JP2020512393A

JP2020512393A - アプタマー−薬物コンジュゲート及びその用途

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Publication number: JP2020512393A
Application number: JP2019555545A
Authority: JP
Inventors: リ，ジュン・ファン; イム，ジョン・フン; キム，ジョン・イン
Original assignee: Interoligo Corp
Current assignee: Interoligo Corp
Priority date: 2016-12-26
Filing date: 2017-12-04
Publication date: 2020-04-23
Anticipated expiration: 2037-12-04
Also published as: WO2018124512A2; AU2017389094A1; US20190358202A1; KR102015524B1; CN110167597A; KR20180075133A; US11458120B2; EP3560517A2; WO2018124512A3; JP7067802B2; AU2017389094B2; EP3560517A4

Abstract

本発明は、薬物−リンカー−ＡＳ１４１１の構造を含むがん標的治療剤に関し、薬物は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、シタラビン、ゲムシタビン、メイタンシン、ＤＭ１、ＤＭ４、カリケアミシン及びその誘導体、ドキソルビシン、デュオカルマイシン及びその誘導体、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ＳＮ−３８、α−アマニチン、およびツブリシン類似体（Tubulysin analog）などから選択できる。【選択図】図１１

Description

本発明は、標的がん治療のための［抗−ヌクレオリンＧＲＯアプタマー］−毒素コンジュゲート（［Anti-Nucleolin GRO Aptamer］-Toxin Conjugate）及びその合成に関する。特に、本発明は、それらのｉｎｖｉｔｒｏ／ｖｉｖｏ効能を検証したものであり、がんの治療に優れた効果を示す［抗−ヌクレオリンアプタマー］−毒素コンジュゲート（［Anti-Nucleolin Aptamer］- Toxin Conjugate）の用途に関する。

今まで抗がん剤をはじめとする数多くの治療剤が開発されて臨床を経て薬として開発されたが、標的抗がん剤のように、治療効果のある物質を目的の発症部位まで選択的かつ効果的に伝達することに関する分野は、更なる研究を必要とする新しい分野である。抗がん剤（anticancer drugs）は、臨床治療の効果を得るために、一般的に最大耐用量（maximum tolerated dose）の近くで使用されるが、急速に増殖する細胞を殺すだけで、正常細胞と腫瘍細胞又は腫瘍組織とを区別することができない。この化学療法（chemotherapy）は、非−腫瘍特異的（non-tumor specific）全身毒性（systemic toxicity）と細胞毒性のため、抗がん剤の治療指数（therapeutic index）と治療濃度域（therapeutic window）が非常に低い欠点を持っている。また、長期治療の際、抗がん剤に対する耐性ができてしまうことがあるため、細胞毒性薬物をがん細胞のみに正確に伝達して死滅させる、向上した新しい治療法が切実に求められている。

過去３０年間、薬物をターゲットに効率よく送ることで薬効を高めようとする試みが数多く行われたが、従来の抗体（naked antibody）よりも効能を向上させるために、抗体と薬物を結合した抗体−薬物コンジュゲート（Antibody-Drug Conjugate）（ＡＤＣ）の臨床への試みが成功可能性が高いと考えられる。ＡＤＣ（抗体−薬物コンジュゲート）は、最近、ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓ社とＩｍｕｎｏｇ社で臨床第３相を成功的に終えて、ＦＤＡの許可を受けて市場に出市し、新しい治療剤の章を開いたと言える。しかし、抗体は、巨大タンパク質で構成されているため、薬物（drug）をつける位置、ついた薬物（drug）の数（１〜６個、平均３．５個）及びつく位置など、ＱＣにおいて多くの問題点を有する。抗体と比較できる標的指向性を有するアプタマーとその治療剤との結合体（アプタマー−薬物コンジュゲート（Aptamer-Drug Conjugate）の開発は、化学的な反応が容易で、治療剤の数及びつける位置を自由に調節可能である利点がある。このため、抗体に対するアプタマーの優位性を組み合わせることで、臨床成功の可能性を高めることができると考えられる。

アプタマー−薬物コンジュゲート（Aptamer−Drug Conjugates：ＡｐＤＣｓ）は、強い毒性のため実際の臨床での使用が難しかった薬物を、標的指向的なアプタマーを薬物（Drug）につけてがん細胞のみに正確に伝達させることにより、副作用なしで治療効果を最大化できると期待される。

下記のように今まで開発されたＡＤＣ技術（抗体−薬物コンジュゲート技術（Antibody-Drug Conjugate Technology））を分析したところ、抗体を薬物に結合させることの技術的な難しさと欠点を知ることができた。アプタマー（aptamer）により、より容易にかつより効率よくアプタマーが結合した治療剤の開発が可能であったので、標的抗がん剤として治療に適用しようとする。

ＡＤＣ技術（Antibody-Drug Conjugate Technology）
ＡＤＣは、抗体の利点（特異性（specificity）、循環中での非毒性（non-toxicity in circulation）、および薬物動態（pharmacokinetics））を最大に活用して、薬物が具体的にがん細胞のみをターゲティングすることに焦点を合わせたテクノロジーである。ＡＤＣは、単クローン抗体薬物、そして抗体と薬物を連結するリンカー（linker）を含む３つの構成要素で構成されており、ＡＤＣテクノロジーは、がん細胞の表面に発現された特定の抗原に特異的に結合する抗体を使用して薬物を腫瘍細胞に伝達する方法である。

ほとんどのＡＤＣは、ターゲットに特異的に結合する抗体がターゲットに結合（binding）することにより細胞内に入る。細胞内へ移動したＡＤＣは、ターゲットから離れて細胞内の他の小胞（vesicles）と融合し、エンドソーム（endosome）−リソソーム（lysosome）の経路で進行する。次いで、エンドソーム（endosomes）の酸性環境にあるプロテアーゼ（proteases）がリンカーを切断し、活性化（active）された「遊離（free）」薬物は、リソソーム膜（lysosomal membrane）を通過して細胞質（cytoplasm）に移動した後、薬物の分子（molecular）ターゲットに結合することにより、腫瘍細胞の細胞周期が停止され、アポトーシス（apoptosis）によりがん細胞が死滅することになる。この中で、一定量の薬物は、細胞で受動的に拡散するか（passive diffusion）、能動的に輸送されるか（active transport）、または死んだ細胞を通じて細胞外に流出される。このとき、流出した薬物が細胞膜透過性を有していれば、周辺の細胞にも入り込み、いわゆるバイスタンダー細胞死（by-stander cell killing）という現象が起き、患者に副作用を発生させることがある。

