JP2023521330A

JP2023521330A - 細胞

Info

Publication number: JP2023521330A
Application number: JP2022561019A
Authority: JP
Inventors: カラムマッケンジー; ショーンコルドバ; マーティンプーレ
Original assignee: オートラスリミテッド
Priority date: 2020-04-09
Filing date: 2021-04-08
Publication date: 2023-05-24
Also published as: CN115315439A; US20230113183A1; EP4132963A2; WO2021205176A2; AU2021253759A1; WO2021205176A3; CA3174812A1

Abstract

本発明は、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、（ｂ）（ｉ）Ｆａｓエクトドメイン及びＴＮＦＲエンドドメインであって、該ＴＮＦＲエンドドメインがデコイ受容体２（ＤｃＲ２）、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＸＥＤＡＲ、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＢＣＭＡ若しくはＦｎ１４エンドドメインのシグナル伝達部分を含む、ＴＮＦＲエンドドメイン、又は（ｉｉ）膜結合型デコイ受容体３（ＤｃＲ３）を含むＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）とを含む細胞に関する。

Description

本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）結合受容体を発現する、操作細胞に関する。

腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、腫瘍細胞に、生存、増殖及び免疫耐性に必須のシグナルを提供する。ＴＭＥは免疫抑制性であり、癌免疫療法、例えばＣＡＲＴ細胞療法において、免疫細胞の持続及び生存を阻害し得る。ＴＭＥによって使用される免疫抑制機構には、例えば、免疫チェックポイントシグナル、例えばＰＤＬ－１及び／又はＣＴＬＡ－４の上方制御、並びにサイトカイン、例えばＩＬ－６及び／又はＴＧＦ－βの分泌が含まれる。

近年の証拠によって、免疫抑制ＴＭＥはまた、デスリガンド、例えばＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）も上方制御することが示唆される。ＦａｓＬは、Ｆａｓの細胞死受容体を発現する免疫細胞、例えば腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のアポトーシスを誘導する。

ＴＭＥがデスリガンドを上方制御することに加えて、ＣＡＲ－Ｔ細胞自体が、ＣＡＲ構築物の活性化及び形質導入に際して、細胞死受容体及びそのリガンドを上方制御し、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ：activation-induced death）を誘発し、ＴＭＥにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞持続の問題を更に悪化させることもまた示されてきている。さらに、ＦａｓＬは、活性化Ｔ細胞によって発現されるだけではなく、活性化Ｔ細胞によって産生されるＩＦＮγへの曝露によっても上方制御される。

特に、２つの共刺激エンドドメインを有する第３世代ＣＡＲは、ＦａｓＬ発現増加の結果として、ＡＩＣＤに特に感受性であるようである（非特許文献１、非特許文献２）。

科学者らは、抗体技術でＦａｓ／ＦａｓＬ相互作用をブロッキングすることを試みてきたが、ｉｎｖｉｖｏデータは、２日～３日ごとにかなりの量の抗体が必要であり、実際にかなりの副作用が生じることを示した（非特許文献３）。

さらに、ＦａｓＬはＴ細胞が殺細胞を行使するための重要な武器であるため、抗体でＦａｓＬをブロッキングすると、ＣＡＲＴ細胞の殺細胞効果を妨害し得る（非特許文献４）。

したがって、ＣＡＲＴ細胞に対する細胞死受容体刺激を抑制してこの免疫チェックポイントを軽減し、ＴＭＥにおいて操作細胞が持続し生存する有効性を改善する別のアプローチが必要である。

Xu et al., 2017, Hum Vaccin Immunother. 13(7):1548-1555 Benmebarek et al., 2019, In J Mol Sci.20(6): 1283 Ma et al., 2016, PLoS Pathog.12(5): e1005642 Gargett et al., 2016, Mol Ther.24:1135-49

本発明者らは、ＦａｓＬに競合的に結合し、Ｆａｓ－ＦａｓＬ経路を中和する受容体を発現する細胞が、Ｆａｓ誘導性アポトーシスを減少させ得るか又は防止し得ることを決定した。こうした受容体とＣＡＲ又はトランスジェニックＴＣＲとを共発現すると、腫瘍血管系内へのＣＡＲ／ＴＣＲ発現細胞の浸潤及びＴＭＥ内でのその持続が改善される。

本発明者らは、Ｆａｓ－ＦａｓＬ経路の中和を達成する２つの代替アプローチを提唱し、これらはどちらもＦａｓＬに競合的に結合して、ＦａｓＬが三量体化を誘発し、それぞれのデスドメインのホモ型相互作用を通じてＦａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）と称されるタンパク質を補充する能力をブロッキングする。

第１のアプローチは、Ｆａｓ受容体の細胞外ドメインを、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）細胞内シグナル伝達ドメインに融合させることを含む。第２のアプローチは、ＦａｓＬに結合する膜結合型デコイ受容体３（ＤｃＲ３）を発現させることを含む。

したがって、第１の態様において、本発明は、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、（ｂ）（ｉ）Ｆａｓエクトドメイン及びＴＮＦＲエンドドメインであって、該ＴＮＦＲエンドドメインがデコイ受容体２（ＤｃＲ２）、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＸＥＤＡＲ、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＢＣＭＡ若しくはＦｎ１４エンドドメインのシグナル伝達部分を含む、ＴＮＦＲエンドドメイン、又は（ｉｉ）膜結合型デコイ受容体３（ＤｃＲ３）を含むＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）とを含む細胞を提供する。

Ｆａｓ受容体のエンドドメインとは異なり、本発明のＴＮＦＲエンドドメインは、ホモ型相互作用を通じて、Ｆａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）上のデスドメインに結合することはできず、したがって、細胞死誘導性シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）の集合は阻害され、最終的にアポトーシスに向かうＦａｓ－ＦａｓＬ経路が阻害される。同様に、膜結合型ＤｃＲ３は、内因性Ｆａｓ受容体のＦａｓＬへの結合を打ち負かし（out-competes）、Ｆａｓ－ＦａｓＬ経路を中和する。

上に記載の第１のアプローチにおいて、本発明のＦＬＢＲは、一般構造：
Ｆａｓエクソ－ＴＭ－ＴＮＦＲエンド
（式中、
ＦａｓエクソはＦａｓエクトドメインであり、
ＴＭは膜貫通ドメインであり、
ＴＮＦＲエンドはＴＮＦＲエンドドメインである）を有し得る。

特に、ＦＬＢＲはＦａｓエクトドメイン及びＣＤ４０エンドドメインを含み得る。ＣＤ４０エンドドメインは配列番号４に示される配列を含み得る。

本発明のＦＬＢＲは、Ｆａｓ膜貫通ドメインを含み得る。あるいは、ＦＬＢＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＤｃＲ２膜貫通ドメイン、ＴＹＲＰ－１膜貫通ドメイン又はＥＧＦＲ膜貫通ドメインを含み得る。

上に記載の第２のアプローチにおいて、ＦＬＢＲは、一般構造：
ＤｃＲ３－スペーサー－ＴＭ－エンド
（式中、
ＤｃＲ３はＤｃＲ３のＦａｓＬ結合ドメインを含み、
スペーサーは、膜貫通ドメインにＤｃＲ３を連結するスペーサー配列であり、
ＴＭは膜貫通ドメインであり、
エンドは任意選択の細胞内配列である）を有し得る。

膜結合型ＤｃＲ３は、ＣＤ８膜貫通ストーク（stalk）を通じて膜に係留され得る。あるいは、膜結合型ＤｃＲ３は、そうでなければ可溶性であるデコイ受容体を形質膜に係留可能な任意の配列を通じて膜に係留され得る。

膜結合型ＤｃＲ３は、Ｃ末端ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）の突然変異を含み得る。これは、ＨＢＤが、架橋を通じて樹状細胞におけるアポトーシスを誘導可能であるヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合するためである。より具体的には、膜結合型ＤｃＲ３のＨＢＤＣ末端部分は、以下に配列番号９として示される配列に関して、Ｋ２５６位、Ｒ２５８位及びＲ２５９位の１つ以上で突然変異を含み得る。これらの、そうでなければ塩基性であるアミノ酸をアラニン残基に突然変異させると、ＨＳＰＧへの結合が無効にされる。

ＦＬＢＲは、Ｆａｓ－ＤｃＲ２（配列番号３５）、Ｆａｓ－ＧＩＴＲ（配列番号３６）、Ｆａｓ－ＣＤ３０（配列番号３７）、Ｆａｓ－ＸＥＤＡＲ（配列番号３８）、Ｆａｓ－ＣＤ２７（配列番号３９）、Ｆａｓ－ＢＣＭＡ（配列番号４０）、Ｆａｓ－ＣＤ４０（配列番号４１）、Ｆａｓ－Ｆｎ１４（配列番号４２）、ＤｃＲ３－ＣＤ８ＳＴＫ（配列番号４３）及びＤｃＲ３突然変異－ＣＤ８ＳＴＫ（配列番号４４）又は配列番号３５～４４のいずれかに少なくとも８０％の配列同一性を持つ変異体より選択される配列を含み得る。ＦＬＢＲはまた、２つ以上のＴＮＦＲエンドドメインを含み得る。例えば、ＦＬＢＲの配列は、Ｆａｓ－ＧＩＴＲ－ＧＩＴＲ、Ｆａｓ－ＧＩＴＲ－ＣＤ３０、Ｆａｓ－ＧＩＴＲ－ＸＥＤＡＲ又はＦａｓ－ＧＩＴＲ－ＤｃＲ２であり得る。あるいは、ＦＬＢＲは、例えばＤｃＲ３－４１ＢＢ、ＤｃＲ３－ＯＸ４０、ＤｃＲ３－ＸＥＤＡＲ、ＤｃＲ３－ＧＩＴＲ、ＤｃＲ３－ＣＤ４０、ＤｃＲ３－ＣＤ２７、ＤｃＲ３－ＢＣＭＡ又はＤｃＲ３－Ｆｎ１４であり得る。

第２の態様において、本発明は、Ｆａｓエクトドメイン及びＴＮＦＲエンドドメインを含むＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）であって、該ＴＮＦＲエンドドメインが、デコイ受容体２（ＤｃＲ２）、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＸＥＤＡＲ、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＢＣＭＡ又はＦｎ１４エンドドメインのシグナル伝達部分を含む、ＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）を提供する。特に、ＴＮＦＲエンドドメインは、ＣＤ４０エンドドメインであり得る。

第３の態様において、本発明は、本発明のＦＬＢＲをコードする核酸配列を提供する。

第４の態様において、本発明は、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする第１の核酸配列と、（ｂ）上に定義されるようなＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）をコードする第２の核酸配列とを含む、核酸構築物を提供する。

第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、共発現部位、例えば自己切断ペプチドをコードする配列によって分離され得る。

第５の態様において、本発明は、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする第１の核酸配列と、（ｂ）上に定義されるようなＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）をコードする第２の核酸配列とを含む、核酸配列のキットを提供する。

第６の態様において、本発明は、本発明の第３の態様に記載の核酸配列又は本発明の第４の態様に記載の核酸構築物を含む、ベクターを提供する。

第７の態様において、本発明は、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、（ｂ）上に定義されるようなＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを含む、ベクターのキットを提供する。

第８の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載の細胞を複数含む、医薬組成物を提供する。

第９の態様において、本発明は、疾患を治療する及び／又は防止する際に使用する本発明の第８の態様に記載の医薬組成物を提供する。

第１０の態様において、本発明は、疾患を治療する及び／又は防止する方法であって、その必要がある被験体に本発明の第８の態様に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。

上記方法は、（ｉ）細胞含有試料の単離工程と、（ｉｉ）本発明の第３の態様に記載の核酸配列、本発明の第４の態様に記載の核酸構築物、本発明の第５の態様に記載の核酸配列のキット、本発明の第６の態様に記載のベクター、又は本発明の第７の態様に記載のベクターのキットでの細胞の形質導入又はトランスフェクション工程と、（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の細胞の被験体への投与工程とを含み得る。

細胞は自己又は同種であり得る。

第１１の態様において、本発明は、疾患の治療及び／又は防止のための薬剤製造における、本発明の第８の態様に記載の医薬組成物の使用を提供する。

疾患は癌であり得る。

第１２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載の細胞を作製する方法であって、本発明の第３の態様に記載の核酸配列、本発明の第４の態様に記載の核酸構築物、本発明の第５の態様に記載の核酸配列のキット、本発明の第６の態様に記載のベクター、又は本発明の第７の態様に記載のベクターのキットを、ｉｎｖｉｔｒｏで細胞内に導入する工程を含む、方法を提供する。

