WO2018124512A2 - 압타머-약물 콘쥬게이트 및 그 용도 - Google Patents

압타머-약물 콘쥬게이트 및 그 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2018124512A2
WO2018124512A2 PCT/KR2017/014060 KR2017014060W WO2018124512A2 WO 2018124512 A2 WO2018124512 A2 WO 2018124512A2 KR 2017014060 W KR2017014060 W KR 2017014060W WO 2018124512 A2 WO2018124512 A2 WO 2018124512A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mmae
pab
cit
val
modifier
Prior art date
Application number
PCT/KR2017/014060
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2018124512A3 (ko
Inventor
이중환
임종훈
김종인
Original Assignee
이중환
인터올리고 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이중환, 인터올리고 주식회사 filed Critical 이중환
Priority to EP17887935.9A priority Critical patent/EP3560517A4/en
Priority to US16/473,771 priority patent/US11458120B2/en
Priority to JP2019555545A priority patent/JP7067802B2/ja
Priority to CN201780080822.7A priority patent/CN110167597A/zh
Priority to AU2017389094A priority patent/AU2017389094B2/en
Publication of WO2018124512A2 publication Critical patent/WO2018124512A2/ko
Publication of WO2018124512A3 publication Critical patent/WO2018124512A3/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4025—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. cromakalim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers

