JP2011093852A - クラスリン結合性ペプチド誘導体 - Google Patents
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Abstract
【課題】単独で細胞内に内在化し、ＧＲＰ７８のクラスリンへの結合を競合的に阻害することで、抗癌剤と共に投与されたときに優れた抗癌作用を奏し、安全であって、抗癌剤と併用しても副作用が少なく、低分子であって、安価に歩留まりよく大量生産可能なクラスリン結合性ペプチド誘導体、及びそれを含有する薬物輸送材料を提供する。
【解決手段】Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐのアミノ酸配列を含む、クラスリン結合性ペプチド誘導体。クラスリン結合性ペプチド誘導体、又はそれがファージのコートタンパク質の末端に化学的結合によって延長されているペプチド組込みファージが、コロイド粒子に含有されており、その表面に前記クラスリン結合性ペプチド誘導体が露出した薬物輸送材料。
【選択図】なし
【解決手段】Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐのアミノ酸配列を含む、クラスリン結合性ペプチド誘導体。クラスリン結合性ペプチド誘導体、又はそれがファージのコートタンパク質の末端に化学的結合によって延長されているペプチド組込みファージが、コロイド粒子に含有されており、その表面に前記クラスリン結合性ペプチド誘導体が露出した薬物輸送材料。
【選択図】なし
Description
本発明は、単独で細胞内に内在化することができ、細胞に存在しているタンパク質であるクラスリンへその細胞内で結合でき、クラスリンへ結合しているタンパク質でとりわけ癌細胞に多数存在しているタンパク質であるＧＲＰ７８との結合を競合的に阻害することによって、癌の治療や診断に用いることができるクラスリン結合性ペプチド誘導体に関するものである。
死亡率の高い死因の一つに、癌疾患がある。癌疾患の治療方法として、癌組織のみならずその周辺組織を摘出するという患者への侵襲性が高い外科療法、癌組織へのＸ線やγ線や電子線の照射のような放射線療法、抗癌剤の経口投与や静脈注射により癌組織の癌細胞を損傷するが正常細胞も損傷してしまうため悪心、嘔吐、脱毛、白血球・血小板減少、肝機能・腎機能障害などの副作用を誘発してしまう化学療法などがある。
癌疾患のうち胆管癌疾患は、胆管支樹の管上皮から発症するものである。その胆管癌は、解剖組織学的に肝内胆管癌と肝外胆管癌とに分類される悪性腫瘍である。胆管癌、特に肝内胆管癌の発症率や死亡率は、人種や地域を問わず増加傾向にある。
肝外胆管等の大胆管で発症した胆管癌は臨床的に見付け易いので早期発見され易いものであるが、肝内胆管等の小胆管で発症した胆管癌は臨床的に見付け難く転移性病変が胆管閉塞となって症状が現れるまで発見され難いものである。
様々な癌の化学療法に用いられる薬剤として、例えば特許文献１に、制癌剤が封入されたリポソーム製剤が開示されている。その中で制癌剤として挙げられているシスプラチン等の抗癌剤は、胆管癌が発見されてから投与したとしてもその胆管癌細胞に対する抗癌効果が弱い。また、管腔を拡張させるステント術を併用した放射線療法は、胆管閉塞が発見された後の胆管癌の対処療法として効果的であるが、胆管癌を完治させるものではない。時に肝内胆管癌は肝内転移や遠隔転移を引き起こし易く、通常の癌疾患に有効な化学療法や放射線療法によっても十分な延命効果が無い。
今のところ胆管癌原発巣やその周辺組織の完全な摘出が、最も有効な胆管癌の治療方法である。しかし、胆管癌原発巣を摘出した場合でさえ、予後が非常に悪く、５年後の生存率は、高々４０％である。
最近、癌治療医薬として、癌細胞を標的にする抗体断片、抗体の可変領域であるＦｖ分子からなる一本鎖抗体、成長因子等が開発されるようになっている。例えば、非特許文献１に、乳癌の増殖を抑制するものとして、癌細胞表面のタンパク質であるＨＥ２に特異的に結合する抗体であるトラスツズマブが開示され、非特許文献２に、胆管癌を治療するために、上皮成長因子受容体に結合する抗体であるセツキシマブと低分子抗癌剤である含フッ素ヌクレオシドであるゲムシタビンとの併用医薬が開示されている。トラスツズマブやセツキシマブのような抗体は、高分子のタンパク質なので、患者の体内で非自己の異物タンパク質と認識されて患者自身の抗体によって中和されてしまい、持続して抗癌効果を奏しない恐れがある。しかもこのような抗体は、大量生産に向かず、面倒な製造工程を必要とするため高価である。
ジ オンコロジスト（Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ）、２００６年、第８巻、ｐ．８５７−８６７
ビーエムシー キャンサー（ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ）、２００６年、第６巻、ｐ．１９０−１９５
