TWI546381B - 用以標的黑色素瘤相關抗原a3胜肽之寡核苷酸適體及其用途 - Google Patents
用以標的黑色素瘤相關抗原a3胜肽之寡核苷酸適體及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI546381B TWI546381B TW104117298A TW104117298A TWI546381B TW I546381 B TWI546381 B TW I546381B TW 104117298 A TW104117298 A TW 104117298A TW 104117298 A TW104117298 A TW 104117298A TW I546381 B TWI546381 B TW I546381B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- cancer
- peptide
- oligonucleotide
- oligonucleotide aptamer
- group
- Prior art date
Links
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 title claims description 126
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 115
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title claims description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 213
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 122
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 77
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 31
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 24
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 22
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 claims description 21
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 claims description 20
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 claims description 19
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 19
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 18
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 claims description 18
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 16
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 14
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 14
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 13
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 13
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 13
- -1 5-(1-pentynyl)-2'-deoxyuridine (5-(1-pentynyl) )-2'-deoxyuridine Chemical compound 0.000 claims description 12
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical group [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 12
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 11
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 10
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 10
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 claims description 10
- 206010062129 Tongue neoplasm Diseases 0.000 claims description 10
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 10
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 10
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 10
- 201000006134 tongue cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 9
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims description 9
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 claims description 8
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 8
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 8
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 7
- WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 6-Mercaptoguanine Natural products N1C(N)=NC(=S)C2=C1N=CN2 WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000000440 Melanoma-associated antigen Human genes 0.000 claims description 6
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 claims description 6
- HRSBDXXXHGAUJF-QJPTWQEYSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-pent-1-ynylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C#CCCC)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 HRSBDXXXHGAUJF-QJPTWQEYSA-N 0.000 claims description 5
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 claims description 5
- BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N Temozolomide Chemical compound O=C1N(C)N=NC2=C(C(N)=O)N=CN21 BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229930183665 actinomycin Natural products 0.000 claims description 5
- 229960000390 fludarabine Drugs 0.000 claims description 5
- GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N fludarabine phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 229960004961 mechlorethamine Drugs 0.000 claims description 5
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960005079 pemetrexed Drugs 0.000 claims description 5
- 229960004964 temozolomide Drugs 0.000 claims description 5
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 claims description 4
- XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 5-aza-2'-deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 4
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 claims description 4
- FVLVBPDQNARYJU-XAHDHGMMSA-N C[C@H]1CCC(CC1)NC(=O)N(CCCl)N=O Chemical compound C[C@H]1CCC(CC1)NC(=O)N(CCCl)N=O FVLVBPDQNARYJU-XAHDHGMMSA-N 0.000 claims description 4
- GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N Capecitabine Chemical compound C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N 0.000 claims description 4
- GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N Capecitabine Natural products C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1C1C(O)C(O)C(C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- PTOAARAWEBMLNO-KVQBGUIXSA-N Cladribine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(Cl)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 PTOAARAWEBMLNO-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 4
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 claims description 4
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 claims description 4
- ZRKWMRDKSOPRRS-UHFFFAOYSA-N N-Methyl-N-nitrosourea Chemical compound O=NN(C)C(N)=O ZRKWMRDKSOPRRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940123237 Taxane Drugs 0.000 claims description 4
- 229940122803 Vinca alkaloid Drugs 0.000 claims description 4
- 229940045799 anthracyclines and related substance Drugs 0.000 claims description 4
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 claims description 4
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 claims description 4
- 229960004117 capecitabine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 claims description 4
- 190000008236 carboplatin Chemical compound 0.000 claims description 4
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 claims description 4
- 229960002436 cladribine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960000928 clofarabine Drugs 0.000 claims description 4
- WDDPHFBMKLOVOX-AYQXTPAHSA-N clofarabine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(Cl)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1F WDDPHFBMKLOVOX-AYQXTPAHSA-N 0.000 claims description 4
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 claims description 4
- 229960003901 dacarbazine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960003603 decitabine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 claims description 4
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 claims description 4
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 claims description 4
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 claims description 4
- HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N mechlorethamine Chemical compound ClCCN(C)CCCl HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 claims description 4
- 229960003440 semustine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 claims description 4
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960003087 tioguanine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960000303 topotecan Drugs 0.000 claims description 4
- UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N topotecan Chemical compound C1=C(O)C(CN(C)C)=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N 0.000 claims description 4
- FPVKHBSQESCIEP-UHFFFAOYSA-N (8S)-3-(2-deoxy-beta-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-d][1,3]diazepin-8-ol Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NCC2O)=C2N=C1 FPVKHBSQESCIEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- JARCFMKMOFFIGZ-UHFFFAOYSA-N 4,6-dioxo-n-phenyl-2-sulfanylidene-1,3-diazinane-5-carboxamide Chemical compound O=C1NC(=S)NC(=O)C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 JARCFMKMOFFIGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 claims description 3
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 3
- GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N Lomustine Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)NC1CCCCC1 GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- YJQPYGGHQPGBLI-UHFFFAOYSA-N Novobiocin Natural products O1C(C)(C)C(OC)C(OC(N)=O)C(O)C1OC1=CC=C(C(O)=C(NC(=O)C=2C=C(CC=C(C)C)C(O)=CC=2)C(=O)O2)C2=C1C YJQPYGGHQPGBLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N Thiotepa Chemical compound C1CN1P(N1CC1)(=S)N1CC1 FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- USZYSDMBJDPRIF-SVEJIMAYSA-N aclacinomycin A Chemical compound O([C@H]1[C@@H](O)C[C@@H](O[C@H]1C)O[C@H]1[C@H](C[C@@H](O[C@H]1C)O[C@H]1C[C@]([C@@H](C2=CC=3C(=O)C4=CC=CC(O)=C4C(=O)C=3C(O)=C21)C(=O)OC)(O)CC)N(C)C)[C@H]1CCC(=O)[C@H](C)O1 USZYSDMBJDPRIF-SVEJIMAYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004176 aclarubicin Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 claims description 3
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 claims description 3
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 claims description 3
- WVYXNIXAMZOZFK-UHFFFAOYSA-N diaziquone Chemical compound O=C1C(NC(=O)OCC)=C(N2CC2)C(=O)C(NC(=O)OCC)=C1N1CC1 WVYXNIXAMZOZFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229950002389 diaziquone Drugs 0.000 claims description 3
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 claims description 3
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 claims description 3
- YAKWPXVTIGTRJH-UHFFFAOYSA-N fotemustine Chemical compound CCOP(=O)(OCC)C(C)NC(=O)N(CCCl)N=O YAKWPXVTIGTRJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004783 fotemustine Drugs 0.000 claims description 3
- 229960001101 ifosfamide Drugs 0.000 claims description 3
- HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N ifosfamide Chemical compound ClCCNP1(=O)OCCCN1CCCl HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 claims description 3
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002247 lomustine Drugs 0.000 claims description 3
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 3
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 claims description 3
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 claims description 3
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims description 3
- KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960001156 mitoxantrone Drugs 0.000 claims description 3
- QXYYYPFGTSJXNS-UHFFFAOYSA-N mitozolomide Chemical compound N1=NN(CCCl)C(=O)N2C1=C(C(=O)N)N=C2 QXYYYPFGTSJXNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229950005967 mitozolomide Drugs 0.000 claims description 3
- 229960000801 nelarabine Drugs 0.000 claims description 3
- IXOXBSCIXZEQEQ-UHTZMRCNSA-N nelarabine Chemical compound C1=NC=2C(OC)=NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O IXOXBSCIXZEQEQ-UHTZMRCNSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002950 novobiocin Drugs 0.000 claims description 3
- YJQPYGGHQPGBLI-KGSXXDOSSA-N novobiocin Chemical compound O1C(C)(C)[C@H](OC)[C@@H](OC(N)=O)[C@@H](O)[C@@H]1OC1=CC=C(C(O)=C(NC(=O)C=2C=C(CC=C(C)C)C(O)=CC=2)C(=O)O2)C2=C1C YJQPYGGHQPGBLI-KGSXXDOSSA-N 0.000 claims description 3
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 claims description 3
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 claims description 3
- FPVKHBSQESCIEP-JQCXWYLXSA-N pentostatin Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC[C@H]2O)=C2N=C1 FPVKHBSQESCIEP-JQCXWYLXSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002340 pentostatin Drugs 0.000 claims description 3
- NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N teniposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@@H](OC[C@H]4O3)C=3SC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N 0.000 claims description 3
- 229960001278 teniposide Drugs 0.000 claims description 3
- 229960001196 thiotepa Drugs 0.000 claims description 3
- DIMILXGLISPALV-UHFFFAOYSA-N 1-(2,2-dichloroethyl)-1-nitrosourea Chemical compound NC(=O)N(N=O)CC(Cl)Cl DIMILXGLISPALV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 2
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 claims description 2
- DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N Carmustine Chemical compound ClCCNC(=O)N(N=O)CCCl DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960005243 carmustine Drugs 0.000 claims description 2
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005619 esophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010749 gastric carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 claims description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 claims description 2
- 229940065658 vidaza Drugs 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- QOFFJEBXNKRSPX-ZDUSSCGKSA-N pemetrexed Chemical compound C1=N[C]2NC(N)=NC(=O)C2=C1CCC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 QOFFJEBXNKRSPX-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims 3
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 125000005577 anthracene group Chemical group 0.000 claims 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- NDLPOXTZKUMGOV-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoferriooxy)iron hydrate Chemical compound O.O=[Fe]O[Fe]=O NDLPOXTZKUMGOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- MNRILEROXIRVNJ-UHFFFAOYSA-N tioguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=S)C2=NC=N[C]21 MNRILEROXIRVNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- LEBVLXFERQHONN-UHFFFAOYSA-N 1-butyl-N-(2,6-dimethylphenyl)piperidine-2-carboxamide Chemical compound CCCCN1CCCCC1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C LEBVLXFERQHONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- VVIAGPKUTFNRDU-UHFFFAOYSA-N 6S-folinic acid Natural products C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 VVIAGPKUTFNRDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 claims 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims 1
- 239000003817 anthracycline antibiotic agent Substances 0.000 claims 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 claims 1
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 claims 1
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 claims 1
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 claims 1
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 claims 1
- 229960003150 bupivacaine Drugs 0.000 claims 1
- NRCNZCLHYWKEDX-UHFFFAOYSA-N cyclohexyl nitrite Chemical compound O=NOC1CCCCC1 NRCNZCLHYWKEDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- VVIAGPKUTFNRDU-ABLWVSNPSA-N folinic acid Chemical compound C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 VVIAGPKUTFNRDU-ABLWVSNPSA-N 0.000 claims 1
- 235000008191 folinic acid Nutrition 0.000 claims 1
- 239000011672 folinic acid Substances 0.000 claims 1