ＡＤＣ開発の難しさ（ＱＣ）
ＡＤＣ（Antibody−Drug Conjugate）の開発は、１９８０年から始まったが、実際の臨床に適用するにあたり、臨床のための安定したリンカーの開発のほか、ＡＤＣ合成プロセスにおけるＱＣが簡単ではない問題を有している。つまり、抗体（antibody）（huJ591）にＤＭ１（薬物（drug））を結合するとき、１つの抗体（antibody）（huj591）にＤＭ１薬物（drug）が１〜７個までついた混合物が得られると、その分離／精製ができず、平均３．５個のＤＭ１薬物（drug）が結合したＡＤＣを臨床で使用する。

また、抗体（antibody）（Ｔｍａｂ）は、薬物（drug）（ＤＭ１）を付けることができるリジン（lysine）が８８個もある。８８個のリジン（lysine）の中で、平均３．５個の薬物（drug）（ＤＭ１）がどの位置のリジン（lysine）につくのかコンジュゲーション部位（conjugation site）を究明する方法は容易ではない。つまり、コンジュゲーション部位（conjugation site）を調べるために、トリプシン消化（trypsin digestion）およびＡｓｐ−Ｎプロテアーゼ消化（Asp-N protease digestion）を行い、それらのフラグメント（fragment）をＥＳＩ−ＴＯＦＭＳで分析した結果を比較することにより、薬物（Drug）（ＤＭ１）がコンジュゲーション（conjugation）される位置をある程度決定することができる。

また、ＡＤＣの製造において、毎生産バッチ別抗体につく薬物（Drug）の平均組成が変わるため、ＱＣが困難である。つまり、抗体（juJ591）にＤＯＴＡをつけた後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳｓｐｅｃｔｒａにおいて、バッチ（batch）Ａでは５．０個、バッチ（batch）Ｂでは８．９個のＤＯＴＡがつくことを確認することができる。他のバッチ（batch）では、６．０及び６．２個のＤＯＴＡがつく。以上のように、ＡＤＣ（Antibody−Drug Conjugate）の合成は、抗体（antibody）自体の特性上、薬物（Drug）を結合する過程での正確なＱＣの難しさなどの改善すべき多くの問題を内包しており、ＡＤＣプロセスでそれを解決するために研究を行っている。

ＡＤＣ（Antibody−Drug Conjugate）の限界：
抗体（antibody）がターゲット指向的に結合した薬物（drug）をガン細胞まで到達させて薬物（drug）による治療効果を示すが、抗体（antibody）に結合してがん細胞に到達する薬物（drug）はわずか２％以下に過ぎない、非常に低い効率を示すことが問題である。これを解決するために、ドキソルビシン（Doxorubicine）のような臨床許可を受けた安全な抗がん剤は、安定な代わりに薬効が低いため、１００〜１，０００倍以上の高い毒性を有する高毒物（highly toxic agents）を抗体に結合する薬物（drug）として選択する。

アプタマー（aptamer）
アプタマー（aptamer）は、抗体（antibody）と類似した性質で、がんなどの病気を引き起こすバイオマーク（biomark）に非常に選択的に結合することにより、診断や標的治療が可能なＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド（oligonucleotide）である。つまり、アプタマー（aptamer）は、標的物質によってユニークな３次元構造（３−dimensional structures）を有し、この３次元構造がタンパク質タグ（がん誘発タンパク質、バイオマーク）に非常に選択的に強く結合して、標的治療、カスタム診断またはミサイル療法を可能にする新しいＢｉｏ−ｃａｐｔｕｒｉｎｇ物質である。

アプタマー（aptamer）と抗体（antibody）との比較
標的治療剤として最も成功したものは抗体であり、現在３０種の抗体標的治療剤がＦＤＡの承認を受けて市販されており、３００種余りが臨床段階を進行中である。しかし、その開発コストが非常に高く、飽和状態であるため、先進製薬会社は既に新しい治療剤の開発に転換している。

抗体（antibody）は、タンパク質（protein）からなっていて、生体内で生成しなければならないなどの困難がまだある。これに対し、アプタマーは、試験管で抗体よりも早くリード化合物（lead compound）を発掘し、合成および変形が容易であるため、「化学抗体（chemical antibody）」と呼ばれる新しいｂｉｏ−ｃａｐｔｕｒｉｎｇｒｅａｇｅｎｔとして期待を集めている。

アプタマー治療剤の開発傾向
２００６年、Ｅｙｅｔｅｃｈ社で最初のアプタマー治療剤であるＭａｃｕｇｅｎを、ＦＤＡの許可を受けてＰｆｉｚｅｒにライセンスして市販を開始した。Ｍａｃｕｇｅｎは、老眼による失明の原因となる黄斑変性（ＡＭＤ、Age−related Macular Degeneration）の治療剤であり、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）による異常な血管の成長を、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）を抑制することで治療効果を示す。その後、アプタマーの治療剤としての可能性が高まり、ＭｅｒｃｋＳｅｒｏｎｏ、Ｔａｋｅｄａ、Ｐｆｉｚｅｒ、Ｅｌａｎ、ＥｌｉＬｉｌｌｙ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、Ｒｉｂｏｍｉｃなどがアプタマーの新薬開発に挑み、現在、約１０種のアプタマーが臨床中である。

アプタマーは、「化学的抗体（chemically antibody）」と呼ばれるほど抗体に比べて高いターゲット結合力および選択性を有し、生物学的な方法で生産する抗体に比べて化学合成的な方法で生産するため、薬物（drug）をつけることがより効率的であり、ＱＣが非常に簡単である利点を有する。抗体の低いターゲット到達率をアプタマーにより解決することができれば、従来のＡＤＣ（Antibody-Drug Conjugate）の低い効率性を克服できると考えられる。