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、単独で細胞内に内在化し、ＧＲＰ７８のクラスリンへの結合を競合的に阻害することで、抗癌剤と共に投与されたときに優れた抗癌作用を奏し、安全であって、抗癌剤と併用しても副作用が少なく、低分子であって、安価に歩留まりよく大量生産可能なクラスリン結合性ペプチド誘導体、及びそれを含有する薬物輸送材料を提供することを目的とする。
前記の目的を達成するためになされた、特許請求の範囲の請求項１に記載されたクラスリン結合性ペプチド誘導体は、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐのアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
請求項２に記載のクラスリン結合性ペプチド誘導体は、請求項１に記載されたもので、前記アミノ酸配列のみからなることを特徴とする。
請求項３に記載のクラスリン結合性ペプチド誘導体は、請求項１に記載されたもので、前記アミノ酸配列に、ビオチン含有化合物、及び／又は蛍光色素が結合されている標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体であることを特徴とする。
請求項４に記載のペプチド組込みファージは、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐのアミノ酸配列を含むクラスリン結合性ペプチド誘導体が、ファージのコートタンパク質の末端に、化学的結合によって延長されていることを特徴とする。
請求項５に記載の薬物輸送材料は、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐのアミノ酸配列を含むクラスリン結合性ペプチド誘導体、又はそれがファージのコートタンパク質の末端に化学的結合によって延長されているペプチド組込みファージが、含有されていることを特徴とする。
請求項６に記載の薬物輸送材料は、請求項５に記載されたもので、前記クラスリン結合性ペプチド誘導体又は前記ペプチド組込みファージが、コロイド粒子、造影材料及び／又は磁性粒子に、含有、結合又は共存され、その表面に前記クラスリン結合性ペプチド誘導体が露出していることを特徴とする。
請求項７に記載の薬物輸送材料は、請求項６に記載されたもので、前記コロイド粒子、造影材料及び／又は磁性粒子が、癌治療剤、又は癌診断剤を含んでいることを特徴とする。
本発明のクラスリン結合性ペプチド誘導体は、クラスリンに結合するＧＲＰ７８を多く有する癌組織の細胞、中でも特に胆管癌細胞に大量に集積し、正常細胞に僅かしか集積しないものであるから、細胞選択的なものである。その特性により、このクラスリン結合性ペプチド誘導体は、癌細胞へ優先的に競合して結合し、正常細胞の細胞分裂促進のような有害事象を発現せず、安全性が高いものである。
このクラスリン結合性ペプチド誘導体は、別な抗癌剤と併用されて相乗的に特に優れた抗癌作用を奏するので、別な抗癌剤の所為による重篤な副作用を軽減して、患者の肉体的・精神的負担を大幅に軽減することができるものである。
このクラスリン結合性ペプチド誘導体は、簡易な構造であり、安価に歩留まり良く、大量生産可能であるから、汎用性に優れている。
このクラスリン結合性ペプチド誘導体は、癌の治療剤や診断薬やそれらの簡便で汎用性の高い原材料として、癌、特に胆管癌の診療のために、用いられる。
ビオチン含有化合物や蛍光色素が結合されたクラスリン結合性ペプチド誘導体は、術前に経皮的胆管ドレナージにより採取した胆汁中の胆管癌細胞の有無を医師や臨床検査技師が組織染色のような方法で簡易かつ迅速に判断することができる診断薬の有効成分として、用いることができるものである。
蛍光色素が結合されたクラスリン結合性ペプチド誘導体は、胆管ドレナージチューブが挿入された胆管癌患者のそのドレナージチューブから胆管内に投与されて、胆管癌に選択的に結合されることにより、従来、癌摘出前に診断が不可能であった胆管癌の進展範囲を、切除前に判定することが可能となるので、手術術式の決定に役立つ診断薬の有効成分として、用いることができるものである。
本発明のペプチド組込みファージは、コートタンパク質のＮ末端がクラスリン結合性ペプチド誘導体で修飾されているので、ＧＲＰ７８を多量に有する癌組織の細胞への集積性に優れているものである。
本発明の薬物輸送材料は、クラスリン結合性ペプチド誘導体やそれを組み込んだファージを含有しているので、クラスリンと結合するＧＲＰ７８を多量に有する癌組織の癌細胞、特に胆管癌細胞へ有意に集積するものである。
癌抑制遺伝子を組み込んだベクターや抗癌剤のような癌治療剤が含まれた薬物輸送材料、又は蛍光剤や造影剤のような癌診断剤が含まれた薬物輸送材料は、クラスリン結合ペプチド誘導体と含有、結合又は共存させることにより、正常細胞へ到達することなく、癌組織へ高濃度に迅速に到達する。
この癌治療剤が含まれた薬物輸送材料によれば、癌治療剤を癌細胞に優先的に取り込ませて、癌治療効果を高めることができる。しかも、この薬物輸送材料によれば、正常組織の細胞への抗癌剤による損傷を最小限に抑えることができるので、癌患者の副作用を大幅に軽減することができる。
