(106개 세포/100 ㎕)가 되도록 PBS(1% FBS 함유)로 1.5 ㎖용 마이크로 튜브에서 재현탁시켰다. 이후, 상온에서 30분간 항-CD4-PE-Pacific Blue(2 ㎍/106개 세포, BioLegend, cat No. 344620)로 염색하였다. V-바텀 96웰 플레이트에 각 웰 당 30 ㎕ 분주 후, 유세포 분석법(Flow Cytometry)으로 CD4+ T 세포들 중 라벨링되지 않은 세포들의 비율 정도를 측정함으로써 이 세포들의 증식 정도를 확인하였다.
그 결과, BNS002 융합단백질은 IL-15 단백질과 유사한 정도의 CD4+ T 세포의 증식을 활성화시키는 것을 확인하였으며, CD4+/FoxP3+ Treg 세포의 증식은 증가시키지 않았다(도 24).
실험예 24. BNS002 융합단백질이 NK 세포의 증식에 미치는 영향 확인
인간에서 분리한 PBMC를 37℃에서 천천히 해동하고, 1,500 rpm으로 4℃에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후 부유액을 제거하고, RPMI1640 배양 배지(FBS 10%, 페니실린/스트렙토마이신 200 ㎕, BNS002 융합단백질, IL-15 단백질 (각 10 ㎍/㎖))로 재현탁하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양이 끝난 PBMC를 차가운 PBS(Sigma, pH 7.4)로 2번 세척하고 원심분리한 후, 100 ㎕당 106개의 세포(106개 세포/100 ㎕)가 되도록 PBS(1% FBS 함유)로 1.5 ㎖용 마이크로 튜브에서 재현탁시켰다. 이후, 상온에서 30분간 항-CD56-PE(0.4 ㎍/106개 세포, BioLegend, cat No. 362508)와 항-CD16-APC(5 ㎕/106개 세포, BioLegend, cat No. 302012)로 염색하였다. V-바텀 96웰 플레이트에 각 웰 당 30 ㎕ 분주 후, 유세포 분석법(Flow Cytometry)으로 CD56+/CD16+ NK 세포들 중 라벨링되지 않은 세포들의 비율 정도를 측정함으로써 이 세포들의 증식 정도를 확인하였다.
그 결과, BNS002 융합단백질은 IL-15 단백질과 유사한 정도의 NK 세포의 증식을 활성화시키는 것을 확인하였다(도 25a 및 도 25b).
실험예 25. BNS002 융합단백질이 T 세포의 기능에 미치는 영향 확인
실험예 25.1. PD-L1/PD-1 차단 분석
PD-1/PD-L1 blockade bioassay kit(Promega cat No. J1252)를 사용하여 실험을 진행하였다.
액체질소에서 보관 중인 PD-L1 aAPC/CHO-K1 세포(Target cell)를 37℃ 항온수조에서 1분 동안 해동하여 미리 데워진 배양 배지(Ham's F12: FBS 10%)에 현탁하여 준비하였다. 96웰-화이트 플레이트(SPL, cat No. 30196)에 각 웰 당 100 ㎕씩 분주하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 다음날, 플레이트를 꺼내 95 ㎕의 배양 배지를 제거하고, 2배씩 연속 희석한 BNS002 융합단백질, 아테졸리주맙(Atezolizumab), PD-1-Fc를 각 웰 당 40 ㎕씩 넣고 Jurkat NFAT-Luc/PD-1 세포(Effector cell)를 준비하는 시간 동안 플레이트 커버를 씌워 상온에서 보관하였다. 액체질소에 보관 중인 이펙터 세포(Effector cell)를 37℃ 항온수조에서 1분 동안 해동하여 미리 데워진 배양 배지(Ham's F12: FBS 10%)에 현탁하여 준비한 후, 타겟 세포(Target cell)와 시료가 담긴 플레이트 각 웰 당 40 ㎕씩 분주하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 6시간 동안 배양하였다.
반응이 완료된 후, 플레이트를 꺼내 거품이 생기지 않도록 주의하여 Bio-Glo reagent를 첨가하였다. 가장자리 3개의 웰에도 Bio-Glo reagent를 넣어 블랭크로 사용하여 백그라운드 신호(background signal)를 보정하였다. 30분간 상온에서 반응시킨 후, Synergy Neo2(BioTek)로 발광(luminescence)을 측정하였다.
그 결과, BNS002 융합단백질은 이펙터(effector) T 세포에 발현하는 PD-1과 결합하여 T 세포의 기능을 억제시키지 않고 오히려 활성화시키는 것을 확인하였다(도 26).
실험예 25.2. PD-L2/PD-1 차단 분석
PD-1/PD-L2 blockade bioassay kit(Promega cat No. CS187131-1)를 사용하여 실험을 진행하였다.
액체질소에서 보관 중인 PD-L2 aAPC/CHO-K1 세포(Target cell)를 37℃ 항온수조에서 1분 동안 해동하여 미리 데워진 배양 배지(Ham's F12: FBS 10%)에 현탁하여 준비하였다. 96웰-화이트 플레이트(SPL, cat No. 30196)에 각 웰 당 100 ㎕씩 분주하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 다음날, 플레이트를 꺼내 95 ㎕의 배양 배지를 제거하고, 2배씩 연속 희석한 BNS002 융합단백질과 PD-L2-Fc를 각 웰 당 40 ㎕씩 넣고 Jurkat NFAT-Luc/PD-1 세포(Effector cell)를 준비하는 시간 동안 플레이트 커버를 씌워 상온에서 보관하였다. 액체질소에 보관 중인 이펙터 세포(Effector cell)를 37℃ 항온수조에서 1분 동안 해동하여 미리 데워진 배양 배지(Ham's F12: FBS 10%)에 현탁하여 준비한 후, 타겟 세포(Target cell)와 시료가 담긴 플레이트 각 웰 당 40 ㎕씩 분주하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 6시간 동안 배양하였다.