Definitions

  • the present invention relates to the [ anti -nucleolin GRO aptamer] -Toxin conjugate and its synthesis for the treatment of target cancer.
  • the invention relates to those of [anti -nucleolin aptamer]
  • the use of -Toxin conjugate showing the excellent effect in the treatment of cancer that verify the in vitro / vivo efficacy.
  • Anticancer drugs are generally used near the maximum tolerated dose to obtain clinical therapeutic effects. Anticancer drugs only kill rapidly proliferating cells and do not differentiate between normal and tumor cells or tumor tissues. Such chemotherapy has the drawback that the therapeutic index and therapeutic window of anticancer drugs are very low because of non-tumor specific systemic toxicity and cytotoxicity. In addition, there is an urgent need for improved new therapies that can cause resistance to anticancer drugs in long-term treatments, thereby accurately delivering and killing cytotoxic drugs only to cancer cells.
  • ADCs antibody-drug conjugated antibodies
  • ADCs Antibody-Drug Conjugates
  • ADCs have recently completed Phase III clinical trials at Seattle Genetics and Imunog, have been approved by the FDA and brought to market a new treatment.
  • antibodies are composed of large proteins, which have many problems in QC, such as the location of drug attachment, the number of drugs attached (1-6, average 3.5), and the location of attachment.
  • aptamer-drug conjugates and the therapeutic properties of aptamers that can be compared with antibodies has the advantage that chemical reactions can be easily controlled to control the number and location of the agent. Therefore, by combining the superiority of the aptamer relative to the antibody, it is considered that the possibility of success in the clinical can be increased.
  • Aptamer-Drug Conjugates are highly toxic and difficult to use in clinical practice, so that the target-oriented aptamers can be delivered to the drug to deliver them only to cancer cells without any side effects. It is expected that you can expect to maximize.
  • ADC is a technology that focuses on drugs specifically targeting cancer cells by taking full advantage of antibody specificities (non-toxicity in circulation and pharmacokinetics).
  • ADC consists of three components, including a monoclonal antibody drug and a linker linking the antibody to the drug.
  • ADC technology uses antibodies that specifically bind to specific antigens expressed on the surface of cancer cells. It is a method of delivering drugs to tumor cells.
  • ADCs enter cells by binding to a target with an antibody that specifically binds to the target.
  • the ADC moved into the cell falls off the target, fuses with other vesicles in the cell, and then proceeds through the endosome-lysosome pathway.
  • the proteases in the acidic environment of endosomes then cleave the linker, and the active "free" drug passes through the lysosomal membrane to the cytoplasm and binds to the drug's molecular target, thereby stopping the cell cycle of tumor cells and apoptosis.
  • a certain amount of the drug is either passive diffusion in the cell, active transport, or flows out of the cell through dead cells. At this time, when the spilled drug passes through the cell membrane permeability, the so-called by-stander cell killing may also occur in surrounding cells, which may cause side effects to the patient.
  • ADC Antibody-Drug Conjugate
  • Antibody (Tmab) has 88 lysines to which Drug (DM1) can attach. It is not easy to identify the conjugation site where the average of 3.5 drugs (DM1) is attached to the lysine of 88 lysine. In other words, trypsin digestion and Asp-N protease digestion to find the conjugation site, and these fragments are compared with the results of ESI-TOFMS analysis to determine the extent of drug (DM1) conjugation.
  • ADC Antibody-Drug Conjugate
  • Antibody reaches the target-bound drug to cancer cells and shows therapeutic effect by the drug, but the drug that reaches the cancer cell by antibody is only 2% or less.
  • a safe, anti-cancer drug with clinical approval such as Doxorubicine, is selected as a drug that binds to antibodies with high toxic agents that are 100 to 1,000 times higher because of their low efficacy.
  • Aptamers are DNA or RNA oligonucleotides that can be diagnosed or targeted by binding selectively to biomarks that cause diseases such as cancer with similar properties to antibodies. That is, aptamers have unique three-dimensional structures according to the target material, and these three-dimensional structures bind strongly to labeling proteins (cancer-induced proteins and biomarks) to target treatment, It is a new bio-capturing material capable of personalized diagnosis or missile therapy.
  • the most successful target therapies are antibodies.
  • 30 antibody targeted therapies are available with FDA approval and 300 clinical trials are in progress.
  • the cost of development is too high and saturated, and advanced pharmaceutical companies are already moving to the development of new treatments.
  • Antibodies are made of proteins and must be made in vivo.However, aptamers are new bio-capturing reagents called “Chemical Antibodies” that can lead to discovery of lead compounds in vitro faster and easier synthesis and modification. It is expected.
  • Macugen is a treatment for age-related Macular Degeneration (AMD), a cause of blindness caused by presbyopia, which causes abnormal blood vessel growth due to VEGF (vascular endothelial growth factor), which inhibits VEGF (vascular endothelial growth factor). It has a therapeutic effect.
  • AMD age-related Macular Degeneration
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • Ribomic began to develop new drugs for aptamers.
  • Aptamers are also called “chemically antibodies” and have higher target binding and selectivity than antibodies, and are biologically produced in a chemically synthetic way as compared to antibodies, resulting in more efficient drug attachment and very simple QC. Has an advantage. If the low target reach rate of the antibody can be solved with aptamer, it is possible to overcome the low efficiency of the ADC (Antibody-Drug conjugate).
  • ADC Antibody-Drug conjugate
  • Aptamer-Drug conjugates are also expected to be a new therapeutic area, but research to develop them is still in its infancy. Recently, the Aptamer-Drug conjugate (Sgc8c-Dox conjugate), which combines doxorubicin (Dox) anticancer with aptamer (Sgc8c) at the University of Florida at Weihong Tangroup, was compared with Doxorubicin. It was difficult to separate / purify Sgc8c-Dox conjugate from naked aptamer Sgc8c, so that high purity Sgc8c-Dox conjugate was not obtained, and both Sgc8c-Dox conjugate and doxorubicin had similar cytotoxic effects (20%). Showed.
  • GRO Guanine-Rich Oligonucleotide
  • aptamers are very unstable in vivo, so PEGTylation of invert dT at 5 'position to PEG position to increase nuclease residence or circulation time in vivo (PEG-aptamer) -idT) is used in the clinic.
  • GRO aptamers have a unique structure called G-quardruplex, which are highly stable and specifically bind to nucleolins that are highly expressed in cancer cells.
  • GRO aptamers inhibit nucleolin expression by interfering with the molecular interactions and functions of nucleus, cytoplasma and membranes, thereby inducing cancer cell necrosis by promoting the expression of p53, a tumor suppressor protein due to antiproliferative effects. Let's do it.
  • AS1411 is a GRO aptamer that is currently undergoing phase 2 clinical trials for non-small cell and kidney cancer in (Anti) Antisoma, and is specifically bound to nucleolins expressed in almost all cancers. It is very stable aptamer with anticancer effect.
  • AS1411 currently being developed as an anti -nucleoline aptamer drug in Antisoma, is a GRO DNA aptamer with a ggtggtggtggttgtggtggtggtg base sequence and successfully completed phase II clinical trials for the treatment of renal and non-small cell lung cancer. Due to uncertainty in the efficacy test, Antisoma (Young) is no longer in Phase III clinical trial for non-small cell cancer, but is moving to Advanced Cancer Therapeutics Inc. to prepare Phase III clinical trial with ACT-GRO-777 (renamed AS1411). .
  • Oligo-drugs including GRO aptamers, currently in development and in clinical use, are rapidly degraded by nuclease-degrading enzymes present in large quantities in plasma in vivo.
  • the therapeutic agent by injection is known to be destroyed more quickly if not treated chemically stable.
  • the rate of destruction can be reduced by chemically altering the oligonucleotides or by forming complexes in combination with appropriate carriers.
  • Various chemical modifications such as replacing ribose 2'-OH with 2'F or 2'OMe groups or changing phospho backbone from PO to PS to resist nucleases, have been successfully used in antisense and siRNA applications.
  • Macugen the first commercially available aptamer treatment licensed by the FDA in 2004, was also optimized after aptamer discovery.
  • GRO aptamers are also important for the specificity of nucleolin targeting, and it is necessary to minimize the "off-target effect" of binding to proteins other than nucleolinic proteins to reduce their efficacy. Recently, Antisoma (Young) has not completed the Phase II clinical trial of AS1411 for non-small cell carcinoma (AML) as the first GRO aptamer. It is considered a disadvantage of not being seen.
  • AS1411-Drug conjugates were found to be more effective in cancer treatment in vitro and in vivo than when used.
  • the cancer target therapeutic agent of the present invention has the following Drug (R) -linker (L) -AS1411 structure.
  • the position where the drug is linked is particularly preferably 12 and 13 positions or 12 or 13 positions.
  • the drug R used here is monomethyl oristin E (MMAE), monomethyl oristin F (MMAF), cytarabine, gemcitabine, maytansine, DM1, DM4, calicheamicin and its derivatives, doxorubicin, Preference is given to duocarmycin and its derivatives, pyrrolobenzodiazepine (PBD), SN-38, ⁇ -amantine, Tubulysin analogs and the like.
  • MMAE monomethyl oristin E
  • MMAF monomethyl oristin F
  • cytarabine gemcitabine
  • maytansine DM1, DM4, calicheamicin and its derivatives
  • doxorubicin Preference is given to duocarmycin and its derivatives, pyrrolobenzodiazepine (PBD), SN-38, ⁇ -amantine, Tubulysin analogs and the like.
  • L is composed of X-Y [R-Y-X-AS1411],
  • Y is maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzoyloxycarbonyl (MC-Val-Cit-PAB), hydrazone, peptide, disulfide, thioether, valine-citrulline, N -maleimidomethylcyclohexane -1-carboxylate (MCC), maleimidocaproyl, mercaptoacetamidocaproyl, N-succinimidyl 4- (2-pyridyldithio) pentanoate (SPP), SMCC, succinimi Diyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), N-succinimidyl 4- (2-pyridylthio) pentanoate (SPDB), phosphodiester bonds, and Is selected from the group consisting of nucleotides,
  • X is 5'-thiol-modifier C6 , thiol-modifier C6 SS, dithiol serinol, PC amino-modifier, 5'-amino-modifier C3, 5'-amino-modifier C6, 5'-amino-modifier C12 , 5'-amino-modifier TEG, amino-modifier C2 dT, amino-modifier C6 dT, S-Bz- thiol-modifier C6-dT, phosphodiester bonds, and nucleotides.
  • AS1411-drug conjugates of the present invention are more effective in treating cancer targets in vitro and in vivo than when using drugs alone.
  • FIG. 6 shows MTT assay results for Mv4-11 cell lines of citrabin- (GLFG-MC-S-C6) -T 3 -AS1411 and citrabin- (GLFG-MC-S-C6) -T 3 -CRO.
  • FIG. 7 is a FDG PET image taken before treatment of A549 lung cancer cell line injected mice (tumor with FDG intake in left thigh).
  • FIG. 8 shows FDG PET images obtained 30 days after MMAE- (PAB-Cit-Val-MC-S-C6) -T 3 -AS1411 treatment in mice injected with A549 lung cancer cell lines (confirmed that tumor FDG intake is reduced).
  • FIG 9 is a FDG PET image taken before treatment for A549 lung cancer cell line-injected mice (tumors with FDG intake in the left thigh region are observed).
  • FIG. 14 shows FDG PET images obtained 30 days after citrabin- (GLFG-MC-S-C6) -T 3 -AS1411 treatment for Mv4-11 AML cell line injected mice (determined tumor FDG uptake).
  • Figure 15 shows Mv4-11 AML cell line injection mice FDG PET image taken before treatment (tumor with FDG intake in left thigh).
  • FDG PET images obtained 30 days after MMAE treatment (confirmed increased tumor FDG intake).
  • FIG. 18 shows MMAE- (PAB-Cit-Val-MC-S-C6) -T 3 -AS1411, 12 or 13- (MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6) -AS1411 and 12,13- (MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6) MTT assay results for the A549 cell line of 2- AS1411.
  • RSS-C6-tttggtggtggtggtggttgtggtggtggtggtgg was removed by centrifugation of the remaining DTT after about 3 hours reduction reaction in the presence of DTT and exchanged with SB17 buffer to HS-C6-tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg [HS -C6-T 3 -AS141].
  • MC-Val-Cit-PAB-MMAE dissolved in a small amount of DMSO was added and shaken overnight. Separation / purification via reverse phase HPLC (Waters-Xbridge OST C18 10 ⁇ 50 mm, 65, TEAE / CAN buffer).
  • MC-Val-Cit-PAB-MMAE dissolved in a small amount of DMSO was added and shaken overnight. Separation / purification via reverse phase HPLC (Waters-Xbridge OST C18 10 ⁇ 50 mm, 65, TEAE / CAN buffer).
  • MC-Val-Cit-PAB-MMAE dissolved in a small amount of DMSO was suspended and shaken overnight.
  • Purified via reverse phase HPLC (Waters-Xbridge OST C18 10X50mm, 65, TEAE / CAN buffer) 12,13- (MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6) 2 -AS1411 and 12 or 13- (MMAE -PAB-Cit-Val-MC-S-C6) -AS1411 was obtained.
  • RSS-C6-tttggtggtggtggtggttgtggtggtggtggtgg [RSS-C6-T 3 -AS141] was removed after about 3 hours of reduction reaction in the presence of DTT through the centrifuge and exchanged with SB17 buffer.
  • Mal-GPLG-citrabin dissolved in a small amount of DMSO was suspended and shaken overnight. Purification was performed through reverse phase HPLC (Waters-Xbridge OST C18 10X50mm, 65, TEAE / CAN buffer) to obtain citrabin- (GLFG-MC-S-C6) -T 3 -AS1411.
  • MMAE- (PAB-Cit-Val-MC-S-C6) -T 3 -AS1411 in A549 cell line which is a nucleolin protein overexpressed lung cancer cell line
  • MMAE- (PAB-Cit-Val-MC-S-C6) -T 3 -AS1411 showed almost the same efficacy as MMAE.
  • A549 cell (ATCC, IMDM + 10% FBS) is determined by the cell test to determine the appropriate cell concentration 2.5 ⁇ 5X10 5 Seed dogs / well in 96well plate and grow one day.
  • MMAE- (PAB-Cit-Val-MC-S-C6) -T 3 -AS1411 and MMAE- (PAB-Cit-Val-MC-S-C6) -T 3 -CRO are heated to 95 ° C for 5 minutes at room temperature. After cooling slowly at each concentration was treated immediately in each well.
  • the treated A549 cells were incubated for 72 h in a 5% CO 2 incubator, followed by 20 uL of reagent solution (Cell Proliferation kit II, Roche) for MTT assay, incubated with time (10 min, 30 min, 1 hr) and absorbed at 490 nm using ELISA reader. It was measured (FIG. 5).
  • citrabin- (GLFG-MC-S-C6) -T 3 -AS1411 conjugate showed almost the same effect as the citrabin.
  • Mv4-11 cell (ATCC, IMDM + 10 % FBS) is determined through a test cell to determine the appropriate cell concentration cell number 2.5 ⁇ 5X10 5 Seed dogs / well in 96well plate and grow one day.
  • Citrabin- (GLFG-MC-S-C6) -T 3 -AS1411 and Citrabin- (GLFG-MC-S-C6) -T 3 -CRO are heated at 95 °C for 5 minutes and then cooled slowly at room temperature. Each well was treated immediately.
  • the treated A549 cells were incubated for 72 h in a 5% CO 2 incubator, followed by 20 uL of reagent solution (Cell Proliferation kit II, Roche) for MTT assay, incubated with time (10 min, 30 min, 1 hr) and absorbed at 490 nm using ELISA reader. It was measured (FIG. 6).
  • MMAE- (PAB-Cit-Val-MC-S-C6) -T 3 -AS1411 and MMAE were administered to A549 lung cancer cell line injected mice for 30 days, and the tumor size was confirmed by PET image. 6.1x10 ⁇ 6 cells / ml of A549 lung cancer cells were injected subcutaneously into the right mouse thigh. Tumor size was measured 3-4 weeks after injection, and microPET was taken before treatment when the diameter reached 0.8cm. For PET imaging, images were obtained after intraperitoneal injection of F-18 FDG 0.2mCi.
  • MMAE- (PAB-Cit-Val-MC-S-C6) -T 3 -AS1411 was intravenously injected four times at five day intervals in five experimental groups. 7.5 mg / kg, 0.5 mg / kg of MMAE). After 30 days of treatment, microPET was taken in the same manner as before treatment. After injection of MMAE- (PAB-Cit-Val-MC-S-C6) -T 3 -AS1411 for 30 days in mice injected with A549 lung cancer cell line, tumors significantly reduced FDG intake when PET image was confirmed. It was confirmed that (Figs. 7 and 8).
  • MMAE was injected into the A549 lung cancer cell line-injected mice for 30 days, followed by PET image. 6.1x10 ⁇ 6 cells / ml of A549 lung cancer cells were injected subcutaneously into the right mouse thigh. Tumor size was measured 3-4 weeks after injection, and microPET was taken before treatment when the diameter reached 0.8cm.
  • images were obtained after intraperitoneal injection of F-18 FDG 0.2mCi. (Siemens Inveon) After confirming the tumor's FDG uptake in the pre-treatment images, five mice were intravenously injected with MMAE four times at 5-day intervals (0.5 mg / kg). Photographed. It was confirmed that the FDG uptake of tumors was increased in the FDG PET images after the treatment compared with the MMAE treatment (FIGS. 9 and 10).
  • A549 lung cancer cells implanted mice standing MMAE- (PAB-Cit-Val- MC-S-C6) -T 3 -AS1411 show that the inhibitory effect is superior than cancer when administered alone as MMAE. It was confirmed that MMAE- (PAB-Cit-Val-MC-S-C6) -T 3 -AS1411 inhibited cancer by 80% more than MMAE alone. Tumor size was measured in the horizontal and vertical axis at intervals of 5 days after the start of treatment, and tumors of each group were extracted 30 days after the start of treatment. Tumor sizes of MMAE- (PAB-Cit-Val-MC-S-C6) -T 3 -AS1411 and MMAE were compared by dividing the images by group as shown below (FIGS. 11 and 12).
  • Mv4-11 AML cell line injection mice were administered with citrabin- (GLFG-MC-S-C6) -T 3 -AS1411 and MMAE for 30 days by IV injection, and the tumor size was confirmed by PET image. 6.1 ⁇ 10 6 cells / ml of Mv4-11 AML cells were injected subcutaneously into the nude mouse right thigh. Tumor size was measured 3-4 weeks after injection, and microPET was taken before treatment when the diameter reached 0.8cm. For PET imaging, images were obtained after intraperitoneal injection of F-18 FDG 0.2mCi.
  • citrabin- (GLFG-MC-S-C6) -T 3 -AS1411 was intravenously injected 4 times at 5 day intervals in 5 experimental mice (7.5 mg / kg, 0.5 mg / kg of MMAE). 30 days after the start of treatment, microPET was photographed in the same manner as before treatment (FIGS. 13 and 14).
  • Mv4-11 AML cell line injection mice were injected with MMAE for 30 days by IV injection, and then PET image was confirmed. 6.1 ⁇ 10 6 cells / ml of Mv4-11 AML cells were injected subcutaneously into the nude mouse right thigh. Tumor size was measured 3-4 weeks after injection, and microPET was taken before treatment when the diameter reached 0.8cm. For PET imaging, images were obtained after intraperitoneal injection of F-18 FDG 0.2mCi. (Siemens Inveon) After confirming the tumor's FDG uptake in the pre-treatment image, five mice were injected intravenously with MMAE four times at five day intervals.
  • A549 cell (ATCC, IMDM + 10% FBS) is determined by the cell test to determine the appropriate cell concentration 2.5 ⁇ 5X10 5 Seed dogs / well in 96well plate and grow one day.
  • A549 cells were incubated for 72h in a 5% CO 2 incubator, followed by 20uL of reagent solution (Cell Proliferation kit II, Roche) for MTT assay, incubated with time (10min, 30min, 1hr), and then absorbed at 490nm using ELISA reader. It was measured (FIG. 17).
  • reagent solution Cell Proliferation kit II, Roche
  • time 10min, 30min, 1hr
  • FIG. 18 shows MMAE- (PAB-Cit-Val-MC-S-C6) -T 3 -AS1411, 12 or 13- (MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6) -AS1411 and 12,13- (MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)
  • Figure 2 shows the results of the MTT assay for the A549 cell line of AS1411.
  • AS1411-drug conjugates of the present invention can be usefully used as a cancer target therapeutic agent.