また、核磁気共鳴診断（ＭＲＩ）用やＸ線診断用の癌診断剤が含まれた薬物輸送材料によれば、癌、とりわけ胆管癌の癌原発巣に癌診断剤を集積させることができるので、画像診断の際に、癌原発巣を特異的に可視化することができ、診断の迅速化、正確化に資する。特にこの薬物輸送材料によれば、早期発見の困難な小胆管での発症初期段階の胆管癌を、特定することができる。また、この薬物輸送材料によれば、癌原発巣が多数出現する胆管癌原発巣全体を可視化したり、遠隔組織に転移した癌組織を特定したりすることができるものである。
薬物輸送材料は、クラスリン結合性ペプチド誘導体やペプチド組込みファージが、コロイド粒子や造影材料や磁性粒子に含有、結合又は共存されていると、薬物輸送に資する。造影材料例えば微小気泡造影剤に含有、結合又は共存されたクラスリン結合性ペプチド誘導体は、胆管ドレナージチューブが挿入された胆管癌患者のドレナージチューブから胆管内に投与されて、胆管癌に選択的に結合された後、体外から収束超音波を照射することにより、胆管癌細胞を選択的に加熱・殺傷することが可能となるので、このクラスリン結合性ペプチド誘導体は、新しい胆管癌の治療法開発のために用いることができるものである。
磁性粒子例えば磁性ナノ粒子に含有、結合又は共存されているクラスリン結合性ペプチド誘導体は、胆管ドレナージチューブが挿入された胆管癌患者のドレナージチューブから胆管内に投与されて、胆管癌に選択的に結合された後、体外から磁場を与えることにより、胆管癌細胞を選択的に加熱・殺傷することが可能となるので、このクラスリン結合性ペプチド誘導体は、新しい胆管癌の治療法開発のために用いることができるものである。
以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの形態に限定されるものではない。
本発明のクラスリン結合性ペプチド誘導体は、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（１文字表記；ＴＰＶＬＥＴＰＫＬＬＬＷ）で示される１２残基のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
このポリペプチドからなるクラスリン結合性ペプチド誘導体は、固相・液相合成により得られるものである。例えば市販のペプチドシンセサイザーを用い、必要に応じ導入・除去する９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基やtert−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基のような適当な保護基を用いペプチドカルボキシル末端から順次アミノ酸の縮合を行うことにより調製される。このアミノ酸配列をコードしたＤＮＡ断片が組込まれたベクターを細胞に取り込ませ、その細胞を増幅させて、このタンパク質を産生させ、必要に応じて単離して調製してもよい。
このようなクラスリン結合性ペプチド誘導体は、ランダムな配列を有するペプチドをバクテリオファージにディスプレイしたペプチド提示ファージライブラリーを用い、バイオパンニングを繰返すことにより、標的となる細胞に選択的に結合し得るリガンドを選択するという分子生物学的手法である所謂ファージディスプレイ法により特定されて同定されたものである。このファージディスプレイ法は、細胞表面抗原のような細胞表面マーカーの特定や精製にも用いられるものである。
クラスリン結合性ペプチド誘導体の同定に用いたペプチド提示ファージライブラリーは、Ｍ１３ファージのマイナーコートタンパク質（ｐＩＩＩ）に融合した任意の１２残基のアミノ酸の組み合わせを基にしたもので、約２．７×１０９通りの異なるアミノ酸配列を含んでいる。癌細胞のような標的細胞に選択的に結合するファージだけを回収、増幅させるバイオパンニングを連続して行うことで、標的細胞に対し結合するリガントとなる１２残基アミノ酸配列を有するペプチドを特定した。
この特定されたペプチドと結合する細胞のタンパク質をナノ流量高速液体クロマトグラフ−エレクトロスプレーイオン源−四重極−飛行時間型
タンデム質量分析計（ｎａｎｏ ＬＣ−ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳ）で分析した結果、このペプチドは細胞内物質輸送に関わるクラスリンと結合することが判明した。
タンデム質量分析計（ｎａｎｏ ＬＣ−ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳ）で分析した結果、このペプチドは細胞内物質輸送に関わるクラスリンと結合することが判明した。