細胞は、被験体から単離された試料に由来し得る。

驚くべきことに、本発明者らは、細胞による本発明のＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）の発現が、単に切除Ｆａｓ細胞内デスドメインを含むＦａｓ受容体を発現している細胞よりも、その細胞にＦａｓＬ仲介アポトーシスに対するより高い耐性を与えることを見出した。本発明者らは、この知見を利用して、ＴＭＥ内で誘導されるＦａｓＬにより有効な耐性を持つＣＡＲ発現細胞及びＴＣＲ発現細胞を生成し、こうしてより優れた免疫療法を提供することを提唱する。

（ａ）古典的ＣＡＲを例示する模式図である。（ｂ）～（ｄ）：異なる世代及びＣＡＲエンドドメインの順列。（ｂ）最初の設計は、ＦｃεＲ１－γ又はＣＤ３ζエンドドメインを通じて、ＩＴＡＭシグナルのみを伝達したが、より後の設計は、更なる（ｃ）１つ又は（ｄ）２つの共刺激シグナルを同じ複合エンドドメイン中で伝達した。野生型Ｆａｓ－ＦａｓＬ誘導性アポトーシス（ａ）、並びにＦａｓ－Ｌ結合受容体（ＦＬＢＲ）であるＦａｓ－ＤｃＲ２（ｂ）、Ｆａｓ－ＴＮＦＲ（ｃ）、膜結合型ＤｃＲ３（ｄ）及びＤｃＲ３構造（ｅ）を例示する模式図である。ＴＮＦスーパーファミリーの概要を示す図である。Ｆａｓ及びＴＲＡＩＬ受容体分子はどちらも、アダプター分子としてＦＡＤＤを使用し、ＴＮＦＲ１及びＤ３はアダプター分子としてＴＲＡＤＤを使用する。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＦａｓ－ＦａｓＬ相互作用の模式図である。ＦａｓＬは、Ｔ細胞／ＣＡＲ－Ｔ細胞及び活性化誘導性細胞死（ＡＩＣＤ）を導く過剰活性化（overactivated）Ｔ細胞（ａ）、ＭＤＳＣ（ｂ）、Ｔｒｅｇ（ｃ）、腫瘍内皮細胞（ｄ）、癌細胞（ｅ）及び癌が分泌するエキソソーム（ｆ）によって発現される。Ｔ細胞共培養アッセイの模式図である。Ｆｍｃ６３（抗ＣＤ１９ＣＡＲ）形質導入ＰＢＭＣの細胞数に対して、ＦａｓＬ結合構築物と共発現されたＣＡＲを比較する、総細胞生存数のフローサイトメトリーデータである。ＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）構築物であるＦａｓ－ＤｃＲ２、Ｆａｓ－ＧＩＴＲ及びＦａｓ－ＣＤ３０及びＤｃＲ３－ＣＤ８ｓｔｋは、他の構築物よりも優れた細胞死レスキューを示す。ＦａｓＬ結合構築物ＤｃＲ３及びＤｃＲ３－ＣＤ８ｓｔｋと共発現されるＣＡＲの総細胞生存数を比較するフローサイトメトリーデータである。膜結合型ＤｃＲ３－ＣＤ８ｓｔｋは、可溶性ＤｃＲ３よりも優れた細胞生存を示した。形質導入ＲＱＲ８陽性細胞の生存を比較するフローサイトメトリーデータである。ＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）構築物であるＦａｓ－ＤｃＲ２、Ｆａｓ－ＧＩＴＲ及びＦａｓ－ＣＤ３０は、他の構築物よりも優れた細胞死レスキューを示す。点線は、Ｆｍｃ６３、ＦａｓΔＤＤ及びＦａｓＬを共発現するよう形質導入されたＰＢＭＣの平均生存を示す。Ｆｍｃ６３に対する、ＦａｓＬ結合構築物と共発現されたＣＡＲを比較する、細胞死を誘導するため固定組換え可溶性Ｆａｓリガンドを使用した総細胞生存数のフローサイトメトリーデータである。ＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）構築物であるＦａｓ－ＤｃＲ２及びＦａｓ－ＧＩＴＲは、他の構築物よりも優れた細胞死レスキューを示す。Ｆｍｃ６３に対する、ＦａｓＬ結合構築物と共発現されたＣＡＲを比較する、細胞死を誘導するため固定組換え可溶性Ｆａｓリガンドを使用した形質導入ＲＱＲ８陽性細胞生存のフローサイトメトリーデータである。絶対ＲＱＲ８陽性細胞の生存数を比較する、細胞死を誘導するため固定可溶性組換えＦａｓリガンドを使用したフローサイトメトリーデータである。ＦａｓＬ結合受容体構築物であるＦａｓ－ＸＥＤＡＲは、５日間の時間経過に渡って恒常的に増殖し、ＦａｓＬ誘導性細胞死をレスキューする。第５日と第０日との間の絶対ＲＱＲ８陽性細胞数の増殖倍相違を比較する、細胞死を誘導するため固定可溶性Ｆａｓリガンドを使用したフローサイトメトリーデータである。ＦａｓＬ結合受容体構築物であるＦａｓ－ＸＥＤＡＲは、切除Ｆａｓ細胞内デスドメイン構築物よりも、はるかにより高い増殖倍相違を示す。形質導入ＲＱＲ８陽性細胞パーセントを比較する、細胞死を誘導するため固定可溶性Ｆａｓリガンドを使用したフローサイトメトリーデータである。ＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）構築物であるＦａｓ－ＸＥＤＡＲは、第０日及び第５日の切除Ｆａｓ細胞内デスドメインよりも、より高いＲＱＲ８陽性細胞濃縮を示す。形質導入ＲＱＲ８陽性細胞の生存を比較する、細胞死を誘導するため固定可溶性Ｆａｓリガンドを使用したフローサイトメトリーデータである。ＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）構築物であるＦａｓ－ＸＥＤＡＲは、「ＦａｓＬ＋抗Ｆｍｃ６３」条件下で明らかであるように、ＦａｓＬ仲介細胞死からの保護を示す。ＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）構築物であるＦａｓ－ＸＥＤＡＲが、切除Ｆａｓ細胞内デスドメインよりも、有意により高い基底インターフェロンγを分泌することを示す、細胞死を誘導するため固定可溶性Ｆａｓリガンドを使用したフローサイトメトリーデータである。ＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）構築物であるＦａｓ－ＸＥＤＡＲが、切除Ｆａｓ細胞内デスドメインよりも、有意により高い誘導性ＩＬ－２を分泌することを示す、フローサイトメトリーデータである。形質導入ＲＱＲ８陽性細胞の生存及び絶対細胞数を比較する、細胞死を誘導するため固定可溶性Ｆａｓリガンドを使用したフローサイトメトリーデータである。驚くべきことに、ＦＬＢＲ構築物であるＦａｓ－ＣＤ２７、Ｆａｓ－ＣＤ４０、Ｆａｓ－ＢＣＭＡ及びＦａｓ－Ｆｎ１４で形質導入されたＰＢＭＣは、ＦａｓΔＤＤ及びＦａｓ－４１ＢＢと比較して、より高い絶対ＲＱＲ８陽性細胞数を有する。ＰＢＳ処理ウェル上でインキュベーションされた形質導入ＰＢＭＣに対して、形質導入ＲＱＲ８陽性細胞の絶対細胞数を比較する、細胞死を誘導するため固定可溶性Ｆａｓリガンドを使用したフローサイトメトリーデータである。ＦＬＢＲ構築物であるＦａｓ－ＣＤ２７、Ｆａｓ－ＣＤ４０、Ｆａｓ－ＢＣＭＡ及びＦａｓ－Ｆｎ１４で形質導入されたＰＢＭＣは、ＦａｓΔＤＤと比較して、固定ＦａｓＬとインキュベーションされた際、優れた増殖を有する。形質導入ＲＱＲ８陽性細胞の増殖倍相違を比較する、細胞死を誘導するため固定可溶性Ｆａｓリガンドを使用したフローサイトメトリーデータ（第０日の絶対細胞数に対する第５日の絶対細胞数）である。ＦＬＢＲ構築物であるＦａｓ－ＣＤ２７、Ｆａｓ－ＣＤ４０、Ｆａｓ－ＢＣＭＡ及びＦａｓ－Ｆｎ１４で形質導入されたＰＢＭＣは、ＦａｓΔＤＤ及びＦａｓ－４１ＢＢと比較して、固定ＦａｓＬとインキュベーションされた際、優れた増殖を有する。ＦＬＢＲ構築物であるＦａｓ－ＣＤ４０、Ｆａｓ－ＢＣＭＡ及びＦａｓ－Ｆｎ１４はまた、恒常的な増殖も誘導する（ＰＢＳ条件と比較）。ＦＬＢＲ構築物であるＦａｓ－ＣＤ２７、Ｆａｓ－ＣＤ４０、Ｆａｓ－ＢＣＭＡ及びＦａｓ－Ｆｎ１４が、Ｆａｓリガンドとインキュベーションされた際、ＦａｓΔＤＤよりも、有意により高いインターフェロンγを分泌することを示す、細胞死を誘導するため固定可溶性Ｆａｓリガンドを使用したフローサイトメトリーデータである。ＦＬＢＲ構築物であるＦａｓ－ＣＤ４０、Ｆａｓ－ＢＣＭＡ及びＦａｓ－Ｆｎ１４はまた、基底インターフェロンγ分泌も誘導する（ＰＢＳ条件と比較）。抗原との反復遭遇後、ＧＤ２ターゲティングＣＡＲと共発現されたＦａｓ－ＸＥＤＡＲ、Ｆａｓ－ＣＤ４０、Ｆａｓ－ＢＣＭＡ及びＦａｓ－Ｆｎ１４は、細胞傷害能を増加させることを示す図である。ＧＤ２ターゲティングＣＡＲＴ細胞を、１：１のエフェクター対ターゲット比で、ＳｕｐＴ１ＧＤ２ターゲットと共培養した。３日又は４日ごとに、ＣＡＲＴ細胞を０．５×１０^５個のＳｕｐＴ１ＧＤ２細胞／ウェルで再刺激した。新たな再刺激のそれぞれの前に、ＦＡＣＳによって、ターゲット細胞の殺細胞を定量化した。ＳｙｔｏｘＢｌｕｅの排除、並びにＣＤ２及びＣＤ３発現の非存在によって、残った生存ターゲット細胞を定義する一方、ＣＤ２及びＣＤ３の発現によってＴ細胞を定義した。線は３つの別個のＰＢＭＣドナーの中央値を示す。

Ｆａｓ－ＦａｓＬ経路
Ｆａｓ受容体（ＣＤ９５、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー６、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ２５４４５）は、相対分子量約４５０００の１型膜貫通糖タンパク質受容体であり、リンパ球及び肝細胞を含む多様な細胞の表面上に位置する。Ｆａｓ受容体は、アポトーシスを導くシグナル伝達経路を誘発し、Ｆａｓの発現は、リンパ球の活性化によって、並びにＩＦＮγ及びＴＮＦ等のサイトカインによって増加され得る。ＦａｓとそのリガンドＦａｓＬ（ＦａｓＬ／ＣＤ９５Ｌ、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ４８０２３）との相互作用は、プログラム細胞死を通じて仲介される多くの生理学的及び病理学的プロセスを制御する。

Ｆａｓ及びＦａｓＬはどちらも、ＴＮＦ－Ｒスーパーファミリーのメンバーであり、１つ～５つの細胞外システインリッチドメイン（ＣＲＤ）と、その細胞質テール中に、長さ８０残基～１００残基のモチーフで構成されるデスドメイン（ＤＤ）を含む。

ＦａｓＬへのＦａｓの結合は、受容体三量体化、及びそのデスドメイン（ＤＤ）のホモ型相互作用を通じたＦａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）と称されるタンパク質の補充を誘発する。次に、ＦＡＤＤは次いで、プロカスパーゼ８を活性化受容体に補充し、生じた細胞死誘導性シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）は、カスパーゼ８タンパク質分解的活性化を行い、これが、アポトーシスを仲介するカスパーゼ（アスパラギン酸特異的システインプロテアーゼ）の続くカスケードを開始する（図２ａ及び図３）。

ＦａｓＬは、ＴＭＥ内の多くの細胞によって過剰発現されるため、重要な免疫チェックポイントである（図４）。ＦａｓＬは、多くの癌自体、例えば黒色腫、肺癌、肝細胞癌、食道癌及び結腸癌によって発現されることが報告されてきている。

さらに、血管を裏打ちし、血流及び栄養素の流れ、並びに白血球の輸送を管理する腫瘍内皮細胞がＦａｓＬを発現する一方、正常血管系は発現しないことが示されてきている。

さらに、ＦａｓＬは、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）によって発現される。ＭＤＳＣは、癌、慢性炎症、自己免疫及び感染性疾患中に拡大し、免疫反応を弱め、それによって腫瘍増殖を促進する細胞の不均一な集団である。最後に、ＦａｓＬはまた、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞によって発現されることも報告されている。