- BPZSYCZIITTYBL-UHFFFAOYSA-N formoterol Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1CC(C)NCC(O)C1=CC=C(O)C(NC=O)=C1 BPZSYCZIITTYBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229960002848 formoterol Drugs 0.000 claims 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 claims 1
- 229960001691 leucovorin Drugs 0.000 claims 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 37
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 21
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 16
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 13
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 8
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 238000012303 cytoplasmic staining Methods 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 6
- 238000000111 isothermal titration calorimetry Methods 0.000 description 6
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 6
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 5
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000003445 Mouth Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000012987 lip and oral cavity carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 3
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 3
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 3
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 3
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N indigo powder Natural products N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 3
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 3
- FPNZBYLXNYPRLR-UHFFFAOYSA-N 2-(4-carbamimidoylphenyl)-1h-indole-6-carboximidamide;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FPNZBYLXNYPRLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 2
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 2
- 206010052360 Colorectal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100028636 HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 4 chain Human genes 0.000 description 2
- 108010040960 HLA-DRB4 Chains Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010079855 Peptide Aptamers Proteins 0.000 description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010042674 Swelling Diseases 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000012954 diazonium Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-O diazynium Chemical compound [NH+]#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- COHYTHOBJLSHDF-BUHFOSPRSA-N indigo dye Chemical compound N\1C2=CC=CC=C2C(=O)C/1=C1/C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-BUHFOSPRSA-N 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N mithramycin Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@H]1O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@H](C)[C@@H](O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@H]1C[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- WBXPDJSOTKVWSJ-ZDUSSCGKSA-L pemetrexed(2-) Chemical compound C=1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2C=1CCC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C([O-])=O)C=C1 WBXPDJSOTKVWSJ-ZDUSSCGKSA-L 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 2
- 229960003171 plicamycin Drugs 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 208000037921 secondary disease Diseases 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZXTWGWHSMCWGA-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC=NC(N)=N1 VZXTWGWHSMCWGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NVKGVBZZSJFQLM-UHFFFAOYSA-N 1-(2-chloroethyl)-1-nitrosourea Chemical compound NC(=O)N(N=O)CCCl NVKGVBZZSJFQLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010052747 Adenocarcinoma pancreas Diseases 0.000 description 1
- HXNNRBHASOSVPG-GUBZILKMSA-N Ala-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HXNNRBHASOSVPG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- PAPSMOYMQDWIOR-AVGNSLFASA-N Arg-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O PAPSMOYMQDWIOR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010006002 Bone pain Diseases 0.000 description 1
- 101100400999 Caenorhabditis elegans mel-28 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010010378 HLA-DP Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000015789 HLA-DP Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 208000000616 Hemoptysis Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 206010019842 Hepatomegaly Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001024703 Homo sapiens Nck-associated protein 5 Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 235000000177 Indigofera tinctoria Nutrition 0.000 description 1
- 229920006061 Kelon® Polymers 0.000 description 1
- LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 102100036946 Nck-associated protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 240000005373 Panax quinquefolius Species 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- ZTKGDWOUYRRAOQ-ULQDDVLXSA-N Val-His-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=CC=C2)C(=O)O)N ZTKGDWOUYRRAOQ-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 238000012863 analytical testing Methods 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 229940044684 anti-microtubule agent Drugs 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 239000003972 antineoplastic antibiotic Substances 0.000 description 1
- 230000004596 appetite loss Effects 0.000 description 1
- 150000004982 aromatic amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000013142 basic testing Methods 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229940096423 bovine collagen type i Drugs 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000011461 current therapy Methods 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000006392 deoxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229960002380 dibutyl phthalate Drugs 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000003534 dna topoisomerase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940097275 indigo Drugs 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 108010047926 leucyl-lysyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 235000021266 loss of appetite Nutrition 0.000 description 1
- 208000019017 loss of appetite Diseases 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000004853 microextraction Methods 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 201000002094 pancreatic adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- DOIRQSBPFJWKBE-UHFFFAOYSA-N phthalic acid di-n-butyl ester Natural products CCCCOC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCCCC DOIRQSBPFJWKBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000004621 scanning probe microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine chloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 238000006863 thiophosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940044693 topoisomerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3517—Marker; Tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
- C12N2320/13—Applications; Uses in screening processes in a process of directed evolution, e.g. SELEX, acquiring a new function
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/31—Combination therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
本揭示內容是關係一種寡核苷酸適體(aptamer)。更具體來說,本揭示內容是關於一種可專一標的至一由主要組織相容複體(major histocompatibility complex, MHC)呈現於細胞表面之胜肽的寡核苷酸適體。
適體是一種寡核苷酸,諸如核醣核酸(ribonucleic acid, RNA)、單股去氧核醣核酸(single-stranded deoxyribonucleic acid, ssDNA),或是一種胜肽分子,可以利用二級或三級結構專一且高親和性地結合至特定標的。一般來說,寡核苷酸適體是由一包含1013