このようなクラスリンは、輸送小胞として機能する細胞質ゾル中のタンパク質であり、上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）を包含する様々なリガンド誘導受容体の応答低下や栄養分の取り込みに必要であり、タンパク質分泌間にトランスゴルジネットワークのタンパク質での振り分けに必要なものである。また、クラスリンは、細胞分裂に不可欠なものである。さらに、クラスリンはタンパク質を正常な形に形成させる分子シャペロンである７８ｋＤａのグルコース制御性タンパク質７８（ＧＲＰ７８）と結合するものである。ＧＲＰ７８は、ポリペプチドやタンパク質の折り畳み、成熟、輸送に重要なシャペロンとして機能する熱ショックタンパク質７０の一種である。ＧＲＰ７８はまた、エストロゲンレセプターを維持したり細胞死から保護したりすると共に、グルコース飢餓、低酸素のようなストレス状態を回復する折り畳み不全タンパク質応答に、重要なものである。
このクラスリン結合性ペプチド誘導体が主に癌細胞に結合する理由は、その詳細が必ずしも明らかでないが、癌細胞は、正常細胞よりもＧＲＰ７８を多く発現しており、正常細胞よりもこのクラスリン結合性ペプチド誘導体を取り込む作用、即ち細胞質への移行作用が強いからであると推察される。また、癌細胞の増殖が抑制されるメカニズムは、その詳細が必ずしも明らかではないが、小胞体（ＥＲ）ストレスが負荷された際に特異的に発現が誘導される分子シャペロンであるＧＲＰ７８が、種々の固形癌細胞で、ＥＲストレス応答の亢進に応じて多く認められているものの、クラスリン結合性ペプチド誘導体がＧＲＰ７８のクラスリン結合を競合阻害することによって、抗癌作用を発現しているものと推察される。
このクラスリン結合性ペプチド誘導体は、１２残基のアミノ酸配列のみからなる例を示したが、それを一部に含むポリペプチドであってもよく、アミノ酸配列のアミノ酸残基上のアミノ基、カルボキシル基、及びその他の活性水素の少なくとも１つの基に、直接的に、又はスペーサー基を介して間接的に、ビオチン含有化合物及び／又は蛍光色素が結合された標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体であってもよい。
この標識化されたクラスリン結合性ペプチド誘導体は、以下のようにして合成される。具体的に、１２残基のアミノ酸配列のアミノ酸残基中のアミノ基にビオチンが結合したビオチン標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体を例に説明する。ジメチルスルホキシドやジメチルホルムアミドのような有機溶媒に溶かしたＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン（ＮＨＳ−ビオチン）を、１２残基のアミノ酸配列のみからなるクラスリン結合性ペプチド誘導体である原料ポリペプチドが溶解したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に加えて、反応させる。ＮＨＳ−ビオチンのＮＨＳ基を介して、この原料ポリペプチドのアミノ酸配列中のアミノ酸残基のアミノ基とビオチンとが結合して、ビオチン標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体が得られる。
また、１２残基のアミノ酸配列のアミノ酸残基中のアミノ基に蛍光色素、例えばフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が結合した蛍光標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体を例に説明する。ジメチルスルホキシドやジメチルホルムアミドのような有機溶媒に溶かしたＦＩＴＣを、１２残基のアミノ酸配列のみからなるクラスリン結合性ペプチド誘導体である原料ポリペプチドが溶解した炭酸ナトリウム溶液に加えて反応させる。ＦＩＴＣのイソチオシアネート基を介して、この原料ポリペプチドのアミノ酸配列中のアミノ基とＦＩＴＣとが結合して、ＦＩＴＣ標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体が形成される。
ビオチン誘導体はビオチンの他に、ビーズにビオチンを固定したビオチンビーズが挙げられる。
蛍光色素はＦＩＴＣの他に、フィコエリスリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、４０５、４３０、４８８、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６３３、６４７、６８０、７００、７５０、７９０（インビトロジェン株式会社の製品；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒは登録商標）、インドシアニングリーン（第一三共株式会社製）が挙げられる。
本発明のペプチド組込みファージは、例えば、コートタンパク質のＮ末端部分にクラスリン結合性ペプチド誘導体が結合されているものである。ファージは、例えば、Ｍ１３ファージが挙げられる。
本発明の薬物輸送材料は、クラスリン結合性ペプチド誘導体、又はそれを組み込んだペプチド組込みファージがコロイド粒子に包含されることにより、コロイド粒子の表面に、癌細胞と結合するリガンドであるクラスリン結合性ペプチド誘導体が露出されているものである。コロイド粒子が、癌治療剤や癌診断剤を内包していてもよい。