반응이 완료된 후, 플레이트를 꺼내 거품이 생기지 않도록 주의하여 Bio-Glo reagent를 첨가하였다. 가장자리 3개의 웰에도 Bio-Glo reagent를 넣어 블랭크로 사용하여 백그라운드 신호(background signal)를 보정하였다. 30분간 상온에서 반응시킨 후, Synergy Neo2(BioTek)로 발광(luminescence)을 측정하였다.
그 결과, BNS002 융합단백질은 이펙터 T 세포에 발현하는 PD-1과 결합하여 T 세포의 기능을 억제시키지 않고 오히려 활성화시키는 것을 확인하였다(도 27).
IX. BNS002 융합단백질의 항암효과 확인
실험예 26. BNS002 융합단백질에 대한 항암효과 확인을 위한 암세포주 확립
인간 흑색종양 세포주 A375(ATCC, CRL-1619) 세포 1×105개를 6웰 플레이트에 분주하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 다음날, 배양 배지를 제거한 뒤 파이어플라이 루시퍼라아제(firefly luciferase; fLuc)와 GFP 유전자가 이입된 렌티바이러스(GenTarget, cat No. LVP914-G)(도 28) 25 MOI(Multiplicity of infection, 25 ㎕)를 첨가하고, 4시간 동안 배양하였다. 4시간 배양 후, 0.05% Trypsin-EDTA(Gibco) 용액으로 세포를 회수한 뒤, 150 mm 배양 디쉬(TPP)로 옮겨 배양하였다. 배양시 형광현미경으로 관찰하며 GFP 발현 세포만을 선택 배양하고, 파이어플라이 루시퍼라아제 발현 인간 흑색종양 세포주 A375-Luc-GFP 세포주를 확립하였다.
A375-Luc-GFP 세포주를 96-웰 화이트 또는 블랙 플레이트에 5×105 개의 세포(n=3)를 100 ㎕의 세포 배양액과 함께 분주하고, 이후 100 ㎕의 세포 배양액과 함께 연속적으로 절반씩 희석하였다(8 point). Bio-Glo 용액을 웰(well) 당 100 ㎕ 첨가 후 Neo2 장비로 1초간 발광(luciferase) 또는 형광(GFP) 영상을 획득하였다. A375-Luc-GFP 세포주의 세포 수가 증가함에 따라 발광 또는 형광 신호의 세기도 증가하였다(도 29).
실험예 27. BNS002 융합단백질이 PD-L1 및 PD-L2를 발현하는 암세포에 미치는 영향 확인
실험예 27.1. 암세포와 PBMC의 공동배양
인간에서 분리한 PBMC를 1.25 μM 농도의 membrane-dye(Red) (Sigma, cat No. PKH26) 염료와 상온에서 1분 동안 반응시켜 염색한 후, 동일 볼륨의 FBS를 넣어 염색 반응을 중지시켰다. 세포에 결합하지 않은 염료는 400×g로 10분간 원심분리하여 부유액을 제거 및 세척한 후 RPMI1640 배양 배지(FBS 10%, 페니실린/스트렙토마이신 200 ㎕)으로 재현탁하였다. 이때, 총 3번의 세척 작업을 수행하였다. RPMI1640 배양 배지(FBS 10%, 페니실린/스트렙토마이신 200 ㎕)에 재현탁시킨 후 형광을 관찰하였다. 형광 염색된 PBMC와 확립한 암세포주(A375-fLuc-GFP)의 공동배양을 위해, A375-fLuc-GFP 세포(1×105)를 분주하고 형광 염색된 PBMC(1×106)를 6웰 플레이트에 분주하여 공동배양하였다. 이때, 항-CD3 항체(OKT3, 1 ㎍/㎖, invitrogen)와 항-CD28 항체(CD28.2, 1 ㎍/㎖, Invitrogen)를 공동으로 처리하거나 처리하지 않은 조건에서 BNS002 융합단백질(10 ㎍/㎖)을 처리하여, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 3일 동안 배양하였다.
실험예 27.2. 공동배양한 암세포와 PBMC에서 PD-L1, PD-L2, 및 PD-1 유전자 발현 확인
악성 흑색종양 세포 A375(ATCC, # CRL-1619)와 PBMC(ATCC, # PCS-800-011)에서 PD-L1, PD-L2와 PD1 유전자의 전사 및 발현을 확인하기 위해, 역전사(reverse transcription) PCR을 시행하였다. PBMC에 항-CD3 항체(1 ㎍/㎖, Invitrogen)와 항-CD28 항체(1 ㎍/㎖, Invitrogen)로 공동 자극하여 활성 배양하여 사용하였다. 각 세포주에서 총(total) RNA를 추출하여 cDNA를 합성(TAKARA, RR036A)하고, 프라이머 세트(표 1)를 이용하여 PCR을 수행하여 A375와 PBMC에서 PD-L1/L2와 PD-1 특이적 복제 산물(120 bp, 173 bp, 289 bp)을 확인하였다.
| 프라이머명 | 서열 | 서열번호 |
| PD-L1 | F: 5'-TGGCATTTGCTGAACGCATTT-3' | 101 |
| PD-L1 | R: 5'-TGCAGCCAGGTCTAATTGTTTT-3' | 102 |
| PD-L2 | F: 5'-CAGCAATGTGACCCTGGAAT-3' | 103 |
| PD-L2 | R: 5'-GGACTTGAGGTATGTGGAACG-3' | 104 |
| PD-1 | F: 5'-TGCAGCTTCTCCAACACATC-3' | 105 |
| PD-1 | R: 5'-CTGCCCTTCTCTCTGTCACC-3' | 106 |
| GAPDH-2 | F: 5'-AGCCGCATCTTCTTTTGCGT-3' | 107 |
| GAPDH-2 | R: 5'-TGACGAACATGGGGGCATCA-3' | 108 |
그 결과, 악성 흑색종양 세포(A375)에서 PD-L1 및 PD-L2 유전자와 면역세포가 존재하는 PBMC에서 PD-1 특이적 복제산물(120 bp, 173 bp, 289 bp)이 확인되었다(도 30).