アプタマー−薬物コンジュゲート（Aptamer-Drug Conjugate）もまた、新たな治療剤としての可能性が期待されるが、治療剤として開発するための研究はまだ初期段階にある。最近、フロリダ大学のＷｅｉｈｏｎｇＴａｎｇｒｏｕｐでアプタマー（aptamer）（Sgc8c）にドキソルビシン（Doxorubicin）（Dox）抗がん剤を結合したアプタマー−薬物コンジュゲート（Aptamer-Drug Conjugate）（Ｓｇｃ８ｃ−Ｄｏｘコンジュゲート）を作成してＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎと抗がん効果を比較したが、ほとんど差がなかった。Ｓｇｃ８ｃ−Ｄｏｘコンジュゲートを合成するにおいて、ｎａｋｅｄａｐｔａｍｅｒであるＳｇｃ８ｃとの分離／精製が難しくて高純度のＳｇｃ８ｃ−Ｄｏｘコンジュゲートが得られず、Ｓｇｃ８ｃ−Ｄｏｘコンジュゲート及びドキソルビシンのいずれも類似した細胞毒性効果（２０％）を示した。

ＧＲＯアプタマー
ＧＲＯ（Guanine−Rich Oligonucleotide）アプタマー（Aptamer）は、１９９年Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ大学のＰａｕｌａＪ. Ｂａｔｅｓ教授が最初に合成して、がん患者に多く発現されるヌクレオリンタンパク質に特異的に結合するメカニズムを明らかにすることにより、抗がん剤治療剤の開発可能性を提示した。現在、ＧＲＯアプタマーの一つとして、Ａｎｔｉｓｏｍａ社（英）でＡＳ１４１１というコードの腎臓および非小細胞がん（ＡＭＬ）治療剤を開発中であり、非小細胞がん（ＡＭＬ）に対しては最近、臨床第２相を終えた。

一般的に、アプタマーは、生体内で非常に不安定であるため、ヌクレアーゼ耐性（nuclease residence）を高めたり、生体内での循環時間（circulation time）を高めるために、アプタマーの３’位置にｉｄＴ（invert dT）を５’位置にＰＥＧｙｌａｔｉｏｎしたアプタマー製剤（PEG−aptamer−idT）を臨床で使用する。

ＧＲＯアプタマーは、Ｇ−ｑｕａｒｄｒｕｐｌｅｘというユニークな構造をなして非常に安定しており、がん細胞に多く発現されるヌクレオリンに特異的に結合する。つまり、ＧＲＯアプタマーは、核（nucleus）、細胞質（cytoplasma）、および、膜（membrane）にあるヌクレオリンの分子間相互作用（molecular interactions）と機能（function）を妨げることでヌクレオリンの発現を抑制して、抗増殖効果（antiproliferative effect）により腫瘍抑制タンパク質であるｐ５３の発現を促進させることにより、がん細胞の壊死を誘発する。

ＡＳ１４１１は、現在、（英）Ａｎｔｉｓｏｍａ社で非小細胞がんと腎臓がんに対する臨床第２相を終え、臨床第３相の開始を目前に控えているＧＲＯアプタマー（aptamer）であり、ほぼすべての癌で発現されるヌクレオリンに特異的に結合して、様々な癌に対する抗がん効果を持っている非常に安定したアプタマーである。

従来の研究の問題点および展望：現在、Ａｎｔｉｓｏｍａ（英）で抗−ヌクレオリンアプタマー（aptamer）薬物として開発中であるＡＳ１４１１は、ggtggtggtggttgtggtggtggtg塩基配列を有するＧＲＯＤＮＡアプタマー（aptamer）である。現在、腎臓および非小細胞肺がんの治療剤として臨床第２相を成功的に終えたが、薬効検証での不確実性によりＡｎｔｉｓｏｍａ（英）が非小細胞がんに対して臨床第３相を進行せず、ＡｄｖａｎｃｅｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ．に移転して、ＡＣＴ−ＧＲＯ−７７７（renamed AS1411）として臨床第３相を準備中である。

現在開発されて臨床に使用しているＧＲＯアプタマー（aptamer）をはじめとするオリゴ薬物は、生体内で血漿に大量存在するヌクレアーゼ（nuclease）分解酵素により非常に急速に分解される。特に注射による治療剤の場合は、化学的に安定な処理が行われない場合に、より急速に破壊されることが知られている。この分解速度を調節するために、オリゴヌクレオチドを化学的に変化させるか、または適切な運搬体と結合した複合体を形成することにより、破壊速度を減少させることができる。ヌクレアーゼ（nuclease）に抵抗するためのリボース（ribose）２’−ＯＨを２’Ｆや２’ＯＭｅ基で置換するか、またはｐｈｏｓｐｈｏｂａｃｋｂｏｎｅをＰＯからＰＳに変化させるなどの様々な化学的変更は、アンチセンス（antisense）やｓｉＲＮＡなどの応用に成功的に使用されてきた。２００４年にＦＤＡの許可を受けて市販されている最初のアプタマー治療剤であるＭａｃｕｇｅｎもまた、アプタマー発掘後に最適化を行った。

ＧＲＯアプタマー（aptamer）もまた、ヌクレオリン標的化（targeting）の特異性（specificity）が治療効果を高めるのに非常に重要なものであり、ヌクレオリンタンパク質ではない他のタンパク質に結合して薬効を減少させる「Ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果」を最小限に抑える必要がある。最近、Ａｎｔｉｓｏｍａ（英）が、最初のＧＲＯアプタマー（aptamer）治療剤であるＡＳ１４１１の非小細胞がん（ＡＭＬ）に対する臨床第２相を終えたにもかかわらず、臨床第３相に進むことができなかったのは、副作用や毒性の原因よりは、投与量が多く、最適の抗がん効果を示さない欠点のためであると考えられる。

そこで、本発明者らは、ＡＳ１４１１にＤｒｕｇを成功的にコンジュゲーション（conjugation）してＡＳ１４１１−薬物コンジュゲートを合成し、ＡＳ１４１１のがん細胞に過剰発現されたヌクレオリンに対するターゲティング能力と、がん細胞のみに伝達されて付いている薬物を単独で使用する時よりも、ＡＳ１４１１−薬物（Drug）コンジュゲートがｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏでのがん標的治療にさらに効果的であることを確認した。