ＦａｓＬはまた、Ｔ細胞によって発現され、ＣＡＲ－Ｔにおいて更に上方制御されることが示されてきており、これは、ＣＡＲＴ細胞が、兄弟殺し（fratricide）に感受性であることを意味する。最後に、ＦａｓＬは、活性化Ｔ細胞によって発現されるだけでなく、活性化Ｔ細胞によって産生されるＩＦＮγへの曝露によっても上方制御される。

Ｔ細胞ホメオスタシスの機構として、常に活性化されているＴ細胞は、活性化誘導性細胞死（ＡＩＣＤ）と称される機構を通じて死に、Ｆａｓ－ＦａｓＬ経路は、この原因として特徴づけられてきている。細胞溶解活性及びサイトカイン産生が改善されているにもかかわらず、第３世代ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＦａｓＬ発現が増加した結果として、ＡＩＣＤにより感受性である。

したがって、Ｆａｓ－ＦａｓＬ経路を通じて誘発されるアポトーシスを回避すると、浸潤（腫瘍血管系を通じたもの）及びＴＭＥ内での持続の両方の意味で、養子移入された細胞に、有意な利点が提供される。

ＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）
本発明は、Ｆａｓエクトドメイン及び腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）エンドドメインを含む、ＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）に関する。ＦＬＢＲは、一般構造：
Ｆａｓエクソ－ＴＭ－ＴＮＦＲエンド
（式中、
ＦａｓエクソはＦａｓの細胞外ドメインであり、
ＴＭは膜貫通ドメインであり、
ＴＮＦＲエンドはＴＮＦ受容体のエンドドメインである）を有し得る。

Ｆａｓエクトドメイン
ヒトＦａｓの配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ（寄託番号Ｐ２５４４５）から入手可能であり、配列番号４９として以下に示される。この配列において、残基２６～１７３は細胞外ドメインを形成し（配列番号５０）、残基１７４～１９０は膜貫通ドメインを形成し（配列番号２０）、残基１９１～３３５は細胞質ドメインを形成する（配列番号５１）。配列番号５１において、実施例に記載される切除Ｆａｓ（ＦａｓΔＤＤ）で欠失される配列部分を下線で示す。

配列番号４９（ヒトＦａｓ）
MLGIWTLLPLVLTSVARLSSKSVNAQVTDINSKGLELRKTVTTVETQNLEGLHHDGQFCHKPCPPGERKARDCTVNGDEPDCVPCQEGKEYTDKAHFSSKCRRCRLCDEGHGLEVEINCTRTQNTKCRCKPNFFCNSTVCEHCDPCTKCEHGIIKECTLTSNTKCKEEGSRSNLGWLCLLLLPIPLIVWVKRKEVQKTCRKHRKENQGSHESPTLNPETVAINLSDVDLSKYITTIAGVMTLSQVKGFVRKNGVNEAKIDEIKNDNVQDTAEQKVQLLRNWHQLHGKKEAYDTLIKDLKKANLCTLAEKIQTIILKDITSDSENSNFRNEIQSLV

配列番号５０（Ｆａｓ細胞外ドメイン）
QVTDINSKGLELRKTVTTVETQNLEGLHHDGQFCHKPCPPGERKARDCTVNGDEPDCVPCQEGKEYTDKAHFSSKCRRCRLCDEGHGLEVEINCTRTQNTKCRCKPNFFCNSTVCEHCDPCTKCEHGIIKECTLTSNTKCKEEGSRSN

配列番号５１（Ｆａｓ細胞質ドメイン）

本発明のＦＬＢＲは、配列番号５０として示されるＦａｓ細胞外ドメイン、又は生じるＦＬＢＲ分子がＦａｓＬへの結合に関して内因性Ｆａｓと競合し、ＦＡＤＤに結合する能力がないか若しくはその能力が減少しているという条件で、配列番号５０に少なくとも８０％、９０％、９５％若しくは９９％同一であるその変異体を含み得る。

２つのポリペプチド配列間の同一性パーセントは、http://blast.ncbi.nlm.nih.govで自由に入手可能であるＢＬＡＳＴ等のプログラムによって容易に決定され得る。適切には、同一性パーセントは、参照及び／又はクエリー配列の全体に渡って決定される。

ＦＬＢＲ膜貫通ドメイン
ＦＬＢＲは、膜を渡る膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、膜中で熱力学的に安定である、例えば二量体化しない、任意のタンパク質構造であり得る。これは、典型的には、いくつかの疎水性残基で構成されるαらせんである。任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインが、膜貫通部分を供給するために使用され得る。タンパク質の膜貫通ドメインの存在及びスパンは、ＴＭＨＭＭアルゴリズム（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）を使用して、当業者によって決定され得る。さらに、タンパク質の膜貫通ドメインが比較的単純な構造である、すなわち膜を渡るために十分な長さの疎水性αらせんを形成すると予測されるポリペプチド配列であるならば、人工的に設計されたＴＭドメインもまた使用可能である（米国特許第７０５２９０６号は膜貫通構成要素を記載する）。

膜貫通ドメインは疎水性αらせんを含み得る。膜貫通ドメインはＦａｓに由来し得る。膜貫通ドメインは、配列番号２０として示される配列又は少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異体を含み得る。

配列番号２０（Ｆａｓ膜貫通ドメイン）
LGWLCLLLLPIPLIVWV

変異体は、変異体配列が膜を横断する能力を保持するという条件で、配列番号２０と少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有し得る。

膜貫通ドメインは、ＴＮＦＲ、例えば本明細書に記載されるようなＴＮＦＲ由来の膜貫通ドメインに基づき得る。適切には、膜貫通ドメインは、ＦＬＢＲ中に存在するエンドドメインと同じＴＮＦＲに基づき得る。

適切には、膜貫通ドメインは、配列番号２０～３４のいずれか１つ、又は少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異体を含み得る。変異体は、変異体配列が膜を横断する能力を保持するという条件で、配列番号２１～３４と少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有し得る。

配列番号２１（ＤｃＲ２膜貫通ドメイン）
YLIIIVVLVIILAVVVVGFSC

配列番号２２（ＧＩＴＲ膜貫通ドメイン）
LGWLTVVLLAVAACVLLLTSA

配列番号２３（ＣＤ３０膜貫通ドメイン）
PVLFWVILVLVVVVGSSAFLL

配列番号２４（ＣＤ８膜貫通ドメイン）
APTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD

配列番号２５（ＣＤ２８膜貫通ドメイン）
FLFVLLGVGSMGVAAIVWGAW

配列番号２６（４－１ＢＢ膜貫通ドメイン）
IISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV

配列番号２７（ＤＲ３膜貫通ドメイン）
MFWVQVLLAGLVVPLLLGATL

配列番号２８（ＯＸ４０膜貫通ドメイン）
VAAILGLGLVLGLLGPLAILL

配列番号２９（ＣＤ７０膜貫通ドメイン）
VLRAALVPLVAGLVICLVVCI

配列番号３０（ＣＤ４０膜貫通ドメイン）
ALVVIPIIFGILFAILLVLVFI

配列番号３１（ＸＥＤＡＲ膜貫通ドメイン）
LVALVSSLLVVF TLAFLGLFF

配列番号３２（Ｆｎ１４膜貫通ドメイン）
ILGGALSLTFVLGLLSGFLVW

配列番号３３（ＢＣＭＡ膜貫通ドメイン）
ILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLL

配列番号３４（ＣＤ２７膜貫通ドメイン）
ILVIFSGMFLVFTLAGALFLH

ＴＮＦＲエンドドメイン
ＴＮＦスーパーファミリーの細胞質ドメイン中の構造モチーフは、そのシグナル伝達特性に基づいて、デスドメイン（ＤＤ）を含むものと、ＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）と会合する他方のものとの２つの群に分類される。膜アンカードメインを欠き、タンパク質分解的に表面から切断されるか、又は糖脂質連結を通じてアンカリングされ、「デコイ受容体」と称される、第３の群がある。

ＴＮＦＲのリストを表１に提供する。

本発明のＦＬＢＲは、ＴＮＦＲのエンドドメイン又はそのシグナル伝達部分を含み得る。ＴＮＦＲは、ＧＩＴＲ、ＤｃＲ２、ＣＤ３０、ＸＥＤＡＲ、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＢＣＭＡ又はＦｎ１４からなる群より選択され得る。

グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）
ＦＬＢＲは、ＧＩＴＲ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ９Ｙ５Ｕ５）のエンドドメインを含み得る。ＧＩＴＲは、Ｔ細胞上に恒常的に発現される細胞表面受容体であり、その表面発現は、ＣＤ３／２８刺激に際して増加する。ＧＩＴＲは共刺激受容体であり、その活性化はＴＲＡＦ２／５補充を通じて、ＮＦκＢ及びＭＡＰキナーゼシグナル伝達を導き、ＣＤ２５の上方制御、並びにＩＬ－２及びＩＦＮγの分泌を生じる。

ＧＩＴＲエンドドメインを配列番号１に示す。ＦＬＢＲは、配列番号１、又は配列番号１に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有し、ＧＩＴＲ仲介シグナル伝達を誘導する能力を保持する、その変異体を含み得る。

配列番号１（ＧＩＴＲエンドドメイン）
QLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV

ＣＤ３０エンドドメイン
ＦＬＢＲは、ＣＤ３０（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ２８９０８）のエンドドメインを含み得る。ＣＤ３０は、ＴＮＦＲＳＦ８としても知られ、ＴＮＦＲファミリーの細胞膜タンパク質であり、腫瘍マーカーである。この受容体は、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞によって発現される。ＴＲＡＦ２及びＴＲＡＦ５は、この受容体と相互作用し、ＮＦκＢの活性化を導くシグナル伝達を仲介し得る。この受容体はアポトーシスの正の制御因子であり、また、自己反応性ＣＤ８エフェクターＴ細胞の増殖潜在能力を限定し、自己免疫に対して身体を保護することも示されてきている。別個のアイソフォームをコードする、この遺伝子の２つの選択的スプライシング転写物変異体が報告されてきている。

ＣＤ３０エンドドメインを配列番号２に示す。ＦＬＢＲは、配列番号２、又は配列番号２に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有し、ＣＤ３０仲介シグナル伝達を誘導する能力を保持する、その変異体を含み得る。

配列番号２（ＣＤ３０エンドドメイン）
HRRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK

ＸＥＤＡＲエンドドメイン
ＦＬＢＲは、ＸＥＤＡＲ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号ＱＰＨＡＶ５）のエンドドメインを含み得る。ＸＥＤＡＲは、ＴＮＦＲＳＦ２７又はＥＤＡ２Ｒ（エクトジスプラシンＡ２受容体）としても知られ、ＴＮＦＲ（腫瘍壊死因子受容体）スーパーファミリーのＩＩＩ型膜貫通タンパク質であり、３つのシステインリッチリピート及び単一の膜貫通ドメインを含むが、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く。このタンパク質は、ＮＦκＢ及びＪＮＫ経路の活性化を仲介する。活性化は、ＴＲＡＦ３及びＴＲＡＦ６への結合によって仲介されるはずである。

ＸＥＤＡＲエンドドメインを配列番号３に示す。ＦＬＢＲは、配列番号３、又は配列番号３に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有し、ＸＥＤＡＲ仲介シグナル伝達を誘導する能力を保持する、その変異体を含み得る。

配列番号３（ＸＥＤＡＲエンドドメイン）
TSNTKCKEEGSRSNLGWLCLLLLPIPLIVWVLYCKQFFNRHCQRGGLLQFEADKTAKEESLFPVPPSKETSAESQVSENIFQTQPLNPILEDDCSSTSGFPTQESFTMASCTSESHSHWVHSPIECTELDLQKFSSSASYTGAETLGGNTVESTGDRLELNVPFEVPSP

ＣＤ４０エンドドメイン
ＦＬＢＲは、ＣＤ４０（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ２５９４２）のエンドドメインを含み得る。ＣＤ４０（表面抗原分類４０）又はＴＮＦＲＳＦ５（腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー５）は、抗原提示細胞上に見られる共刺激タンパク質であり、その活性化に必要である。この受容体は、Ｔ細胞依存性免疫グロブリンクラススイッチ、メモリーＢ細胞発展、及び胚中心形成を含む、広く多様な免疫及び炎症反応を仲介する際に必須であることが見出されてきている。ＣＤ４０は、マクロファージ及びＢ細胞においてＥＲＫを活性化する、ＴＲＡＦ６及びＭＡＰ３Ｋ８仲介シグナルを伝達し、免疫グロブリン分泌の誘導を導く。

ＣＤ４０エンドドメインを配列番号４に示す。ＦＬＢＲは、配列番号４、又は配列番号４に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有し、ＣＤ４０仲介シグナル伝達を誘導する能力を保持する、その変異体を含み得る。