실험예 27.3. ELISA 분석을 통한 인간 IFN-γ 분비량 확인
상기 실험예 27.1.에서 각 시료들을 처리하고 배양한 세포의 배양 상층액에 분비된 인간 IFN-γ의 양은 인간 IFN-γ ELISA kit(Biolegend, cat No.430103)를 사용하여 측정하였다. 항-인간-IFN-γ 항체를 ELISA 플레이트에 넣고, 4℃에서 밤새 반응시켜 코팅하였다. 이후, 1% BSA가 첨가된 PBS 용액으로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 세척 버퍼(PBS 중 0.05% Tween-20)로 세척한 후, 표준 용액 및 각각의 시료들을 7.5 nM 농도로 희석하여 넣은 후 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 플레이트를 세척하여 2차 검출 항체(detection antibody)를 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 세척한 후, 아비딘-HRP(Avidin-HRP) 용액을 넣고 실온에서 30분간 반응시켰다. 기질 용액을 넣어 상온 및 암(dark) 조건하에서 20분간 발색 반응을 유도하였다. 마지막으로, H2S04을 넣어 발색 반응을 중지시키고, Synergy Neo2(BioTek)로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 농도 계산을 하였다.
그 결과, BNS002 융합단백질을 처리한 세포에서 IL-15 단백질을 처리한 세포보다 IFN-γ 분비량이 통계적으로 유의미하게 증가한 것을 확인하였다(도 31).
실험예 27.4. 암세포 살상 효과 확인
면역세포 활성 및 종양세포 살상 효과 확인을 위해, 공동배양한 세포에 5 ㎍/mL의 항-CD3 항체(OKT3, 1 ㎍/㎖, invitrogen)와 항-CD28 항체(CD28.2, 1 ㎍/㎖, Invitrogen)를 처리하거나 처리하지 않은 조건에서 BNS002 융합단백질을 50 nM 농도로 처리하여, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 72시간 동안 배양하였다. 암세포 살상 정도를 정량화하고자 24시간, 48시간 및 72시간 동안 공동배양한 후 웰(well)을 PBS로 2회 세척하고, 10 ㎕의 EZ-Cytox (Daeillab, Cat. No., EZ-1000)를 넣어 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 후, 450 nm에서의 흡광도를 Synergy Neo2(BioTek)로 측정하였다.
BNS002 융합단백질 처리 후, 1일(24시간), 2일(48시간) 및 3일(72시간)에 측정된 암세포 살상 정도가 도 32에 나타난 바와 같이 측정되었다.
또한, 암세포 살상 효과에 대한 통계적 분석을 위해 BNS002 융합단백질 처리 후 2일에 측정된 암세포 살상 정도를 비교한 결과, BNS002 융합단백질을 처리한 세포에서 처리하지 않은 세포보다 암세포의 살상 효과가 통계적으로 유의미하게 증가한 것을 확인하였다(도 33).
또한, 암세포 살상 효과에 대한 EC50 분석을 위해 다양한 농도의 BNS002 융합단백질 처리 후 2일에 측정된 암세포 살상 정도를 비교한 결과, BNS002 융합단백질을 처리한 세포에서 처리하지 않은 세포보다 암세포의 살상 효과가 증가한 것을 확인하였다(도 34).
실험예 28.
BNS002 융합단백질의 암세포주 특이적인 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 활성 확인
A375 세포주를 배양 배지(RPMI1640: FBS 10%, Antibiotic-Antimycotic 1%)에 현탁하여 96웰 화이트 플레이트에 1×104개/100 ㎕의 세포 농도로 분주한 후 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 다음날, A375 세포가 분주된 플레이트에서 배양 배지 95 ㎕를 제거한 후, 미리 만들어 놓은 ADCC 분석 버퍼(ADCC Assay Buffer: RPMI1640 배양 배지, low IgG 혈청(serum) 0.25%)를 25㎕씩 첨가하여 이펙터 세포(NFAT-luc/FcγRIIIa)를 준비하는 동안 상온에서 배양하였다. 미리 데워진 3.6 mL의 ADCC 분석 버퍼에 630 ㎕의 ADCC Bioassay Effector Cell(Jurkat/NFAT-luc/FcγRIIIa)을 현탁한 후 각 웰에 25 ㎕씩 분주하였다. 2.5배 연속 희석시킨 BNS002 융합단백질 시료를 각 웰에 25 ㎕씩 처리하였다. 웰 플레이트 뚜껑을 닫아 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 6시간 동안 배양하였다. 배양 후 15분 정도 실온에 보관한 다음 각 웰에 75 ㎕의 Bio-Glo™ Luciferase Assay Reagent를 처리하고, 30분 후 발광 활성(luciferase activity)을 Synergy Neo2(BioTek)로 측정하였다.