Abstract

본 발명은 약물-링커-AS1411 구조를 포함하는 암 표적 치료제에 관한 것으로, 약물은 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE), 모노메틸 오리스타틴 F(MMAF), 시타라빈, 젬시타빈, 메이탄시네, DM1, DM4, 칼리키아미신 및 그 유도체, 독소루비신, 듀오카르마이신 및 그 유도체, 피롤로벤조디아제핀(PBD), SN-38, α-아만틴, 및 투불루신 유사체(Tubulysin analog) 등으로부터 선택될 수 있다.

Description

압타머-약물 콘쥬게이트 및 그 용도
본 발명은 표적암 치료를 위한 [anti-nucleolin GRO aptamer]-Toxin 콘쥬게이트 및 그 합성에 관한 것이다. 특히 본 발명은 이들의 in vitro/ vivo 효능을 검증한 것으로 암치료에 탁월한 효과를 나타내는 [anti-nucleolin aptamer]-Toxin 콘쥬게이트의 용도에 관한 것이다.
지금까지 항암제를 비롯한 수많은 치료제들이 개발되고 임상을 거쳐 약으로 개발되었으나 표적 항암제와 같이 치료효과가 있는 물질을 원하는 발병 부위까지 얼마나 선택적이고 효과적으로 전달하는가는 아직까지 연구를 해야 할 새로운 분야이다. 항암제(Anticancer Drugs)는 임상치료 효과를 얻기 위하여 일반적으로 최대허용량(maximum tolerated dose) 근처에서 사용되며, 항암제는 빠르게 증식하는 세포를 죽일 뿐, 정상세포와 종양세포 또는 종양조직을 구별하지 못한다. 이러한 화학요법(Chemotherapy)은 non-tumor specific 전신독성(systemic toxicity)과 세포독성 때문에 항암제의 therapeutic index와 therapeutic window가 매우 낮다는 결점을 가지고 있다. 또한, 장기 치료 시 항암제에 대한 내성을 야기시킬 수 있어 세포독성 약물을 암세포에만 정확하게 전달하여 사멸시키는 향상된 새로운 치료법이 절실히 요구되고 있다.
지난 30년간 약물을 타겟에 효과적으로 보내어 약효를 높이고자 하는 많은 시도가 있었지만 기존의 항체(Naked antibody) 보다 효능을 향상시키고자 항체와 약물이 결합된 Antibody-Drug 콘쥬게이트(ADC)의 임상에의 시도가 성공가능성이 높은 것으로 여겨진다. ADC(Antibody-Drug 콘쥬게이트)는 최근 Seattle Genetics사와 Imunog사에서 임상 3상을 성공적으로 마쳐 FDA 허가를 받고 시장에 출시하여 새로운 치료제의 장을 열었다고 할 수 있다. 하지만 항체는 거대 단백질로 구성되어 있어서 Drug을 붙이는 위치와 붙은 Drug의 갯수(1~6개, 평균 3.5개) 및 붙는 위치들 등 QC에서의 많은 문제점을 가진다. 항체와 비교될 수 있는 압타머의 표적지향적인 성질과 이의 치료제와의 결합체(Aptamer-Drug 콘쥬게이트)의 개발은 화학적인 반응이 용이하여 치료제 수와 붙이는 위치를 마음대로 조절 가능하다는 이점을 가진다. 따라서 항체 대비 압타머의 우수성을 접목하여 임상에의 성공가능성을 높일 수 있다고 여겨진다.
압타머-약물 콘쥬게이트(Aptamer-Drug Conjugates: ApDCs)는 독성이 강하여 실제 임상에서의 사용이 어려웠던 약물을 표적지향적인 압타머를 약물(Drug)에 붙여서 암세포에만 정확하게 전달하게 함으로써 부작용이 없는 치료효과를 극대화를 기대할 수 있으리라 기대된다.
즉, 하기와 같이 지금까지 개발된 ADC 기술(Antibody-Drug 콘쥬게이트 Technology)를 분석한 결과 항체를 약물에 결합시키는데 기술적인 어려움과 단점을 알 수 있었다. 압타머(Aptamer)로 더 쉽게 더 효율적으로 압타머가 결합된 치료제의 개발이 가능하였으므로 표적 항암제로서 치료에 적용하고자 한다.
ADC 기술(Antibody-Drug 콘쥬게이트 Technology)
ADC는 항체의 장점(specificity, non-toxicity in circulation과 pharmacokinetics)을 최대로 활용하여 약물이 구체적으로 암 세포만 타겟팅하는데 초점을 맞춘 테크놀로지이다. ADC는 단클론항체 약물, 그리고 항체와 약물을 연결하는 링커(linker)를 포함한 세 가지 구성요소로 구성되어 있으며, ADC테크놀로지는 암 세포의 표면에 발현된 특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 약물을 종양세포에 전달하는 방법이다.
대부분 ADC는 타겟에 특이적으로 결합하는 항체가 타겟에 binding함으로 세포 내에 들어간다. 세포 내로 이동된 ADC는 타겟에서 떨어지고 세포 내 다른 vesicles와 융합한 다음 endosome-lysosome 경로로 진행된다. 이어서 endosomes의 산성 환경에 있는 proteases가 링커를 절단하고, 활성화(active)된 "free" 약물은 lysosomal membrane을 통과하여 cytoplasm으로 이동한 후 약물의 molecular 타겟에 결합함으로써 종양세포의 세포주기는 정지되고 apoptosis로 인해 암세포가 죽게 된다. 이중 일정 양의 약물은 세포에서 수동적으로 확산되거나(passive diffusion), 능동적으로 수송 되거나(active transport), 또는 죽은 세포를 통해 세포 밖으로 유출된다. 이때, 유출된 약물이 세포막 투과성을 지나면 주변 세포에도 들어가 소위 by-stander cell killing이라는 현상이 일어나 환자에게 부작용이 생길 수 있다.
ADC 개발의 어려움(QC)
ADC(Antibody-Drug 콘쥬게이트)의 개발은 1980년부터 시작하였으나 실제로 임상에의 적용에 있어서 임상을 위하여 안정한 링커의 개발외에 ADC 합성 프로세스에서의 QC가 간단하지 않은 문제점을 가지고 있다. 즉, antibody(huJ591)에 DM1(Drug)을 결합할 때 1개의 antibody(huj591)에 DM1 drug이 1~7개까지 붙은 혼합물이 얻어지면 이의 분리/정제를 하지 못하고 평균 3.5개의 DM1 drug이 결합된 ADC를 임상에서 사용한다.
또한, Antibody(Tmab)는 Drug(DM1)이 붙을 수 있는 lysine이 88개나 된다. 88개의 lysine 중에서 평균 3.5개의 Drug(DM1)이 어느 위치의 lysine에 붙는지 conjugation site를 규명하는 방법이 쉽지가 않다. 즉, conjugation site를 알아내기 위하여 trypsin digestion 및 Asp-N protease digestion을 하고 이들 fragment들을 ESI-TOFMS롤 분석한 결과들을 비교함으로써 어느 정도 Drug(DM1)이 conjugation되는 자리를 결정할 수가 있다.
또한, ADC 제조에서 매 생산 배치별 항체에 붙는 약물(Drug)의 평균 조성이 달라져서 QC가 힘들다. 즉, 항체(juJ591)에 DOTA를 붙힌 후 MALDI-TOF MS spectra에서 batch A에서는 5.0개 batch B에서는 8.9개의 DOTA가 붙는 것을 확인할 수 있다. 다른 batch에서는 DOTA가 6.0 및 6.2개가 붙는다. 이상에서와 같이 ADC(Antibody-Drug 콘쥬게이트) 합성은 antibody 자체의 특성상 Drug을 결합하는 과정에서 정확한 QC의 어려움 등 개선되어야 할 많은 문제점들을 내포하고 있으며 ADC 프로세스에서 이의 해결을 위한 노력을 연구중이다.
ADC(Antibody-Drug 콘쥬게이트)의 한계 :
Antibody가 타겟 지향적으로 결합된 Drug을 암세포까지 도달하여 Drug에 의한 치료효과를 보이나 antibody에 결합되어 암세포에 도달하는 drug은 불과 2% 이하밖에 되지 않는 매우 낮은 효율성을 보이는 것이 문제이다. 이를 해결하기 위하여 독소루비신(Doxorubicine)과 같은 임상허가를 받은 안전한 항암제는 안정한 대신 약효가 낮아서 100~1,000배 이상의 높은 독성을 가지는(Highly toxic agents)를 항체에 결합하는 drug으로 선택을 한다.
압타머(Aptamer)
압타머(Aptamer)는 항체(Antibody)와 비슷한 성질로 암 등의 질병을 일으키는 바이오마크(Biomark)에 매우 선택적으로 결합함으로써 진단이나 표적치료가 가능한 DNA 또는 RNA oligonucleotide이다. 즉, 압타머(Aptamer)는 표적물질에 따라 독특한 3차원 구조(3-dimensional structures)를 가지며, 이러한 3차원 구조가 표지단백질(암유발단백질, 바이오마크)에 매우 선택적으로 강하게 결합하여 표적치료, 개인별 맞춤진단 또는 미사일 요법 치료가 가능한 새로운 Bio-capturing 물질이다.
압타머(Aptamer)와 항체(Antibody) 비교
표적치료제로 가장 성공적인 것이 항체로 현재 30종의 항체 표적치료제가 FDA 승인을 받아 시판 중이며 임상단계로 300여 종이 진행 중이다. 하지만, 그 개발 비용이 너무 비싸고 포화상태로 이미 선진 제약사들은 새로운 치료제의 개발로 전환 중이다.
항체(antibody)는 protein으로 이루어져 있어서 생체 내에서 만들어야 하는 등 아직은 어려움이 있지만 압타머는 시험관에서 항체보다 빨리 lead compound를 발굴하고 쉽게 합성과 변형이 가능하여 "Chemical Antibody"로 불리우는 새로운 bio-capturing reagent로 기대되고 있다.
압타머 치료제 개발 경향
Eyetech사에서 2006년 최초의압타머 치료제 Macugen을 FDA 허가를 받아 Pfizer에 라이센싱하여 시판 시작. Macugen은 노안으로 인한 실명의 원인인 황반변성(AMD, Age-related Macular Degeneration) 치료제로 그 원인이 VEGF(혈관내피성장인자)로 인한 비정상적인 혈관을 성장하는데 이 VEGF(혈관내피성장인자)를 억제하는 작용으로 치료효과를 나타낸다. 그 후 압타머의 치료제로의 가능성이 높아지자 Merck Serono, Takeda, Pfizer, Elan, Eli Lilly, GlaxoSmithKline, Ribomic 등이 압타머 신약개발에 뛰어 들어 현재 임상 중인 압타머가 약 10여종이 된다.
압타머 또한 "화학적 항체(chemically antibody)"로 불리울 만큼 항체에 비하여 더 높은 타겟 결합력 및 선택성을 가지며 생물학적이 항체에 비하여 화학합성적인 방법으로 생산됨으로 Drug을 붙이는 데 더 효율적이며 QC가 매우 간단하다는 이점을 가진다. 항체의 낮은 타겟 도달율을 압타머를 가지고서 해결할 수 있으면 기존의 ADC(Antibody-Drug 콘쥬게이트)의 낮은 효율성을 극복이 가능하리라 여겨진다.
Aptamer-Drug 콘쥬게이트 또한 새로운 치료제 영역으로 그 가능성이 기대되나 치료제로의 개발을 위한 연구는 아직 초기단계이다. 최근에 플로리다 대학의 Weihong Tangroup에서aptamer(Sgc8c)에 doxorubicin (Dox) 항암제를 결합한 Aptamer-Drug 콘쥬게이트(Sgc8c-Dox 콘쥬게이트)를 만들어 Doxorubicin과 항암효과를 비교하였으나 별 차이가 없었다. 이는 Sgc8c-Dox 콘쥬게이트를 합성하면서 naked aptamer인 Sgc8c와의 분리/정제가 힘들어 높은 순도의 Sgc8c-Dox 콘쥬게이트를 얻지를 못하였고, Sgc8c-Dox 콘쥬게이트와 독소루비신 모두 비슷한 세포 독성 효과(20%)를 보여 주었다.
GRO 압타머
GRO(Guanine-Rich Oligonucleotide) aptamer는 199년 Louisville 대학의 Paula J. Bates 교수가 처음 합성하여 암환자에서 많이 발현되는 뉴클레오린 단백질에 특이적으로 결합하는 기전을 밝힘으로써 항암제 치료제 개발에 대한 가능성을 제시하였다. 현재 GRO aptamer 중에 하나로 Antisoma(영)에서 AS1411이란 코드로 신장 및 비소세포암(AML) 치료제로 개발 중이며 비소세포암(AML)에 대하여는 최근에 임상2상을 마쳤다.
일반적으로 압타머는 생체 내에서 매우 불안정하여 nuclease residence를 높이거나 생체 내에서의 circulation time을 높이기 위하여 압타머의 3'위치에idT(invert dT) 를 5' 위치에 PEGylation 한 압타머제제(PEG-aptamer-idT)를 임상에서 사용한다.
GRO 압타머는 G-quardruplex라는 독특한 구조를 이루어 매우 안정하며 암세포에 많이 발현되는 뉴클레오린에 특이적으로 결합한다. 즉, GRO 압타머는 nucleus, cytoplasma 및 membrane에 있는 뉴클레오린의 molecular interactions와 function을 방해함으로써 뉴클레오린 발현을 억제하여 antiproliferative effect로 인하여 종양억제 단백질인 p53의 발현을 촉진하게 함으로서 암세포의 괴사를 유발시킨다.