薬物輸送材料は、例えば以下のようにして、調製される。クラスリン結合性ペプチド誘導体や組込みファージと、リポソームを形成するリン脂質と、必要に応じて、リポソームに内包される癌治療剤や癌診断剤とを分散させると、リポソームの表面にオリゴペプチドが露出した薬物輸送材料が得られる。薬物輸送材料は、クラスリン結合性ペプチド誘導体、又はそれを組み込んだペプチド組込みファージが、溶解又は懸濁した液であってもよい。
コロイド粒子は、例えば、リポソーム、金属含有コロイド粒子、生体分解性樹脂コロイド粒子、フチン酸含有コロイド粒子、硫黄コロイド粒子、タンパク質コロイド粒子が挙げられる。中でも、リポソームであることが好ましい。リポソームは、例えば、脂肪やリン脂質でできたコロイド粒子が挙げられ、より具体的には、ＳＵＶリポソーム（small unilamellar vesicle liposome：小さな１枚膜リポソーム）、ＲＥＶリポソーム（reversephase evaporation vesicle liposome：逆相蒸発法リポソーム）、またはＭＬＶリポソーム（multilamellar vesicle liposome：多重層リポソーム）が挙げられる。
このコロイド粒子に内包される癌治療剤として、癌抑制遺伝子を組み込んだベクターや抗癌剤が挙げられる。抗癌剤は、例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、塩酸ドキソルビシンであるアドリアシン（アドリアシンは登録商標）、パクリタキセルであるタキソール（タキソールは登録商標）が挙げられる。
このコロイド粒子に内包される癌診断剤として、例えば、［１α，２α（ｎ）−３Ｈ］コレステロール オレオイル エーテル、ガドリニウム含有造影剤が挙げられる。
造影材料として、例えば、超音波診断用や核磁気共鳴（ＭＲＩ）診断用などの微小気泡造影剤（マイクロバブル）、より具体的には、レボビスト（シェーリング社製、Levovist：レボビストは登録商標）、オプティソン（アマシャム社製、Optison：オプティソンは登録商標）、ソナゾイド（ＧＥヘルスケア社製、製品名）が挙げられる。
磁性粒子として、例えば１〜１０００ｎｍナノ粒子である磁性ナノ粒子、より具体的には、デキストランマグネタイトであるFerucarbotranのようなリゾビスト（バイエル薬品株式会社製、リゾビストは登録商標）が挙げられる。
以下、本発明の実施例を詳細に説明する。
ファージライブラリーを、Ｐｈ．Ｄ．−１２ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ（ニュー・イングランド・バイオラボ社の製品名）で作製し、ヒト胆管癌細胞に対して結合する１２残基のアミノ酸配列を提示するファージを調製した。以下の実験で使用する細胞は全て、４日毎に継代されたものである。
（調製例１．クラスリン結合性ペプチド誘導体の調製及び同定）
〔1.1 サブトラクション〕
正常細胞株に結合するファージを吸着させるため、以下のようにしてサブトラクションを行った。ファージ吸着細胞として、正常ヒト胆管上皮細胞株であるＭＭＮＫ−１細胞を用いた。５％の二酸化炭素含有加湿大気下、３７℃で、６穴細胞培養プレートを用いて、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンが含有されているダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；インビトロジェン株式会社製）中で、ＭＭＮＫ−１細胞を、コンフルエントになるまで培養した後、このプレートを４℃で３０分静置し、培養ＭＭＮＫ−１細胞を得た。この培地を吸引し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；シグマアルドリッチジャパン株式会社製）を１％含有するＰＢＳ（大日本住友製薬株式会社製）でこのＭＭＮＫ−１細胞を２回洗浄した。１％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭを１穴につき１ｍｌ、このプレートに加え、４℃で３０分間、このプレートを毎分５０回で振盪させ、このＭＭＮＫ−１細胞を培養した。この細胞に、１穴につき２×１０１１プラーク形成単位（plaque-forming unit；ｐｆｕ）にＰＢＳで希釈したファージライブラリーのファージの１００μｌを加えた。このプレートを、マイクロインキュベーターで４℃、６０分間振盪させ、その後、ＭＭＮＫ−１未結合ファージが含有された上清を回収し、次のバイオパンニング工程に用いた。
〔1.1 サブトラクション〕