ADCC Assay의 발광 활성은 표면 항원(PD-L1/L2)을 가진 표적 세포(A375), 특정 항체(BNS002 융합단백질), FcγRIIIa를 표현하는 이펙터 세포가 존재할 때만 결과값을 얻을 수 있는 시험법으로 BNS002 융합단백질에 대한 ADCC 활성이 도 35에 나타난 바와 같이 측정되었다.
실험예 29. 마우스 유래 대장암 세포 동종이식 마우스에서의 BNS002 융합단백질의 항암효과 확인
실험예 29.1. 종양 억제 효과 확인
동결 마우스 종양 세포주, 구체적으로 대장선암(colorectal carcinoma) 세포주인 CT26 세포주 1 바이얼(vial)을 열 불활성화(heat inactivation)된 10% FBS(Gibco, 10082-147)가 포함된 RPMI1640 배지를 이용하여 해동하고, 이를 세포 배양용 플라스크에 넣어 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 후, PBS를 이용하여 세척하고, 2.5% Trypsin-EDTA(Gibco, 15090)를 10배 희석한 다음, 이를 첨가하여 세포를 분리하였다. 세포 분리 후, 원심분리(1,000 rpm, 5분)하여 상층액을 제거한 뒤, 새로운 배지로 세포 부유액을 얻었다. 현미경을 이용하여 생존력(viability)을 확인한 후, 5.0×106 cells/mL의 농도로 배지에 희석하여 세포주를 준비하였다. 마우스는 5주령의 수컷 BALB/c 마우스(코아텍)를 사용하였다. 세포주 이식시 5.0×105 cells/0.1 mL/head의 투여액량으로 피하 투여하였다. 암세포를 이식하고 일정 기간 경과 후에 종양의 부피를 측정하여 약 60-90 mm3에 도달한 개체들을 분리한 후, 5 mg/kg의 용량으로 BNS002 융합단백질을 정맥투여하였다. 첫 투여 이후 3일에 한 번씩 총 4회 투여를 진행하였다. 이때, 음성대조군으로는 PBS를 투여하고, 양성대조군으로는 5 mg/kg의 항-PD-L1 항체인 아테졸리주맙(Atezolizumab)를 투여하였다. 항암효과를 확인하기 위해 일주일에 2회 종양의 크기를 측정하였다(도 36).
그 결과, BNS002 융합단백질을 처리한 CT26 암세포주 식립 마우스의 종양의 크기가 음성대조군 및 양성대조군에 비해 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 37).
BNS002 융합단백질 투여군과 음성대조군에서의 종양 억제에 대한 통계적 유의미성을 확인한 결과, 일부 측정 시점에서 통계적으로 유의미하게 억제되었음이 관찰되었다(도 38).
실험예 29.2. 암조직 내 면역세포 분석
상기 실험예 29.1.의 마우스 중 각 군 당 3마리에 한하여 적출한 종양을 10% FBS가 포함된 RPMI 배지에 넣은 뒤 FACS 분석에 사용하였다. 암조직 내 면역세포를 분석하기 위해, 암조직을 단일 세포 수준으로 분리한 후, 하기 표 2에 기재된 항체를 이용하여 T 세포, NK 세포, DC(Dendritic Cell), 대식세포(Macrophage)에 대해 분석을 실시하였다.
| 이펙터 T 세포 | NK 세포, DC, 대식세포 |
| CD3-efluor® 450 (Thermo, 48-0031-82) CD45-PerCP-cyanine 5.5 (Thermo, 45-0451-82) CD4-PE-cy7 (Thermo, 25-0041-82) CD8-APC (Thermo, 17-0081-82) |
CD3-efluor® 450 (Thermo, 48-0031-82) CD45-Super bright 600 (Thermo, 63-0451-82) CD335-PE (Thermo, 12-3351-82) CD11c-Percp-cy5 (Thermo, 45-0114-82) F4/80-PE-cy7 (Thermo, 25-4801-82) CD49b-APC (Thermo, 17-5971-82) CD11b-APC-eFluor 770 (Thermo, 47-0112-82) |
그 결과, BNS002 융합단백질을 투여한 실험군에서 대식세포, 수지상세포, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포가 양성대조군 및 음성대조군에 비해 증가하였다(도 39). 또한, BNS002 융합단백질을 투여한 실험군에서 NK 세포가 양성대조군 및 음성대조군에 비해 유의미하게 증가하였다(도 39).
실험예 30. 인간 유래 폐암 세포(H460)와 인간 말초혈액 단핵세포 이식 인간화 마우스에서의 BNS002 융합단백질의 항암효과 확인
동결 인간 종양 세포주, 구체적으로 폐암(lung carcinoma) 세포주인 H460 세포주 1 바이얼(vial)을 열 불활성화(heat inactivation)된 10% FBS(Gibco, 10082-147)가 포함된 RPMI1640 배지를 이용하여 해동하고, 이를 세포 배양용 플라스크에 넣어 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 후, PBS를 이용하여 세척하고, 2.5% Trypsin-EDTA(Gibco, 15090)를 10배 희석한 다음, 이를 첨가하여 세포를 분리하였다. 세포 분리 후, 1,000 rpm 조건으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 뒤, 새로운 배지로 세포 부유액을 얻었다. 현미경을 이용하여 생존력(viability)을 확인한 후, 5.0×107 cells/mL의 농도로 배지에 희석하여 세포주를 준비하였다. 또한 인간에서 분리한 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 실험예 21.1.과 같이 일주일 활성 배양하였다. 현미경을 이용하여 생존력(viability)을 확인한 후, 2.5×108 cells/mL의 농도로 배지에 희석하여 세포주를 준비하였다. 마우스는 6주령의 수컷 NXG 마우스(Janvier-labs)를 사용하였고, 1주일간 순화 과정을 거친 후 각 그룹별 평균 무게를 맞추기 위해 체중 측정을 실시하여 재그룹핑 하였다. 세포주 이식시 5.0×106 cells(H460)과 2.5×107 cells(hPBMC)/0.1 mL/head의 투여액량으로 피하 투여하였다. 암세포를 이식하고 다음날, 흡입 마취제(2% 이소플루란, 하나제약)로 마취시킨 후, 10 mg/kg의 용량으로 BNS002 융합단백질을 꼬리정맥 투여하였다. 첫 투여 이후 3~4일에 한 번씩 총 6회 투여를 진행하였다. 이때, 음성대조군으로는 식염수(Saline; JW 중외제약)를 투여하고, 양성대조군으로는 10 mg/kg의 항-PD-L1 항체인 아테졸리주맙(Atezolizumab; Evidentic) 또는 PD-1 D-Fc를 투여하였다. 항암효과를 확인하기 위해 일주일에 2회 종양의 크기를 측정하였다(도 40).