–1016
隨機RNA或ssDNA序列之起始資料庫,利用指數增幅型系統性適體演化法(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)經活體外篩選而得。
如同抗體,寡核苷酸適體亦可專一性地結合至特定標的,據以進行各式基礎試驗及臨床相關應用。相較於抗體,寡核苷酸適體具有下列操作優勢:(1)經濟型合成及可變型修飾:一旦選定,即可大量合成寡核苷酸適體,並藉由化學反應來進行各式修飾以符合不同的應用需求;(2)高穩定性:寡核苷酸適體可以乾燥粉末的形式長久保存,一旦溶於溶液,亦具有溫度穩定性及結構可逆性,意即,即使變性後仍可回覆至其天然的構型;(3)高生物相容性:由於免疫系統會將核酸視為自體抗原,因此寡核苷酸適體往往為低毒性及低免疫原分子;以及(4)可快速穿透組織:如同核酸一般,利用轉染(transfection)試劑即可使寡核苷酸適體穿透組織,進入細胞而與特定細胞內標的結合。基於該些物化特性,寡核苷酸適體可取代抗體作為一種生物標的工具,藉以進行研究、診斷、藥物開發及臨床治療等各項應用。
腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen, TAA)是一種僅會表現於腫瘤細胞/癌細胞上的分子,常被視為腫瘤標記來確認、標記或治療腫瘤細胞/癌細胞。黑色素瘤相關抗原A3(melanoma-associated antigen A3, MAGE-A3)即為一腫瘤相關抗原;約74%的黑色素瘤、57%的食道癌、38%的胃癌、39%的肺癌及33%的多發性骨髓瘤可偵測到MAGE-A3的表現。此外,諸如膀胱癌、乳癌、胰臟癌、腎臟癌、肺癌及頭頸部鱗狀細胞癌等不同類型的腫瘤亦會表現MAGE-A3。另一方面,已知MAGE-A3的表現與腫瘤/癌症的惡化以及較差的預後具有關聯。因此,MAGE-A3可作為一種用以標的不同類型、不同時期之腫瘤的生物分子。
目前已確認數個可經由MHC I型及MHC II型呈現之MAGE-A3抗原表現位置(epitope)。在不同種族間可觀察到多個表現於腫瘤上,且位於胺基酸111-126區域之MAGE-A3胜肽與包含HLA-A、HLA-B、HLA-DP及HLA-DR等人類白血球抗原(human leukocyte antigen,HLA,人類MHC基因座)分子相關。因此,該些抗原可用以專一標的多數的癌症病患。
有鑑於此,相關領域亟需一種可專一且高親和性結合至腫瘤相關MAGE-A3胜肽的適體。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要,以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述,且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
本揭示內容是關於一種可標的至一胜肽的寡核苷酸適體,一種包含該寡核苷酸適體的組合物,及其於標的一胜肽呈現細胞(peptide-presenting cell)的用途,其中該胜肽是經由MHC呈現於細胞之表面。此外,基於專一標的之特性,本發明寡核苷酸適體可藉由與一抗癌藥物接合來治療胜肽呈現腫瘤(peptide-presenting tumor),其中該胜肽係經由MHC呈現於腫瘤之表面。
本揭示內容的第一態樣是關於一種可標的至一由MHC分子呈現之胜肽的寡核苷酸適體。依據一實施方式,該胜肽具有序列編號:4的胺基酸序列。在一特定實施方式中,該寡核苷酸適體包含序列AGCACTCAATATTCCC(序列編號:1)。在另一特定實施方式中,該寡核苷酸適體更包含一上游序列ATCCAGAGTGACGCAGCA(序列編號:2)及一下游序列TGGACACGGTGGCTTAGT(序列編號:3)。
在本揭示內容某些實施方式中,該胜肽是一腫瘤相關胜肽,且係源自MAGE-A3。
在另一態樣中,本揭示內容提供了一種組合物;該組合物包含上述可標的至胜肽的寡核苷酸適體,及一種藥學上可接受之賦形劑。
依據本揭示內容的某些實施方式,該胜肽會表現於一腫瘤上,而該腫瘤係選自由黑色素瘤(melanomas)、血癌(leukemia)、大腸直腸癌(colorectal carcinoma)、舌癌(tongue carcinoma)、食道癌(esophageal carcinomas)、胃癌(gastric carcinomas)、肺癌(lung cancer)、多發性骨髓瘤(multiple myeloma)、膀胱癌(bladder cancer)、乳癌(breast cancer)、胰臟癌(pancreatic cancer)、腎臟癌(renal cancer)、肝癌(hepatocellular carcinoma)、卵巢癌(ovarian cancer)、前列腺癌(prostate cancer)及頭頸部鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma)所組成的群組。
依據本揭示內容實施方式,可利用一或多化學基團來修飾寡核苷酸適體,該化學基團可以是2’-嘧啶氨基團(2’-aminopyrimidinyl group)、2’-O-甲基嘌呤基團(2’-O-methylpurinyl group)、5’-二烷基團(5’-dialkyl group)、硫代磷酸帽(phosphorothioate cap)、2’-OH核苷酸(2’-OH nucleotides)、2’-氟嘧啶(2’-Fluoropyrimidine)或5-(1-戊炔基)-2’-去氧尿苷(5-(1-pentynyl)-2’-deoxyuridine)。在一特定實施例中,係以硫代磷酸帽來修飾寡核苷酸適體。
依據本揭示內容某些實施方式,寡核苷酸適體可與螢光染劑、報導分子、顯影劑、抗癌藥物、胜肽或粒子接合。在本揭示內容某些實施方式中,寡核苷酸適體係與氧化鐵磁性粒子接合。在本揭示內容其他實施方式中,寡核苷酸適體係與螢光染劑接合。
在另一態樣中,本揭示內容是關於寡核苷酸適體及包含該寡核苷酸適體之組合物的用途。舉例來說,寡核苷酸適體及包含寡核苷酸適體的組合物可用以標的胜肽呈現細胞。在一特定實施例中,該胜肽是源自MAGE-A3,且係經由MHC分子呈現於細胞表面。
依據本揭示內容的實施方式,本發明提供了一種利用包含寡核苷酸適體之組合物來標的胜肽呈現細胞的方法。該方法包含將胜肽呈現細胞與一足夠劑量之本發明組合物共同培養,藉以使寡核苷酸適體結合至胜肽呈現細胞;其中胜肽呈現細胞是一腫瘤細胞,其係選自由黑色素瘤、血癌、大腸直腸癌、舌癌、食道癌、胃癌、肺癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、乳癌、胰臟癌、腎臟癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌及頭頸部鱗狀細胞癌所組成的群組。依據本揭示內容某些實施方式,該胜肽是經由MHC分子所呈現,且係源自MAGE-A3。
在本揭示內容某些實施方式中,可以一或多化學基團來修飾包含於組合物中的寡核苷酸適體,藉以增加寡核苷酸適體的穩定性;其中,該化學基團可以是2’-嘧啶氨基團、2’-O-甲基嘌呤基團、5’-二烷基團、硫代磷酸帽、2’-OH核苷酸、2’-氟嘧啶或5-(1-戊炔基)-2’-去氧尿苷。在一特定實施例中,係以硫代磷酸帽來修飾寡核苷酸適體。
依據本揭示內容的某些實施方式,為因應不同的應用需求,用以標的胜肽呈現細胞之組合物中的寡核苷酸適體可與螢光染劑、報導分子、顯影劑、抗癌藥物、胜肽或粒子接合。在本揭示內容一實施方式中,寡核苷酸適體係與氧化鐵磁性粒子接合。在本揭示內容一特定實施方式中,寡核苷酸適體係與螢光染劑接合。
依據另一實施態樣,本揭示內容提供了一種用以治療一罹患或疑似患有腫瘤之病患的方法,其中該腫瘤會表現一腫瘤相關胜肽。該方法包含投予該個體一治療有效量的本發明組合物,以減緩或降低腫瘤的進程;其中組合物中的寡核苷酸適體係與一抗癌藥物接合。利用本發明組合物來治療的腫瘤可以是黑色素瘤、血癌、大腸直腸癌、舌癌、食道癌、胃癌、肺癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、乳癌、胰臟癌、腎臟癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌或頭頸部鱗狀細胞癌。依據本揭示內容的實施方式,該腫瘤相關胜肽是一MAGE-A3胜肽,且係經由MHC分子呈現於腫瘤表面。
依據一實施方式,與本揭示內容之寡核苷酸適體接合的抗癌藥物可以是甲基二胺(mechlorethamine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、黴法蘭(melphalan)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、依弗醯胺(ifosfamide)、硫酸布他卡因(busulfan)、N-亞硝基-N-甲脲(N-Nitroso-N-methylurea)、雙氯乙基亞硝脲(carmustine)、環己亞硝(lomustine)、司莫司汀(semustine)、福莫司汀(fotemustine)、鏈佐黴素(streptozotocin)、達卡巴嗪(dacarbazine)、米托唑胺(mitozolomide)、替莫唑胺(temozolomide)、沙奧特帕(thiotepa)、亞絲醌(diaziquone)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、益樂鉑(oxaliplatin)、胺甲喋呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡培他濱(capecitabine)、阿拉伯糖基胞嘧啶(cytarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、地西他濱(decitabine)、維達紮(vidaza)、氟達拉濱(fludarabine)、奈拉濱(nelarabine)、克拉屈濱(cladribine)、氯法拉濱(clofarabine)、噴司他丁(pentostatin)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、硫醇嘌呤(mercaptopurine)、長春花生物鹼(vinca alkaloids)、紫杉烷類(taxanes)、愛萊諾替康(irinotecan)、拓撲替康(topotecan)、依妥普賽(etoposide)、阿黴素(doxorubicin)、雙羥恩(mitoxantrone)、坦尼坡賽(teniposide)、諾波黴素(novobiocin)、美巴龍(merbarone)、阿柔比星(aclarubicin)、蒽環抗生素(anthracyclines)、放線菌素(actinomycin)、博萊黴素(bleomycin)、普卡黴素(plicamycin)或絲裂黴素(mitomycin)。
可利用一或多化學基團來修飾本發明用以治療胜肽呈現腫瘤之組合物中的寡核苷酸適體,藉以增加寡核苷酸適體的穩定性;其中,該化學基團可以是2’-嘧啶氨基團、2’-O-甲基嘌呤基團、5’-二烷基團、硫代磷酸帽、2’-OH核苷酸、2’-氟嘧啶或5-(1-戊炔基)-2’-去氧尿苷。在一特定實施例中,係以硫代磷酸帽來修飾寡核苷酸適體。
在參閱下文實施方式後,本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的,以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備,下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述;但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而,亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數界是約略的數值,此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而,任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處,「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是,「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內,視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外,或除非另有明確的說明,當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此,除非另有相反的說明,本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值,且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處,將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間;除非另有說明,此處所述的數值範圍皆包含端點。
除非本說明書另有定義,此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外,在不和上下文衝突的情形下,本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型;而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
「寡核苷酸」(oligonucleotide)一詞在本說明書係可指多去氧核糖核苷酸(包含2'-去氧-D-核糖或其修飾形式),即DNA;或是多核糖核苷酸(包含D-核糖或其修飾形式),即RNA;亦或是任何多核苷酸,其係為一嘌呤或嘧啶的N-配糖體或C-配糖體,或是經修飾的嘌呤、嘧啶或鹼基。
在本說明書中,「適體」(aptamer)或「寡核苷酸適體」(oligonucleotide aptamer)是指具有特定結合區域的寡核苷酸,該特定結合區域可與環境中一特定標的分子形成複合體,而不會與環境中其他物質形成複合體。寡核苷酸同時意指寡核苷酸之一或多條序列。
本說明書是以對比解離常數(comparative dissociation constant,Kd
)來定義適體與環境中其他分子或不相關分子之間的結合專一性。一般來說,適體與標的物之Kd
值會是適體與環境中不相關分子之Kd
值的2倍;較佳的情況是,二者相差5倍;更佳的情況是,二者相差10倍。最佳的情況是,二者的Kd
值相差50倍、100倍或200倍。可利用任何已知方法來測定解離常數的數值。
於本說明書中,一「藥學上可接受之賦形劑」(pharmaceutically acceptable excipient)是指一物質,其適合與主藥一起使用而不會產生過度的有害副作用(如毒性、刺激及過敏反應),具有一適當的效益/危害比。另外,各賦形劑必須為「可接受的」(acceptable),即與該藥劑組合物之其餘成分相容。賦形劑可以是固態、半固態、液態稀釋液、膏狀物或膠囊的形式。
「治療」(treating)一詞包含部份或完全預防、改善、減輕及/或處理表現MAGE-A3胜肽腫瘤之相關病徵(symptom)、次要病徵(secondary disorder)或症狀(condition),其中是藉由抑制表現MAGE-A3胜肽之腫瘤細胞生長及/或促進表現MAGE-A3胜肽之腫瘤細胞死亡來使罹患或疑似患有相關病徵、疾病或症狀之個體獲得效益。「治療」(treating)一詞於本說明書中亦指應用或投予本揭示內容之可標的至MAGE-A3胜肽且與抗癌藥物接合的適體及/或其組合物至一個體,其係患有MAGE-A3胜肽表現腫瘤之相關病徵、次要病徵或症狀,以達到部份或完全減輕、減緩、治癒疾病、延遲發病、抑制病程發展、降低疾病嚴重性,及/或降低一或多個癌症之相關病徵、症狀、或次要病徵的發生。表現MAGE-A3胜肽腫瘤之相關病徵、次要病徵及/或症狀包含,但不侷限於,腫脹、出血、疼痛、潰瘍、淋巴結腫大、咳嗽、咳血、肝腫大、骨頭疼痛、骨折、體腫減輕、食慾不振及貧血。在此「治療」(treating)亦可以是施用至患有早期該些病徵或症狀之個體,以降低該個體發展成為表現MAGE-A3胜肽腫瘤之相關病徵、次要病徵及/或症狀的風險。在此「治療」(treating)為可以有效地減少一個或多個病徵或臨床標記。換句話說,在此治療亦可以是降低、減緩或終止疾病病程、病徵或症狀的發展。
「有效量」(effective amount)在此處係指一藥物的用量足以產生所欲的療效反應。具體的有效量取決於多種因素,如欲治療的特定狀況、患者的生理條件(如患者體重、年齡或性別)、接受治療的哺乳動物或動物的類型、治療持續時間、目前療法(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。有效量亦指一種化合物或組合物,其治療利益效果超越其毒性或有害影響。舉例來說,可將有效量表示成藥物的總重量(譬如以克、毫克或微克為單位),或表示成藥物重量與體重之比例(其單位為毫克/公斤(mg/kg))。亦或是,有效量可以醫藥組合物中活性成份的濃度來表示,例如莫耳濃度(molar concentration)、重量濃度(mass concentration)、體積濃度(volume concentration)、重量莫耳濃度(molality)、莫耳分率(mole fraction)、重量分率(mass fraction)及混合比例(mixing ratio)。習知技藝者可依據動物模式的劑量來計算藥物(如本揭示內容之奈米粒子)的人體等效劑量(human equivalent dose, HED)。舉例來說,習知技藝者可依據美國食品藥物管理局(US Food and Drug Administration, FDA)所公告之「估算成人健康志願者在初始臨床治療測式之最大安全起始劑量」(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)來估算人體使用之最高安全劑量。