AS1411은 현재 (영)Antisoma에서 비소세포암과 신장암에 대한 임상 2상을 마치고 임상 3상에의 진입을 앞두고 있는 GRO aptamer로 거의 모든 암에서 발현되는 뉴클레오린에 특이적으로 결합하여 다양한 암에 대하여 항암효과를 가지고 있는 매우 안정한 압타머이다.
기존연구의 문제점 및 전망 : 현재 Antisoma(영)에서 anti-뉴클레오린 aptamer 약물로 개발 중인 AS1411은 ggtggtggtggttgtggtggtggtg염기서열을 가지는 GRO DNA aptamer로 현재 신장 및 비소세포폐암 치료제로 임상 2상을 성공적으로 마쳤으나 약효검증에서의 불확실성으로 인하여 Antisoma(영)가 비소세포암에 대하여 임상 3상을 더 이상 진행하지를 않고 Advanced Cancer Therapeutics Inc.에 이전하여 ACT-GRO-777(renamed AS1411)로 임상 3상을 준비 중이다.
현재 개발되어 임상에 사용중인 GRO aptamer를 비롯한 올리고 약물은 생체 내에서 혈장에 대량으로 존재하는 nuclease 분해 효소에 매우 빨리 분해된다. 특히 주사에 의한 치료제의 경우, 화학적으로 안정하게 처리되지 않을 경우 더 빨리 파괴된다고 알려져 있다. 이러한 분해 속도를 조절하기 위하여 올리고 뉴클레오타이드를 화학적으로 변화시키거나, 또는 적절한 운반체와 결합한 복합체를 형성함으로써 파괴 속도를 감소시킬 수 있다. Nuclease에 저항하기 위한 ribose 2'-OH를 2'F나 2'OMe 기로 치환하거나, phospho backbone을 PO에서 PS로 변화시키는 등의 다양한 화학적 변경은 antisense나 siRNA 등의 응용에 성공적으로 사용되어 왔다. 2004년 FDA로부터 허가받아 시판중인 최초의 압타머 치료제인 Macugen 또한 압타머 발굴 후 최적화를 하였다.
GRO aptamer 또한 뉴클레오린 targeting의 특이성(specificity)이 치료효과를 높이는데 매우 중요하며 뉴클레오린 단백질이 아닌 다른 단백질에 결합하여 약효를 감소시키는 “Off-target 효과”를 최소화할 필요가 있다. 최근에 Antisoma(영)가 최초의 GRO aptamer 치료제로 AS1411의 비소세포암(AML)에 대한 임상 2상을 마치고 임상 3상을 쉽게 들어가지 못하는 이유가 부작용이나 독성의 원인보다는 투여량이 많고 최적의 항암 효과를 보이지를 않는다는 단점이라고 여겨진다.
이에 본 발명자들은 AS1411에 Drug을 성공적으로 콘쥬게이션(conjugation) 시켜 AS1411-약물 콘쥬게이트를 합성하였고, AS1411의 암세포에 과다 발현된 뉴클레오린에 대한 타겟팅 능력과 암세포에만 전달되어 붙어 있는 약물만 단독으로 사용할 때보다 AS1411-Drug 콘쥬게이트가 in vitro 및 in vivo에서의 암표적 치료가 더 효과적임을 확인하였다.
본 발명의 암 표적 치료제는 다음과 같은 Drug(R)-linker(L)-AS1411 구조를 가진다.
Figure PCTKR2017014060-appb-I000001
약물이 연결되는 위치는 12와 13 위치 혹은 12나 13 위치가 특히 바람직하다.
Figure PCTKR2017014060-appb-I000002
Figure PCTKR2017014060-appb-I000003
여기에서 사용되는 약물인 R은 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE), 모노메틸 오리스타틴 F(MMAF), 시타라빈, 젬시타빈, 메이탄시네, DM1, DM4, 칼리키아미신 및 그 유도체들, 독소루비신, 듀오카르마이신 및 그 유도체들, 피롤로벤조디아제핀(PBD), SN-38, α-아만틴, 투불루신 유사체(Tubulysin analog) 등이 바람직하다.
Figure PCTKR2017014060-appb-I000004
MMAE
Figure PCTKR2017014060-appb-I000005
MMAF
Figure PCTKR2017014060-appb-I000006
MMAD
Figure PCTKR2017014060-appb-I000007
Auristatin E
Figure PCTKR2017014060-appb-I000008
Auristatin F
Figure PCTKR2017014060-appb-I000009
DM1
Figure PCTKR2017014060-appb-I000010
DM4
Figure PCTKR2017014060-appb-I000011
네모루비신(Nemorubicin)
Figure PCTKR2017014060-appb-I000012
PNU-159682
Figure PCTKR2017014060-appb-I000013
투불루신 M
Figure PCTKR2017014060-appb-I000014
칼리키아미신
Figure PCTKR2017014060-appb-I000015
아실화된 칼리키아미신
Figure PCTKR2017014060-appb-I000016
탈토불린
상기 식에서 L은 X-Y로 구성되고[R-Y-X-AS1411],
Y는, 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤조일옥시카르보닐(MC-Val-Cit-PAB), 히드라존, 펩티드, 디설파이드, 티오에테르, 발린-시트룰린, N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카르복실래이트 (MCC), 말레이미도카프로일, 머캅토아세트아미도카프로일, N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오) 펜타노에이트(SPP), SMCC, 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실래이트(SMCC), N- 숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트(SPDB), 포스포디에스테르 결합, 및 뉴클레오타이드로 이루어지는 그룹으로부터 선택되며,
X는, 5'-티올-개질제 C6, 티올-개질제 C6 S-S, 디티올 세리놀, PC 아미노-개질제, 5'-아미노-개질제 C3, 5'-아미노-개질제 C6, 5'-아미노-개질제 C12, 5'-아미노-개질제 TEG, 아미노-개질제 C2 dT, 아미노-개질제 C6 dT, S-Bz- 티올-개질제 C6-dT, 포스포디에스테르 결합, 및 뉴클레오타이드 로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 AS1411-약물 콘쥬게이트는 약물만 단독으로 사용할 때보다 in vitro 및 in vivo에서의 암표적 치료에 더욱 효과적이다.
도 1은 HS-C6-T3-AS1411와 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411의 Gel run data 및 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411의 ESI-MS.
도 2는 HS-C6-T3-CRO와 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-CRO의 Gel run data 및 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-CRO의 ESI-MS.
도 3은 12,13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)2-AS1411의 ESI-MS.
도 4는 12 또는 13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-AS1411의 ESI-MS.
도 5는 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411와 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-CRO의 A549 세포주에 대한 MTT assay 결과.
도 6은 시트라빈-(GLFG-MC-S-C6)-T3-AS1411과 시트라빈-(GLFG-MC-S-C6)-T3-CRO 의 Mv4-11 세포주에 대한 MTT assay 결과.
도 7은 A549 폐암 세포주 주입 마우스에 대하여 치료 전 시행한 FDG PET 영상(좌측 허벅지 부위에 FDG섭취를 가진 종양이 관찰됨).
도 8은 A549 폐암 세포주 주입 마우스에 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411 치료 30일 후 얻은 FDG PET영상(종양의 FDG섭취가 감소함을 확인함).
도 9는 A549 폐암 세포주 주입 마우스에 대하여 치료 전 시행한 FDG PET 영상(좌측 허벅지 부위에 FDG섭취를 가진 종양이 관찰됨).
도 10은 A549 폐암 세포주 주입 마우스에 대하여 MMAE 치료 30일 후 얻은 FDG PET영상(종양의 FDG섭취가 증가하였음을 확인함).
도 11은 A549 종양 모델에서 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411와 MMAE 치료 후 측정한 종양의 크기 비교.
도 12는 A549 종양 모델에서 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411와 MMAE 치료 후 30일에 적출한 종양의 크기 비교.
도 13은 Mv4-11 AML 세포주 주입 마우스에 대하여 치료 전 시행한 FDG PET 영상(좌측 허벅지 부위에 FDG섭취를 가진 종양이 관찰됨).
도 14는 Mv4-11 AML 세포주 주입 마우스에 대하여 시트라빈-(GLFG-MC-S-C6)-T3-AS1411 치료 30일 후 얻은 FDG PET영상(종양의 FDG섭취가 감소함을 확인함).
도 15는 Mv4-11 AML 세포주 주입 마우스에 대하여 치료 전 시행한 FDG PET 영상(좌측 허벅지 부위에 FDG섭취를 가진 종양이 관찰됨).
도 16은 Mv4-11 AML 세포주 주입 마우스에 대하여 MMAE 치료 30일 후 얻은 FDG PET영상(종양의 FDG섭취가 증가하였음을 확인함).
도 17은 농도별 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411, 12 또는 13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-AS1411 및 12,13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)2-AS1411의 A549 cell viability.
도 18은 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411, 12 또는 13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-AS1411 및 12,13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)2-AS1411의 A549 세포주에 대한 MTT assay 결과.
이하 본 발명을 실시 예를 통해 더욱 상세하게 설명한다.
[ GRO Aptamer ]-Drug 콘쥬게이트 합성
실시예 1.
MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411 [AS1411-MMAE 콘쥬게이트] 합성
말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤조일옥시카르보닐 모노메틸 오리스타틴 E [MC-Val-Cit-PAB-MMAE]에 HS-C6-tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg [HS-C6-T3-AS141]를 반응시켜 모노메틸 오리스타틴 E-p- 아미노벤조일옥시카르보닐 -시트룰린-발린-Mal-S-C6- tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg [MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411]를 합성하였다. 즉 RSS-C6-tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg [RSS-C6-T3-AS141])을 DTT 존재 하에 약 3시간 환원 반응 후 남아있는 DTT를 원심분리기를 통해 제거하고, SB17 완충액으로 교환하여 HS-C6-tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg [HS-C6-T3-AS141]를 얻었다. 소량의 DMSO에 녹인 MC-Val-Cit-PAB-MMAE를 넣어주고 밤새도록 흔들어주었다. 역상 HPLC(Waters-Xbridge OST C18 10X50mm, 65, TEAE/CAN buffer)를 통하여 분리/정제하였다.
Figure PCTKR2017014060-appb-I000017
MC-Val-Cit-PAB-MMAE와 HS-C6-T3-AS1411의 반응으로 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411의 합성