配列番号４（ＣＤ４０エンドドメイン）
KKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ

ＣＤ２７エンドドメイン
ＦＬＢＲは、ＣＤ２７（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号ＱＰＨＡＶ５）のエンドドメインを含み得る。ＣＤ２７は、ＴＮＦＲＳＦ７（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー７）又はＴ細胞活性化抗原ＣＤ２７としても知られ、Ｔ細胞免疫の生成及び長期維持に必要な膜貫通タンパク質である。ＣＤ２７は、リガンドＣＤ７０に結合し、Ｂ細胞活性化及び免疫グロブリン合成の制御に重要な役割を果たす。この受容体は、ＮＦκＢ及びＭＡＰＫ８／ＪＮＫの活性化を導くシグナルを伝達する。アダプタータンパク質ＴＲＡＦ２及びＴＲＡＦ５は、この受容体のシグナル伝達プロセスを仲介することが示されてきている。アポトーシス促進性タンパク質であるＣＤ２７結合タンパク質（ＳＩＶＡ）は、この受容体に結合することができ、この受容体によって誘導されるアポトーシスにおいて、重要な役割を果たすと考えられる。

ＣＤ２７エンドドメインを配列番号５に示す。ＦＬＢＲは、配列番号５、又は配列番号５に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有し、ＧＩＴＲ仲介シグナル伝達を誘導する能力を保持する、その変異体を含み得る。

配列番号５（ＣＤ２７エンドドメイン）
QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP

ＢＣＭＡエンドドメイン
ＦＬＢＲは、ＢＣＭＡ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号ＱＯ２２２３）由来のエンドドメインを含み得る。ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）はＴＮＦＲＳＦ１７（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７）としても知られ、ヒトにおいてはＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＴＮＦＲＳＦ１７は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体であり、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ）及びＡ増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３）を認識する。この受容体は、Ｂ細胞生存を促進し、体液性免疫の制御において役割を果たす。この受容体はまた、ＮＦκＢ及びＪＮＫも活性化する。

ＢＣＭＡエンドドメインを配列番号６に示す。ＦＬＢＲは、配列番号６、又は配列番号６に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有し、ＧＩＴＲ仲介シグナル伝達を誘導する能力を保持する、その変異体を含み得る。

配列番号６（ＢＣＭＡエンドドメイン）
RKINSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSISAR

Ｆｎ１４エンドドメイン
ＦＬＢＲは、Ｆｎ１４（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ９ＮＰ８４）のエンドドメインを含み得る。Ｆｎ１４は、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａとしても知られ、ＴＮＦＳＦ１２／ＴＷＥＡＫの受容体であり、或る細胞タイプではアポトーシスの弱い誘導因子である。Ｆｎ１４はまた、血管形成及び内皮細胞増殖も促進し、マトリックスタンパク質への細胞接着を調節し得る。

Ｆｎ１４エンドドメインを配列番号７に示す。ＦＬＢＲは、配列番号７、又は配列番号７に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有し、Ｆｎ１４仲介シグナル伝達を誘導する能力を保持する、その変異体を含み得る。

配列番号７（Ｆｎ１４エンドドメイン）
RRCRRREKFTTPIEETGGEGCPAVALIQ

ＤｃＲ２（デコイ受容体２）
ＦＬＢＲは、ＤｃＲ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ９ＵＢＮ６）のエンドドメインの一部を含み得る。ＤｃＲ２は、ＴＲＡＩＬ４又はＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー１０Ｄ）としても知られ、細胞傷害性リガンドＴＲＡＩＬの細胞表面受容体である。

本発明のＦＬＢＲは、機能性デスドメインを欠く、ＤｃＲ２の細胞内ドメインを含み得る。例えば、ＤｃＲ２エンドドメインは、ＦＡＤＤに結合不能である切除デスドメインを含み得る。Ｆａｓの細胞外結合ドメインを、非機能性デスドメインを有するＤｃＲ２の細胞内ドメインと融合させると、ＦａｓＬへの結合に関してＦａｓと競合するが、ＦＡＤＤに結合不能であり、ＦａｓＬ誘導性アポトーシス経路を阻害する、ＦＬＢＲが生じる。

ＤｃＲ２細胞内ドメインは、ＮＦ－κＢシグナル伝達を誘導し、生存促進機能及び抗アポトーシス機能を提供し、これは癌に利用される特徴である。したがって、本発明のＦＬＢＲにおいて、ＦａｓエクトドメインとＤｃＲ２エンドドメインとを組み合わせることは、ＦａｓＬによって誘導されるアポトーシス促進性シグナルを打ち消し、ＮＦκＢを通じて、アポトーシス促進性シグナルを生存促進性結果に変換する点で、有益である。

切除デスドメインを含むＤｃＲ２エンドドメインを配列番号８に示す。ＦＬＢＲは、配列番号８、又は配列番号８に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有し、ＤｃＲ２仲介シグナル伝達を誘導する能力を保持する、その変異体を含み得る。

配列番号８（ＤｃＲ２エンドドメイン）
RKKFISYLKGICSGGGGGPERVHRVLFRRRSCPSRVPGAEDNARNETLSNRYLQPTQVSEQEIQGQELAELTGVTVESPEEPQRLLEQAEAEGCQRRRLLVPVNDADSADISTLLDASATLEEGHAKETIQDQLVGSEKLFYEEDEAGSATSCL

本発明のＦＬＢＲは、２つ以上のＴＮＦＲエンドドメインを含み得る。例えば、ＦＬＢＲのＦａｓエクトドメイン及びＴＮＦＲエンドドメインを、表１に列挙されるＴＮＦＲエンドドメインのいずれか１つより選択される更なるＴＮＦＲエンドドメインのシグナル伝達部分に融合させてもよい。ＦＬＢＲ構築物は、例えば、Ｆａｓ受容体エクトドメイン及び２つのＴＮＦＲエンドドメインを含み得る（例えばＦａｓ－ＣＤ３０－４１ＢＢ又はＦａｓ－ＣＤ３０－ＯＸ４０）。

以下は、シグナルペプチド（通常のテキスト）、Ｆａｓエクトドメイン（太字）、膜貫通ドメイン（斜字）及びＴＮＦＲエンドドメイン（下線）を含む完全ＦＬＢＲ配列のリストである。ＦＬＢＲは、これらの全配列の１つ又は一部を含み得る。例えば、ＦＬＢＲは、Ｆａｓエクトドメイン及びＴＮＦＲの組み合わせを含み得るが、異なるシグナルペプチド及び／又は膜貫通ドメインを伴い得る。

配列番号３５（ヒトＦａｓ－Ｄｃｒ２）

配列番号３６（ヒトＦａｓ－ＧＩＴＲ）

配列番号３７（ヒトＦａｓ－ＣＤ３０）

配列番号３８（ヒトＦａｓ－ＸＥＤＡＲ）

配列番号３９（ヒトＦａｓ－ＣＤ２７）

配列番号４０（ヒトＦａｓ－ＢＣＭＡ）

配列番号４１（ヒトＦａｓ－ＣＤ４０）

配列番号４２（ヒトＦａｓ－Ｆｎ１４）

本発明のＦＬＢＲは、配列番号３５～４２のいずれか１つ又は少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異体を含み得る。変異体は、細胞によって発現された際、変異体配列が、ＦａｓＬ誘導性アポトーシスを阻害する能力を保持するという条件で、配列番号３５～４２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有し得る。

膜結合型ＤｃＲ３
ＤｃＲ３（デコイ受容体３、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｏ９５４０７）は、選択的スプライシングを経てＴＮＦＲスーパーファミリーの可溶性メンバーを生じる、Ｉ型膜貫通糖タンパク質である。この可溶性受容体は、ＦａｓＬに結合し、その生物学的機能を中和して、こうしてＦａｓＬ誘導性アポトーシスを阻害する。ＤｃＲ３はまた、リガンドＴＬ１Ａ及びＬＩＧＨＴに結合し、これらもまた、それぞれ、受容体ＤＲ３及びＨＶＥＭを通じて、アポトーシス誘導に関連する。

ＴＭＥにおけるＦａｓＬ誘導性ＣＡＲ－Ｔ細胞アポトーシスを克服するため、本発明のＦＬＢＲは、ＦａｓＬに結合することによって、Ｆａｓと競合するであろう、ＤｃＲ３のＦａｓＬ結合部分を含み得る。しかし、ＤｃＲ３は可溶性タンパク質であるため、ＣＡＲ－ＴによるＤｃＲ３の分泌は、宿主Ｔ細胞に対する交絡効果を有し得る（ＦａｓＬ発現宿主Ｔ細胞反応を中和する）。

ＤｃＲ３と宿主Ｔ細胞上に存在するＦａｓＬとの細胞－細胞接触を減少させるため、本発明のＤｃＲ３は膜結合型ＤｃＲ３である。膜結合型ＤｃＲ３は、一般構造：
ＤｃＲ３－スペーサー－ＴＭ－エンド
（式中、
ＤｃＲ３はＤｃＲ３のＦａｓＬ結合ドメインを含み、
スペーサーは、膜貫通ドメインにＤｃＲ３を連結するスペーサー配列であり、
ＴＭは膜貫通ドメインであり、
エンドは任意選択の細胞内配列である）を有し得る。

ＦＬＢＲは、配列番号９、又はＦａｓＬに結合する能力を保持する、配列番号９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するその変異体を有するＤｃｒ３ドメインを含み得る。

配列番号９（ＤｃＲ３）
VAETPTYPWRDAETGERLVCAQCPPGTFVQRPCRRDSPTTCGPCPPRHYTQFWNYLERCRYCNVLCGEREEEARACHATHNRACRCRTGFFAHAGFCLEHASCPPGAGVIAPGTPSQNTQCQPCPPGTFSASSSSSEQCQPHRNCTALGLALNVPGSSSHDTLCTSCTGFPLSTRVPGAEECERAVIDFVAFQDISIKRLQRLLQALEAPEGWGPTPRAGRAALQLKLRRRLTELLGAQDGALLVRLLQALRVARMPGLERSVRERFLPVH

ＤｃＲ３の構造は、ＦａｓＬに結合する４つのＮ末端システインリッチドメイン（ＣＲＤ）、及びヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合するＣ末端ヘパラン結合ドメイン（ＨＢＤ）を含む（図２ｅ）。ＤｃＲ３のＨＢＤがＨＳＰＧの架橋を通じて樹状細胞においてアポトーシスを誘導するが、ＦａｓＬ結合ＣＲＤは誘導しないことが示されてきている（You et al., 2008, Blood 111, 1480-1488）。

ＤｃＲ３のＨＢＤは、３つの塩基性アミノ酸（Ｋ^２５６、Ｒ^２５８及びＲ^２５９）を含む結合モチーフを通じて、ＨＳＰＧに結合する。本発明のＦＬＢＲは、残基Ｋ^２５６、Ｒ^２５８及びＲ^２５９の１つ以上に突然変異を含む、ＤｃＲ３の突然変異体型を含み得る。突然変異（複数の場合もある）は、ＨＳＰＧへの結合を減少させ得るか又は無効にし得る。その突然変異又は各突然変異は、置換突然変異であり得る。その突然変異又は各突然変異は、アラニンでのアミノ酸の置換を含み得る。ＦＬＢＲは、太字で示されるような、Ｋ^２５６位、Ｒ^２５８位及びＲ^２５９位の各々でアラニン突然変異を含む、配列番号１０として示される配列を含み得る。

配列番号１０（突然変異体ＤｃＲ３）

スペーサー
スペーサー配列は、ＤｃＲ３ドメインを細胞膜から物理的に遠ざけ、及び／又は或る程度の柔軟性を提供する、任意の配列であり得る。ＣＡＲにおいて一般的に使用されるスペーサー配列は、本発明の膜結合型ＤｃＲ３ＦＬＢＲで使用され得る。例示する目的のみのため、適切な配列のリストを表２に提供する。

膜結合型ＤｃＲ３は、配列番号１１～１７として示されるスペーサー、又は配列番号１１～１７に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するその変異体の任意の１つを含み得る。

ＦＬＢＲは、スペーサーにＤｃＲ３を連結するアミノ酸の短いストレッチを含み得る。リンカーは、例えば、２つ～１０個の間又は３つ～５つの間のアミノ酸を含み得る。リンカーは「標準」ＳＤＰリンカー配列であり得る。

本明細書に記載のＦＬＢＲは、図２ｄ及び図５ｂに示されるような、ＣＤ８膜貫通ストーク（ＣＤ８ｓｔｋ）を通じて、形質膜に結合している修飾ＤｃＲ３を含み得る。

膜結合型ＤｃＲ３ＴＭドメイン
膜結合型ＤｃＲ３はまた、膜貫通ドメインも含む。上に説明されるように、膜貫通ドメインは、膜において熱力学的に安定である任意のタンパク質構造であり得て、典型的には、いくつかの疎水性残基を含むαらせんである。膜貫通ドメインは、任意の膜貫通タンパク質に由来し得る。スペーサーが膜貫通タンパク質、例えばＣＤ８又はＣＤ２８に由来する場合、ＴＭドメインは、好適には、同じタンパク質に由来し得る。