「個體」(subject)一詞是指包含人類的動物,其係依據本揭示內容之方法,能接受本揭示內容之奈米粒子的治療。除非特定指出,否則「個體」(subject)一詞同時意指男性及女性,且可以是任何年齡,例如兒童或成人。
在本揭示內容中,胜肽呈現細胞(peptide-presenting cell)係指會表現胜肽的細胞;較佳的情況是,胜肽呈現細胞係指具有胜肽表現於細胞表面的細胞,其中該胜肽是經由MHC呈現於細胞表面。相似地,胜肽呈現腫瘤(peptide-presenting tumor)係指會表現胜肽的腫瘤;較佳的情況是,胜肽呈現腫瘤係指包含細胞表面具有胜肽表現之細胞的腫瘤,其中該胜肽係經由MHC呈現於細胞表面。
本發明是關於一種可辨識由MHC呈現之胜肽的寡核苷酸適體,包含該可標的至胜肽之寡核苷酸適體的組合物,及其於標的至胜肽呈現細胞的用途及/或當與一抗癌藥物接合時,於治療胜肽呈現腫瘤的用途。依據本揭示內容某些實施方式,該胜肽是源自MAGE-A3。
首先利用指數增幅型系統性寡核苷酸適體演化法(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)來得到可專一標的至一胜肽(例如MAGE-A3111-125
胜肽)的寡核苷酸適體。一般來說,會先合成一寡核苷酸資料庫(包含約1013
–1016
隨機RNA或ssDNA序列),其中各序列具有一固定長度的隨機產生序列,及位於該序列之5’及3’端的引子序列。將該資料庫與標的胜肽(例如MAGE-A3111-125
胜肽)作用反應後,利用聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)來偵測並增殖放大可專一標的至標的物的寡核苷酸。重複上述之結合-篩選步驟數次,以增加沖提產物對標的物的親合性及專一性,最終可得到一具有最高親合性的序列。
篩選出的寡核苷酸適體可高度專一地與標的胜肽結合。本揭示內容的第一態樣是關於一種可標的至MAGE-A3胜肽的寡核苷酸適體;其中該寡核苷酸適體是由16個核苷酸所組成(即AGCACTCAATATTCCC,序列編號:1,以下簡稱Ap16),且該MAGE-A3胜肽具有序列編號:4的胺基酸序列。
依據本揭示內容一實施方式,寡核苷酸適體Ap16更包含一上游序列ATCCAGAGTGACGCAGCA(序列編號:2)及一下游序列TGGACACGGTGGCTTAGT(序列編號:3)。組成的寡核苷酸適體具有52個核苷酸,因此簡稱為Ap52。
在本揭示內容實施方式中,Ap16及Ap52皆可結合至MAGE-A3胜肽,且其解離常數Kd
可以奈米莫耳來計算表示。
本發明另一態樣是將該可專一結合至MAGE-A3胜肽的寡核苷酸適體(即Ap16或Ap52)配製為一組合物;該組合物可標的至MAGE-A3胜肽呈現細胞。MAGE-A3胜肽是一種會呈現於不同類型腫瘤的腫瘤相關抗原;會呈現MAGE-A3胜肽的腫瘤包含,但不限於,黑色素瘤、血癌、大腸直腸癌、舌癌、食道癌、胃癌、肺癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、乳癌、胰臟癌、腎臟癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌及頭頸部鱗狀細胞癌。因此,可標的至MAGE-A3胜肽的寡核苷酸適體及包含該寡核苷酸適體的組合物將可作為一種用以標記及/或治療會表現MAGE-A3胜肽之腫瘤的生物工具。
依據本揭示內容某些實施方式,該MAGE-A3胜肽係經由MHC分子呈現於細胞表面。在一實施方式中,該MAGE-A3胜肽係經由MHC I型呈現於細胞表面。在另一實施方式中該MAGE-A3胜肽係經由MHC II型呈現於細胞表面。
除了本發明寡核苷酸適體(即Ap16或Ap52)外,本發明組合物更包含一藥學上可接受之賦形劑。用以與本發明寡核苷酸適體組合使用之藥學上可接受之賦形劑的選擇主要是取決於藥學或使用組合物的產品期望形式。
依據本揭示內容的實施方式,可利用一或多化學基團來修飾Ap16或Ap52,藉以增加寡核苷酸適體的穩定性。依據不同的應用需求,可在化學合成核酸序列的過程中加入適當的化學基團來修飾Ap16或Ap52。適當的化學基團包含,但不限於2’-嘧啶氨基團、2’-O-甲基嘌呤基團、5’-二烷基團、硫代磷酸帽、2’-OH核苷酸、2’-氟嘧啶及5-(1-戊炔基)-2’-去氧尿苷。在一特定實施方式中,係利用硫代磷酸帽來修飾Ap16或Ap52。
在本揭示內容其他實施方式中,Ap16或Ap52可用以偵測或治療MAGE-A3呈現細胞或腫瘤;在該些實施方式中,Ap16或Ap52係與螢光染劑、報導分子、顯影劑、抗癌藥物、胜肽或粒子接合。可利用習知技藝人士所熟知的任何方法來進行接合反應。舉例來說,在合成核酸序列的過程中,將3’或5’一級胺(primary amine)與不同分子接合;或是經由傳統的碳二亞胺(carbodiimide)、醛類(aldehyde)、重氮類(diazonium)或其他方式將一級烷基胺標誌接合至核苷酸之芳胺。
依據一實施方式,Ap16或Ap52係與氧化鐵磁性粒子接合。依據另一實施方式,Ap16或Ap52係與螢光染劑接合。依據再另一實施方式,Ap16或Ap52係與抗癌藥物接合。
靛青染料(Cyanine)是一種螢光染劑,相較於螢光素(Fluorescein, FITC)及玫瑰紅(rhodamine, TRITC, RRX)等傳統染劑,靛青染料可發散出強度更高且較為穩定的螢光訊號。在多種靛青染料中,靛青染料3(Cyanine 3, Cy3)及靛青染料5(Cyanine 5, Cy5)尤為廣泛使用。Cy3發散橘色螢光(激發波長約為550奈米,發散波長約為570奈米);Cy5則會吸收橘色區段(約649奈米)的光源,並發散紅色區段的螢光(約650/670奈米)。可利用不同的螢光偵測裝置、顯影器及顯微鏡,佐以可觀察四甲基玫瑰紅(Tetramethylrhodamine, TRITC)螢光的濾鏡來偵測Cy3的表現。Cy3的高消光係數(extinction coefficient)特性使其不論於膠體或溶液中皆可以肉眼進行觀察。據此,在本揭示內容某些用以分析寡核苷酸適體及MAGE-A3胜肽呈現細胞之結合/標的的試驗中,係採用Cy3作為與Ap16或Ap52接合的螢光染劑。
適用與本發明Ap16或Ap52接合之抗癌藥物包含,但不限於,(1)烷化劑(alkylating agent),例如甲基二胺(mechlorethamine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、黴法蘭(melphalan)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、依弗醯胺(ifosfamide)、硫酸布他卡因(busulfan)、N-亞硝基-N-甲脲(N-Nitroso-N-methylurea)、雙氯乙基亞硝脲(carmustine)、環己亞硝(lomustine)、司莫司汀(semustine)、福莫司汀(fotemustine)、鏈佐黴素(streptozotocin)、達卡巴嗪(dacarbazine)、米托唑胺(mitozolomide)、替莫唑胺(temozolomide)、沙奧特帕(thiotepa)、亞絲醌(diaziquone)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)及益樂鉑(oxaliplatin);(2)抗代謝物,例如胺甲喋呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡培他濱(capecitabine)、阿拉伯糖基胞嘧啶(cytarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、地西他濱(decitabine)、維達紮(vidaza)、氟達拉濱(fludarabine)、奈拉濱(nelarabine)、克拉屈濱(cladribine)、氯法拉濱(clofarabine)、噴司他丁(pentostatin)、硫鳥嘌呤(thioguanine)及硫醇嘌呤(mercaptopurine);(3)抗微管劑(anti-microtubule agent),例如長春花生物鹼(vinca alkaloids)及紫杉烷類(taxanes);(4)拓撲異構酶抑製劑(topoisomerase inhibitor),例如愛萊諾替康(irinotecan)、拓撲替康(topotecan)、依妥普賽(etoposide)、阿黴素(doxorubicin)、雙羥恩(mitoxantrone)、坦尼坡賽(teniposide)、諾波黴素(novobiocin)、美巴龍(merbarone)及阿柔比星(aclarubicin);以及(5)細胞毒性抗生素(cytotoxic antibiotic),例如蒽環抗生素(anthracyclines)、放線菌素(actinomycin)、博萊黴素(bleomycin)、普卡黴素(plicamycin)及絲裂黴素(mitomycin)。
依據本揭示內容一實施方式,硫代磷酸帽修飾及螢光染劑接合皆能有效增加寡核苷酸適體(即Ap16及Ap52)的穩定性。在一特定實施方式中,硫代磷酸帽修飾及螢光染劑接合對於增加寡核苷酸適體(即Ap16及Ap52)的穩定性具有相加乘的功效(synergistic effect)。
本揭示內容的另一態樣是關於Ap16或Ap52的用途;包含用以標的MAGE-A3胜肽呈現細胞的方法及/或治療MAGE-A3胜肽呈現腫瘤的方法。
依據本揭示內容的實施方式,利用包含Ap16或Ap52之組合物來標的MAGE-A3胜肽呈現細胞的方法包含:將MAGE-A3胜肽呈現細胞與足夠劑量之組合物共同培養,藉以使本發明寡核苷酸適體(即Ap16或Ap52)結合至MAGE-A3胜肽呈現細胞。該些MAGE-A3胜肽呈現細胞為一腫瘤細胞,其係選自由黑色素瘤、血癌、大腸直腸癌、舌癌、食道癌、胃癌、肺癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、乳癌、胰臟癌、腎臟癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌及頭頸部鱗狀細胞癌所組成的群組。
在本揭示內容某些實施方式中,可以一或多化學基團來修飾本發明組合物中的Ap16或Ap52;舉例來說,該些化學基團可以是2’-嘧啶氨基團、2’-O-甲基嘌呤基團、5’-二烷基團、硫代磷酸帽、2’-OH核苷酸、2’-氟嘧啶或5-(1-戊炔基)-2’-去氧尿苷。在一特定實施例中,是利用硫代磷酸帽來修飾本發明組合物中的Ap16或Ap52。
依據本揭示內容某些實施方式,本發明組合物中的Ap16或Ap52可與螢光染劑、報導分子、顯影劑、抗癌藥物、胜肽或粒子接合。在本揭示內容一實施方式中,本發明組合物中的Ap16或Ap52係與氧化鐵磁性粒子接合。在本揭示內容一特定實施方式中,本發明組合物中的Ap16或Ap52係與Cy3螢光染劑接合。
可依據接合分子的特性,以不同方式偵測Ap16或Ap52與MAGE-A3胜肽呈現細胞的結合。舉例來說,可利用螢光顯微鏡或流式細胞儀來偵測與螢光染劑(例如Cy3)接合的Ap16或Ap52。
足以使本發明組合物結合至MAGE-A3呈現細胞的劑量約為100-1000 nM;意即,使用劑量可以是100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000 nM。較佳的情況是,使用約為300-500 nM的劑量。在一特定實施方式中,約使用400 nM的組合物來偵測MAGE-A3胜肽的表現。
本揭示內容的再另一態樣提供了一種用以治療一罹患或疑似患有腫瘤之病患的方法,其中該腫瘤會表現MAGE-A3抗原。該方法包含投予該個體一治療有效量的本發明組合物,以減緩或降低腫瘤的進程;且該組合物中的寡核苷酸適體係與一抗癌藥物接合。
如同上述,可利用一或多化學基團來修飾與抗癌藥物接合的寡核苷酸適體(即Ap16或Ap52),據以增加寡核苷酸適體的穩定性。舉例來說,可利用硫代磷酸帽來修飾寡核苷酸適體。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣,以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明,且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後,可在不需過度解讀的情形下,完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻,其全文皆視為本說明書的一部分。
實施例
材料及方法
細胞培養
舌癌細胞株Cal-27(美國菌種保存中心編號:CRL-2095)、大腸直腸腺癌細胞株DLD-1(美國菌種保存中心編號:CCL-221)、肝癌細胞株HepG2(美國菌種保存中心編號:HB-8065)、乳腺癌細胞株MCF-7(美國菌種保存中心編號:HTB-22)及口腔黏膜纖維母細胞OMF係培養於DMEM細胞培養液。慢性骨髓性白血病K-562(美國菌種保存中心編號:CCL-243)、肺癌細胞株A549(美國菌種保存中心編號:CCL-185)及胰臟腺癌細胞株AsPC-1(美國菌種保存中心編號:CRL-1682)係培養於RPMI細胞培養液。惡性黑色素瘤細胞株SK-MEL-28(美國菌種保存中心編號:HTB-72)係培養於MEM細胞培養液。上述細胞培養液皆包含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)及1倍青黴素-鏈黴素-麩醯胺酸(Penicillin-Streptomycin-Glutamine)。纖維囊腫細胞株MCF-10A(美國菌種保存中心編號:CRL-10317)係培養於包含5%馬血清、每毫升20奈克表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、每毫升0.5毫克氫皮質酮(hydrocortisone)、每毫升100奈克霍亂菌毒素(cholera toxin)、每毫升20微克胰島素及1倍X青黴素-鏈黴素-麩醯胺酸的DMEM細胞培養液。人類正常表皮黑色素初代細胞株HEM-a(ScienCell,美國)係培養於裝有黑色素細胞培養液(Melanocyte Medium,MelM,ScienCell,美國)之以聚-L-離胺酸(poly-L-lysine)塗佈之T-75細胞培養瓶。人類正常支氣管上皮細胞株BEAS-2B(美國菌種保存中心編號:CRL-9609)及人類正常肝臟上皮細胞株THLE-3(美國菌種保存中心編號:CRL-11233)係培養於T-75細胞培養瓶中,其內裝有預先溶於BEBM細胞培養液之每毫升0.01毫克纖網蛋白(fibronectin)、每毫升0.03毫克第I型牛膠原(bovine collagen type I)及每毫升0.01毫克牛血清白蛋白(bovine serum albumin)的BEGM細胞培養液。人類正常大腸直腸上皮細胞株FHC(美國菌種保存中心編號:CRL-1831)係培養於包含10 mM HEPES、每毫升0.005奈克氫皮質酮、每毫升10奈克霍亂菌毒素、每毫升0.005奈克胰島素、每毫升0.005毫克運鐵蛋白(transferrin)及10%胎牛血清的DMEM/F12細胞培養液。人類正常胰臟類上皮細胞株hTERT-HPNE(美國菌種保存中心編號:CRL-4023)係培養於一混合培養液,其係由75%之不包含葡萄糖的DMEM及25%之包含5%胎牛血液、每毫升10奈克表皮生長因子、5.5 mM D-葡萄糖及每毫升750奈克嘌黴素(puromycin)的B3基底培養液(Medium M3 Base)所組成。所有的細胞皆係培養於含有5%二氧化碳、37˚C的潮溼環境中;當細胞生長至90%滿度時,加入胰蛋白(trypsin)/乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)及胰蛋白中和溶液(ScienCell Research Laboratories,美國),以收集細胞。
細胞轉染(
Cell transfection
)
由OriGene Technologies(美國)購買建構於pCMV6-AC-GFP 載體之以GFP標記的人類HLA cDNA-HLA I (HLA-A,產品編號RG200661)及HLA II (HLA-DRB4,產品編號RG202743)。利用PureLink®
高純度質體微萃取套組(PureLink®
HiPure Plasmid Midiprep Kit,Life Technologies,美國)萃取質體DNA,並將該質體DNA以Lipofectamine®