Gel run으로 HS-C6-T3-AS1411로부터 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411의 합성을 확인하였고 ESI-MS를 통하여 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411분자량을 확인하였다(도 1). C364H479N120O202P29S [Cal. MW = 10697.69, Obs. MW = 10697.0]
실시예 2.
MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-CRO 합성
말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤조일옥시카르보닐 모노메틸 오리스타틴 E [MC-Val-Cit-PAB-MMAE]에 HS-C6-tttcctcctcctccttctcctcctcctcc [HS-C6-T3-CRO]를 반응시켜 모노메틸 오리스타틴 E-p- 아미노벤조일옥시카르보닐 -시트룰린-발린-Mal-S-C6-ttt cctcctcctccttctcctcctcctcc [MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-CRO]를 합성하였다. 즉 RSS-C6-tttcctcctcctccttctcctcctcctcc [RSS-C6-T3-CRO)을 DTT 존재 하에 약 3시간 환원 반응 후 남아있는 DTT를 원심분리기를 통해 제거하고, SB17 완충액으로 교환 HS-C6-tttcctcctcctccttctcctcctcctcc [HS-C6-T3-CRO]를 얻었다. 소량의 DMSO에 녹인 MC-Val-Cit-PAB-MMAE를 넣어주고 밤새도록 흔들어주었다. 역상 HPLC(Waters-Xbridge OST C18 10X50mm, 65, TEAE/CAN buffer)를 통하여 분리/정제하였다.
Figure PCTKR2017014060-appb-I000018
MC-Val-Cit-PAB-MMAE와 HS-C6-T3-CRO의 반응으로 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-CRO의 합성
Gel run으로 HS-C6-T3-CRO로부터 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-CRO의 합성을 확인하였고 ESI-MS를 통하여 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-CRO분자량을 확인하였다(도 2). C347H479N86O202P29S [Cal. MW = 10018.03, Obs. MW = 10017.28]
실시예 3.
12,13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)2-AS1411 및 12 또는 13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-AS1411의 합성
말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤조일옥시카르보닐 모노메틸 오리스타틴 E [MC-Val-Cit-PAB-MMAE]에 ggtggtggtggu[5-N-(6-(3-티오프로파노일)-아미노헥실)-3-아크릴아미도]u[5-N-(6-(3-티오프로파노일)-아미노헥실)-3-아크릴아미도]gtggtggtggtgg [12,13-(HS-C6)2-AS1411]를 반응시켜 ggtggtggtggu[5-N-(6-(3-모노메틸 오리스타틴-p-아미노벤조일옥시카르보닐-시트룰린-발린-Mal-티오프로파노일)-아미노헥실)-3-아크릴아미도]u[5-N-(6-(3-모노메틸 오리스타틴-p-아미노벤조일옥시카르보닐-시트룰린-발린-Mal-티오프로파노일)-아미노헥실)-3-아크릴아미도]gtggtggtggtgg [12,13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)2-AS1411] 및 ggtggtggtggu[5-N-(6-(3-모노메틸 오리스타틴-p-아미노벤조일옥시카르보닐-시트룰린-발린-Mal-티오프로파노일)-아미노헥실)-3-아크릴아미도]ugtggtggtggtgg] [12 또는 13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-AS1411]를 합성하였다. 즉, ggtggtggtggu[5-N-(6-(3-benzoyl티오프로파노일)-아미노헥실)-3-아크릴아미도]u[5-N-(6-(3-benzoyl티오프로파노일)-아미노헥실)-3-아크릴아미도] gtggtggtggtgg[12,13-(Bz-S-C6)2-AS1411]을 DTT 존재 하에 약 3시간 환원 반응 후 남아있는 DTT를 원심분리기를 통해 제거하고, SB17 완충액으로 교환하여 ggtggtggtggu[5-N-(6-(3-티오프로파노일)-아미노헥실)-3-아크릴아미도]u[5-N-(6-(3-티오프로파노일)-아미노헥실)-3-아크릴아미도]gtggtggtggtgg [12,13-(HS-C6)2-AS1411]를 얻었다. 소량의 DMSO에 녹인 MC-Val-Cit-PAB-MMAE를 널어주고 밤새도록 흔들어주었다. 역상 HPLC(Waters-Xbridge OST C18 10X50mm, 65, TEAE/CAN buffer)를 통하여 정제하여 12,13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)2-AS1411 및 12 또는 13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-AS1411를 얻었다.
Figure PCTKR2017014060-appb-I000019
MC-Val-Cit-PAB-MMAE와 12,13-(HS-C6)2-AS1411의 반응으로 12,13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)2-AS1411 및 12 또는 13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-AS1411의 합성
ESI-MS를 통하여 12,13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)2-AS1411 및 12 또는r 13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-AS1411분자량을 확인하였다(도 3 및 도 4). 12,13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)2-AS1411, C418H568N129O197P25S2 [Cal. MW = 11390.21, Obs. MW = 11390.0], 12 또는 13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-AS1411, C350H463N118O182P25S2 [Cal. MW = 10073.58, Obs. MW = 10073.0]
실시예 4.
시트라빈-(GLFG-MC-S-C6)-T3-AS1411 콘쥬게이트 합성
말레이미도카프로일-(Gly-Phe-Leu-Gly)-시트라빈 [MC-GFLG-시트라빈]에 HS-C6-tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg[HS-C6-T3-AS1411]를 반응시켜 시트라빈-(Gly-Leu-Phe-Gly)-Mal-S-C6-tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg [시트라빈-(GLFG-MC-S-C6)-T3-AS1411]를 합성하였다. 즉 RSS-C6-tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg [RSS-C6-T3-AS141])을 DTT 존재 하에 약 3시간 환원 반응 후 남아있는 DTT를 원심분리기를 통해 제거하고, SB17 완충액으로 교환하였다. 소량의 DMSO에 녹인 Mal-GPLG-시트라빈을 널어주고 밤새도록 흔들어주었다. 역상 HPLC(Waters-Xbridge OST C18 10X50mm, 65,TEAE/CAN buffer)를 통하여 정제하여 시트라빈-(GLFG-MC-S-C6)-T3-AS1411를 얻었다. ESI-MS를 통하여 시트라빈-(GLFG-MC-S-C6)-T3-AS1411의 분자량을 확인하였다. C334H424N117O199P29S [Cal. MW = 10191.91, Obs. MW = 10190.88]
Figure PCTKR2017014060-appb-I000020
C-GFLG-시트라빈과 HS-C6-T3-AS1411의 반응으로 시트라빈-(GLFG-MC-S-C6)-T3-AS1411의 합성
실시예 5.
12,13-(시트라빈-GLFG-MC-S-C6)2-AS1411 콘쥬게이트 및 12 또는 13-(시트라빈-GLFG-MC-S-C6)-AS1411 콘쥬게이트의 합성
말레이미도카프로일-(Gly-Phe-Leu-Gly)- 시트라빈 [MC-GFLG-시트라빈]에 ggtggtggtggu[5-N-(6-(3-티오프로파노일)-아미노헥실)-3-아크릴아미도]u[5-N-(6-(3-티오프로파노일)-아미노헥실)-3-아크릴아미도]gtggtggtggtgg [12,13-(HS-C6)2-AS1411]를 반응시켜 ggtggtggtggu[시트라빈-Gly-Leu-Phe-Gly-Mal-티오프로파노일)-아미노헥실)-3-아크릴아미도]u[시트라빈-Gly-Leu-Phe-Gly-Mal-티오프로파노일)-아미노헥실)-3-아크릴아미도] gtggtggtggtgg [12,13-(시트라빈-GLFG-MC-S-C6)2-AS1411] 및 ggtggtggtggu[시트라빈-Gly-Leu-Phe-Gly-Mal-티오프로파노일)-아미노헥실)-3-아크릴아미도]ugtggtggtggtgg] [12 또는 13-(시트라빈-GLFG-MC-S-C6)-AS1411]를 합성하였다. 즉, ggtggtggtggu[5-N-(6-(3-benzoyl티오프로파노일)-아미노헥실)-3-아크릴아미도]u[5-N-(6-(3-benzoyl티오프로파노일)-아미노헥실)-3-아크릴아미도]gtggtggtggtgg [12,13-(Bz-S-C6)2-AS1411]을 DTT 존재 하에 약 3시간 환원 반응 후 남아있는 DTT를 원심분리기를 통해 제거하고, SB17 완충액으로 교환하여 ggtggtggtggu[5-N-(6-(3-티오프로파노일)-아미노헥실)-3-아크릴아미도]u[5-N-(6-(3-티오프로파노일)-아미노헥실)-3-아크릴아미도]gtggtggtggtgg [12,13-(HS-C6)2-AS1411]를 얻었다. 소량의 DMSO에 녹인 MC-GFLG-시트라빈을 넣어주고 밤새도록 흔들어주었다. 역상 HPLC(Waters-Xbridge OST C18 10X50mm, 65, TEAE/CAN buffer)를 통하여 정제하여 12,13-(시트라빈-GLFG-MC-S-C6)2-AS1411 및 12 또는 13-(시트라빈-GLFG-MC-S-C6)-AS1411를 얻었다. ESI-MS를 통하여 각각의 분자량을 확인하였다. 12,13-(시트라빈-GLFG-MC-S-C6)2-AS1411, C358H458N123O191P25S2 [Cal. MW = 10378,66 Obs. MW = 10379.23], 12 또는 13-(시트라빈-GLFG-MC-S-C6)-AS1411, C320H408N115O179P25S2 [Cal. MW = 9567.81, Obs. MW = 9568.09]
Figure PCTKR2017014060-appb-I000021
MC-GFLG-시트라빈과 12,13-(HS-C6)2-AS1411의 반응으로 12,13-(시트라빈-GLFG-MC-S-C6)2-AS1411 및 12 또는 13-(시트라빈-GLFG-MC-S-C6)-AS1411의 합성
실시예 6.
In vitro 효능검증
MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411 및 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-CRO의 A549 세포주에 대한 MTT assay
뉴클레오린 단백질이 과발현된 폐암 세포주인 A549 세포주에서 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411의 cell inhibition 효능검증을 MTT assay를 통해 in vitro에서 확인하였다. MMAE, AS1411, MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411와 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-CRO의 MTT assay를 통한 세포의 cell viability와 proliferation을 비교 시 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411가 MMAE와 거의 비슷한 효능을 보임을 확인하였다. A549 cell (ATCC, IMDM+10%FBS)은 적정세포농도를 결정하는 cell test를 통해 정해진 cell number 2.5~5X105 개/well를 96well plate에 seeding후 하루를 키웠다. MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411와 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-CRO는 95℃에서 5분간 heating하여 상온에서 천천히 냉각 후 농도 별로 각 well에 바로 처리하였다. 처리된 A549 cell은 5% CO2 incubator에서 72h동안 incubation시킨 후 MTT assay용 reagent solution (Cell Proliferation kitⅡ, Roche)을 20uL씩 처리하고 시간별 (10min, 30min, 1hr)로 incubation후 ELISA reader기로 490nm 흡광도를 측정하였다(도 5).