本発明のがん標的治療剤は、次のような薬物（Ｒ）−リンカー（Ｌ）−ＡＳ１４１１（Drug（Ｒ）−Linker（Ｌ）−ＡＳ１４１１）の構造を有する。

薬物が連結される位置は、１２と１３の位置、若しくは１２や１３の位置が特に好ましい。

ここで使用される薬物であるＲは、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、シタラビン、ゲムシタビン、メイタンシン、ＤＭ１、ＤＭ４、カリケアミシン及びその誘導体、ドキソルビシン、デュオカルマイシン及びその誘導体、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ＳＮ−３８、α−アマニチン、ツブリシン類似体（Tubulysin analog）などが好ましい。

ＭＭＡＥ

ＭＭＡＦ

ＭＭＡＤ

アウリスタチン（Auristatin）Ｅ

アウリスタチン（Auristatin）Ｆ

ＤＭ１

ＤＭ４

ネモルビシン（Nemorubicin）

ＰＮＵ−１５９６８２

ツブリシンＭ

カリケアミシン

アシル化されたカリケアミシン

タルトブリン

前記式中、Ｌは、Ｘ−Ｙで構成され［Ｒ−Ｙ−Ｘ−ＡＳ１４１１］、
Ｙは、マレイミドカプロイル−バリン‐シトルリン−ｐ−アミノベンゾイルオキシカルボニル（ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ）、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、チオエーテル、バリン‐シトルリン、Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＭＣＣ）、マレイミドカプロイル、メルカプトアセトアミドカプロイル、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、ＳＭＣＣ、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＤＢ）、ホスホジエステル結合、およびヌクレオチドからなる群より選択され、
Ｘは、５’−チオール−改質剤Ｃ６、チオール−改質剤Ｃ６Ｓ−Ｓ、ジチオールセリノール、ＰＣアミノ−改質剤、５’−アミノ−改質剤Ｃ３、５’−アミノ−改質剤Ｃ６、５’−アミノ−改質剤Ｃ１２、５’−アミノ−改質剤ＴＥＧ、アミノ−改質剤Ｃ２ｄＴ、アミノ−改質剤Ｃ６ｄＴ、Ｓ−Ｂｚ−チオール−改質剤Ｃ６−ｄＴ、ホスホジエステル結合、およびヌクレオチドからなる群より選択される。

本発明のＡＳ１４１１−薬物コンジュゲートは、薬物のみを単独で使用する時よりもｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおけるがん標的治療にさらに効果的である。

ＨＳ−Ｃ６−Ｔ_３−ＡＳ１４１１とＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１のゲルランデータ（gel run data）およびＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１のＥＳＩ−ＭＳ。ＨＳ−Ｃ６−Ｔ_３−ＣＲＯとＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＣＲＯのゲルランデータ（gel run data）およびＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＣＲＯのＥＳＩ−ＭＳ。１２，１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１のＥＳＩ−ＭＳ。１２又は１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−ＡＳ１４１１のＥＳＩ−ＭＳ。ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１とＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＣＲＯのＡ５４９細胞株に対するＭＴＴアッセイの結果。シタラビン−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１とシタラビン−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＣＲＯのＭｖ４−１１細胞株に対するＭＴＴアッセイの結果。Ａ５４９肺がん細胞株注入マウスに対して治療前に施行したＦＤＧＰＥＴ画像（左太もも部分にＦＤＧ摂取を有する腫瘍が観察）。Ａ５４９肺がん細胞株注入マウスにＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１治療３０日後に得られたＦＤＧＰＥＴ画像（腫瘍のＦＤＧ摂取が減少したことを確認）。Ａ５４９肺がん細胞株注入マウスに対して治療前に施行したＦＤＧＰＥＴ画像（左太もも部分にＦＤＧ摂取を有する腫瘍が観察）。Ａ５４９肺がん細胞株注入マウスに対してＭＭＡＥ治療３０日後に得られたＦＤＧＰＥＴ画像（腫瘍のＦＤＧ摂取が増加したことを確認）。Ａ５４９腫瘍モデルにおけるＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１とＭＭＡＥ治療後に測定した腫瘍の大きさの比較。Ａ５４９腫瘍モデルにおけるＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１とＭＭＡＥ治療３０日後に摘出した腫瘍の大きさの比較。Ｍｖ４−１１ＡＭＬ細胞株注入マウスに対して治療前に施行したＦＤＧＰＥＴ画像（左太もも部分にＦＤＧ摂取を有する腫瘍が観察）。Ｍｖ４−１１ＡＭＬ細胞株注入マウスに対してシタラビン−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１治療３０日後に得られたＦＤＧＰＥＴ画像（腫瘍のＦＤＧ摂取が減少したことを確認）。Ｍｖ４−１１ＡＭＬ細胞株注入マウスに対して治療前に施行したＦＤＧＰＥＴ画像（左太もも部分にＦＤＧ摂取を有する腫瘍が観察）。Ｍｖ４−１１ＡＭＬ細胞株注入マウスに対してＭＭＡＥ治療３０日後に得られたＦＤＧＰＥＴ画像（腫瘍のＦＤＧ摂取が増加したことを確認）。濃度別ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１、１２又は１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−ＡＳ１４１１、および１２，１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１のＡ５４９細胞生存能力（cell viability）。ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１、１２又は１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−ＡＳ１４１１、および１２，１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１のＡ５４９細胞株に対するＭＴＴアッセイの結果。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

［ＧＲＯアプタマー］−薬物（［ＧＲＯ Aptamer］−Drug）コンジュゲートの合成
実施例１
ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１［ＡＳ１４１１−ＭＭＡＥコンジュゲート］の合成
マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンゾイルオキシカルボニルモノメチルアウリスタチンＥ［ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ］にＨＳ−Ｃ６−tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg［ＨＳ−Ｃ６−Ｔ_３−ＡＳ１４１］を反応して、モノメチルアウリスタチンＥ−ｐ−アミノベンゾイルオキシカルボニル−シトルリン−バリン−Ｍａｌ−Ｓ−Ｃ６−tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg［ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１］を合成した。つまり、ＲＳＳ−Ｃ６−tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg［ＲＳＳ−Ｃ６−Ｔ_３−ＡＳ１４１］）をＤＴＴの存在下で約３時間還元反応した後、残っているＤＴＴを遠心分離器で除去し、ＳＢ１７緩衝液に交換して、ＨＳ−Ｃ６−tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg［ＨＳ−Ｃ６−Ｔ_３−ＡＳ１４１］を得た。少量のＤＭＳＯに溶かしたＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを入れて一晩振とうさせた。逆相ＨＰＬＣ（Waters−Xbridge OST C18 10×50mm、65、TEAE/ CAN 緩衝液（buffer））により分離／精製した。

ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとＨＳ−Ｃ６−Ｔ_３−ＡＳ１４１１の反応によるＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１の合成

ＧｅｌｒｕｎでＨＳ−Ｃ６−Ｔ_３−ＡＳ１４１１からＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１の合成を確認し、ＥＳＩ−ＭＳによりＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１の分子量を確認した（図１）。Ｃ_３６４Ｈ_４７９Ｎ_１２０Ｏ_２０２Ｐ_２９Ｓ［Ｃａｌ．ＭＷ＝１０６９７．６９、Ｏｂｓ．ＭＷ＝１０６９７．０］

実施例２
ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＣＲＯの合成
マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンゾイルオキシカルボニルモノメチルアウリスタチンＥ［ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ］にＨＳ−Ｃ６−tttcctcctcctccttctcctcctcctcc［ＨＳ−Ｃ６−Ｔ_３−ＣＲＯ］を反応して、モノメチルアウリスタチンＥ−ｐ−アミノベンゾイルオキシカルボニル−シトルリン−バリン−Ｍａｌ−Ｓ−Ｃ６−tttcctcctcctccttctcctcctcctcc［ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＣＲＯ］を合成した。つまり、ＲＳＳ−Ｃ６−tttcctcctcctccttctcctcctcctcc［ＲＳＳ−Ｃ６−Ｔ_３−ＣＲＯ）をＤＴＴの存在下で約３時間還元反応した後、残っているＤＴＴを遠心分離器で除去し、ＳＢ１７緩衝液に交換しＨＳ−Ｃ６−tttcctcctcctccttctcctcctcctcc［ＨＳ−Ｃ６−Ｔ_３−ＣＲＯ］を得た。少量のＤＭＳＯに溶かしたＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを入れて一晩振とうさせた。逆相ＨＰＬＣ（Waters−Xbridge OST C18 10×50mm、65、TEAE/CAN 緩衝液（buffer））により分離／精製した。

ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとＨＳ−Ｃ６−Ｔ_３−ＣＲＯの反応によるＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＣＲＯの合成

ＧｅｌｒｕｎでＨＳ−Ｃ６−Ｔ_３−ＣＲＯからＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＣＲＯの合成を確認し、ＥＳＩ−ＭＳによりＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＣＲＯ分子量を確認した（図２）。Ｃ_３４７Ｈ_４７９Ｎ_８６Ｏ_２０２Ｐ_２９Ｓ［Ｃａｌ．ＭＷ＝１００１８．０３、Ｏｂｓ．ＭＷ＝１００１７．２８］

実施例３
１２，１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１、および１２又は１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−ＡＳ１４１１の合成
マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンゾイルオキシカルボニルモノメチルアウリスタチンＥ［ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ］に、ggtggtggtggu［５−Ｎ−（６−（３−チオプロパノイル）−アミノヘキシル）−３−アクリルアミド］ｕ［５−Ｎ−（６−（３−チオプロパノイル）−アミノヘキシル）−３−アクリルアミド］gtggtggtggtgg［１２，１３−（ＨＳ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１］を反応し、ggtggtggtggu［５−Ｎ−（６−（３−モノメチルアウリスタチン−ｐ−アミノベンゾイルオキシカルボニル−シトルリン−バリン−Ｍａｌ−チオプロパノイル）−アミノヘキシル）−３−アクリルアミド］ｕ［５−Ｎ−（６−（３−モノメチルアウリスタチン−ｐ−アミノベンゾイルオキシカルボニル−シトルリン−バリン−Ｍａｌ−チオプロパノイル）−アミノヘキシル）−３−アクリルアミド］gtggtggtggtgg［１２，１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１］およびggtggtggtggu ［５−Ｎ−（６−（３−モノメチルアウリスタチン−ｐ−アミノベンゾイルオキシカルカルボニル−シトルリン−バリン−Ｍａｌ−チオプロパノイル）−アミノヘキシル）−３−アクリルアミド］ugtggtggtggtgg］［１２又は１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−ＡＳ１４１１］を合成した。つまり、ggtggtggtggu［５−Ｎ−（６−（３−ｂｅｎｚｏｙｌチオプロパノイル）−アミノヘキシル）−３−アクリルアミド］ｕ［５−Ｎ−（６−（３−ｂｅｎｚｏｙｌチオプロパノイル）−アミノヘキシル）−３−アクリルアミド］gtggtggtggtgg［１２，１３−（Ｂｚ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１］をＤＴＴの存在下で約３時間還元反応した後、残っているＤＴＴを遠心分離器で除去し、ＳＢ１７緩衝液に交換してggtggtggtggu［５−Ｎ−（６−（３−チオプロパノイル）−アミノヘキシル）−３−アクリルアミド］ｕ［５−Ｎ−（６−（３−チオプロパノイル）−アミノヘキシル）−３−アクリルアミド］gtggtggtggtgg［１２，１３−（ＨＳ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１］を得た。少量のＤＭＳＯに溶かしたＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを入れて一晩振とうさせた。逆相ＨＰＬＣ（Waters−Xbridge OST C18 10×50mm、65、TEAE/CAN 緩衝液（buffer））により精製し、１２，１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１、および１２又は１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−ＡＳ１４１１を得た。

ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと１２，１３−（ＨＳ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１の反応による１２，１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１、および１２又は１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−ＡＳ１４１１の合成

ＥＳＩ−ＭＳにより１２，１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１、および１２又はｒ１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−ＡＳ１４１１の分子量を確認した（図３及び図４）。１２，１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１、Ｃ_４１８Ｈ_５６８Ｎ_１２９Ｏ_１９７Ｐ_２５Ｓ_２［Ｃａｌ．ＭＷ＝１１３９０．２１、Ｏｂｓ．ＭＷ＝１１３９０．０］、１２又は１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−ＡＳ１４１１、Ｃ_３５０Ｈ_４６３Ｎ_１１８Ｏ_１８２Ｐ_２５Ｓ_２［Ｃａｌ．ＭＷ＝１００７３．５８、Ｏｂｓ．ＭＷ＝１００７３．０］