그 결과, BNS002 융합단백질을 처리한 H460 암세포주 이식 마우스의 종양의 크기가 음성대조군 및 양성대조군에 비해 감소하였으며(도 41), 이러한 감소가 통계적으로 유의미함을 확인하였다(도 42).
실험예 31. 인간 유래 대장암 세포(HCT116)와 인간 말초혈액 단핵세포 이식 인간화 마우스에서의 BNS002 또는 BNS002S 융합단백질의 항암효과 확인
실험예 31.1. BNS002 융합단백질의 투여 용량별 항암효과 확인
동결 인간 종양 세포주로서 대장암(colon carcinoma) 세포주인 HCT116 세포주를 사용한 것 이외에 실험예 30.과 동일한 방법으로 세포주를 준비하였다. 또한, 인간에서 분리한 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 실험예 21.1.과 같이 일주일 활성 배양하였다. 현미경을 이용하여 생존력(viability)을 확인한 후, 2.5×108 cells/mL의 농도로 배지에 희석하여 세포주를 준비하였다. 마우스는 6주령의 수컷 NSG 마우스(NOD.Cg-B2mtm1UncPrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)(오리엔트 바이오)를 사용하였으며, 인간화 마우스 제작을 위해 인간 말초혈액 단핵세포 1×107 cells(hPBMC)/0.1 mL/head의 투여액량으로 꼬리 정맥에 피하 투여하였다. 인간 말초혈액 단핵세포 투여 14일 후에 FACS 분석을 통해 혈액에서의 hCD45+ 발현을 측정하여 인간화 마우스를 확인하였다. 인간화 마우스 확인 후, 세포주 HCT116 이식 시 3×106 cell의 투여액량으로 피하 투여하였다. 암세포를 이식하고 이틀 후, 흡입 마취제(2% 이소플루란, 하나제약)로 마취시킨 후, 5, 10, 20 mg/kg의 용량으로 BNS002 융합단백질(PD-1 D-Fc-IL-15)을 복강 투여하였다. 첫 투여 이후 3~4일에 한 번씩 총 4회 투여를 진행하였다. 이때, 음성대조군으로는 식염수(Saline; JW 중외제약)를 투여하였으며, 항암효과를 확인하기 위해 일주일에 2회 종양의 크기를 측정하였다(도 43).
그 결과, BNS002 융합단백질을 처리한 HCT116 암세포주 이식 인간화 마우스 동물 실험에서 음성대조군(Vehicle 처리) 대비 통계적으로 유의미하게 농도 의존적으로 종양의 크기가 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 특히, 10 mg/kg의 용량으로 투여 시 항암 효과가 가장 우수하였다(도 44).
한편, BNS002 융합단백질 처리에 따른 체중 변화에 미치는 영향은 없음을 확인하였다(도 45).
실험예 31.2. BNS002 융합단백질(PD-1 D-Fc-IL-15)과 대조 약물간의 항암효과 확인
실험예 31.1.과 동일한 방법으로 HCT116 세포주 및 PBMC를 준비하여 인간화 마우스를 제작하였다. 인간화 마우스에 HCT116 암세포를 이식하고 이틀 후, 흡입 마취제(2% 이소플루란, 하나제약)로 마취시켰다. 이후, BNS002 융합단백질(PD-1 D-Fc-IL-15)은 10 mg/kg의 용량으로 복강 투여하였다. 첫 투여 이후 3~4일에 한 번씩 총 4회 투여를 진행하였다. 이때, 음성대조군으로는 식염수(Saline; JW 중외제약)를 투여하였으며, 비교 대조군으로 BNS001D(PD-1 D-Fc) 및 BNS002I(Fc-IL-15) 융합단백질을 단독 또는 병용으로 투여하였다. 또한, 양성대조군으로 시판 항체 아테졸리주맙(Atezolizumab; Anti-PD-L1(Tecentriq, Roche)), 아벨루맙(Avelumab; Anti-PD-L1(Bavencio, Merck)) 및 펨브로리주맙(Pembrolizumab; Anti-PD-1(Keytruda, MSD))을 투여하였다. 투여 물질의 항암효과를 확인하기 위해 일주일에 2회 종양 크기 및 체중을 측정하였다(도 46).
그 결과, BNS002 융합단백질(PD-1 D-Fc-IL-15)을 처리한 HCT116 암세포주 이식 인간화 마우스 동물 실험에서 음성대조군 대비 통계적으로 유의미하게 종양의 크기가 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 47 및 도 49).