3000轉染試劑(Lipofectamine®
3000 Transfection Reagent,Life Technologies,美國)轉染至K-562細胞中。將轉染細胞培養於包含10%胎牛血清及每毫升250微克之G418的RPMI 1640細胞培養液中;3天後,利用流式細胞儀來進行結合分析。
共軛焦顯微鏡(
Confocal microscopy
)
利用共軛焦顯微鏡(TCS-SP5-MP-SMD, Leica)來擷取細胞影像。先將細胞種植於Millicell EZ SLIDE 8-孔洞玻片(Merck Millipore)。24小時後,以新鮮細胞培養液置換原培養液。利用細胞培養液以1:2000的比例稀釋鈣黃綠素AM(Calcein AM,激發波長:488奈米,Molecular Probes)後,將稀釋後的鈣黃綠素AM加入細胞,並置於細胞烘箱30分鐘以標記細胞質;接著,利用洗滌緩衝液洗滌細胞二次。將與Cy3(激發波長:520奈米,Molecular Probes)接合的DNA(300 nM)溶於50微升的結合緩衝液中,於95˚C反應5分鐘後,置於冰上30分鐘,使其變性。之後,加入150微升之冰結合緩衝液,將混合液靜置於室溫。將200微升之結合緩衝液加入細胞,於室溫以每分鐘60轉速(60 rpm)培養2小時。以200微升之洗滌緩衝液洗滌細胞3次,每次10分鐘,以去除未結合的共軛物。之後,利用3.7%甲醛(formaldehyde)固定細胞10分鐘。以洗滌緩衝液洗滌細胞3次後,加入4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4’, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride,DAPI,激發波長:405奈米)20分鐘,以標記細胞核。以洗滌緩衝液洗滌細胞3次後,利用共軛焦顯微鏡觀察細胞的螢光表現。
西方墨點分析(
Western blot analysis
)
以12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分離細胞裂解物,再利用抗MAGE-A3單株抗體(Clone 2F10,OriGene Technologies,美國)及與山葵過氧化酶(horseradish peroxidase, HRP)接合之山羊抗-小鼠IgG(H+L)二級抗體(ThermoFisher Scientific,美國)來偵測MAGE-A3的表現。藉由ImageQuant LAS 4000(GE Healthcare Life Sciences,美國)來偵測免疫螢光影像。
以等溫滴定微量熱儀(
Isothermal titration calorimetry, ITC
)偵測解離常數
Kd
利用MicroCal iTC200
(GE Healthcare Life Sciences)以25˚C之洗滌緩衝液(包含0.45%葡萄糖及5 mM氯化鎂的達爾伯克氏磷酸緩衝生理食鹽水(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline))來測量DNA與胜肽之間的解離常數K d
。以2微升之寡核苷酸適體(0.1 mM)滴定分析未修飾之MAGE-A3111-125
胜肽(0.3 mM,200微升),間隔時間為150秒,連續注入18次。以MicroCal Origin 7及一組位置結合模式來分析焓變量(enthalpy change,DH
)及結合常數(association constant,K a
)。
流式細胞儀(
Flow cytometry
)
以洗滌溶液(包含0.45%葡萄糖、5 mM氯化鎂的達爾伯克氏磷酸緩衝生理食鹽水)於37˚C洗滌細胞二次後,將400 nM之與Cy3-接合的Ap52寡核苷酸適體加入1×106
細胞,於室溫反應2小時。以200微升之洗滌緩衝液洗滌細胞3次後,將細胞懸浮於400微升的洗滌緩衝液中。利用BD FACSAria IIu流式細胞儀(BD Biosciences,美國)計數50,000個細胞反應,以偵測螢光強度。各細胞株皆以流式細胞儀分析三次(三重覆實驗)。未處理的細胞係為對照組細胞。
核酸酶抗性試驗
(
Nuclease resistance assay
)
利用以DMEM細胞培養液釋的10%胎牛血清,於37˚C來進行寡核苷酸適體的核酸酶抗性試驗。將寡核苷酸適體Ap52、硫-Ap52(ThioAp52,A*TCCAGA G*TGACGCAGCA-A*GCACTCA*ATATTCC*C-TGGACACG*GTGGCTTAG*T;其中*為硫代磷酸化的位置)、與Cy3接合之Ap52,及與Cy3接合之硫-Ap52以減壓乾燥蒸發至0.5微克後,加入300毫升之包含10%胎牛血液的DMEM細胞培養液,靜置於37˚C。收集0、1、2、6、12及24小時之檢體(50毫升),並將其保存於–20°C至少20分鐘。將各檢體乾燥蒸發後,加入10微升膠體填充緩衝液(gel loading buffer)及10微升滅菌水。取10微升混合液於室溫、0.5倍三-硼酸鹽( Tris-borate-EDTA,TBE)緩衝液中,以18%聚丙烯醯胺凝膠進行電泳分析。再利用ImageJ軟體來分析電泳降解強度。
實施例1 以SELEX流程來篩選可標的至MAGE-A3胜肽的寡核苷酸適體
利用SELEX流程來篩選可專一標的至MAGE-A3胜肽的寡核苷酸適體。本發明所使用的隨機寡核苷酸資料庫及寡核苷酸(包含生物素或Cy3共軛物,及生物素化的共軛物)皆係由基龍米克斯(台灣,台北)客製化製得。與卵白素鍵結的磁珠(Dynabeads®
My OneTM
卵白素C1)則是購買自美國萊富科技(Life Technologies)。
本發明寡核苷酸適體是選自一隨機寡核苷酸資料庫,並藉由磁珠於活體外來進行篩選。該隨機寡核苷酸資料庫包含1015
條由52個核苷酸(52-mer)所組成的核苷酸序列。該核苷酸序列依序包含:一由18個核苷酸(ATCCAGAGTGACGCAGCA,序列編號:2)所組成的5’端引子序列,一由16個核苷酸所組成的中央隨機序列,以及一由18個核苷酸(TGGACACGGTGGCTTAGT,序列編號:3)所組成的3’端引子序列。以洗滌緩衝液(包含0.45%葡萄糖、5 mM氯化鎂的達爾伯克氏磷酸緩衝生理食鹽水)洗滌與卵白素鍵結的磁珠(10微升包含107
顆磁珠)二次,藉以移除殘存的防腐劑及溶劑。接著將磁珠與生物素化的胜肽MAGE-A3111-125
(RKVAELVHFLLLKYR,序列編號:4)於室溫的環境下,以99 rpm的轉速反應1小時。MAGE-A3111-125
胜肽與卵白素鍵結磁珠的反應比例為10:1,反應體積則為100微升。之後,以洗滌緩衝液洗滌磁珠2次,以移除未結合的胜肽。以100微升的生物素溶液(每毫升1毫克)於上述反應環境下,阻斷卵白素未與生物素接合的位置。再以結合緩衝液(包含0.01%酵母菌tRNA及0.1%牛血清白蛋白的洗滌緩衝液)來洗滌胜肽-磁珠複合體,藉以移除未接合的生物素及過多的離子。所得之胜肽-磁珠複合體將用以進行後續分析試驗。
利用與卵白素鍵結的磁珠來移除非專一性接合的寡核苷酸。再以分子量載留管柱(載留分子量為3,000,聚醚碸膜,Sartorius)來回收殘存的寡核苷酸,並將之置於室溫的環境下進行真空乾燥後,以50微升的結合緩衝液回溶;所得的寡核苷酸係為ssDNA資料庫。
將所得的資料庫置於95˚C反應5分鐘後,再放置冰上30分鐘,使其變性。將資料庫與MAGE-A3111-125
-磁珠複合體均勻混合,於室溫持續攪拌反應1小時。利用磁鐵來收集DNA-胜肽-磁珠複合體。以100微升之洗滌緩衝液洗滌3次後,以95˚C純水沖提結合DNA,再利用具有序列編號:2的5’端引子及具有序列編號:3的3’端引子進行聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR),來增殖放大特定的DNA片段,其中聚合酶鏈鎖反應是利用PfuUltra High-Fidelity DNA 聚合酶(默克,台灣)於95˚C反應150秒、95˚C反應30秒、56.3˚C反應30秒、72˚C反應30秒,及72˚C反應180秒,共10次循環反應。增殖產物(dsDNA)可作為一模板,利用一5’端接有生物素的順向引子進行錨定聚合酶鏈鎖反應(anchored PCR),反應條件則同於上述步驟。
增殖後,均勻混合各反應物(總體積為500微升),將混合物加入一裝有卵白素瓊脂糖珠(streptavidin Sepharose bead,GE,英國)的DNA合成管柱(Glen Research,美國),使二者結合;之後,將5’-生物素由增殖的ssDNA移除。接著將沖提出的ssDNA進行去鹽(NAP-5管柱,GE,英國)及真空乾燥後,以50微升之結合緩衝液回溶產物;製得的資料庫可用以進行下一輪的篩選。經過7次上述的活體外篩選後,利用聚合酶鏈鎖反應增殖沖提出的DNA產物,將其轉殖至pCR®
2.1-TOPO載體(Invitrogen)後,進行後續定序分析。
由上述方法共可得到94條序列(分別具有不同胺基酸序列);接著,再逐一分析評估各序列與MAGE-A3111-125
的結合親和力及專一性。質體DNA是利用上述方法藉由錨定聚合酶鏈鎖反應來進行增殖。利用12%變性的PAGE來純化各ssDNA產物,再將純化產物與生物素化胜肽MAGE-A3111-125
靜置反應,其中該生物素化胜肽MAGE-A3111-125
係先以與卵白素鍵結的磁珠預處理,藉由卵白素-生物素交互反應以形成一胜肽-磁珠複合物。以磁鐵分離可專一結合至胜肽MAGE-A3111-125
的序列,並利用資料庫所述步驟進一步純化分離的序列。
選定一條可專一結合至MAGE-A3111-125
的寡核苷酸適體,進行後續分析;其中該寡核苷酸適體包含一5’端引子序列(ATCCAGAGTGACGCAGCA,序列編號:2),一中央隨機序列(AGCACTCAATATTCCC,序列編號:1),及一3’端引子序列(TGGACACGGTGGCTTAGT,序列編號:3)。所得的寡核苷酸適體係由52個核苷酸所組成,簡稱為「Ap52」。
實施例2 定性Ap52
本實施例將進一步分析實施例1之Ap52與MAGE-A3111-125
胜肽的結合專一性,結果分述於第1至6圖;其中,第1圖繪示出Ap52可專一地結合至MAGE-A3111-125
胜肽,第2至4圖分別繪示出Ap52可專一標的至會表現MAGE-A3的癌細胞,第5及6圖則確認可被實施例1之Ap52辨識/結合之MAGE-A3111-125
於癌細胞的表現位置。
2.1 Ap52可專一地結合至MAGE-A3111-125
胜肽
如第1圖所示,Ap52對於MAGE-A3111-125
胜肽具有高親和性及專一性(標示為Ap52及「+」的電泳線);相較之下,該適體並不會與源自NY-ESO-1之胜肽結合(詳見第1圖中,標示為N1、N2及N3的電泳線;其中N1、N2及N3分別代表NY-ESO-1之87-111、119-143及157-170的抗原決定位置)。改變5’端引子的序列(置換為ATAGGAGTCGACCGACAC,序列編號:5)及3’ 端引子的序列(置換為GTCTACATCTAAGCTCAT,序列編號:6)會使適體非專一地結合至與卵白素鍵結而無胜肽連接的磁珠(標示為PB及「–」的電泳線);該結果顯示,Ap52適體與胜肽間的結合具有序列專一性。據此,Ap52可高度專一地結合至MAGE-A3111-125
胜肽。
2.2 Ap52可專一地結合至會表現MAGE-A3的癌細胞
亦進一步分析Ap52是否可專一標的至會表現MAGE-A3的癌細胞。在本實施例中,分別利用7種癌細胞株及與癌細胞株對應的正常細胞株來進行分析;該些細胞株為MCF-7(乳腺癌)與MCF-10A(纖維囊腫)、SK-MEL-28(惡性黑色素瘤)與HEM-a(人類正常表皮黑色素初代細胞)、Cal-27(舌癌)與OMF(口腔黏膜纖維纖維母細胞)、DLD-1(大腸直腸腺癌)與FHC(大腸上皮細胞)、HepG2(肝癌)與THLE-3(肝臟上皮細胞)、A549(肺癌)與BEAS-2B(支氣管上皮細胞),以及AsPC-1(胰腺癌)與hTERT-HPNE(胰臟類上皮細胞)。在進行分析實驗前,先利用西方墨點分析來確認MAGE-A3於各細胞的表現。如第2圖所示,MAGE-A3僅會表現於癌細胞,在正常細胞則不會偵測到其表現。
為觀察Ap52與MAGE-A3呈現細胞間的結合,先將Ap52與Cy3接合(即Ap52-Cy3),再將Ap52-Cy3投予至貼附細胞,並於16、24及48小時後收集細胞進行分析。以鈣黃綠素AM(Calcein AM)標記細胞質;待適體結合及洗滌後,利用DAPI來標記細胞核。雷射掃描共軛焦顯微鏡的分析結果顯示,細胞培養48小時後,可清楚觀察到Cy3的訊號。如第3圖所示,Cy3訊號會表現於7種不同的癌細胞上:SK-MEL-28細胞(第3a圖)、MCF-7細胞(第3b圖)、Cal-27細胞(第3c圖)、DLD-1細胞(第3d圖)、HepG2細胞(第3e圖)、A549細胞(第3f圖)及AsPC-1細胞(第3g圖);相對地,在正常/非癌化的細胞上,則僅能觀察到背景值:HEM-a細胞(第3h圖)、MCF-10A細胞(第3i圖)、OMF細胞(第3j圖)、FHC細胞(第3k圖)、THLE-3細胞(第3l圖)、BEAS-2B細胞(第3m圖)及hTERT-HPNE細胞(第3n圖)。Ap52訊號的強弱大致與西方墨點分析顯示的MAGE-A3蛋白表現量相符(比較第2及3圖)。
進一步利用流式細胞儀來分析Ap52對癌細胞的結合專一性。如第4圖結果所示,相較於未經處理的對照組,7種癌細胞-MCF-7細胞(第4a圖)、DLD-1細胞(第4b圖)、HepG2細胞(第4c圖)、 A549細胞(第4d圖)、SK-MEL-28細胞(第4e圖)、Cal-27細胞(第4f圖)及AsPC-1細胞(第4g圖)在接受與Cy3接合之Ap52處理後,皆可偵測到螢光訊號(以星號標記處)。更具體來說,相較於其他種類的癌細胞,在DLD-1細胞(第4b圖)、SK-MEL-28細胞(第4e圖)及Cal-27細胞(第4f圖)可觀察到更高量的螢光訊號,此結果與西方墨點分析結果大致符合(比較第2圖及第4圖)。
上述結果指出,Ap52可專一標的至各種會表現MAGE-A3的癌細胞,而不會與不表現MAGE-A3之正常細胞/非癌化細胞結合。
2.3 與Ap52結合之MAGE-A3111-125
於細胞內的表現位置
第3圖顯示,主要會在細胞表面或邊緣觀察到與Cy3接合之適體所發散的訊號。為確認與本發明Ap52結合之MAGE-A3111-125
是否是位於細胞表面,分別以鈣黃綠素AM(細胞質染色,第5a圖)、DAPI (細胞核染色,第5b圖)及與Cy3接合之適體(第5c圖)處理SK-MEL-28細胞後,進行螢光顯微分析。結合圖(第5d圖)指出,與Cy3接合之Ap52會專一標的至SK-MEL-28細胞的表面,而不會與細胞質或細胞核結合。第10圖為癌細胞株SK-MEL-28的z軸連續切片照片;結果指出,與Cy3接合之Ap52所發散的螢光訊號主要係位於細胞邊緣或其表面。
據此,與本發明Ap52結合之MAGE-A3111-125
主要是表現於癌細胞的細胞膜上。
2.4 以MHC分子呈現MAGE-A3胜肽
本實施例係利用缺乏MHC且會表現全長之MAGE-A3蛋白的細胞(即K-562細胞)來證實Ap52的標的專一性;其中,Ap52可專一辨識MAGE-A3111-125
胜肽,而不會辨識/結合至MAGE-A3全長蛋白。相關結果繪示於第6圖。
依據流式細胞分析結果,K-562細胞不會與Cy3-Ap52結合(第6圖)。然而,將以GFP標記之cDNA轉染至細胞以暫時性表現MHC蛋白後,可發現Ap52會明顯結合至細胞上(第6c-f圖);其中,不會論是MHC I型(即HLA I或HLA-A)或MHC II型(即HLA II或HLA-DRB4)推測皆可呈現MAGE-A3111-125
胜肽,進而有效引發Cy3-Ap52結合至細胞上(第6d及6f圖)。表1總結了流式細胞分析的定量結果。
本實施例結果指出,Ap52可專一辨識且結合至以不同HLA分子呈現於細胞表面的MAGE-A3111-125
。
2.5 修飾Ap52
為增加DNA於環境或體液中的穩定性,本實施例提供一種經修飾的Ap52(標記為硫-Ap52,ThioAp52),其係具有7個硫代磷酸取代基(phosphorothioate substitute)。適體的核酸酶抗性試驗是於包含血清的細胞培養液中進行。如表2所述,6小時後,未經修飾的Ap52含量會減少至起始量的20%左右;24小時後,更會減少至起始量的10%左右。相較之下,硫-Ap52在經過6及24小時後,僅會分別減少至起始量的50%及30%。此外,與Cy3接合之Ap52亦可增加適體的穩定性,且二種不同的修飾方法會產生相加乘的保護功效(表2)。因此,以不同化學修飾後的適體可進一步使用於未來各式診斷及治療應用中。
實施例2.1至2.5的結果證實,Ap52不僅會於活體外專一地結合至MAGE-A3111-125
胜肽,亦會專一地標的至癌細胞表面的MAGE-A3111-125
胜肽,其中該MAGE-A3111-125
胜肽是由MHC呈現於癌細胞之表面。此外,結果亦證實,適當地修飾Ap52(例如加入硫代磷酸取代基或以螢光染劑接合)可增加適體的穩定性。
實施例3 定性Ap16
如SELEX所示,適體的親和性及專一性主要是取決於中央隨機區域;位於中央隨機區域上游及下游的序列僅提供一輔助性辨識。據此,為了解Ap52的中央隨機區域是否亦可專一辨識MAGE-A3111-125