正常細胞株に結合するファージを吸着させるため、以下のようにしてサブトラクションを行った。ファージ吸着細胞として、正常ヒト胆管上皮細胞株であるＭＭＮＫ−１細胞を用いた。５％の二酸化炭素含有加湿大気下、３７℃で、６穴細胞培養プレートを用いて、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンが含有されているダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；インビトロジェン株式会社製）中で、ＭＭＮＫ−１細胞を、コンフルエントになるまで培養した後、このプレートを４℃で３０分静置し、培養ＭＭＮＫ−１細胞を得た。この培地を吸引し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；シグマアルドリッチジャパン株式会社製）を１％含有するＰＢＳ（大日本住友製薬株式会社製）でこのＭＭＮＫ−１細胞を２回洗浄した。１％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭを１穴につき１ｍｌ、このプレートに加え、４℃で３０分間、このプレートを毎分５０回で振盪させ、このＭＭＮＫ−１細胞を培養した。この細胞に、１穴につき２×１０１１プラーク形成単位（plaque-forming unit；ｐｆｕ）にＰＢＳで希釈したファージライブラリーのファージの１００μｌを加えた。このプレートを、マイクロインキュベーターで４℃、６０分間振盪させ、その後、ＭＭＮＫ−１未結合ファージが含有された上清を回収し、次のバイオパンニング工程に用いた。
〔1.2 バイオパンニング〕
ヒト胆管癌細胞のみに結合するファージを得るため、以下のようにしてバイオパンニングを行った。バイオパンニングに用いた細胞は、ヒト胆管癌細胞株のＲＢＥ細胞である。ＲＢＥ細胞の培地は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンが含有されているＲＰＭＩ−１６４０培地（インビトロジェン株式会社製）である。この培地を用いたこと以外は、前記のサブトラクションの工程で培養ＭＭＮＫ−１細胞を得たのと同様にして、６穴細胞培養プレート中に、培養ＲＢＥ細胞を得た。その６穴細胞培養プレートに、前記のサブトラクションの工程で回収したＭＭＮＫ−１未結合ファージ含有上清の１ｍｌを加え、マイクロインキュベーターで４℃、６０分間このプレートを振盪させた後、その培地をＲＢＥ未結合ファージごと除去した。このファージが結合したＲＢＥ細胞を洗浄するため、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳをこのプレートに加え、除去する操作を４回繰返した。氷上にこのプレートを置き、この細胞とファージとの非特異的相互作用を解離させるため、０．２Ｍのグリシン塩酸塩水溶液（ｐＨ２．２）を１穴あたり１ｍｌずつ加え、５分間プレートを静置した。１Ｍのトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス：Ｔｒｉｓ）塩酸塩（ｐＨ９．１）を１穴あたり１５０μｌずつ加え、プレート中の内容液を中和した。このプレートの内容液を吸引し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを１穴あたり１ｍｌずつ加え、このファージ結合細胞を洗浄した。１％トリス−エチレンジアミン四酢酸（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）を１穴あたり１ｍｌずつ加え、マイクロインキュベーターで４℃、６０分間このプレートを振盪させ、ＲＢＥ細胞を溶解させスクレーパーで剥がして攪拌した後、ＲＢＥ細胞結合性の遊離ファージを１％Ｔｒｉs−ＥＤＴＡごと回収した。
ヒト胆管癌細胞のみに結合するファージを得るため、以下のようにしてバイオパンニングを行った。バイオパンニングに用いた細胞は、ヒト胆管癌細胞株のＲＢＥ細胞である。ＲＢＥ細胞の培地は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンが含有されているＲＰＭＩ−１６４０培地（インビトロジェン株式会社製）である。この培地を用いたこと以外は、前記のサブトラクションの工程で培養ＭＭＮＫ−１細胞を得たのと同様にして、６穴細胞培養プレート中に、培養ＲＢＥ細胞を得た。その６穴細胞培養プレートに、前記のサブトラクションの工程で回収したＭＭＮＫ−１未結合ファージ含有上清の１ｍｌを加え、マイクロインキュベーターで４℃、６０分間このプレートを振盪させた後、その培地をＲＢＥ未結合ファージごと除去した。このファージが結合したＲＢＥ細胞を洗浄するため、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳをこのプレートに加え、除去する操作を４回繰返した。氷上にこのプレートを置き、この細胞とファージとの非特異的相互作用を解離させるため、０．２Ｍのグリシン塩酸塩水溶液（ｐＨ２．２）を１穴あたり１ｍｌずつ加え、５分間プレートを静置した。１Ｍのトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス：Ｔｒｉｓ）塩酸塩（ｐＨ９．１）を１穴あたり１５０μｌずつ加え、プレート中の内容液を中和した。このプレートの内容液を吸引し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを１穴あたり１ｍｌずつ加え、このファージ結合細胞を洗浄した。１％トリス−エチレンジアミン四酢酸（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）を１穴あたり１ｍｌずつ加え、マイクロインキュベーターで４℃、６０分間このプレートを振盪させ、ＲＢＥ細胞を溶解させスクレーパーで剥がして攪拌した後、ＲＢＥ細胞結合性の遊離ファージを１％Ｔｒｉs−ＥＤＴＡごと回収した。