実施例４
シタラビン−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１コンジュゲートの合成
マレイミドカプロイル−（Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ）−シタラビン［ＭＣ−ＧＦＬＧ−シタラビン］に、ＨＳ−Ｃ６−tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg［ＨＳ−Ｃ６−Ｔ３−ＡＳ１４１１］を反応し、シタラビン−（Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）−Ｍａｌ−Ｓ−Ｃ６−tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg［シタラビン−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１］を合成した。つまり、ＲＳＳ−Ｃ６−tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg［ＲＳＳ−Ｃ６−Ｔ_３−ＡＳ１４１］）をＤＴＴの存在下で約３時間還元反応した後、残っているＤＴＴを遠心分離器で除去し、ＳＢ１７緩衝液に交換した。少量のＤＭＳＯに溶かしたＭａｌ−ＧＰＬＧ−シタラビンを入れて一晩振とうさせた。逆相ＨＰＬＣ（Waters−Xbridge OST C18 10×50mm、65、TEAE/CAN 緩衝液）により精製してシタラビン−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１を得た。ＥＳＩ−ＭＳによりシタラビン−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１の分子量を確認した。Ｃ_３３４Ｈ_４２４Ｎ_１１７Ｏ_１９９Ｐ_２９Ｓ［Ｃａｌ．ＭＷ＝１０１９１．９１、Ｏｂｓ．ＭＷ＝１０１９０．８８］

Ｃ−ＧＦＬＧ−シタラビンとＨＳ−Ｃ６−Ｔ_３−ＡＳ１４１１の反応によるシタラビン−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１の合成

実施例５
１２，１３−（シタラビン−ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１コンジュゲート、および１２又は１３−（シタラビン−ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−ＡＳ１４１１コンジュゲートの合成
マレイミドカプロイル−（Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ）−シタラビン［ＭＣ−ＧＦＬＧ−シタラビン］に、ggtggtggtggu［５−Ｎ−（６−（３−チオプロパノイル）−アミノヘキシル）−３−アクリルアミド］ｕ［５−Ｎ−（６−（３−チオプロパノイル）−アミノヘキシル）−３−アクリルアミド］gtggtggtggtgg［１２，１３−（ＨＳ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１］を反応し、ggtggtggtggu［シタラビン−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｍａｌ−チオプロパノイル）−アミノヘキシル）−３−アクリルアミド］ｕ［シタラビン−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｍａｌ−チオプロパノイル）−アミノヘキシル）−３−アクリルアミド］gtggtggtggtgg［１２，１３−（シタラビン−ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１］およびggtggtggtggu［シタラビン−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｍａｌ−チオプロパノイル）−アミノヘキシル）−３−アクリルアミド］ugtggtggtggtgg］［１２又は１３−（シタラビン−ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−ＡＳ１４１１］を合成した。つまり、ggtggtggtggu［５−Ｎ−（６−（３−ｂｅｎｚｏｙｌチオプロパノイル）−アミノヘキシル）−３−アクリルアミド］ｕ［５−Ｎ−（６−（３−ｂｅｎｚｏｙｌチオプロパノイル）−アミノヘキシル）−３−アクリルアミド］gtggtggtggtgg［１２，１３−（Ｂｚ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１］をＤＴＴの存在下で約３時間還元反応した後、残っているＤＴＴを遠心分離器で除去し、ＳＢ１７緩衝液に交換して、ggtggtggtggu［５−Ｎ−（６−（３−チオプロパノイル）−アミノヘキシル）−３−アクリルアミド］ｕ［５−Ｎ−（６−（３−チオプロパノイル）−アミノヘキシル）−３−アクリルアミド］gtggtggtggtgg［１２，１３−（ＨＳ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１］を得た。少量のＤＭＳＯに溶かしたＭＣ−ＧＦＬＧ−シタラビンを入れて一晩振とうさせた。逆相ＨＰＬＣ（Waters−Xbridge OST C18 10×50mm、65、TEAE/CAN 緩衝液）により精製して、１２，１３−（シタラビン−ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１、および１２又は１３−（シタラビン−ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−ＡＳ１４１１を得た。ＥＳＩ−ＭＳにより、それぞれの分子量を確認した。１２，１３−（シタラビン−ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１、Ｃ_３５８Ｈ_４５８Ｎ_１２３Ｏ_１９１Ｐ_２５Ｓ_２［Ｃａｌ．ＭＷ＝１０３７８，６６Ｏｂｓ．ＭＷ＝１０３７９．２３］、１２又は１３−（シタラビン−ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−ＡＳ１４１１、Ｃ_３２０Ｈ_４０８Ｎ_１１５Ｏ_１７９Ｐ_２５Ｓ_２［Ｃａｌ．ＭＷ＝９５６７．８１、Ｏｂｓ．ＭＷ＝９５６８．０９］

ＭＣ−ＧＦＬＧ−シタラビンと１２，１３−（ＨＳ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１の反応による１２，１３−（シタラビン−ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１、および１２又は１３−（シタラビン−ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−ＡＳ１４１１の合成

実施例６
Ｉｎｖｉｔｒｏ効能の検証
ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１およびＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＣＲＯのＡ５４９細胞株に対するＭＴＴアッセイ
ヌクレオリンタンパク質が過剰発現された肺がん細胞株であるＡ５４９細胞株におけるＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１の細胞阻害（cell inhibition）効能の検証をＭＴＴアッセイによりｉｎｖｉｔｒｏで確認した。ＭＭＡＥ、ＡＳ１４１１、ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１とＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＣＲＯを、ＭＴＴアッセイにより細胞の細胞生存能力（cell viability）及び増殖（proliferation）を比較したところ、ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１がＭＭＡＥとほぼ同様の効果を示すことを確認した。Ａ５４９細胞（cell）（ＡＴＣＣ、ＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳ）は、適正細胞濃度を決定する細胞試験（cell test）により定められた細胞数（cell number）２．５〜５×１０^５個／ｗｅｌｌを９６ウエルプレート（９６well Plate）に蒔種（seeding）した後、一日育てた。ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１とＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＣＲＯは、９５℃で５分間熱処理（heating）して常温で徐々に冷却した後、濃度別に各ウエル（well）にすぐに処理した。処理されたＡ５４９細胞（cell）は、５％ＣＯ_２インキュベーター（incubator）で７２時間の間インキュベーション（incubation）した後、ＭＴＴアッセイ用試薬液（reagent solution）（Cell Proliferation kit II、Roche）を２０ｕＬずつ処理し、時間別（１０分、３０分、１時間）でインキュベーション（incubation）した後、ＥＬＩＳＡリーダー（reader）機で４９０ｎｍ吸光度を測定した（図５）。