ＣＤ２８及びＣＤ８αの配列は、それぞれ、配列番号５２及び５３として以下に示される。

配列番号５２（ＣＤ２８ＴＭドメイン）
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV

配列番号５３（ＣＤ８ＴＭドメイン）
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT

膜貫通ドメインは、配列番号５２若しくは５３として示される配列、又は膜を渡る能力を保持する、少なくとも９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するその変異体を含み得る。

膜結合型ＤｃＲ３エンドドメイン
膜結合型ＤｃＲ３変異体を含むＦＬＢＲは、形質膜にごく近接する極性領域（polar region）を提供する細胞内極性アンカーを含み得る。極性アンカー配列を以下に配列番号１８として示す。

あるいは又はさらに、ＦＬＢＲは細胞内剛性リンカーを含み得る。この配列は、一般的に使用されるグリシンセリンリンカーよりも柔軟性でなく、組換えタンパク質配列のＣ末端で好適である。剛性リンカー配列を以下に配列番号１９として示す。

配列番号１８（極性アンカー）
RKKR

配列番号１９（切除を含む剛性リンカー）
LEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALE

本発明のＦＬＢＲの膜結合型ＤｃＲ３特徴はまた、極性アンカー／剛性リンカーに加えて又はその代わりに、ＴＮＦＲエンドドメインも含み得る。ＴＮＦＲエンドドメインは、表１に列挙するＴＮＦＲのいずれか１つより選択され得る。ＴＮＦＲエンドドメインは、配列番号１～８として示される配列の１つを含み得る。

以下は、膜結合型ＤｃＲ３に基づく２つの完全ＦＬＢＲ配列である。この配列には、シグナルペプチド（通常のテキスト）、ＤｃＲ３（太字）、標準リンカー（太字かつ下線）、スペーサー（斜字）、膜貫通ドメイン（下線）、極性アンカー（二重下線）及び剛性リンカー（太字かつ斜字）が含まれる。ＦＬＢＲは、これらの全配列の１つ又はその一部を含み得る。例えばＦＬＢＲは、ＤｃＲ３及び極性アンカー／剛性アンカーを含み得るが、異なるシグナルペプチド、スペーサー及び／又は膜貫通ドメインを伴い得る。

配列番号４３（ヒトＤｃＲ３－ＣＤ８ストーク／ＴＭ／剛性リンカー）

配列番号４４（ヒト突然変異体ＤｃＲ３－ＣＤ８ストーク／ＴＭ／剛性リンカー）

本発明のＦＬＢＲは、配列番号４３若しくは４４、又は少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異体を含み得る。変異体は、細胞によって発現された際、変異体配列が、ＦａｓＬ誘導性アポトーシスを阻害する能力を保持するという条件で、配列番号４３又は４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有し得る。

核酸配列
本発明は、
（ｉ）Ｆａｓエクトドメイン及びＴＮＦＲエンドドメインであって、該ＴＮＦＲエンドドメインがデコイ受容体２（ＤｃＲ２）、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＸＥＤＡＲ、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＢＣＭＡ若しくはＦｎ１４エンドドメインのシグナル伝達部分を含む、ＴＮＦＲエンドドメイン、又は、
（ｉｉ）膜結合型デコイ受容体３（ＤｃＲ３）、
を含むＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）をコードする核酸配列を提供する。

核酸配列は、ＴＮＦＲを発現するポリヌクレオチドが細胞の内因性ゲノムの一部ではないという意味で、「外因性ポリヌクレオチド」である。例えば、外因性ポリヌクレオチドは、操作核酸構築物又はベクターの一部であり得る。

本明細書で使用される際、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、及び「核酸」は、互いに同義であると意図される。

多くの異なるポリヌクレオチド及び核酸が、遺伝暗号の縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることは、当業者によって理解されるであろう。さらに、当業者は、ルーチンの技術を使用して、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を作製して、その中でポリペプチドを発現しようとする任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映し得る。

本発明に記載の核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。これらは、一本鎖又は二本鎖であり得る。これらはまた、その中に合成又は修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対する多くの異なるタイプの修飾が当該技術分野に知られる。これらには、メチルホスホネート及びホスホロチオエート主鎖、分子の３’端及び／又は５’端へのアクリジン鎖又はポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書に記載されるような使用の目的のため、ポリヌクレオチドは、当該技術分野で利用可能な任意の方法によって修飾され得ることが理解されるものとする。こうした修飾は、関心対象のポリヌクレオチドのｉｎｖｉｖｏ活性又は寿命を増進するために行われ得る。

ヌクレオチド配列と関連する用語「変異体」、「相同体」又は「誘導体」には、配列からの又は配列への１つ（以上）の核酸の任意の置換、変異、修飾、置換、欠失又は付加が含まれる。

核酸構築物
１つの態様において、本発明は、（ｉ）ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする第１の核酸配列と、（ｉｉ）上に定義されるような第２の核酸配列とを含む、核酸構築物を提供する。

核酸構築物は、一般構造：
ＣＡＲ／ＴＣＲ－共発現－ＦＬＢＲ、又は、
ＦＬＢＲ－共発現－ＣＡＲ／ＴＣＲ
（式中、
ＣＡＲ／ＴＣＲは、ＣＡＲ又はＴＣＲをコードする核酸配列であり、
共発現は、別個のポリペプチドとして、ＣＡＲ／ＴＣＲ及びＦＬＢＲの共発現を可能にする核酸配列であり、
ＦＬＢＲは、本明細書に記載されるようなＦａｓＬ結合受容体をコードする核酸配列である）を有し得る。

上記構造において、「共発現」は、２つのポリペプチドを別個の実体として共発現することを可能にする核酸配列である。これは、核酸構築物が、切断部位（複数の場合もある）によって連結される、両方のポリペプチドを産生するように、切断部位をコードする配列であり得る。ポリペプチドが産生された際、いかなる外部切断活性の必要性もなしに、直ちに個々のペプチドに切断されるように、切断部位は、自己切断性であり得る。

切断部位は、２つのポリペプチドが分離されることを可能にする任意の配列であり得る。

用語「切断」は、便宜上、本明細書において使用されるが、切断部位は、古典的切断以外の機構によって、ペプチドの個々の実体への分離を引き起こし得る。例えば口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断ペプチド（以下を参照されたい）に関しては、「切断」活性の主要因となる多様なモデル：宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク質分解又は翻訳効果が提唱されてきている（Donnelly et al (2001) J. Gen. Virol. 82:1027-1041）。タンパク質をコードする核酸配列間に切断部位が配置された際に、タンパク質が別個の実体として発現されるようにする限り、こうした「切断」の正確な機構は、本発明の目的のためには重要ではない。

切断部位は、例えばフューリン切断部位、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位であり得るか、又は自己切断ペプチドをコードし得る。

「自己切断ペプチド」は、タンパク質及び自己切断ペプチドを含むポリペプチドが産生されたならば、いかなる外部の切断活性の必要性も伴わずに、はっきり区別できる別個の第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとに直ちに「切断される」か又は分離されるように機能するペプチドを指す。

自己切断ペプチドは、アフトウイルス又はカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断ペプチドであり得る。アフトウイルス及びカルジオウイルスの一次２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体のＣ末端での２Ａ「切断」によって仲介される。アフトウイルス、例えば口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）及びウマ鼻炎Ａウイルスにおいては、２Ａ領域は約１８アミノ酸の短いセクションであり、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存されたプロリン残基）と共に、それ自体のＣ末端での「切断」を仲介可能な自律要素に相当する（上述のようなDonelly et al (2001)）。

「２Ａ様」配列は、アフトウイルス又はカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルス、並びにトリパノソーマ属（Trypanosoma）種内の反復配列及び細菌配列において見出されてきている（上述のようなDonnelly et al (2001)）。

切断部位は、配列番号５４に示される２Ａ様配列（ＲＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）を含み得る。

本発明は更に、（ｉ）ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする第１の核酸配列と、（ｉｉ）本明細書に定義されるようなＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）を発現可能な外因性ポリヌクレオチドである第２の核酸配列を含むキットを提供する。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
図１に模式的に示される古典的ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に連結するキメラＩ型膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他の形式、又はターゲット抗原のリガンドに基づき得る。バインダーを膜から分離し、その適切な配向を可能にするため、スペーサードメインが必要な場合がある。使用される一般的なスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。抗原に応じて、よりコンパクトなスペーサー、例えばＣＤ８α由来のストーク及び更にはＩｇＧ１ヒンジのみでも十分であり得る。膜貫通ドメインは、タンパク質を細胞膜中にアンカリングし、スペーサーをエンドドメインに連結する。

初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１のγ鎖又はＣＤ３ζいずれかの細胞内部分由来のエンドドメインを有した。その結果、これらの第１世代受容体は、免疫学的シグナル１を伝達し、同族（cognate）ターゲット細胞のＴ細胞殺細胞を誘発するために十分であったが、Ｔ細胞が増殖し生存するように完全に活性化することには失敗した。この限界を克服するため、複合エンドドメインが構築されている。Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分をＣＤ３ζのものに融合させると、抗原認識後に活性化シグナル及び共刺激シグナルを同時に伝達し得る第２世代受容体が生じる。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８のものである。これは、最も強力な共刺激シグナル、すなわち、Ｔ細胞増殖を誘発する免疫学的シグナル２を供給する。いくつかの受容体もまた、記載されてきており、これにはＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメイン、例えば生存シグナルを伝達し、緊密に関連するＯＸ４０及び４－１ＢＢが含まれる。更により強力な第３世代ＣＡＲが現在記載されており、これらは、活性化、増殖及び生存シグナルを伝達可能なエンドドメインを有する。

ＣＡＲコード核酸は、例えば、レトロウイルスベクターを使用して、Ｔ細胞にトランスファーされ得る。この方式では、養子細胞移入のため、多数の抗原特異的Ｔ細胞を生成可能である。ＣＡＲがターゲット抗原に結合すると、これは、ターゲット抗原がその上で発現されているＴ細胞に活性化シグナルの伝達を生じる。したがって、ＣＡＲは、ターゲティングされる抗原を発現している細胞に対して、Ｔ細胞の特異性及び細胞傷害性を向ける。

抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識する古典的ＣＡＲの一部である。

抗体の抗原結合部位、抗体模倣体、及びＴ細胞受容体に基づくものを含む、多くの抗原結合部位が当該技術分野に知られる。例えば、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ターゲット抗原の天然リガンド、ターゲットに十分なアフィニティを持つペプチド、ラクダ類（camelid）等の単一ドメインバインダー、Ｄａｒｐｉｎとしての人工的単一バインダー、又はＴ細胞受容体由来の一本鎖を含み得る。

多様な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が知られ、このうちいくつかを以下の表３に示す。本発明で使用される抗原結合ドメインは、この表に示されるようなＴＡＡに結合可能なドメインであり得る。

膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜を渡る古典的ＣＡＲの配列である。このドメインは、疎水性αらせんを含み得る。膜貫通ドメインは、上に説明されるように、任意の膜貫通タンパク質に由来し得るか、又は合成であり得る。ＣＡＲのＴＭドメインは、ＣＤ２８に由来し得て、これは優れた受容体安定性を与える。あるいは、膜貫通ドメインは、メラノソームタンパク質Ｔｒｙｐ－１に由来し得る。

シグナルペプチド
ＣＡＲは、細胞、例えばＴ細胞において発現された際、新生タンパク質が小胞体へと導かれ、続いて細胞表面へと導かれ、そこで発現されるようなシグナルペプチドを含み得る。

シグナルペプチドのコアは、単一αらせんを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチを含み得る。シグナルペプチドは、アミノ酸の短い正荷電ストレッチで始まることができ、このストレッチは、転位置の間、ポリペプチドの適切なトポロジーの強制を補助する。シグナルペプチド端には、典型的には、シグナルペプチダーゼによって認識され切断されるアミノ酸ストレッチがある。シグナルペプチダーゼは、転位置中、又は転位置の完了後に切断して、遊離シグナルペプチド及び成熟タンパク質を生じ得る。次いで、遊離シグナルペプチドは、特定のプロテアーゼによって消化される。

スペーサードメイン
ＣＡＲは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとを連結するスペーサー配列を含み得る。柔軟なスペーサーは、抗原結合ドメインを異なる向きに配向して結合を容易にすることを可能にする。

スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジ、又はヒトＣＤ８ストーク若しくはマウスＣＤ８ストークを含み得る。あるいは、スペーサーは、ＩｇＧ１Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジ又はＣＤ８ストークと類似の長さ及び／又はドメインスペーシング特性を有する別のリンカー配列を含み得る。ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合モチーフを除去するように改変され得る。ＣＡＲは、表２に列挙されるスペーサーの１つを含み得る。