실시예 7.
시트라빈-(GLFG-MC-S-C6)-T3-AS1411 및 시트라빈-(GLFG-MC-S-C6)-T3-CRO의 Mv4-11 세포주에 대한 MTT assay
뉴클레오린 단백질이 과발현된 폐암 세포주인 Mv4-11 세포주에서 시트라빈-(GLFG-MC-S-C6)-T3-AS1411의 cell inhibition 효능검증을 MTT assay를 통해 in vitro에서 확인하였다. 시트라빈, AS1411, 시트라빈-(GLFG-MC-S-C6)-T3-AS1411 및 시트라빈-(GLFG-MC-S-C6)-T3-CRO의 MTT assay를 통한 세포의 cell viability와 proliferation을 비교 시 시트라빈-(GLFG-MC-S-C6)-T3-AS1411 콘쥬게이트가 시트라빈과 거의 비슷한 효능을 보임을 확인하였다. Mv4-11 cell (ATCC, IMDM+10%FBS)은 적정세포농도를 결정하는 cell test를 통해 정해진 cell number 2.5~5X105 개/well를 96well plate에 seeding후 하루를 키웠다. 시트라빈-(GLFG-MC-S-C6)-T3-AS1411과 시트라빈-(GLFG-MC-S-C6)-T3-CRO는 95℃에서 5분간 heating하여 상온에서 천천히 cooling후 농도 별로 각 well에 바로 처리하였다. 처리된 A549 cell은 5% CO2 incubator에서 72h동안 incubation시킨 후 MTT assay용 reagent solution (Cell Proliferation kitⅡ, Roche)을 20uL씩 처리하고 시간별 (10min, 30min, 1hr)로 incubation후 ELISA reader기로 490nm 흡광도를 측정하였다(도 6).
실시예 8.
In vivo 효능 검증
MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411의 A549 폐암 세포주 주입 마우스에 대하여 in vivo 치료 효능 검증
A549 폐암 세포주 주입 마우스에 대하여 IV injection으로 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411와 MMAE를 각각 30일 동안 투여한 후 PET image로 tumor size를 확인하였다. A549 폐암 세포 6.1x10^6 cell/ml를 누드마우스 오른쪽 허벅지에 피하로 주입하였다. 주사 후 3~4주에 종양의 크기를 측정하여, 지름 0.8cm 에 달하였을 때 치료 전 microPET 촬영을 하였다. PET영상을 위하여 F-18 FDG 0.2mCi를 복강 내에 주사한 후 영상을 얻었다. (Siemens Inveon) 영상에서 종양의 FDG 섭취를 확인한 후, 실험군 5마리 마우스에서 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411를 5일 간격으로 4회 정맥 주사하였다(7.5mg/kg, 0.5mg/kg of MMAE). 치료 시작 30일 후에 치료전과 동일한 방법으로 microPET을 촬영하였다. A549 폐암 세포주 주입 마우스에 대하여 IV injection으로 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411를 30일 동안 투여한 후 PET image 확인하였을 때 종양의 FDG섭취가 현저하게 감소함을 확인하였다(도 7 및 도 8).
실시예 9.
MMAE의 A549 폐암 세포주 주입 마우스에 대하여 in vivo 치료 효능 검증
A549 폐암 세포주 주입 마우스에 대하여 IV injection으로 MMAE를 30일 동안 투여한 후 PET image확인하였다. A549 폐암 세포 6.1x10^6 cell/ml를 누드마우스 오른쪽 허벅지에 피하로 주입하였다. 주사 후 3~4주에 종양의 크기를 측정하여, 지름 0.8cm에 달하였을 때 치료 전 microPET 촬영을 하였다. PET영상을 위하여 F-18 FDG 0.2mCi를 복강 내에 주사한 후 영상을 얻었다. (Siemens Inveon) 치료 전 영상에서 종양의 FDG 섭취를 확인한 후, 5마리 마우스에서 MMAE를 5일 간격으로 4회 정맥 주사하였다.(0.5mg/kg) 치료 시작 30일 후에 치료전과 동일한 방법으로 microPET을 촬영하였다. MMAE 치료 전과 비교 시 치료 후에도 FDG PET 영상에서 종양의 FDG섭취가 증가하였음을 확인하였다(도 9 및 도 10).
실시예 10.
Ex- vivo 검증
A549 폐암 세포주 주입 마우스서MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411가 MMAE 단독으로 투여했을 때 보다 암억제 효능이 월등함을 보인다. MMAE 단독투여에 비하여 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411가 80% 더 암을 억제함을 확인하였다. 치료 시작 후 5일 간격으로 종양의 크기를 가로세로축으로 측정하고 치료 시작한 지 30일이 지난 후 각 그룹들의 종양을 적출하였다. 아래의 사진과 같이 그룹별로 나누어 촬영하여 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411와 MMAE 의 종양 크기를 비교하였다(도 11 및 도 12).
MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411와 MMAE의 폐암 (A549 cell line)에 대한 in vivo 효능 검증 결과 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411가 MMAE 단독 투여에 비해 효능이 월등함을 확인하였다
실시예 11.
In vivo 효능 검증
시트라빈-(GLFG-MC-S-C6)-T3-AS1411의 Mv4-11 AML 세포주 주입 마우스에 대하여 in vivo 치료 효능 검증
Mv4-11 AML 세포주 주입 마우스에 대하여 IV injection으로 시트라빈-(GLFG-MC-S-C6)-T3-AS1411와 MMAE를 각각 30일 동안 투여한 후 PET image로 tumor size를 확인하였다. Mv4-11 AML 세포 6.1x10^6 cell/ml를 누드마우스 오른쪽 허벅지에 피하로 주입하였다. 주사 후 3~4주에 종양의 크기를 측정하여, 지름 0.8cm 에 달하였을 때 치료 전 microPET 촬영을 하였다. PET영상을 위하여 F-18 FDG 0.2mCi를 복강 내에 주사한 후 영상을 얻었다. (Siemens Inveon)영상에서 종양의 FDG 섭취를 확인한 후, 실험군 5마리 마우스에서 시트라빈-(GLFG-MC-S-C6)-T3-AS1411를 5일 간격으로 4회 정맥 주사하였다(7.5mg/kg, 0.5mg/kg of MMAE). 치료 시작 30일 후에 치료전과 동일한 방법으로 microPET을 촬영하였다(도 13, 도 14)
실시예 12.
MMAE의 Mv4 -11 AML 세포주 주입 마우스에 대하여 in vivo 치료 효능 검증
Mv4-11 AML 세포주 주입 마우스에 대하여 IV injection으로 MMAE를 30일 동안 투여한 후 PET image확인하였다. Mv4-11 AML 세포 6.1x10^6 cell/ml를 누드마우스 오른쪽 허벅지에 피하로 주입하였다. 주사 후 3~4주에 종양의 크기를 측정하여, 지름 0.8cm에 달하였을 때 치료 전 microPET 촬영을 하였다. PET영상을 위하여 F-18 FDG 0.2mCi를 복강 내에 주사한 후 영상을 얻었다. (Siemens Inveon) 치료 전 영상에서 종양의 FDG 섭취를 확인한 후, 5마리 마우스에서 MMAE를 5일 간격으로 4회 정맥 주사하였다. (0.5mg/kg) 치료 시작 30일 후에 치료전과 동일한 방법으로 microPET을 촬영하였다. MMAE 치료 전과 비교 시 치료 후에도 FDG PET 영상에서 종양의 FDG섭취가 증가하였음을 확인하였다(도 15, 도 16)
실시예 13.
In vitro 효능검증
A549 세포주에 대한 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411, 12 또는 13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-AS1411 및 12,13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)2-AS1411의 MTT assay
뉴클레오린 단백질이 과발현된 폐암 세포주인 A549 세포주에서 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411, 12 또는 13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-AS1411 및 12,13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)2-AS1411의 cell inhibition 효능검증을 MTT assay를 통해 in vitro에서 확인하였다. MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411, 12 또는 13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-AS1411 및 12,13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)2-AS1411의 MTT assay를 통한 세포의 cell viability와 proliferation을 비교 시 12,13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)2-AS1411가 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411보다 월등한 효능을 보임을 확인하였다. A549 cell (ATCC, IMDM+10%FBS)은 적정세포농도를 결정하는 cell test를 통해 정해진 cell number 2.5~5X105 개/well를 96well plate에 seeding후 하루를 키웠다. MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411, 12 또는 13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-AS1411 및 12,13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)2-AS1411은 95℃에서 5분간 heating하여 상온에서 천천히 cooling후 농도 별로 각 well에 바로 처리하였다. 처리된 A549 cell은 5% CO2 incubator에서 72h동안 incubation시킨 후 MTT assay용 reagent solution (Cell Proliferation kitⅡ, Roche)을 20uL씩 처리하고 시간별 (10min, 30min, 1hr)로 배양 후 ELISA reader기로 490nm 흡광도를 측정하였다(도 17). 도 17에서 A, B, C,D는 다음과 같다.
MMAE-Linker-Aptamer 콘쥬게이트
A MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-CRO
B MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411
C 12 또는 13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-AS1411
D 12,13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)2-AS1411
도 18은 MMAE-(PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-T3-AS1411, 12 또는 13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)-AS1411 및 12,13-(MMAE-PAB-Cit-Val-MC-S-C6)2-AS1411의 A549 세포주에 대한 MTT assay 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 AS1411-약물 콘쥬게이트는 암표적 치료제로 유용하게 사용 가능하다.