実施例７
シタラビン−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１およびシタラビン−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＣＲＯのＭｖ４−１１細胞株に対するＭＴＴアッセイ
ヌクレオリンタンパク質が過剰発現された肺がん細胞株であるＭｖ４−１１細胞株におけるシタラビン−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１の細胞阻害（cell inhibition）効能の検証をＭＴＴアッセイによりｉｎｖｉｔｒｏで確認した。シタラビン、ＡＳ１４１１、シタラビン−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１およびシタラビン−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＣＲＯを、ＭＴＴアッセイにより細胞の細胞生存能力（cell viability）及び増殖（proliferation）を比較したところ、シタラビン−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１コンジュゲートがシタラビンとほぼ同様の効果を示すことを確認した。Ｍｖ４−１１細胞（cell）（ＡＴＣＣ、ＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳ）は、適正細胞濃度を決定する細胞試験（cell test）により定められた細胞数（cell number）２．５〜５×１０^５個／ウエル（well）を９６ウエルプレート（９６well plate）に蒔種（seeding）した後、一日育てた。シタラビン−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１とシタラビン−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＣＲＯは、９５℃で５分間熱処理（heating）して常温で徐々に冷却（cooling）した後、濃度別に各ウエル（well）にすぐに処理した。処理されたＡ５４９細胞（cell）は、５％ＣＯ_２インキュベーター（incubator）で７２時間の間インキュベーション（incubation）した後、ＭＴＴアッセイ用試薬液（reagent solution）（Cell Proliferation kit II、Roche）を２０ｕＬずつ処理し、時間別（１０分、３０分、１時間）にインキュベーション（incubation）した後、ＥＬＩＳＡリーダー（reader）機で４９０ｎｍ吸光度を測定した（図６）。

実施例８
Ｉｎｖｉｖｏ効能の検証
ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１のＡ５４９肺がん細胞株注入マウスに対するｉｎｖｉｖｏ治療効果の検証
Ａ５４９肺がん細胞株注入マウスに対して静脈注射（IV injection）でＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１とＭＭＡＥをそれぞれ３０日間投与した後、ＰＥＴｉｍａｇｅから腫瘍サイズ（tumor size）を確認した。Ａ５４９肺がん細胞６．１ｘ１０^６細胞（cell）／ｍｌをヌードマウスの右太ももに皮下注入した。注射してから３〜４週間後に腫瘍の大きさを測定し、直径０．８ｃｍに達した時に治療前のｍｉｃｒｏＰＥＴ撮影を行った。ＰＥＴ画像のために、Ｆ−１８ＦＤＧ０.２ｍＣｉを腹腔内に注射した後の画像を得た。（ＳｉｅｍｅｎｓＩｎｖｅｏｎ）画像から腫瘍のＦＤＧ摂取を確認した後、実験群５匹のマウスにＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１を５日間隔で４回静脈内注射した（７．５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇｏｆＭＭＡＥ）。治療開始３０日後に、治療前と同じ方法でｍｉｃｒｏＰＥＴを撮影した。Ａ５４９肺がん細胞株注入マウスに対して、静脈注射（IV injection）でＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１を３０日間投与した後にＰＥＴｉｍａｇｅを確認したとき、腫瘍のＦＤＧ摂取が著しく減少したことを確認した（図７及び図８）。

実施例９
ＭＭＡＥのＡ５４９肺がん細胞株注入マウスに対するｉｎｖｉｖｏ治療効果の検証
Ａ５４９肺がん細胞株注入マウスに対して、静脈注射（IV injection）でＭＭＡＥを３０日間投与した後、ＰＥＴｉｍａｇｅを確認した。Ａ５４９肺がん細胞６．１×１０^６細胞（cell）／ｍｌをヌードマウスの右太ももに皮下注入した。注射してから３〜４週間後に腫瘍の大きさを測定し、直径０．８ｃｍに達した時に治療前のｍｉｃｒｏＰＥＴ撮影を行った。ＰＥＴ画像のために、Ｆ−１８ＦＤＧ０．２ｍＣｉを腹腔内に注射した後の画像を得た。（ＳｉｅｍｅｎｓＩｎｖｅｏｎ）治療前の画像から腫瘍のＦＤＧ摂取を確認した後、５匹のマウスにＭＭＡＥを５日間隔で４回静脈内注射した（０．５ｍｇ／ｋｇ）。治療開始３０日後に治療前と同じ方法でｍｉｃｒｏＰＥＴを撮影した。ＭＭＡＥ治療前と比較して、治療後にもＦＤＧＰＥＴ画像から腫瘍のＦＤＧ摂取が増加したことを確認した（図９及び図１０）。

実施例１０
Ｅｘ−ｖｉｖｏ検証
Ａ５４９肺がん細胞株注入マウスにおいて、ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１が、ＭＭＡＥを単独で投与した時よりも優れたがん抑制効果を示す。ＭＭＡＥ単独投与に比べて、ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１が８０％さらに癌を抑制することを確認した。治療開始後５日間隔で腫瘍の大きさを横縦軸で測定し、治療開始から３０日経過した後に各グループの腫瘍を摘出した。下記の写真のようにグループ別に分けて撮影して、ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１とＭＭＡＥの腫瘍サイズを比較した（図１１及び図１２）。
ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１とＭＭＡＥの肺がん（Ａ５４９細胞ライン（cell line））に対するｉｎｖｉｖｏ効能を検証したところ、ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１がＭＭＡＥ単独投与に比べて優れた効能を示すことを確認した。