〔1.3 ＲＢＥ細胞結合性のファージの増幅〕
滅菌済みの三角フラスコに、大腸菌の増殖や培養に用いられるＬＢ培地２０ｍｌを加え、その後大腸菌株ＥＲ２７３８を白金スパーテルでかきとって加え、３７℃で１．５〜２時間振盪培養した。その早期対数増殖期の大腸菌株ＥＲ２７３８含有ＬＢ培地に、前記のバイオパンニングの工程で得たＲＢＥ細胞結合性の遊離ファージを含む１％Ｔｒｉs−ＥＤＴＡ液の１００μｌを加え、３７℃、５時間、１５０ｒｐｍで攪拌して増幅させた。その後、それを滅菌済みであるコニカルチューブに移して、１００００ｒｐｍ、４℃で１０分間このコニカルチューブを遠心した。このコニカルチューブ内の上清を別なコニカルチューブに移し、再度同じ条件でこのコニカルチューブを遠心した。このコニカルチューブ内の上清の１５ｍｌを別なコニカルチューブに移し、２．５ｍｌのポリエチレングリコール／塩化ナトリウムを加えた。４℃で一晩このコニカルチューブを静置した後、このコニカルチューブの内容液を別なコニカルチューブに移し、１００００ｒｐｍ、４℃で１５分間このコニカルチューブを遠心した。上清を除去し、１００００ｒｐｍ、４℃で５分間このペレットのみのコニカルチューブを再遠心した。ピペットを用いて、遠心したこのコニカルチューブ内のペレット状ＲＢＥ細胞結合性ファージ以外の水分を除去した。１ｍｌのトリス緩衝生理食塩水液（ＴＢＳ）をこのコニカルチューブに加え、ＲＢＥ細胞結合性ファージを懸濁して、１３０００ｒｐｍ、４℃で５分間このコニカルチューブを遠心した。上清の１０００μｌを別なマイクロチューブに移し、そのチューブにポリエチレングリコール／塩化ナトリウムの１７０μｌを加えた。このマイクロチューブを氷上で６０分静置して、１３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。上清を除去し、１３０００ｒｐｍ、４℃で１分間このマイクロチューブを再遠心した。ピペットを用いて、このマイクロチューブ内のペレット状ＲＢＥ細胞結合性ファージ以外の水分を除去し、ＰＢＳを１ｍｌ加え、ＲＢＥ細胞結合性ファージを懸濁したＰＢＳ液を得た。
滅菌済みの三角フラスコに、大腸菌の増殖や培養に用いられるＬＢ培地２０ｍｌを加え、その後大腸菌株ＥＲ２７３８を白金スパーテルでかきとって加え、３７℃で１．５〜２時間振盪培養した。その早期対数増殖期の大腸菌株ＥＲ２７３８含有ＬＢ培地に、前記のバイオパンニングの工程で得たＲＢＥ細胞結合性の遊離ファージを含む１％Ｔｒｉs−ＥＤＴＡ液の１００μｌを加え、３７℃、５時間、１５０ｒｐｍで攪拌して増幅させた。その後、それを滅菌済みであるコニカルチューブに移して、１００００ｒｐｍ、４℃で１０分間このコニカルチューブを遠心した。このコニカルチューブ内の上清を別なコニカルチューブに移し、再度同じ条件でこのコニカルチューブを遠心した。このコニカルチューブ内の上清の１５ｍｌを別なコニカルチューブに移し、２．５ｍｌのポリエチレングリコール／塩化ナトリウムを加えた。４℃で一晩このコニカルチューブを静置した後、このコニカルチューブの内容液を別なコニカルチューブに移し、１００００ｒｐｍ、４℃で１５分間このコニカルチューブを遠心した。上清を除去し、１００００ｒｐｍ、４℃で５分間このペレットのみのコニカルチューブを再遠心した。ピペットを用いて、遠心したこのコニカルチューブ内のペレット状ＲＢＥ細胞結合性ファージ以外の水分を除去した。１ｍｌのトリス緩衝生理食塩水液（ＴＢＳ）をこのコニカルチューブに加え、ＲＢＥ細胞結合性ファージを懸濁して、１３０００ｒｐｍ、４℃で５分間このコニカルチューブを遠心した。上清の１０００μｌを別なマイクロチューブに移し、そのチューブにポリエチレングリコール／塩化ナトリウムの１７０μｌを加えた。このマイクロチューブを氷上で６０分静置して、１３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。上清を除去し、１３０００ｒｐｍ、４℃で１分間このマイクロチューブを再遠心した。ピペットを用いて、このマイクロチューブ内のペレット状ＲＢＥ細胞結合性ファージ以外の水分を除去し、ＰＢＳを１ｍｌ加え、ＲＢＥ細胞結合性ファージを懸濁したＰＢＳ液を得た。
〔1.4 ファージ数の測定〕