BNS002 융합단백질 투여군은 비교 대조군인 BNS001D(PD-1 D-Fc) 및 BNS002I(Fc-IL-15) 투여군 보다 종양의 크기가 감소함을 확인하였다. 특히, BNS002 융합단백질 투여군은 BNS001D(PD-1 D-Fc)+BNS002I(Fc-IL-15) 병용 투여군보다 종양의 크기가 감소함을 확인하였다(도 47).
또한, BNS002 융합단백질 투여군은 양성대조군으로 사용한 시판 항체 펨브로리주맙(Anti-PD-1(Keytruda, MSD)) 및 아벨루맙(Anti-PD-L1(Bavencio, Merck)) 투여군과 비교하여 통계적으로 유의미하게 종양의 크기가 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 아테졸리주맙(Anti-PD-L1(Tecentriq, Roche)) 투여군과 비교하여서도 BNS002 융합단백질은 동등한 수준의 종양 크기 감소를 보임을 확인하였다(도 49).
한편, BNS002 융합단백질 처리에 따른 체중 변화에 미치는 영향은 없음을 확인하였다(도 48 및 도 50).
실험예 31.3. BNS002S 융합단백질(PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra)과 대조 약물간의 항암효과 확인
실험예 31.1.과 동일한 방법으로 HCT116 세포주 및 PBMC를 준비하여 인간화 마우스를 제작하였다. 인간화 마우스에 HCT116 암세포를 이식하고 이틀 후, 흡입 마취제(2% 이소플루란, 하나제약)로 마취시켰다. 이후, BNS002S 융합단백질(PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra)은 5 mg/kg의 용량으로 복강 투여하였다. 첫 투여 이후 3~4일에 한 번씩 총 4회 투여를 진행하였다. 이때, 음성대조군, 비교 대조군 및 양성대조군은 실험예 31.2.와 동일 조건으로 투여하였다. 이후, 투여 물질의 항암효과를 확인하기 위해 일주일에 2회 종양 크기 및 체중을 측정하였다(도 46).
그 결과, BNS002S 융합단백질(PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra)을 처리한 HCT116 암세포주 이식 인간화 마우스 동물 실험에서 음성대조군 대비 통계적으로 유의미하게 종양의 크기가 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 51 및 도 53).
BNS002S 융합단백질 투여군은 비교 대조군인 BNS001D(PD-1 D-Fc) 및 BNS002I(Fc-IL-15) 투여군 보다 종양의 크기가 감소함을 확인하였다. 특히, BNS002S 융합단백질 투여군은 BNS001D(PD-1 D-Fc)+BNS002I(Fc-IL-15) 병용 투여군보다 종양의 크기가 감소함을 확인하였다(도 51).
또한, BNS002S 융합단백질 투여군은 양성대조군으로 사용한 시판 항체 펨브로리주맙(Anti-PD-1(Keytruda, MSD)) 및 아벨루맙(Anti-PD-L1(Bavencio, Merck)) 투여군과 비교하여 종양의 크기가 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 아테졸리주맙(Anti-PD-L1(Tecentriq, Roche)) 투여군과 비교하여서도 BNS002S 융합단백질은 동등한 수준의 종양 크기 감소를 보임을 확인하였다(도 53).
한편, BNS002 융합단백질 처리에 따른 체중 변화에 미치는 영향은 없음을 확인하였다(도 52 및 도 54).
실험예 32. 인간 유래 폐암 세포(A549)와 인간 말초혈액 단핵세포 이식 인간화 마우스에서의 BNS002 또는 BNS002S 융합단백질의 항암효과 확인
실험예 32.1. BNS002 융합단백질(PD-1 D-Fc-IL-15)과 대조 약물간의 항암효과 확인
동결 인간 종양 세포주로서, 폐암(lung carcinoma, NSCLC) 세포주인 A549 세포주를 사용한 것 이외에, 실험예 31.1.과 동일한 방법으로 A549 세포주 및 PBMC를 준비하여 인간화 마우스를 제작하였다. 인간화 마우스에 A549 암세포를 이식하고 이틀 후, 흡입 마취제(2% 이소플루란, 하나제약)로 마취시켰다. 이후, BNS002 융합단백질(PD-1 D-Fc-IL-15)은 10 mg/kg의 용량으로 복강 투여하였다. 첫 투여 이후 3~4일에 한 번씩 총 4회 투여를 진행하였다. 이때, 음성대조군으로는 식염수(Saline; JW 중외제약)를 투여하였으며, 양성대조군으로 시판 항체 아테졸리주맙(Atezolizumab; Anti-PD-L1(Tecentriq, Roche)), 아벨루맙(Avelumab; Anti-PD-L1(Bavencio, Merck)) 및 펨브로리주맙(Pembrolizumab; Anti-PD-1(Keytruda, MSD))을 투여하였다. 투여 물질의 항암효과를 확인하기 위해 일주일에 2회 종양 크기 및 체중을 측정하였다(도 55).
그 결과, BNS002 융합단백질(PD-1 D-Fc-IL-15)을 처리한 A549 암세포주 이식 인간화 마우스 동물 실험에서 음성대조군 대비 통계적으로 유의미하게 종양의 크기가 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 또한, BNS002 융합단백질 투여군은 양성대조군으로 사용한 시판 항체 아테졸리주맙(Anti-PD-L1(Tecentriq, Roche)), 펨브로리주맙(Anti-PD-1(Keytruda, MSD)) 및 아벨루맙(Anti-PD-L1(Bavencio, Merck)) 투여군과 비교하여 동등한 수준의 종양 크기 감소를 보임을 확인하였다(도 56).