Claims (4)

  1. 약물-링커-AS1411 구조를 포함하는 암 표적 치료제.
  2. 제 1항에 있어서, 약물은 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE), 모노메틸 오리스타틴 F(MMAF), 시타라빈, 젬시타빈, 메이탄시네, DM1, DM4, 칼리키아미신 및 그 유도체, 독소루비신, 듀오카르마이신 및 그 유도체, 피롤로벤조디아제핀(PBD), SN-38, α-아만틴, 및 투불루신 유사체(Tubulysin analog)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 표적 치료제.
  3. 제 1항에 있어서, 링커는 X-Y로 구성되고,
    여기에서 Y는, 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤조일옥시카르보닐(MC-Val-Cit-PAB), 히드라존, 펩티드, 디설파이드, 티오에테르, 발린-시트룰린, N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카르복실래이트 (MCC), 말레이미도카프로일, 머캅토아세트아미도카프로일, N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오) 펜타노에이트(SPP), SMCC, 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실래이트(SMCC), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트(SPDB), 포스포디에스테르 결합, 및 뉴클레오타이드로 이루어지는 그룹으로부터 선택되며,
    X는, 5'-티올-개질제 C6, 티올-개질제 C6 S-S, 디티올 세리놀, PC 아미노-개질제, 5'-아미노-개질제 C3, 5'-아미노-개질제 C6, 5'-아미노-개질제 C12, 5'-아미노-개질제 TEG, 아미노-개질제 C2 dT, 아미노-개질제 C6 dT, S-Bz- 티올-개질제 C6-dT, 포스포디에스테르 결합, 및 뉴클레오타이드로 이루어지는 그룹으로부터 선택 선택되는 것을 특징으로 하는 암 표적 치료제.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 링커는 AS1411의 12 또는 13 위치, 또는 12와 13 위치 양쪽에 연결되는 것을 특징으로 하는 암 표적 치료제.
PCT/KR2017/014060 2016-12-26 2017-12-04 압타머-약물 콘쥬게이트 및 그 용도 WO2018124512A2 (ko)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17887935.9A EP3560517A4 (en) 2016-12-26 2017-12-04 APTAMER INGREDIENT CONJUGATE AND USE OF IT
US16/473,771 US11458120B2 (en) 2016-12-26 2017-12-04 Aptamer-drug conjugate and use thereof
JP2019555545A JP7067802B2 (ja) 2016-12-26 2017-12-04 アプタマー－薬物コンジュゲート及びその用途
CN201780080822.7A CN110167597A (zh) 2016-12-26 2017-12-04 适配体-药物缀合物及其用途
AU2017389094A AU2017389094B2 (en) 2016-12-26 2017-12-04 Aptamer-drug conjugate and use thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2016-0179111 2016-12-26
KR1020160179111A KR102015524B1 (ko) 2016-12-26 2016-12-26 압타머-약물 콘쥬게이트 및 그 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2018124512A2 true WO2018124512A2 (ko) 2018-07-05
WO2018124512A3 WO2018124512A3 (ko) 2018-08-23