,本實施例將進一步分析該區域(具有16個核苷酸,AGCACTCAATATTCCC,序列編號:1,以下簡稱Ap16)對MAGE-A3之結合親和力。
3.1 Ap16或Ap52對MAGE-A3111-125
的結合親合力
等溫滴定微量熱儀(Isothermal titration calorimetry, ITC)是一種用以測量二分子間作用力的技術;實施例3.1即是利用該技術來分析Ap16及Ap52對MAGE-A3111-125
胜肽的結合親合力。如第7A及7B圖所示,Ap16(第7A圖)及Ap52(第7B圖)對MAGE-A3111-125
胜肽的結合親合力相差不到2倍;結果顯示,Ap16 對MAGE-A3111-125
胜肽的解離常數約為95 nM,Ap52對MAGE-A3111-125
胜肽的解離常數則約為57 nM。因此,Ap52及Ap16皆可有效結合至MAGE-A3111-125
胜肽。
3.2 Ap16對癌細胞的專一性
基於實施例3.1的分析結果,實施例3.2將進一步檢測Ap16對惡性黑色素瘤細胞株SK-MEL-28的細胞標的特性。先將Ap16與Cy3接合後,將該接合物與SK-MEL-28細胞依前述步驟共同培養。利用共軛焦雷射掃描顯微鏡來觀察Cy3所發散的螢光訊號,並據以分析Ap16與SK-MEL-28細胞間的結合特性。如第8a圖所示,與Cy3結合之Ap16可有效結合至SK-MEL-28細胞表面及邊緣。此外,觀察到的Ap16-Cy3螢光強度會大於等於Ap52-Cy3結合至細胞所發散的螢光強度(結果未顯示)。另一條由SELEX篩選出、亦具有16個核苷酸的核酸片段(序列編號:7,以下簡稱Ap16-對照組),由於已證實無法結合至MAGE-A3111-125
,將作為之後實驗的負對照組。實驗結果顯示,與Cy3結合之Ap16-對照組在與SK-MEL-28細胞共同培養後,僅可觀察到背景值(第8b圖)。相似地,與Cy3結合之Ap16(第8c圖)或Ap16-對照組(第8d圖)在與正常HEM-a共同培養後,亦無法觀察到螢光訊號;意即,Ap16不會結合至正常HEM-a細胞。該些結果指出,Ap16序列即足以專一地結合至細胞表面的MAGE-A3111-125
胜肽。
除了黑色素瘤細胞,亦利用其他不同類型的癌細胞來檢測Ap16對癌細胞的結合專一性。第9圖的結果證實,與Cy3結合的Ap16可成功地結合至乳癌細胞株MCF-7(第9a圖)及口腔癌細胞株Cal-27(第9c圖)的細胞表面,卻不會結合至乳房正常細胞株MCF-10A(第9b圖)及口腔正常細胞株OMF(第9d圖)。利用共軛焦顯微鏡來分析SK-MEL-28黑色素瘤細胞株(第10a圖)及Cal-27口腔癌細胞(第10b圖)則清楚顯示,螢光訊號會表現於細胞邊緣或表面。第11圖之照片為第10a圖細胞的z軸連續影像,其中數字代表SK-MEL-28黑色素瘤細胞的連續切片分析圖。據此,Ap16與Ap52皆可專一標的至會表現MAGE-A3的癌細胞。
如同上述,適體的上游及下游序列僅參與適體結構及功能的調控,因此,在某些情況下,該些序列非為必要性序列。本發明的結果即證實,Ap16或Ap52的中央隨機區域本身即足以有效且專一地結合至MAGE-A3111-125
。據此,對於某些僅能以較短之寡核苷酸進行特定標的的研究/應用,Ap16或可取代Ap52,作為更符合相關需求的生物性工具。
總結上述, Ap52及Ap16皆可高親和性且專一性地結合至腫瘤相關抗原MAGE-A3111-125
胜肽,據以標的不同類型的癌細胞。相較於其他種試劑,適體本身具有的優勢,加上利用SELEX篩選即可進行合成,促使適體可廣泛地用以偵測各式腫瘤相關抗原。因此,本發明寡核苷酸適體可有效標的癌細胞的特性,將提供診斷及治療等應用領域另一種選擇。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例,然其並非用以限定本發明,本發明所屬技術領域中具有通常知識者,在不悖離本發明之原理與精神的情形下,當可對其進行各種更動與修飾,因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
無
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂,所附圖式之說明如下: 第1圖是依據本揭示內容實施例2之聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)結果繪示出Ap52與特定胜肽間結合親和性及專一性的照片,該試驗係先將胜肽MAGE-A3111-125
(+)、NY-ESO-1119-143
(N1)、NY-ESO-1157-170
(N2)、NY-ESO-187-111
(N3)或無胜肽(-)與Ap52進行反應後,經沖提純化,再利用PCR增殖放大;PB在此作為寡核苷酸適體的實驗對照組; 第2圖是依據本揭示內容實施例2之西方墨點分析結果所繪示出的照片,其係關於MAGE-A3於特定癌細胞株的表現量; 第3圖是依據本揭示內容實施例2之共軛焦雷射掃描顯微影像所繪示出的照片,其係關於與靛青染料3(Cyanine 3, Cy3)接合之Ap52與不同細胞的結合:(a)SK-MEL-28細胞、(b)MCF-7細胞、(c)Cal-27細胞、(d)DLD-1細胞、(e)HepG2細胞、(f)A549細胞、(g)AsPC-1細胞、(h)HEM-a細胞、(i)MCF-10A細胞、(j)OMF細胞、(k)FHC細胞、(l)THLE-3細胞、(m)BEAS-2B細胞或(n)hTERT-HPNE細胞;所有的顯微影像皆是Cy-3(紅色,激發波長為561奈米)、DAPI(藍色,核染色,激發波長為405奈米)及鈣黃綠素AM(Calcein AM,綠色,細胞質染色,激發波長為488奈米)染色影像的結合重疊圖; 第4圖是依據本揭示內容實施例2之流式細胞分析結果所繪示出的曲線圖,其係關於與Cy3接合之Ap52可標的至不同的癌細胞株:(a)MCF-7細胞、(b)DLD-1細胞、(c)HepG2細胞、(d)A549細胞、(e)SK-MEL-28細胞、(f)Cal-27細胞及(g)AsPC-1細胞;右側曲線代表與Cy3接合之Ap52和特定細胞的結合,並以星號標記結合後發散的螢光訊號;未處理的細胞在此作為實驗對照組(左側曲線); 第5圖是依據本揭示內容實施例2之共軛焦雷射掃描顯微影像所繪示出的照片,其係關於與Cy3接合之Ap52可標的至癌細胞株SK-MEL-28,其中SK-MEL-28細胞是分別以(a)鈣黃綠素AM(綠色,細胞質染色,激發波長為488奈米)、(b)DAPI(藍色,核染色,激發波長為405奈米)及(c)與Cy3接合之Ap52(紅色,激發波長為561奈米)處理;(d)為(a)、(b)及(c)圖的結合重疊影像; 第6圖是依據本揭示內容實施例2之流式細胞分析所繪示出的螢光量化結果,其係關於(a)K-562細胞,(b)以與Cy3結合之Ap52處理的K-562細胞,(c)表現以綠色螢光蛋白(green fluorescent protein, GFP)標記之HLA-I的K-562細胞,(d)表現以GFP標記之HLA-I,且以Cy3-Ap52處理的K-562細胞,(e)表現以GFP標記之HLA-II的K-562細胞,及(f)表現以GFP標記之HLA-II,且以Cy3-Ap52處理的K-562細胞的螢光表現量,其中(d)及(f)中雙螢光表現細胞(右上矩形)代表與Cy3-Ap52結合之GFP表現細胞; 第7A圖是關於實施例2之Ap52與MAGE-A3111-125
胜肽的結合分析數據,其係利用等溫滴定微量熱儀測量來進行測量,上圖係原始滴定數據,該數據顯示將適體注入胜肽後所產生的熱能,各高峰則表各單次注入;下圖為滴定曲線圖,該圖顯示各滴定的整合式熱能;由滴定結果及一組位置結合模式(one-set-of sites binding model,MicroCal Origin 7)所得之熱能參數為Ap16:K d
= 95 nM,DH
=每莫耳-41千卡;Ap52:K d
= 57 nM,DH
=每莫耳-24千卡; 第7B圖是關於實施例3之Ap16與MAGE-A3111-125
胜肽的結合分析數據,其係利用等溫滴定微量熱儀測量來進行測量,上圖係原始滴定數據,該數據顯示將適體注入胜肽後所產生的熱能,各高峰則表各單次注入;下圖為滴定曲線圖,該圖顯示各滴定的整合式熱能;由滴定結果及一組位置結合模式(one-set-of sites binding model,MicroCal Origin 7)所得之熱能參數為Ap16:K d
= 95 nM,DH
=每莫耳-41千卡;Ap52:K d
= 57 nM,DH
=每莫耳-24千卡; 第8圖是依據實施例3之共軛焦雷射掃描顯微影像所繪示出的照片,其係關於與Cy3結合之Ap16與皮膚癌細胞株SK-MEL-28(a)或正常細胞株HEM-a(c)的結合;此外,實施例3之與Cy3結合的Ap16-對照組亦與SK-MEL-28(b)或HEM-a(d)共同培養,作為標的對照之用;所有的顯微影像皆是Cy-3(紅色,激發波長為561奈米)、DAPI(藍色,核染色,激發波長為405奈米)及鈣黃綠素AM(Calcein AM,綠色,細胞質染色,激發波長為488奈米)染色影像的結合重疊圖; 第9圖是依據實施例3之共軛焦雷射掃描顯微影像所繪示出的照片,其係關於與Cy3結合之Ap16與乳癌細胞株MCF-7(a)、乳房正常細胞株MCF-10A(b)、口腔癌細胞株Cal-27(c)及口腔正常細胞株OMF(d)之間的結合;所有的顯微影像皆是Cy-3(紅色,激發波長為561奈米)、DAPI(藍色,核染色,激發波長為405奈米)及鈣黃綠素AM(Calcein AM,綠色,細胞質染色,激發波長為488奈米)染色影像的結合重疊圖; 第10圖是依據實施例3之共軛焦雷射掃描顯微影像所繪示出的照片,其係關於與Cy3結合之Ap16可標的至黑色素瘤細胞株SK-MEL-28(a)及口腔癌細胞株Cal-27(b);所有的顯微影像皆是Cy-3(紅色,激發波長為561奈米)、DAPI(藍色,核染色,激發波長為405奈米)及鈣黃綠素AM(Calcein AM,綠色,細胞質染色,激發波長為488奈米)染色影像的結合重疊圖;以及 第11圖是依據實施3之共軛焦雷射掃描顯微影像所繪示出的照片,其係以與Cy3結合之Ap16處理SK-MEL-28細胞株後,利用共軛焦雷射掃描顯微鏡來分析SK-MEL-28細胞株之Z軸的連續切片影像;所有的顯微影像皆是Cy-3(紅色,激發波長為561奈米)、DAPI(藍色,核染色,激發波長為405奈米)及鈣黃綠素AM(Calcein AM,綠色,細胞質染色,激發波長為488奈米)染色影像的結合重疊圖。
根據慣常的作業方式,圖中各種特徵與元件並未依比例繪製,其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。
<110> 中央研究院 <120> 用以標的黑色素瘤相關抗原A3胜肽之適體及其用途 <130> P2803-TW <160> 7 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> Ap16 <400> 1 agcactcaat attccc 16 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> Ap16的上游序列 <400> 2 atccagagtg acgcagca 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> Ap16的下游序列 <400> 3 tggacacggt ggcttagt 18 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> MAGE-A3序列 <400> 4 Arg Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg 1 5 10 15 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> PB的上游序列 <400> 5 ataggagtcg accgacac 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> PB的下游序列 <400> 6 gtctacatct aagctcat 18 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> Ap16-負對照 <400> 7 atcattcgga tgtgtg 16
Claims (35)
- 一種寡核苷酸適體,其可標的至一由主要組織相容複體(major histocompatibility complex,MHC)呈現於一細胞之表面的胜肽,其中該寡核苷酸適體是一具有序列編號:1的核苷酸序列,或是一依序由序列編號:2、1及3所組成的核苷酸序列。
- 如請求項1所述之寡核苷酸適體,其中該胜肽係源自黑色素瘤相關抗原A3(melanoma-associated antigen A3,MAGE-A3)。
- 如請求項2所述之寡核苷酸適體,其中該胜肽具有序列編號:4的胺基酸序列。
- 如請求項1所述之寡核苷酸適體,其中該細胞係源自於一腫瘤,而該腫瘤係選自由黑色素瘤(melanomas)、血癌(leukemia)、大腸直腸癌(colorectal carcinoma)、舌癌(tongue carcinoma)、食道癌(esophageal carcinomas)、胃癌(gastric carcinomas)、肺癌(lung cancer)、多發性骨髓瘤(multiple myeloma)、膀胱癌(bladder cancer)、乳癌(breast cancer)、胰臟癌(pancreatic cancer)、腎臟癌(renal cancer)、肝癌 (hepatocellular carcinoma)、卵巢癌(ovarian cancer)、前列腺癌(prostate cancer)及頭頸部鱗狀細胞癌(headand neck squamous cell carcinoma)所組成的群組。
- 如請求項1所述之寡核苷酸適體,其中該寡核苷酸適體可利用一或多化學基團來進行修飾,且該化學基團可以是2’-嘧啶氨基團(2’-aminopyrimidinyl group)、2’-O-甲基嘌呤基團(2’-O-methylpurinyl group)、5’-二烷基團(5’-dialkyl group)、硫代磷酸帽(phosphorothioate cap)、2’-OH核苷酸(2’-OH nucleotides)、2’-氟嘧啶(2’-Fluoropyrimidine)或5-(1-戊炔基)-2’-去氧尿苷(5-(1-pentynyl)-2’-deoxyuridine)。
- 如請求項5所述之寡核苷酸適體,其中該寡核苷酸適體係利用硫代磷酸帽來進行修飾。
- 如請求項1所述之寡核苷酸適體,其中該寡核苷酸適體係與一螢光染劑、一報導分子、一顯影劑、一抗癌藥物、一胜肽或一粒子接合。
- 如請求項7所述之寡核苷酸適體,其中該粒子是一氧化鐵磁性粒子。
- 如請求項7所述之寡核苷酸適體,其中該寡核苷酸適體是與螢光染劑接合。
- 如請求項1所述之寡核苷酸適體,更包含一抗癌藥物與其接合。
- 如請求項10所述之寡核苷酸適體,其中該抗癌藥物可以是甲基二胺(mechlorethamine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、黴法蘭(melphalan)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、依弗醯胺(ifosfamide)、硫酸布他卡因(busulfan)、N-亞硝基-N-甲脲(N-Nitroso-N-methylurea)、雙氯乙基亞硝脲(carmustine)、環己亞硝(lomustine)、司莫司汀(semustine)、福莫司汀(fotemustine)、鏈佐黴素(streptozotocin)、達卡巴嗪(dacarbazine)、米托唑胺(mitozolomide)、替莫唑胺(temozolomide)、沙奧特帕(thiotepa)、亞絲醌(diaziquone)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、益樂鉑(oxaliplatin)、胺甲喋呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡培他濱(capecitabine)、阿拉伯糖基胞嘧啶(cytarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、地西他濱(decitabine)、維達紮(vidaza)、氟達拉濱(fludarabine)、奈拉濱 (nelarabine)、克拉屈濱(cladribine)、氯法拉濱(clofarabine)、噴司他丁(pentostatin)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、硫醇嘌呤(mercaptopurine)、長春花生物鹼(vincaalkaloids)、紫杉烷類(taxanes)、愛萊諾替康(irinotecan)、拓撲替康(topotecan)、依妥普賽(etoposide)、阿黴素(doxorubicin)、雙羥恩(mitoxantrone)、坦尼坡賽(teniposide)、諾波黴素(novobiocin)、美巴龍(merbarone)、阿柔比星(aclarubicin)、蒽環抗生素(anthracyclines)、放線菌素(actinomycin)、博萊黴素(bleomycin)、普卡黴素(plicamycin)或絲裂黴素(mitomycin)。