한편, BNS002 융합단백질 처리에 따른 체중 변화에 미치는 영향은 없음을 확인하였다(도 57).
실험예 32.2. BNS002S 융합단백질(PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra)과 투여 용량별 항암효과 확인
실험예 32.1.과 동일한 방법으로 A549 세포주 및 PBMC를 준비하여 인간화 마우스를 제작하였다. 인간화 마우스에 A549 암세포를 이식하고 이틀 후, 흡입 마취제(2% 이소플루란, 하나제약)로 마취시킨 후, 1 및 5 mg/kg의 용량으로 BNS002S(PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra) 융합단백질을 복강 투여하였다. 첫 투여 이후 3~4일에 한 번씩 총 4회 투여를 진행하였다. 이때, 음성대조군으로는 식염수(Saline; JW 중외제약)를 투여하였으며, 투여물질의 항암효과를 확인하기 위해 일주일에 2회 종양 크기 및 몸무게를 측정하였다.
그 결과, BNS002S 융합단백질(PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra)을 처리한 A549 암세포주 이식 인간화 마우스 동물 실험에서 음성대조군(Vehicle 처리) 대비 통계적으로 유의미하게 농도 의존적으로 종양의 크기가 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 특히, 5 mg/kg의 용량으로 투여 시 항암 효과가 가장 우수하였다(도 58).
한편, BNS002S 융합단백질 처리에 따른 체중 변화에 미치는 영향은 없음을 확인하였다(도 59).
실험예 32.3. BNS002S 융합단백질(PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra)과 대조 약물간의 항암효과 확인
실험예 32.1.과 동일한 방법으로 A549 세포주 및 PBMC를 준비하여 인간화 마우스를 제작하였다. 인간화 마우스에 A549 암세포를 이식하고 이틀 후, 흡입 마취제(2% 이소플루란, 하나제약)로 마취시켰다. 이후, BNS002S 융합단백질은 5 mg/kg의 용량으로 복강 투여하였다. 첫 투여 이후 3~4일에 한 번씩 총 4회 투여를 진행하였다. 이때, 음성대조군 및 양성대조군은 실험예 32.1.과 동일 조건으로 투여하였다. 투여 물질의 항암효과를 확인하기 위해 일주일에 2회 종양 크기 및 몸무게를 측정하였다.
그 결과, BNS002S 융합단백질(PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra)을 처리한 A549 암세포주 이식 인간화 마우스 동물 실험에서 음성대조군 대비 통계적으로 유의미하게 종양의 크기가 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 또한, BNS002S 융합단백질 투여군은 양성대조군으로 사용한 시판 항체 아테졸리주맙(Anti-PD-L1(Tecentriq, Roche)), 펨브로리주맙(Anti-PD-1(Keytruda, MSD)) 및 아벨루맙(Anti-PD-L1(Bavencio, Merck)) 투여군과 비교하여 동등한 수준의 종양 크기 감소를 보임을 확인하였다(도 60). 한편, BNS002S 융합단백질 처리에 따른 체중 변화에 미치는 영향은 없음을 확인하였다(도 61).
실험예 33. 인간 유래 유방암 세포(MDA-MB-231)와 인간 말초혈액 단핵세포 이식 인간화 마우스에서의 BNS002 또는 BNS002S 융합단백질의 항암효과 확인
실험예 33.1. BNS002 융합단백질(PD-1 D-Fc-IL-15)과 대조 약물간의 항암효과 확인
동결 인간 종양 세포주로서, 유방암(breast carcinoma, TNBC) 세포주인 MDA-MB-231 세포주를 사용한 것 이외에, 실험예 31.1.과 동일한 방법으로 MDA-MB-231 세포주 및 PBMC를 준비하여 인간화 마우스를 제작하였다. 인간화 마우스에 MDA-MB-231 암세포를 이식하고 이틀 후, 흡입 마취제(2% 이소플루란, 하나제약)로 마취시켰다. 이후, BNS002 융합단백질(PD-1 D-Fc-IL-15)은 10 mg/kg의 용량으로 복강 투여하였다. 첫 투여 이후 3~4일에 한 번씩 총 4회 투여를 진행하였다. 이때, 음성대조군으로는 식염수(Saline; JW 중외제약)를 투여하였으며, 양성대조군으로 시판 항체 아테졸리주맙(Atezolizumab; Anti-PD-L1(Tecentriq, Roche)), 아벨루맙(Avelumab; Anti-PD-L1(Bavencio, Merck)) 및 펨브로리주맙(Pembrolizumab; Anti-PD-1(Keytruda, MSD))을 투여하였다. 투여 물질의 항암효과를 확인하기 위해 일주일에 2회 종양 크기 및 체중을 측정하였다(도 62).
그 결과, BNS002 융합단백질(PD-1 D-Fc-IL-15)을 처리한 MDA-MB-231 암세포주 이식 인간화 마우스 동물 실험에서 음성대조군과 비교하여 종양의 크기 감소 효과를 나타내지 않음을 확인하였다(도 63). 또한, BNS002 융합단백질 처리에 따른 체중 변화에도 미치는 영향은 없었다(도 64).
실험예 33.2. BNS002S 융합단백질(PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra)과 대조 약물간의 항암효과 확인
실험예 33.1.과 동일한 방법으로 MDA-MB-231 세포주 및 PBMC를 준비하여 인간화 마우스를 제작하였다. 인간화 마우스에 MDA-MB-231 암세포를 이식하고 이틀 후, 흡입 마취제(2% 이소플루란, 하나제약)로 마취시켰다. 이후, BNS002S 융합단백질은 5 mg/kg의 용량으로 복강 투여하였다. 첫 투여 이후 3~4일에 한 번씩 총 4회 투여를 진행하였다. 이때, 음성대조군 및 양성대조군은 실험예 33.1.과 동일 조건으로 투여하였다. 투여 물질의 항암효과를 확인하기 위해 일주일에 2회 종양 크기 및 몸무게를 측정하였다.