実施例１１
Ｉｎｖｉｖｏ効能の検証
シタラビン−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１のＭｖ４−１１ＡＭＬ細胞株注入マウスに対するｉｎｖｉｖｏ治療効果の検証
Ｍｖ４−１１ＡＭＬ細胞株注入マウスに対して静脈注射（IV injection）でシタラビン−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１とＭＭＡＥをそれぞれ３０日間投与した後、ＰＥＴｉｍａｇｅから腫瘍サイズ（tumor size）を確認した。Ｍｖ４−１１ＡＭＬ細胞６．１×１０^６細胞（cell）／ｍｌをヌードマウスの右太ももに皮下注入した。注射してから３〜４週間後に腫瘍の大きさを測定し、直径０．８ｃｍに達した時に治療前のｍｉｃｒｏＰＥＴ撮影を行った。ＰＥＴ画像のために、Ｆ−１８ＦＤＧ０．２ｍＣｉを腹腔内に注射した後の画像を得た。（ＳｉｅｍｅｎｓＩｎｖｅｏｎ）画像から腫瘍のＦＤＧ摂取を確認した後、実験群５匹のマウスにシタラビン−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１を５日間隔で４回静脈内注射した（ＭＭＡＥの７．５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ）。治療開始３０日後に治療前と同じ方法でｍｉｃｒｏＰＥＴを撮影した（図１３、図１４）。

実施例１２
ＭＭＡＥのＭｖ４−１１ＡＭＬ細胞株注入マウスに対するｉｎｖｉｖｏ治療効果の検証
Ｍｖ４−１１ＡＭＬ細胞株注入マウスに対して、静脈注射（IV injection）でＭＭＡＥを３０日間投与した後、ＰＥＴｉｍａｇｅを確認した。Ｍｖ４−１１ＡＭＬ細胞６．１×１０^６細胞（cell）／ｍｌをヌードマウスの右太ももに皮下注入した。注射してから３〜４週間後に腫瘍の大きさを測定し、直径０．８ｃｍに達した時に治療前のｍｉｃｒｏＰＥＴ撮影を行った。ＰＥＴ画像のために、Ｆ−１８ＦＤＧ０．２ｍＣｉを腹腔内に注射した後の画像を得た。（ＳｉｅｍｅｎｓＩｎｖｅｏｎ）治療前の画像から腫瘍のＦＤＧ摂取を確認した後、５匹のマウスからＭＭＡＥを５日間隔で４回静脈内注射した（０．５ｍｇ／ｋｇ）。治療開始３０日後に治療前と同じ方法でｍｉｃｒｏＰＥＴを撮影した。ＭＭＡＥの治療前と比較して、治療後にもＦＤＧＰＥＴ画像から腫瘍のＦＤＧ摂取が増加したことを確認した（図１５、図１６）。

実施例１３
Ｉｎｖｉｔｒｏ効能の検証
Ａ５４９細胞株に対するＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１、１２又は１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−ＡＳ１４１１、および１２，１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１のＭＴＴアッセイ
ヌクレオリンタンパク質が過剰発現された肺がん細胞株であるＡ５４９細胞株におけるＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１、１２又は１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−ＡＳ１４１１、および１２，１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１の細胞阻害（cell inhibition）効能の検証をＭＴＴアッセイによりｉｎｖｉｔｒｏで確認した。ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１、１２又は１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−ＡＳ１４１１、および１２，１３−（ＭＭＡＥ− ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１をＭＴＴアッセイにより細胞の細胞生存能力（cell viability）及び増殖（proliferation）を比較したところ、１２，１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１が、ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１よりも優れた効能を示すことを確認した。Ａ５４９細胞（cell）（ＡＴＣＣ、ＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳ）は、適正細胞濃度を決定する細胞試験（cell test）により定められた細胞数（cell number）２．５〜５×１０^５個／ウエル（well）を９６ウエルプレート（９６well plate）に蒔種（seeding）した後一日育てた。ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１、１２又は１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−ＡＳ１４１１、および１２，１３−（ＭＭＡＥ− ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１は、９５℃で５分間熱処理（heating）して常温で徐々に冷却（cooling）した後、濃度別に各ウエル（well）にすぐに処理した。処理されたＡ５４９細胞（cell）は、５％ＣＯ_２インキュベーター（incubator）で７２時間の間インキュベーション（incubation）した後、ＭＴＴアッセイ用試薬液（reagent solution）（Cell Proliferation kit II、Roche）を２０ｕＬずつ処理し、時間別（１０分、３０分、１時間）に培養した後、ＥＬＩＳＡリーダー（reader）機で４９０ｎｍ吸光度を測定した（図１７）。図１７のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄは、次のとおりである。

図１８は、ＭＭＡＥ−（ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ_３−ＡＳ１４１１、１２又は１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−ＡＳ１４１１、および１２，１３−（ＭＭＡＥ−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）_２−ＡＳ１４１１のＡ５４９細胞株に対するＭＴＴアッセイの結果を示すものである。

本発明のＡＳ１４１１−薬物コンジュゲートは、がん標的治療剤として有用に使用可能である。

Claims

薬物−リンカー−ＡＳ１４１１の構造を含むがん標的治療剤。
薬物は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、シタラビン、ゲムシタビン、メイタンシン、ＤＭ１、ＤＭ４、カリケアミシン及びその誘導体、ドキソルビシン、デュオカルマイシン及びその誘導体、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ＳＮ−３８、α-アマニチン、およびツブリシン類似体（Tubulysin analog）から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のがん標的治療剤。
リンカーは、Ｘ−Ｙで構成され、
ここで、Ｙは、マレイミドカプロイル−バリン‐シトルリン−ｐ−アミノベンゾイルオキシカルボニル（ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ）、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、チオエーテル、バリン‐シトルリン、Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＭＣＣ）、マレイミドカプロイル、メルカプトアセトアミドカプロイル、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、ＳＭＣＣ、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＤＢ）、ホスホジエステル結合、およびヌクレオチドからなる群より選択され、
Ｘは、５’−チオール−改質剤Ｃ６、チオール−改質剤Ｃ６Ｓ−Ｓ、ジチオールセリノール、ＰＣアミノ−改質剤、５’−アミノ−改質剤Ｃ３、５’−アミノ−改質剤Ｃ６、５’−アミノ−改質剤Ｃ１２、５’−アミノ−改質剤ＴＥＧ、アミノ−改質剤Ｃ２ｄＴ、アミノ−改質剤Ｃ６ｄＴ、Ｓ−Ｂｚ−チオール−改質剤Ｃ６−ｄＴ、ホスホジエステル結合、およびヌクレオチドからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載のがん標的治療剤。
前記リンカーは、ＡＳ１４１１の１２又は１３の位置、若しくは１２と１３の位置の両方に連結されることを特徴とする、請求項１に記載のがん標的治療剤。