- 一種寡核苷酸適體組合物,其可用以標的一由MHC呈現於一細胞表面之胜肽,其中該寡核苷酸適體組合物包含請求項1所述之寡核苷酸適體,及一藥學上可接受的賦形劑。
- 如請求項12所述之寡核苷酸適體組合物,其中該胜肽係源自MAGE-A3。
- 如請求項13所述之寡核苷酸適體組合物,其中該胜肽具有序列編號:4的胺基酸序列。
- 如請求項12所述之寡核苷酸適體組合物, 其中該細胞係源自一腫瘤,而該腫瘤係選自由黑色素瘤、血癌、大腸直腸癌、舌癌、食道癌、胃癌、肺癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、乳癌、胰臟癌、腎臟癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌及頭頸部鱗狀細胞癌所組成的群組。
- 如請求項12所述之寡核苷酸適體組合物,其中該寡核苷酸適體可利用一或多化學基團來進行修飾,且該化學基團可以是2’-嘧啶氨基團、2’-O-甲基嘌呤基團、5’-二烷基團、硫代磷酸帽、2’-OH核苷酸、2’-氟嘧啶或5-(1-戊炔基)-2’-去氧尿苷。
- 如請求項16所述之寡核苷酸適體組合物,其中該寡核苷酸適體是以硫代磷酸帽進行修飾。
- 如請求項12所述之寡核苷酸適體組合物,其中該寡核苷酸適體係與一螢光染劑、一報導分子、一顯影劑、一抗癌藥物、一胜肽或一粒子接合。
- 如請求項18所述之寡核苷酸適體組合物,其中該粒子是一氧化鐵磁性粒子。
- 如請求項18所述之寡核苷酸適體組合物,其中該寡核苷酸適體係與螢光染劑接合。
- 一種於活體外標的一細胞的方法,其中該細胞具有一由MHC呈現於細胞表面之胜肽,該方法包含將該細胞與一足夠劑量之請求項1所述的寡核苷酸適體共同培養,以使該寡核苷酸適體結合至該細胞。
- 如請求項21所述之方法,其中該胜肽係源自MAGE-A3。
- 如請求項22所述之方法,其中該胜肽具有序列編號:4的胺基酸序列。
- 如請求項21所述之方法,其中該細胞係源自一腫瘤,而該腫瘤係選自由黑色素瘤、血癌、大腸直腸癌、舌癌、食道癌、胃癌、肺癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、乳癌、胰臟癌、腎臟癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌及頭頸部鱗狀細胞癌所組成的群組。
- 如請求項21所述之方法,其中該寡核苷酸適體可利用一或多化學基團來進行修飾,且該化學基團可以是2’-嘧啶氨基團、2’-O-甲基嘌呤基團、5’-二烷基團、硫代磷酸帽、2’-OH核苷酸、2’-氟嘧啶或5-(1-戊炔基)-2’-去氧尿苷。
- 如請求項25所述之方法,其中該寡核苷 酸適體是以硫代磷酸帽進行修飾。
- 如請求項21所述之方法,其中該寡核苷酸適體係與一螢光染劑、一報導分子、一顯影劑、一抗癌藥物、一胜肽或一粒子接合。
- 如請求項27所述之方法,其中該粒子是一氧化鐵磁性粒子。
- 如請求項27所述之方法,其中該寡核苷酸適體係與螢光染劑接合。
- 一種如請求項1所述之寡核苷酸適體的用途,其係用以製備一可治療癌症的藥物。
- 如請求項30所述之用途,其中該腫瘤會表現一具有序列編號:4之胺基酸序列的胜肽。
- 如請求項30所述之用途,其中該腫瘤係選自由黑色素瘤、血癌、大腸直腸癌、舌癌、食道癌、胃癌、肺癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、乳癌、胰臟癌、腎臟癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌及頭頸部鱗狀細胞癌所組成的群組。
- 如請求項30所述之用途,其中該寡核苷酸適體係與一抗癌藥物接合,且該抗癌藥物可以是甲基二胺、環磷醯胺、黴法蘭、氮芥苯丁酸、依弗醯胺、硫酸布他卡因、N-亞硝基-N-甲脲、雙氯乙基亞硝脲、環己亞硝、司莫司汀、福莫司汀、鏈佐黴素、達卡巴嗪、米托唑胺、替莫唑胺、沙奧特帕、亞絲醌、順鉑、卡鉑、益樂鉑、胺甲喋呤、培美曲塞、氟尿嘧啶、卡培他濱、阿拉伯糖基胞嘧啶、吉西他濱、地西他濱、維達紮、氟達拉濱、奈拉濱、克拉屈濱、氯法拉濱、噴司他丁、硫鳥嘌呤、硫醇嘌呤、長春花生物鹼、紫杉烷類、愛萊諾替康、拓撲替康、依妥普賽、阿黴素、雙羥恩、坦尼坡賽、諾波黴素、美巴龍、阿柔比星、蒽環抗生素、放線菌素、博萊黴素、普卡黴素或絲裂黴素。
- 如請求項30所述之用途,其中該寡核苷酸適體可利用一或多化學基團來進行修飾,且該化學基團可以是2’-嘧啶氨基團、2’-O-甲基嘌呤基團、5’-二烷基團、硫代磷酸帽、2’-OH核苷酸、2’-氟嘧啶或5-(1-戊炔基)-2’-去氧尿苷。
- 如請求項30所述之用途,其中該寡核苷酸適體是以硫代磷酸帽進行修飾。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201462005433P | 2014-05-30 | 2014-05-30 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW201604281A TW201604281A (zh) | 2016-02-01 |
TWI546381B true TWI546381B (zh) | 2016-08-21 |
Family
ID=54699847
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW104117298A TWI546381B (zh) | 2014-05-30 | 2015-05-29 | 用以標的黑色素瘤相關抗原a3胜肽之寡核苷酸適體及其用途 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9976146B2 (zh) |
EP (1) | EP3149167B1 (zh) |
JP (1) | JP6313478B2 (zh) |
TW (1) | TWI546381B (zh) |
WO (1) | WO2015184224A1 (zh) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI642778B (zh) | 2016-11-17 | 2018-12-01 | 國立清華大學 | 對卵巢癌具有專一性的適合體及卵巢癌檢測方法 |
KR102015524B1 (ko) | 2016-12-26 | 2019-08-29 | 인터올리고 주식회사 | 압타머-약물 콘쥬게이트 및 그 용도 |
KR102154683B1 (ko) * | 2019-11-08 | 2020-09-11 | 주식회사 압타머사이언스 | 글리피칸-3 특이적 변형 압타머 및 이의 용도 |
CN114317545B (zh) * | 2022-01-19 | 2023-12-15 | 南京大学 | 一种核酸适体及其应用 |
CN114507668B (zh) * | 2022-03-04 | 2023-05-16 | 中南大学湘雅医院 | 一种同时识别多种恶性肿瘤细胞的核酸适体及其应用 |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6291430B1 (en) * | 1997-09-12 | 2001-09-18 | Ludwig Institute For Cancer Research | Mage-3 peptides presented by HLA class II molecules |
US5965535A (en) * | 1997-09-12 | 1999-10-12 | Ludwig Institute For Cancer Research | Mage-3 peptides presented by HLA class II molecules |
IT1309584B1 (it) * | 1999-02-26 | 2002-01-24 | San Raffaele Centro Fond | Peptidi immunogenici derivati da mage-3 presentati da mhc di classeii e loro uso. |
AU2004279441B2 (en) * | 2003-10-08 | 2010-07-01 | The Feinstein Institute For Medical Research | Methods and compositions for diagnosis and treatment of B cell chronic lymphocytic leukemia |
US20110038865A1 (en) * | 2007-06-26 | 2011-02-17 | University Of Miami | Antibody- endostatin fusion protein and its variants |
WO2010071852A2 (en) * | 2008-12-19 | 2010-06-24 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Oligonucleotide micelles |
CA2767767A1 (en) * | 2009-07-30 | 2011-02-03 | Helmholtz-Zentrum Fuer Infektionsforschung Gmbh | Compositions for generating an antigen specific immune response |
CA2806921C (en) * | 2010-07-23 | 2019-11-26 | Trustees Of Boston University | Anti-despr inhibitors as therapeutics for inhibition of pathological angiogenesis and tumor cell invasiveness and for molecular imaging and targeted delivery |
US9241920B2 (en) * | 2011-10-27 | 2016-01-26 | New York University | Inhibition of c-Myc ubiquitination to prevent cancer initiation and progression |
AU2013243948A1 (en) * | 2012-04-02 | 2014-10-30 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease |
CA2870288A1 (en) * | 2012-04-10 | 2013-10-17 | John J. Rossi | Rna aptamers for therapeutic and diagnostic delivery to pancreatic cancer cells |
WO2014005153A2 (en) * | 2012-06-29 | 2014-01-03 | University Of Rochester | Methods for treating mds1-evi1 mediated cancer |
CN102766634B (zh) * | 2012-08-09 | 2013-09-11 | 武汉大学 | 一种靶向人高转移肝癌细胞的单链dna适配子及其应用 |
-
2015
- 2015-05-29 TW TW104117298A patent/TWI546381B/zh active
- 2015-05-29 EP EP15798948.4A patent/EP3149167B1/en active Active
- 2015-05-29 WO PCT/US2015/033115 patent/WO2015184224A1/en active Application Filing
- 2015-05-29 JP JP2016569074A patent/JP6313478B2/ja active Active
- 2015-05-29 US US15/312,667 patent/US9976146B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20170183660A1 (en) | 2017-06-29 |
JP2017517260A (ja) | 2017-06-29 |
WO2015184224A1 (en) | 2015-12-03 |
JP6313478B2 (ja) | 2018-04-18 |
TW201604281A (zh) | 2016-02-01 |
EP3149167A1 (en) | 2017-04-05 |
EP3149167A4 (en) | 2017-12-27 |
EP3149167B1 (en) | 2019-09-04 |
US9976146B2 (en) | 2018-05-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TWI546381B (zh) | 用以標的黑色素瘤相關抗原a3胜肽之寡核苷酸適體及其用途 | |
CN116159242A (zh) | 使用交变电场提高细胞膜通透性 | |
CN106164293A (zh) | 适配子构建体 | |
TWI627965B (zh) | 腸道纖維化處置劑 | |
KR101556339B1 (ko) | 페리오스틴에 대한 압타머 및 이를 포함하는 항암제 조성물 | |
TW202102272A (zh) | 光免疫療法之方法及相關之生物標記 | |
EA023864B1 (ru) | Применение мацитентана в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством и/или лучевой терапией для лечения метастазов в головном мозге | |
TW202034959A (zh) | 抗體-藥物結合物與parp抑制劑之組合 | |
Kong et al. | Therapeutic targets in subependymoma | |
TW201821125A (zh) | 皮膚纖維化症治療劑 | |
US10640772B2 (en) | DNA aptamers binding to molecular targeted agents and detection method of molecular targeted medicine using the same | |
US20230055235A1 (en) | Anti-cancer immunotherapeutic composition for treating cancer | |
EP3038609B1 (en) | Cytotoxic t cell response modifiers | |
US20230127087A1 (en) | Glypican-3-specific modified aptamer and use thereof | |
JP2022519116A (ja) | がん療法において使用するためのデオキシシチジン誘導体又はデオキシウリジン誘導体 | |
Liu et al. | Engineered stem cell biomimetic liposomes carrying levamisole for macrophage immunity reconstruction in leukemia therapy | |
KR101730036B1 (ko) | Dna 결합 단백질을 이용한 나노입자 클러스터 제작방법 | |
JP2011093852A (ja) | クラスリン結合性ペプチド誘導体 | |
EP3883545A1 (en) | Nanoplexed poly(i:c) formulations and uses thereof | |
JP2016021883A (ja) | ヒト大腸癌細胞Colo205に特異的に結合する核酸 | |
JP2021534790A (ja) | 血液脳関門を通過するアプタマー及びその応用 | |
KR101585192B1 (ko) | 나노막대-기반 나노 복합 세포내 운반체 | |
KR102101179B1 (ko) | 유방암유래 암줄기세포의 선택적 표적치료를 위한 나노복합체 제조방법 | |
Martinelli | Multiple roles of circulating tumor cells and exosomes in cancer metastasis: implications for therapeutic intervention | |
JP2024046855A (ja) | インテグリンα7β1受容体に対する結合能を有するDNAアプタマー |