細胞内シグナル伝達ドメイン
細胞内シグナル伝達ドメインは、古典的ＣＡＲのシグナル伝達部分である。細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインであり得るか、又はこうしたドメインを含み得る。

細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含み得る。ＩＴＡＭは４アミノ酸の保存配列であり、免疫系の或る特定の細胞表面タンパク質の細胞質テール中で２回反復される。このモチーフは、任意の２つの他のアミノ酸によってロイシン又はイソロイシンから分離されて、特徴ＹｘｘＬ／Ｉを生じる、チロシンを含む。これらの特徴の２つは、典型的には、分子テール中で、６つ～８つの間のアミノ酸によって分離される（ＹｘｘＬ／Ｉｘ_{（６～８）}ＹｘｘＬ／Ｉ）。

ＩＴＡＭは、免疫細胞におけるシグナル伝達に重要である。したがって、これらは、重要な細胞シグナル伝達分子、例えばＴ細胞受容体複合体のＣＤ３及びζ鎖、Ｂ細胞受容体複合体のＣＤ７９α及びβ鎖、並びに或る特定のＦｃ受容体のテール中に見られる。これらのモチーフ内のチロシン残基は、受容体分子とそのリガンドとの相互作用後にリン酸化されて、細胞のシグナル伝達経路に関与する他のタンパク質のドッキング部位を形成する。

最も一般的に使用されるシグナル伝達ドメイン構成要素は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３－ζエンドドメインのものである。これは、抗原が結合した後、Ｔ細胞に活性化シグナルを伝達する。ＣＤ３－ζは、完全に適格な活性化シグナルは提供しない可能性があり、更なる共刺激シグナル伝達が必要とされる場合がある。２つの主なタイプの共刺激シグナル：Ｉｇファミリーに属するもの（ＣＤ２８、ＩＣＯＳ）及びＴＮＦファミリーに属するもの（ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ等、表１を参照されたい）がある。例えば、キメラＣＤ２８及びＯＸ４０をＣＤ３－ζと共に使用して、増殖／生存シグナルを伝達してもよく、又は３つ全てを共に使用してもよい（図１Ｂに例示される）。

エンドドメインは、配列番号４５～４８として示される配列、又は、変異体配列が細胞に活性化シグナルを伝達する能力を保持するという条件で、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するその変異体を含み得る。

配列番号４５（ＣＤ３－ζエンドドメイン）
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

配列番号４６（４－１ＢＢ及びＣＤ３－ζエンドドメイン）
MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

配列番号４７（ＣＤ２８及びＣＤ３－ζエンドドメイン）
SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

配列番号４８（ＣＤ２８、ＯＸ４０及びＣＤ３－ζエンドドメイン）
SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

トランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチドとしての抗原の断片の認識に関与する、Ｔ細胞表面上に見られる分子である。

ＴＣＲは、２つの異なるタンパク質鎖で構成されるヘテロ二量体である。ヒトにおいて、Ｔ細胞の９５％では、ＴＣＲはα鎖及びβ鎖（それぞれ、ＴＲＡ及びＴＲＢにコードされる）からなる一方、Ｔ細胞の５％では、ＴＣＲはγ鎖及びδ鎖（γ／δ、それぞれ、ＴＲＧ及びＴＲＤにコードされる）からなる。

ＴＣＲが抗原性ペプチド及びＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）と会合すると、Ｔリンパ球はシグナル伝達を通じて活性化される。

慣用的な抗体が向けられるターゲット抗原とは対照的に、ＴＣＲによって認識される抗原は、プロセシングされ、ペプチド／ＭＨＣ複合体として細胞表面に送達される、潜在的な細胞内タンパク質の全てを含み得る。

ベクターを使用して、ＴＲＡ及びＴＲＢ遺伝子又はＴＲＧ及びＴＲＤ遺伝子を細胞内に人工的に導入することによって、異種（すなわち非天然）ＴＣＲ分子を発現するよう細胞を操作することが可能である。例えば、ＴＣＲを操作するための遺伝子を、自己Ｔ細胞内に再導入して、Ｔ細胞養子療法のため、患者に戻し入れてもよい。こうした「異種」ＴＣＲもまた、本明細書において、「トランスジェニックＴＣＲ」と称され得る。

本発明は、本明細書に定義されるようなトランスジェニックＴＣＲ及びＦＬＢＲを共発現する細胞に関する。

ベクター
本発明はまた、本発明に記載のＦＬＢＲをコードする１つ以上の核酸配列を含む、ベクター、又はベクターのキットも提供する。こうしたベクターを使用して、こうしたベクターが本明細書に定義されるようなＣＡＲ／ＴＣＲ及びＦＬＢＲを発現するように、宿主細胞内に核酸配列を導入してもよい。

ベクターは例えば、プラスミド若しくはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター若しくはレンチウイルスベクター、又はトランスポゾンに基づくベクター若しくは合成ｍＲＮＡであり得る。

ベクターは、細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞をトランスフェクション又は形質導入可能であり得る。

細胞
本発明は、本明細書に定義されるようなＣＡＲ／ＴＣＲ及びＦＬＢＲを共発現する細胞を提供する。

細胞は本発明の核酸又はベクターを含み得る。

細胞は、細胞溶解性免疫細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞であり得る。

Ｔ細胞又はＴリンパ球は、細胞仲介性免疫で中心的な役割を果たすリンパ球タイプである。これらは、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって、他のリンパ球、例えばＢ細胞及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）と区別され得る。以下に要約されるように、多様なタイプのＴ細胞がある。

ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の形質細胞及びメモリーＢ細胞への成熟、並びに細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスにおいて、他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、その表面上にＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子によって、ペプチド抗原と共に提示された際に活性化される。これらの細胞は、異なるサイトカインを分泌して、異なるタイプの免疫反応を促す、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、又はＴＦＨを含む、いくつかのサブタイプの１つに分化し得る。

細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、又はＣＴＬ）は、ウイルス感染した細胞及び腫瘍細胞を破壊し、また、移植拒絶にも関与する。ＣＴＬはその表面にＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全ての有核細胞表面上に存在するＭＨＣクラスＩと会合する抗原に結合することによって、そのターゲットを認識する。制御性Ｔ細胞によって分泌されるＩＬ－１０、アデノシン及び他の分子を通じて、ＣＤ８＋細胞はアネルギー状態に不活性化することができ、これが実験自己免疫脳脊髄炎等の自己免疫疾患を防止する。

メモリーＴ細胞は、感染が解消した後、長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞サブセットである。これらは、同族抗原に再曝露されると、迅速に多数のエフェクターＴ細胞に拡大し、こうして過去の感染に対する「記憶」を免疫系に提供する。メモリーＴ細胞は、３つのサブタイプ：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）及び２つのタイプのエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞及びＴＥＭＲＡ細胞）を含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、典型的には、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。

制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、以前、サプレッサーＴ細胞として知られており、免疫寛容の維持に決定的である。その主要な役割は、免疫反応の終了に向かってＴ細胞仲介性免疫を停止すること、及び胸腺において負の選択プロセスを回避した自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。

ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主要なクラスである天然存在Ｔｒｅｇ細胞及び適応Ｔｒｅｇ細胞が記載されてきている。

天然存在Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としてもまた知られる）は、胸腺中で生じ、ＴＳＬＰで活性化されている骨髄（ＣＤ１１ｃ＋）及び形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方と、発生中のＴ細胞との間の相互作用に関連付けられてきている。天然存在Ｔｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と称される細胞内分子の存在によって、他のＴ細胞とは区別され得る。ＦＯＸＰ３遺伝子の突然変異は、制御性Ｔ細胞発生を防止して、致死性自己免疫疾患ＩＰＥＸを引き起こし得る。

適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞又はＴｈ３細胞としても知られる）は、正常免疫反応中に生じ得る。

細胞は、ナチュラルキラー細胞（又はＮＫ細胞）であり得る。ＮＫ細胞は、自然免疫系の一部を形成する。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ独立方式で、ウイルス感染細胞からの自然シグナル（innate signals）に対する迅速な反応を提供する。

ＮＫ細胞（自然リンパ球群に属する）は、大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）と定義され、Ｂリンパ球及びＴリンパ球を生成する共通のリンパ球前駆体から分化する、第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺及び胸腺中で分化し、成熟し、次いで、循環内に進入することが知られる。

本発明の細胞は、上述の細胞タイプのいずれであってもよい。

本発明に記載の細胞は、患者自身の末梢血から（第１パーティ）、又はドナー末梢血からの造血幹細胞移植の設定において（第２パーティ）、又は無関係のドナー由来の末梢血から（第３パーティ）のいずれかで、ｅｘｖｉｖｏで生成され得る。

あるいは、細胞は、誘導性前駆細胞又は胚性前駆細胞から、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞へのｅｘｖｉｖｏ分化から得られ得る。あるいは、溶解機能を保持し、療法剤として作用し得る不死化Ｔ細胞株を使用してもよい。

これら全ての実施形態において、ウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡ又はＲＮＡでのトランスフェクションを含む、多くの手段の１つによって、キメラポリペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを導入することによって、キメラポリペプチド発現細胞が生成される。

本発明の細胞は、被験体由来のｅｘｖｉｖｏ細胞であり得る。細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料に由来し得る。細胞は、本発明の第１の態様によるキメラポリペプチドを提供する分子をコードする核酸で形質導入される前に、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処理によって、活性化及び／又は拡大され得る。

本発明の細胞は、
（ｉ）被験体又は上に列挙する他の供給源からの細胞含有試料の単離と、
（ｉｉ）本明細書に定義されるようなＣＡＲ／ＴＣＲ及びＦＬＢＲをコードする１つ以上の核酸配列での細胞の形質導入又はトランスフェクションと、
によって作製され得る。

細胞は、次いで、精製することができ、例えば、ＣＡＲ／ＴＣＲの抗原結合ドメインの発現又はＦａｓエクトドメインの発現に基づいて選択され得る。

医薬組成物
本発明はまた、本発明の単数又は複数の細胞を含む医薬組成物にも関する。特に、本発明は、本発明による細胞を含有する医薬組成物に関する。

医薬組成物は、医薬的に許容され得るキャリアー、希釈剤又は賦形剤を更に含み得る。医薬組成物は、任意選択で、１つ以上の更なる医薬的に活性であるポリペプチド及び／又は化合物を含み得る。こうした製剤は、例えば、静脈内注入に適した形態であり得る。

治療法
本発明は、本発明の細胞を（例えば上述のような医薬組成物中で）被験体に投与する工程を含む、疾患を治療及び／又は防止する方法を提供する。

適切には、疾患を治療及び／又は防止する本発明の方法は、本発明の細胞を（例えば上述のような医薬組成物中で）被験体に投与することを含み得る。

疾患を治療する方法は、本発明の細胞の療法的使用に関する。これに関して、疾患と関連する少なくとも１つの症状を弱めるか、減少させるか又は改善するため、及び／又は疾患の進行を減速させるか、減少させるか又は遮断するため、存在する疾患又は病態を有する被験体に、細胞を投与し得る。

疾患を防止する方法は、本発明の細胞の予防的使用に関する。これに関して、疾患にまだ罹患していない被験体及び／又は疾患のいかなる症状も示していない被験体に細胞を投与して、疾患の原因を防止するか若しくは損ない、又は疾患と関連する少なくとも１つの症状の発展を減少させるか若しくは防止してもよい。被験体は、疾患の素因を有するか、又は疾患を発展させるリスクがあると考えられてもよい。

方法は、
（ｉ）細胞含有試料を単離する工程と、
（ｉｉ）こうした細胞を、本発明によって提供される核酸配列又はベクターで形質導入又はトランスフェクションする工程と、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の細胞を被験体に投与する工程と、
を含み得る。

本発明は、疾患を治療及び／又は防止する際に使用する本発明の細胞を提供する。

本発明はまた、疾患の治療及び／又は防止のための薬剤の製造における細胞の使用にも関する。

本発明の方法によって治療及び／又は防止される疾患は、癌であり得る。

癌は、例えば膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌（腎細胞）、白血病、肺癌、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、前立腺癌及び甲状腺癌であり得る。

疾患は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、神経芽細胞腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）又はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）であり得る。

本発明の細胞、特にＣＡＲ細胞は、ターゲット細胞、例えば癌細胞を殺すことが可能であり得る。ターゲット細胞は、ＴＡＡの発現、例えば上記表３に提供されるＴＡＡの発現によって認識可能であり得る。癌は、表３に列挙される癌であり得る。

細胞を作製する方法
本発明のＣＡＲ又はトランスジェニックＴＣＲ発現細胞は、ＣＡＲ又はＴＣＲ及びＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを、ウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡ又はＲＮＡでのトランスフェクションを含む多くの手段の１つによって導入することにより、生成され得る。

本発明の細胞は、
（ｉ）被験体又は上に列挙する他の供給源の１つからの細胞含有試料の単離と、
（ｉｉ）上に定義されるような１つ以上の核酸配列又は核酸構築物での、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏでの細胞の形質導入又はトランスフェクションと、
によって作製され得る。