Family

ID=62711062

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2017/014060 WO2018124512A2 (ko) 2016-12-26 2017-12-04 압타머-약물 콘쥬게이트 및 그 용도

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11458120B2 (ko)
EP (1) EP3560517A4 (ko)
JP (1) JP7067802B2 (ko)
KR (1) KR102015524B1 (ko)
CN (1) CN110167597A (ko)
AU (1) AU2017389094B2 (ko)
WO (1) WO2018124512A2 (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020080912A1 (ko) * 2018-10-19 2020-04-23 인터올리고 주식회사 치료 효능을 개선한 핵산 변형체 및 이를 포함하는 항암용 약학 조성물
EP3868774A4 (en) * 2018-10-19 2023-05-10 Interoligo Corporation MODIFIED NUCLEIC ACID WITH IMPROVED TREATMENT EFFICIENCY AND ANTI-CANCER PHARMACEUTICAL COMPOSITION THEREOF
KR20210061293A (ko) * 2019-11-19 2021-05-27 주식회사 바이오이즈 압타머 기반 표적화 복합 항암제
CN113941007A (zh) * 2020-07-16 2022-01-18 成都科岭源医药技术有限公司 一种串联的双药物链接组装单元及其应用
CN114053248B (zh) * 2020-08-10 2023-10-20 复旦大学 一种调控肿瘤代谢的核酸和小分子药物共递送纳米制剂及其制备方法
WO2023113243A1 (ko) * 2021-12-16 2023-06-22 인터올리고 주식회사 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 및 이의 용도
CN115227829B (zh) * 2022-02-22 2023-10-13 成都中医药大学 酸敏感性适配体雷公藤甲素偶联物及应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1984003285A1 (en) * 1983-02-22 1984-08-30 Molecular Biosystems Inc Defined sequence single strand oligonucleotides incorporating reporter groups, process for the chemical synthesis thereof, and nucleosides useful in such synthesis
FR2786398B1 (fr) 1998-11-30 2002-12-27 Synt Em Composition pharmaceutique anti-cancereuse et anti-chimioresistance comprenant un agent anticancereux et au moins un peptide
CA2494105C (en) * 2002-07-31 2013-04-02 Seattle Genetics, Inc. Drug conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
ES2347959T3 (es) 2003-02-20 2010-11-26 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de anticuerpos anti-cd70-farmaco y su uso para el tratamiento del cancer.
US8030475B2 (en) * 2008-05-22 2011-10-04 The Curators Of The University Of Missouri Inhibitors of retroviral reverse transcriptase
US8569252B2 (en) 2009-04-15 2013-10-29 Postech Academy-Industry Foundation Nucleolin specific aptamer and use thereof
CN103269722A (zh) * 2010-09-24 2013-08-28 马林克罗特有限公司 治疗性和/或诊断性纳米载体的靶向的适体缀合物
US9845362B2 (en) 2010-10-08 2017-12-19 The University Of North Carolina At Charlotte Compositions comprising chimeric antigen receptors, T cells comprising the same, and methods of using the same
CN103608042A (zh) 2011-04-26 2014-02-26 雷加多生物科学公司 生产peg化的寡核苷酸的方法
TWI546381B (zh) 2014-05-30 2016-08-21 中央研究院 用以標的黑色素瘤相關抗原a3胜肽之寡核苷酸適體及其用途
EP3164420A4 (en) * 2014-06-30 2018-05-23 Tarveda Therapeutics, Inc. Targeted conjugates and particles and formulations thereof
KR101653451B1 (ko) 2014-09-17 2016-09-01 포항공과대학교 산학협력단 Her-2 표적화 압타머 복합체 및 이의 용도
CN106215191A (zh) * 2016-08-04 2016-12-14 华东师范大学 一种脑胶质瘤靶向递药系统及其制备方法和用途

Also Published As

Publication number Publication date
WO2018124512A3 (ko) 2018-08-23
EP3560517A2 (en) 2019-10-30
US11458120B2 (en) 2022-10-04
JP2020512393A (ja) 2020-04-23
AU2017389094B2 (en) 2023-01-05
EP3560517A4 (en) 2020-08-26
KR102015524B1 (ko) 2019-08-29
JP7067802B2 (ja) 2022-05-16
US20190358202A1 (en) 2019-11-28
CN110167597A (zh) 2019-08-23
KR20180075133A (ko) 2018-07-04
AU2017389094A1 (en) 2019-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018124512A2 (ko) 압타머-약물 콘쥬게이트 및 그 용도
JP3645283B2 (ja) リソゾーム酵素開裂性抗腫瘍剤結合体
TWI813394B (zh) 含三級胺之藥物之標的遞送
JP7257951B2 (ja) 改善された生理化学的特性を有する自己安定性リンカーを用いる薬物コンジュゲート
JP3814294B2 (ja) 親水性分子の脂質化のための方法および組成物
AU2005270336B2 (en) Treatment of hyperproliferative disease with superantigens in combination with another anticancer agent
US7462627B2 (en) Multi-arm polymeric conjugates of 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin for treatment of breast, colorectal, pancreatic, ovarian and lung cancers
WO2016080626A2 (en) Prodrugs activated by caspase
AU2007212201B2 (en) Multi-arm polymeric conjugates of 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin for treatment of breast, colorectal, pancreatic, ovarian and lung cancers
TW201231054A (en) Vitamin-receptor binding drug delivery compounds and conjugates and preparation processes
Batisse et al. A new delivery system for auristatin in STxB-drug conjugate therapy
US5514794A (en) Antibody-drug conjugates
CN106715533A (zh) 聚恶唑啉抗体药物结合物
WO2019078611A1 (ko) Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물
WO2022045433A1 (ko) 디그옥시제닌에 대한 인간화 항체 및 이의 용도
EP4144361A1 (en) Pharmaceutical composition for preventing or treating mucositis induced by radiotherapy, chemotherapy, or combination thereof, comprising glp-2 derivatives or long-acting conjugate of same
WO2021167308A2 (ko) 항암제 프로드러그 컨쥬게이트의 새로운 용도
WO2013176516A1 (ko) 트랜스글루타미나아제를 이용하여 제조한 항체-약물 결합체 및 이의 용도
EP4201431A1 (en) Intermediate for preparing antibody-drug conjugate (adc), preparation method therefor, and use thereof
WO2023204581A1 (ko) 암세포 사멸효과를 가지는 3d 하이드로젤 복합체 및 이의 제조방법
WO2017188653A1 (en) Fusion protein comprising ccl3 variant and use thereof cross-reference to related applications
US20240148883A1 (en) Branched Linkers for Antibody-Drug Conjugates and Methods of Use Thereof
AU2016361668A1 (en) MMP-sensitive taxane prodrug
WO2023204330A1 (ko) Itgb2 매개 약물 전달시스템
US20220211860A1 (en) Peptide derivatives and conjugates thereof for treating cancer

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17887935

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019555545

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017389094

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20171204

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2017887935

Country of ref document: EP