그 결과, BNS002S 융합단백질(PD-1D-Fc-IL-15/IL-15Ra)을 처리한 MDA-MB-231 암세포주 이식 인간화 마우스 동물 실험에서 음성대조군 대비 통계적으로 유의미하게 종양의 크기가 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 또한, BNS002S 융합단백질 투여군은 양성대조군으로 사용한 시판 항체 아테졸리주맙(Anti-PD-L1(Tecentriq, Roche)), 펨브로리주맙(Anti-PD-1(Keytruda, MSD)) 및 아벨루맙(Anti-PD-L1(Bavencio, Merck)) 투여군과 비교하여 종양의 크기가 현저하게 감소시킴을 확인하였다(도 65). 한편, BNS002S 융합단백질 처리에 따른 체중 변화에 미치는 영향은 없음을 확인하였다(도 66).
Claims (25)
- PD-1 단백질 및 IL-15 단백질을 포함하는 융합단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 PD-1 단백질 및 상기 IL-15 단백질은 링커에 의해 결합된 것인, 융합단백질. - 제1항에 있어서,
상기 PD-1 단백질은 서열번호 2, 23 또는 39의 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합단백질. - 제1항에 있어서,
상기 IL-15 단백질은 서열번호 6 또는 24의 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합단백질. - 제2항에 있어서,
상기 링커는 면역글로불린의 Fc 도메인인 것인, 융합단백질. - 제5항에 있어서,
상기 Fc 도메인은 야생형 또는 변이체인 것인, 융합단백질. - 제6항에 있어서,
상기 Fc 도메인의 야생형은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합단백질. - 제6항에 있어서,
상기 Fc 도메인의 변이체는 서열번호 14의 아미노산 서열에서 Q81R, M198L, L79G, T136S, L138A, Y177V, Q81R/M198L, L79G/M198L, T136S/L138A/Y177V 또는 Q81R/T136S/L138A/Y177V/M198L의 치환이 일어난 것인, 융합단백질. - 제8항에 있어서,
상기 Fc 도메인의 변이체는 서열번호 4, 10, 55, 88 또는 97의 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합단백질. - 제6항에 있어서,
상기 Fc 도메인의 변이체는 야생형과 비교하여 반감기(Half-life)가 증가된 것인, 융합단백질. - 제1항에 있어서,
상기 융합단백질은 하기 구조식 I 내지 IV로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인, 융합단백질:
N'-A-[L1]n-Fc 도메인-[L2]m-B-[L3]l-S-C' I
N'-A-[L1]n-Fc 도메인-[L2]m-S-[L3]l-B-C' II
N'-S-[L3]l-B-[L1]n-Fc 도메인-[L2]m-A-C' III
N'-B-[L3]l-S-[L1]n-Fc 도메인-[L2]m-A-C' IV
이때, 상기 구조식 I 내지 IV에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 A는 PD-1 단백질 또는 이의 단편이고,
상기 B는 IL-15 단백질 또는 이의 변이체이며,
상기 S는 IL-15 결합 단백질이며,
상기 L1, L2 및 L3은 각각 펩타이드 링커이고,
상기 n, m 및 l은 각각 독립적으로, O 또는 1이다. - 제11항에 있어서,
상기 L1이 서열번호 3 또는 43의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커인 것인, 융합단백질. - 제11항에 있어서,
상기 L2가 서열번호 5, 44 또는 62의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커인 것인, 융합단백질. - 제11항에 있어서,
상기 L3은 서열번호 96의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커인 것인, 융합단백질. - 제11항에 있어서,
상기 융합단백질은 하기 구조식 V 또는 VI으로 이루어진 것인, 융합단백질:
N'-A-[L1]n-Fc 도메인-[L2]m-B-C' V
N'-B-[L1]n-Fc 도메인-[L2]m-A-C' VI
이때, 상기 구조식 V 및 VI에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 A는 PD-1 단백질 또는 이의 단편이고,
상기 B는 IL-15 단백질 또는 이의 변이체이며,
상기 L1 및 L2은 각각 펩타이드 링커이고,
상기 n 및 m은 각각 독립적으로, O 또는 1이다. - 제1항에 있어서,
상기 융합단백질은 서열번호 8, 12, 16, 26, 29, 33, 37, 41, 46, 49, 57, 60, 77, 80, 83, 90 또는 93의 아미노산 서열에 대해 85% 혹은 그 이상의 서열 동일성을 갖는 것인, 융합단백질. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 융합단백질 두 개가 결합된 융합단백질 이량체.
- 제17항에 있어서,
상기 융합단백질 이량체는 동형이량체(homodimer)인 것인, 융합단백질 이량체. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제19항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9, 13, 17, 27, 30, 35, 38, 42, 47, 50, 58, 61, 78, 81, 84, 91 또는 94의 염기서열에 대해 85% 혹은 그 이상의 서열 동일성을 갖는 것인, 폴리뉴클레오티드. - 제19항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제21항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 융합단백질; 또는 제17항 또는 제18항의 융합단백질 이량체;를 유효성분으로 포함하는 암질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제23항에 있어서,
상기 약학 조성물이 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 것인, 약학 조성물. - 제23항에 있어서,
상기 암은 대장암, 흑색종, 위암, 간암, 폐암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 방광암, 신장암, 담낭암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
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