細胞は、次いで、精製することができ、例えば、抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて選択され得る。

本開示は、本明細書に開示される例示的な方法及び材料によって限定されず、本明細書に記載されるものと類似又は同等のあらゆる方法及び材料を、本開示の実施形態の実施又は試験において使用することができる。数値範囲には、範囲を画定する数値が含まれる。別に示されない限り、それぞれ、いかなる核酸配列も左から右に５’から３’配向で記載され、アミノ酸配列は、左から右へアミノからカルボキシ配向で記載される。

或る範囲の値が与えられる場合、文脈において他に明示されない限り、その範囲の上限と下限との間に存在する、下限の単位の１０分の１までの各介在値も具体的に開示されるものと理解すべきである。指定された範囲内の任意の指定された値又は介在値と、その指定された範囲内の任意の他の指定された値又は介在値との間のより小さい範囲がいずれも、本開示に包含される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立して、その範囲内に含まれる場合があり又は除外される場合があり、そのより小さな範囲内にいずれかの境界が含まれる、いずれの境界も含まれない、又は両方の境界が含まれる各範囲もまた、指定された範囲内の任意の具体的に除外された境界に従って、本開示内に含まれる。指定された範囲が境界の一方又は両方を含む場合に、それらの含まれる境界のいずれか又は両方を除外する範囲もまた本開示内に含まれる。

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合に、単数形（singular forms "a", "an", and "the"）は、文脈上特に明記されていない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。

本明細書において使用される「含む（comprising）」、「含む（comprises）」、及び「から構成される（comprised of）」という用語は、「含む（including）」、「含む（includes）」又は「含有する（containing）」、「含有する（contains）」と同義であり、非排他的又はオープンエンド形式であり、追加の列挙されていない成員、要素、又は方法工程を除外するものではない。「含む（comprising）」、「含む（comprises）」、及び「から構成される（comprised of）」という用語には、「のみからなる（consisting of）」という用語も含まれる。

本明細書において論じられる出版物は、本出願の出願日前のそれらの開示についてのみ示される。本明細書おいては、そのような出版物が本明細書に添付の特許請求の範囲に対する従来技術をなすことを認めるものと解釈されるべきものは何もない。

次に、本発明を実施例によって更に説明するが、実施例は、本発明の実施において当業者を支援するのに用いられるという意図があり、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例１－ＦａｓＬに結合する構築物のｉｎｖｉｔｒｏ試験
表４に列挙される構築物を発現する細胞パネルを生成した。全ての細胞は、第２世代抗ＣＤ１９ＣＡＲ（Ｆｍｃ６３）を発現した。２つのバージョンの細胞パネルを生成し、一方では、構築物はＦａｓリガンドをコードする遺伝子を含み、したがって、細胞はＦａｓＬを共発現し（図６～図８中の＋ＦａｓＬ）、一方では、構築物はＦａｓリガンドをコードする遺伝子を含まなかった（図６～図８中の－ＦａｓＬ）。細胞を培養し、ＦａｓＬ誘導性細胞死に抵抗する能力に関して試験した。

より詳細には、新鮮に単離された初代ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体（０．５μｇ／ｍｌ）で２４時間活性化した。次いで、ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ）をＰＢＭＣに更に２４時間添加した。活性化されたＰＢＭＣのうち、３０００００個に、２４ウェルプレート中、関心対象の遺伝子（複数の場合もある）を含有する未精製レトロウイルス上清で形質導入した。

ＰＢＭＣを１０００ｇで４０分間回転させ、その時点で、細胞をインキュベーターに移し、３日間培養した。次いで、細胞をピペッティングすることによって再懸濁し、１００μｌを９６ウェルプレートに移した。生存ＰＢＭＣ数を計数することによって、フローサイトメーター上で、細胞生存を分析した。

Ｆｍｃ６３単独で発現するよう操作されたＰＢＭＣに対して、絶対細胞数を正規化した。

構築物番号１～８の結果を図６に示す。Ｆａｓ－ＤｃＲ２、Ｆａｓ－ＧＩＴＲ、Ｆａｓ－ＣＤ３０又は膜結合型ＤｃＲ３と共にＣＡＲを発現する細胞は、Ｆａｓ－４１ＢＢ、ＦａｓＯＸ４０又はＦａｓΔＤＤとＣＡＲを共発現する細胞よりも、細胞死に抵抗する際、はるかにより優れていることが明らかにわかる。

同様に、図７は、可溶性ＤｃＲ３を発現している同等の細胞よりも、本発明の膜結合型ＤｃＲ３を発現している細胞に関して、細胞生存が増加することを示す（構築物８及び９を比較）。

上記方法論を構築物１～７に関して反復したが、この場合は、構築物はまた、国際公開第２０１３／１５３３９１号に記載される短い自殺遺伝子ＲＱＲ８も発現した。ＲＱＲ８は、形質導入細胞のマーカーとして使用された（ＲＱＲ８陽性細胞）。ＦＬＢＲであるＦａｓ－ＤｃＲ２、Ｆａｓ－ＣＤ３０又はＦａｓ－ＧＩＴＲの１つを発現している細胞は、Ｆａｓ－ΔＤＤ、Ｆａｓ－ＯＸ４０又はＦａｓ－４１ＢＢを発現している細胞よりもより高い形質導入細胞数を有することが見出された。

実施例２－固定Ｆａｓリガンドを用いたＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）のｉｎｖｉｔｒｏ試験
ＦａｓＬを発現するよう形質導入されていない、実施例１に記載される細胞パネルを、固定可溶性Ｆａｓリガンドを使用したＦａｓＬ誘導性細胞死に抵抗する能力に関して試験した。ＰＢＭＣに、上記表４中の構築物２、３、５及び６、すなわちＣＡＲ＋ＦａｓΔＤＤ、Ｆａｓ－ＤｃＲ２、Ｆａｓ－ＧＩＴＲ及びＦａｓ－ＯＸ４０を発現するレトロウイルスベクターで形質導入した。

可溶性Ｆａｓリガンド（２．５μｇ）を９６ウェルプレート上に４℃で一晩固定した。Ｆａｓリガンド固定プレートをＰＢＳで４回洗浄した。５００００の形質導入ＰＢＭＣを、固定Ｆａｓリガンドを含むウェルに添加し、インキュベーター中で５日間培養した。細胞を遠心分離によって回転させ、ＣＤ３及びＣＤ３４に関して染色し、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）絶対計数ビーズ（Thermo Fisher）を使用して、生存ＰＢＭＣの絶対数を決定した。Ｆａｓリガンドの非存在下でＦｍｃ６３のみを形質導入されたＰＢＭＣに対して、絶対細胞数を正規化した。

結果を図９及び図１０に示す。Ｆａｓ－ＯＸ４０又はｄｎＦａｓを発現している細胞に関して見られるよりも、固定ＦａｓＬと共に培養された、Ｆａｓ－ＤｃＲ２及びＦａｓ－ＧＩＴＲを発現している細胞に関して、細胞数の増加が見られた。

実施例３－固定Ｆａｓリガンドを用いたＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）のｉｎｖｉｔｒｏ試験
表５に列挙する構築物を発現する細胞パネルを生成した。全ての細胞は抗ＣＤ１９ＣＡＲ（Ｆｍｃ６３）を発現した。固定可溶性Ｆａｓリガンドを使用して、ＦａｓＬ誘導性細胞死に抵抗する能力に関して細胞を試験した。次いで、抗Ｆｍｃ６３抗イディオタイプ抗体の存在下又は非存在下で細胞を試験した。

実施例１に記載されるような構築物を発現するレトロウイルスベクターでＰＢＭＣに形質導入した。

可溶性Ｆａｓリガンド（２．５μｇ）を、９６ウェルプレート上に、単独で又は１μｇ抗Ｆｍｃ６３Ａｂと組み合わせてのいずれかで、４℃で一晩固定した。別個のウェルに対照としてＰＢＳを添加した。Ｆａｓリガンド／抗Ｆｍｃ６３Ａｂ固定プレートをＰＢＳで４回洗浄した。形質導入ＰＢＭＣ（５００００個）をウェルに添加し、インキュベーター中で５日間培養した。

９６ウェルプレート内に細胞を植え付けた時点（第０日）で、細胞を遠心分離によって回転させ、ＣＤ３及びＣＤ３４に関して染色し（ＲＱＲ８及びしたがって形質導入細胞を検出するため）、フローサイトメトリーによって細胞を分析して、ＲＱＲ８を発現している細胞の割合を決定した。ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）絶対計数ビーズを使用して、ＰＢＭＣの絶対数を決定した。

インキュベーション第５日、細胞を遠心分離によって回転させ、１００μｌの上清をサイトカイン分析のために除去し、細胞をＣＤ３及びＣＤ３４に関して染色し、次いで、フローサイトメトリーによって細胞を分析して、ＲＱＲ８を発現している細胞の割合を決定した。ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）絶対計数ビーズを使用して、生存ＰＢＭＣの絶対数を決定した。インキュベーション第５日の絶対細胞数を、第０日分析に対して比較して、増殖倍相違を測定した。絶対細胞数を、ＰＢＳ処理ウェル上で培養されたＰＢＭＣに対して正規化した。

結果を図１１～図１６に示す。

Ｆａｓ－ＸＥＤＡＲの発現は、ＣＡＲ刺激の非存在下でＰＢＭＣの恒常的な増殖を誘導し、ＦａｓＬ誘導性細胞死を防止可能である（図１１及び図１２）。

Ｆｍｃ６３－ＣＤ３ｚ形質導入細胞は、ＦａｓＬ仲介性細胞死に感受性である。これは、形質導入細胞を、ＦａｓＬ、抗ｆｍｃ６３イディオタイプＡｂと同時インキュベーションした際に特に明らかである（図１３、青い円）。図１３及び図１４に示されるように、Ｆａｓ－ＸＥＤＡＲを発現している細胞は、ドミナントネガティブＦａｓ（すなわち切除デスドメインを含むＦａｓ（ＦａｓΔＤＤ））を発現している細胞よりも、ＦａｓＬによって誘導される死により優れた耐性を示す。Ｆａｓ－ＸＥＤＡＲを発現するベクターで形質導入された細胞集団は、形質導入細胞に関して、経時的に濃縮された（図１３）。

固定Ｆａｓリガンド単独又はＦａｓリガンド／抗Ｆｍｃ６３のいずれかを含むプレート上で、形質導入ＰＢＭＣを５日間インキュベーションした後、細胞を回転させ、１００μｌ上清をサイトカイン分析のために取り出した。製造者の指示に従って、ＥＬＩＳＡＭＡＸ（商標）ＤｅｌｕｘｅＳｅｔヒトＩＦＮ－γ（BioLegend）及びＥＬＩＳＡＭＡＸ（商標）ＤｅｌｕｘｅＳｅｔヒトＩＬ－２（BioLegend）を使用して、上清のサイトカイン濃度を測定した。

Ｆａｓ－ＸＥＤＡＲを発現している細胞は、切除Ｆａｓ（ＦａｓΔＤＤ）を発現している細胞よりも、ＩＬ２及びインターフェロンγの有意により高い放出を示した（図１５及び図１６）。ＩＦＮγの増加は、固定Ｆａｓリガンドインキュベーションの非存在下であっても観察された（図１５）。

実施例４－固定Ｆａｓリガンドを用いたＴＮＦＲＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）の更なるｉｎｖｉｔｒｏスクリーニング
表６に列挙する構築物を発現する細胞パネルを生成した。全ての細胞は抗ＣＤ１９ＣＡＲ（Ｆｍｃ６３－ＣＤ３ｚ）を発現した。固定可溶性Ｆａｓリガンドを使用して、ＦａｓＬ誘導性細胞死に抵抗する能力に関して細胞を試験した。

固定可溶性Ｆａｓリガンドを使用して細胞死を誘導し、実施例２に記載される方法論を反復した。結果を図１７～図２０に示す。

Ｆａｓ－ＴＮＦＲキメラの発現は、ＦａｓＬ誘導性細胞死を防止し、また、ＦａｓＬ会合に際してＰＢＭＣの増殖を誘導することが示された。特に、Ｆａｓ－ＣＤ２７、Ｆａｓ－ＣＤ４０、Ｆａｓ－ＢＣＭＡ及びＦａｓ－Ｆｎ１４を発現している細胞は、最高の平均細胞数を示した（図１７）。図１８は、ＦａｓＬの非存在下での形質導入ＰＢＭＣ培養に対して、固定ＦａｓＬの存在下で培養された形質導入ＰＢＭＣの絶対細胞数を示し、スクリーニングされたＦａｓ－ＴＮＦＲの各々の発現が増殖を誘導したことが確認される。第０日分析と比較した増殖倍相違（図１９）は、Ｆａｓ－ＣＤ２７、Ｆａｓ－ＣＤ４０、Ｆａｓ－ＢＣＭＡ及びＦａｓ－Ｆｎ１４の発現が、Ｆａｓ－４１ＢＢ及びＦａｓΔＤＤの発現よりも、形質導入ＰＢＭＣのより多い増殖を誘導することを示した。

Ｆａｓリガンドと形質導入ＰＢＭＣの５日間のインキュベーション後、細胞を回転させ、１００μｌ上清をサイトカイン分析のために取り出した。製造者の指示に従って、ＥＬＩＳＡＭＡＸ（商標）ＤｅｌｕｘｅＳｅｔヒトＩＦＮ－γ（BioLegend）を使用して、上清のサイトカイン濃度を測定した。図２０に示されるように、Ｆａｓ－ＣＤ４０を発現している細胞は、ＦａｓΔＤＤを発現している細胞よりも、インターフェロンγの有意により高い放出を示した。ＩＦＮγ放出の増加は、固定ＦａｓＬへの曝露の非存在下であっても、Ｆａｓ－ＣＤ４０ＦＬＢＲを発現している細胞に関して観察された。ＦＬＢＲであるＦａｓ－ＣＤ２７、Ｆａｓ－ＣＤ４０、Ｆａｓ－ＢＣＭＡ及びＦａｓ－Ｆｎ１４を発現している細胞もまた、ＦａｓΔＤＤ構築物のものと比較した際、固定Ｆａｓリガンドとインキュベーションされた際に、より高いインターフェロンγ放出（ｐｇ／ｍｌ）を示した。

実施例５－再刺激アッセイにおける、抗ＧＤ２ＣＡＲ及びＴＮＦＲＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）を共発現する細胞の細胞傷害能の試験
ＣＡＲの背景において、Ｆａｓ－ＴＮＦＲキメラの細胞傷害性の利点を評価するため、形質導入ＰＢＭＣを再刺激の連続ラウンドに供した（図２１）。ＧＤ２ターゲティングＣＡＲをそれ自体で、又は２Ａ自己切断ペプチドを通じて切除Ｆａｓ（ＦａｓΔＤＤ）、Ｆａｓ－４１ＢＢ、Ｆａｓ－ＸＥＤＡＲ、Ｆａｓ－ＣＤ４０、Ｆａｓ－ＣＤ２７、Ｆａｓ－ＢＣＭＡ若しくはＦａｓ－Ｆｎ１４のいずれかと共発現されてのいずれかで発現するように、ＰＢＭＣに形質導入した。非形質導入（ＮＴ）及び形質導入ＰＢＭＣを、ＧＤ２を発現しているＳｕｐＴ１ターゲット細胞と、１：１のエフェクター対ターゲット比で共培養し、４日間培養し、その時点で、残りの生存ターゲット細胞の割合を定量化した。３日又は４日ごとに、ＣＡＲ－Ｔ細胞を０．５×１０^５個のＳｕｐＴ１ＧＤ２細胞／ウェルで再刺激した。Ｆａｓ－ＸＥＤＡＲ、Ｆａｓ－ＣＤ４０、Ｆａｓ－ＢＣＭＡ及びＦａｓ－Ｆｎ１４を共発現しているＧＤ２ＣＡＲ－Ｔ細胞（図２１Ｅ、図２１Ｆ、図２１Ｈ及び図２１Ｉ）は、ｉｎｖｉｔｒｏ連続共培養殺細胞アッセイ中、ＧＤ２陽性ＳｕｐＴ１腫瘍細胞との反復遭遇後に、細胞傷害性及び拡大を維持するそれらの能力を測定した際、対照ＧＤ２ＣＡＲ－Ｔ細胞並びにＦａｓΔＤＤ、Ｆａｓ－４１ＢＢ及びＦａｓ－ＣＤ２７を共発現しているＧＤ２ＣＡＲ－Ｔ細胞（図２１Ｂ、図２１Ｃ、図２１Ｄ及び図２１Ｇ）よりも有意に優れた性能を示した。対照ＧＤ２ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＦａｓΔＤＤ、Ｆａｓ－４１ＢＢ又はＦａｓ－ＣＤ２７を共発現しているＧＤ２ＣＡＲ－Ｔ細胞はどちらも、５回目の再刺激までに、ターゲットを一掃することに失敗し始め、拡大してＧＤ２陽性腫瘍細胞を排除する能力を失った。対照的に、Ｆａｓ－ＸＥＤＡＲ、Ｆａｓ－ＣＤ４０、Ｆａｓ－ＢＣＭＡ及びＦａｓ－Ｆｎ１４を共発現しているＧＤ２ＣＡＲ－Ｔ細胞は、はるかにより長く抗原刺激に反応し続け、その結果、ターゲット細胞の一掃に優れていた。

細胞培養及び試薬
実験で使用された全ての細胞株及び初代Ｔ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Biosera）及び１％Ｌ－グルタミン（ＧｌｕｔａＭＡＸ、Gibco）を補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（Lonza）中で培養された。ＳｕｐＴ１細胞は、ＡＴＣＣより購入された。Ｔ細胞は、National Health Service Blood and Transplant（NHSBT、英国コリンデール）より得られたＰＢＭＣより生成された。形質導入Ｔ細胞は、上述のものと同じ培地中で、１００Ｕ／ｍＬのインターロイキン－２（ＩＬ－２）を添加して培養された。ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）絶対計数ビーズ（Thermo Fisher）を使用して、生存ＰＢＭＣの絶対数を決定した。製造者の指示に従って、ＥＬＩＳＡＭＡＸ（商標）ＤｅｌｕｘｅＳｅｔヒトＩＦＮ－γ（BioLegend、４３０１０４）及びＥＬＩＳＡＭＡＸ（商標）ＤｅｌｕｘｅＳｅｔヒトＩＬ－２（BioLegend、４３１８０４）を使用して、サイトカイン濃度を測定した。

形質導入
ｇａｇ－ｐｏｌをコードするプラスミド（ｐＥＱ－Ｐａｍ３－Ｅ３６）、ＲＤ１１４エンベロープをコードするプラスミド（ＲＤＦ３７）、及び所望のレトロウイルストランスファーベクタープラスミドと共に、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（Millipore）を使用して、２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって、レトロウイルスを産生した。以前に記載されるように、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Takara）を使用して形質導入を行った。ＱＢＥＮＤ／１０ｍＡｂを使用して実行される、ＲＱＲ８染色の発現に基づいて、フローサイトメトリーによって、異なる構築物に関する形質導入効率を評価した。ＭＡＣＳＱｕａｎｔＡｎａｌｙｚｅｒ１０（Miltenyi）を使用してフローサイトメトリー分析を行った。ＢＤＦＡＣＳを使用して、フローソーティングを行った。

上記の明細書において挙げられる全ての出版物は、引用することにより本明細書の一部をなす。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本発明の記載された方法及びシステムに様々な変更及び変動を加えられることは、当業者には明らかであろう。本発明を、特定の好ましい実施形態に関連して記載してきたが、特許請求の範囲に記載される本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、分子生物学又は関連分野における当業者に明らかである本発明の実施について記載された様式の様々な変更は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。

Claims

（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、
（ｂ）
（ｉ）Ｆａｓエクトドメイン及びＴＮＦＲエンドドメインであって、該ＴＮＦＲエンドドメインがデコイ受容体２（ＤｃＲ２）、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＸＥＤＡＲ、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＢＣＭＡ若しくはＦｎ１４エンドドメインのシグナル伝達部分を含む、ＴＮＦＲエンドドメイン、又は、
（ｉｉ）膜結合型デコイ受容体３（ＤｃＲ３）、
を含むＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）と、
を含む細胞。
前記ＦＬＢＲがＦａｓエクトドメインとＴＮＦＲエンドドメインとを含み、一般構造：
Ｆａｓエクソ－ＴＭ－ＴＮＦＲエンド
（式中、
Ｆａｓエクソは前記Ｆａｓエクトドメインであり、
ＴＭは膜貫通ドメインであり、
ＴＮＦＲエンドは前記ＴＮＦＲエンドドメインである）を有する、請求項１に記載の細胞。
前記ＦＬＢＲがＦａｓエクトドメイン及びＣＤ４０エンドドメインを含む、請求項１又は２に記載の細胞。
前記ＣＤ４０エンドドメインが配列番号４に示される配列を含む、請求項３に記載の細胞。
ＦＬＢＲが膜結合型ＤｃＲ３を含み、一般構造：
ＤｃＲ３－スペーサー－ＴＭ－エンド
（式中、
ＤｃＲ３はＤｃＲ３の前記ＦａｓＬ結合ドメインを含み、
スペーサーは、膜貫通ドメインにＤｃＲ３を連結するスペーサー配列であり、
ＴＭは膜貫通ドメインであり、
エンドは任意選択の細胞内配列である）を有する、請求項１に記載の細胞。
膜結合型ＤｃＲ３が、Ｃ末端ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）で突然変異を含む、請求項５に記載の細胞。
前記膜結合型ＤｃＲ３が、配列番号９として示される配列に関して、突然変異Ｋ２５６Ａ、Ｒ２５８Ａ及びＲ２５９Ａを含む、請求項６に記載の細胞。
前記スペーサーがＣＤ８ストークを含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の細胞。
前記細胞内配列が極性アンカー及び／又は剛性リンカーを含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の細胞。
前記ＦＬＢＲが、Ｆａｓ－ＤｃＲ２（配列番号３５）、Ｆａｓ－ＧＩＴＲ（配列番号３６）、Ｆａｓ－ＣＤ３０（配列番号３７）、Ｆａｓ－ＸＥＤＡＲ（配列番号３８）、Ｆａｓ－ＣＤ２７（配列番号３９）、Ｆａｓ－ＢＣＭＡ（配列番号４０）、Ｆａｓ－ＣＤ４０（配列番号４１）、Ｆａｓ－Ｆｎ１４（配列番号４２）、Ｆａｓ－ＤｃＲ３－ＣＤ８ＳＴＫ（配列番号４３）及び突然変異体ＤｃＲ３－ＣＤ８ＳＴＫ（配列番号４４）又は配列番号３５～４４のいずれかに対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ変異体より選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞。
Ｆａｓエクトドメイン及びＴＮＦＲエンドドメインを含むＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）であって、前記ＴＮＦＲエンドドメインが、前記デコイ受容体２（ＤｃＲ２）、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＸＥＤＡＲ、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＢＣＭＡ又はＦｎ１４エンドドメインの前記シグナル伝達部分を含む、ＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）。
Ｆａｓエクトドメイン及びＣＤ４０エンドドメインを含む、請求項１１に記載のＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）。
請求項１１又は１２に記載のＦＬＢＲをコードする核酸配列。
（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする第１の核酸配列と、
（ｂ）請求項１～１２のいずれか一項に定義されるようなＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）をコードする第２の核酸配列と、
を含む、核酸構築物。
前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列が、共発現部位によって分離される、請求項１４に記載の核酸構築物。
（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする第１の核酸配列と、
（ｂ）請求項１～１２のいずれか一項に定義されるようなＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）をコードする第２の核酸配列と、
を含む、核酸配列のキット。
請求項１３に記載の核酸配列又は請求項１４～１６のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、
（ｂ）請求項１～１２のいずれか一項に定義されるようなＦａｓＬ結合受容体（ＦＬＢＲ）をコードする核酸配列を含む第２のベクターと、
を含む、ベクターのキット。
請求項１～１０のいずれか一項に記載の細胞を複数含む、医薬組成物。
疾患を治療する及び／又は防止する際に使用する請求項１９に記載の医薬組成物。
疾患を治療する及び／又は防止する方法であって、その必要がある被験体に請求項１９に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
（ｉ）細胞含有試料の単離工程と、
（ｉｉ）請求項１３に記載の核酸配列、請求項１４若しくは１５に記載の核酸構築物、請求項１６に記載の核酸配列のキット、請求項１７に記載のベクター、又は請求項１８に記載のベクターのキットでの前記細胞の形質導入又はトランスフェクション工程と、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の前記細胞の被験体への投与工程と、
を含む、請求項２１に記載の方法。
前記細胞が自己である、請求項２２に記載の方法。
前記細胞が同種である、請求項２１に記載の方法。
疾患の治療及び／又は防止のための薬剤製造における、請求項１９に記載の医薬組成物の使用。
前記疾患が癌である、請求項２０に記載の使用のための医薬組成物、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法、又は請求項２５に記載の使用。
請求項１～１０のいずれか一項に記載の細胞を作製する方法であって、請求項１３に記載の核酸配列、請求項１４若しくは１５に記載の核酸構築物、請求項１６に記載の核酸配列のキット、請求項１７に記載のベクター、又は請求項１８に記載のベクターのキットを、ｅｘｖｉｖｏで前記細胞内に導入する工程を含む、方法。
前記細胞が被験体から単離された試料に由来する、請求項２７に記載の方法。