ファージ数を、プラークインフェクションアッセイにて、以下のようにして測定した。コニカルチューブにＬＢ培地の１０ｍｌを加え、その後大腸菌株ＥＲ２７３８を白金スパーテルでかきとって加え、３７℃で２時間振盪培養した。この大腸菌含有ＬＢ培地の１８５μｌを、前記のＲＢＥ細胞結合性のファージの増幅の工程で得たＲＢＥ細胞結合性ファージを懸濁したＰＢＳ液の１０μｌに加え、その混合液を５分間静置した。予め温めて溶かしておいたアガローストップの４０ｍｌを、別なコニカルチューブに移し、アガローストップが冷えてきたら、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ；和光純薬工業株式会製）含有液の濃度０．０５ｇ／ｍＬの４８０μｌと、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；和光純薬工業株式会社製）含有液の濃度０．２３８３ｇ／ｍＬの１２０μｌとを加え、それを、予め温めておいた別なコニカルチューブに３〜４ｍｌずつ取り分けた。このコニカルチューブに、前記の大腸菌含有ＬＢ培地とＲＢＥ細胞結合性ファージ懸濁ＰＢＳ液との混合液を加え、攪拌した。これらを、ファージが感染した大腸菌のみを増殖させる培地であるテトラサイクリン含有ＬＢプレートに撒き、このプレートを裏返して一晩、３７℃で培養した。このプレートにできたプラークを数えた。１個のプラークは１個のファージ粒子に由来するため、プラーク数をファージ数と見做した。その結果を図１中に、第１回のデータとして示す。
ファージ数を、プラークインフェクションアッセイにて、以下のようにして測定した。コニカルチューブにＬＢ培地の１０ｍｌを加え、その後大腸菌株ＥＲ２７３８を白金スパーテルでかきとって加え、３７℃で２時間振盪培養した。この大腸菌含有ＬＢ培地の１８５μｌを、前記のＲＢＥ細胞結合性のファージの増幅の工程で得たＲＢＥ細胞結合性ファージを懸濁したＰＢＳ液の１０μｌに加え、その混合液を５分間静置した。予め温めて溶かしておいたアガローストップの４０ｍｌを、別なコニカルチューブに移し、アガローストップが冷えてきたら、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ；和光純薬工業株式会製）含有液の濃度０．０５ｇ／ｍＬの４８０μｌと、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；和光純薬工業株式会社製）含有液の濃度０．２３８３ｇ／ｍＬの１２０μｌとを加え、それを、予め温めておいた別なコニカルチューブに３〜４ｍｌずつ取り分けた。このコニカルチューブに、前記の大腸菌含有ＬＢ培地とＲＢＥ細胞結合性ファージ懸濁ＰＢＳ液との混合液を加え、攪拌した。これらを、ファージが感染した大腸菌のみを増殖させる培地であるテトラサイクリン含有ＬＢプレートに撒き、このプレートを裏返して一晩、３７℃で培養した。このプレートにできたプラークを数えた。１個のプラークは１個のファージ粒子に由来するため、プラーク数をファージ数と見做した。その結果を図１中に、第１回のデータとして示す。
〔1.5 バイオパンニングとファージ増幅との繰返し〕
前記のＲＢＥ細胞結合性のファージの増幅の工程で得たファージを更に精製して、正常細胞株であるＭＭＮＫ−１細胞に結合するファージを取り除くため、その増幅したファージを、前記のサブトラクションの工程と同様にして、ＭＭＮＫ−１細胞に結合したファージを除去し、ＭＭＮＫ−１細胞に結合しないファージを回収するというサブトラクション操作と、前記のバイオパンニングの工程と同様にして、ＲＢＥ細胞結合性のファージを回収するというバイオパンニング操作と、前記ＲＢＥ細胞結合性のファージの増幅の工程と同様にして、そのファージを増幅する操作との繰返し工程を、計３回繰返した。
前記のＲＢＥ細胞結合性のファージの増幅の工程で得たファージを更に精製して、正常細胞株であるＭＭＮＫ−１細胞に結合するファージを取り除くため、その増幅したファージを、前記のサブトラクションの工程と同様にして、ＭＭＮＫ−１細胞に結合したファージを除去し、ＭＭＮＫ−１細胞に結合しないファージを回収するというサブトラクション操作と、前記のバイオパンニングの工程と同様にして、ＲＢＥ細胞結合性のファージを回収するというバイオパンニング操作と、前記ＲＢＥ細胞結合性のファージの増幅の工程と同様にして、そのファージを増幅する操作との繰返し工程を、計３回繰返した。
図１に、サブトラクション操作とバイオパンニング操作とファージの増幅操作との繰返し工程を、３回繰返したときに、この繰返し工程毎に、前記のファージ数の測定の工程と同様にして測定したきの結果を、第２回、第３回のデータとして示す。図１から明らかな通り、ファージの回収数は、繰返し回数と共に増加し、ファージの純度が、順次向上していることが、分かった。
（調製例２ ファージクローンの調製）
次に、同一の遺伝子を持つファージクローンを調製した。
次に、同一の遺伝子を持つファージクローンを調製した。
〔2.1 ファージの選択とファージクローンの調製〕
先ずコニカルチューブにＬＢ培地の１０ｍｌを加え、その後大腸菌株ＥＲ２７３８を白金スパーテルでかきとって加え、３７℃で一晩振盪培養させて大腸菌含有ＬＢ培地を作製した。ＬＢ培地の４９．５ｍｌが入っているコニカルチューブに、大腸菌含有ＬＢ培地の０．５ｍｌを加え、攪拌した。これの２ｍｌずつを別なコニカルチューブ４０本に夫々移した。ファージクローンの調製に供するため、前記の調製例１中のバイオパンニングとファージ増幅との繰返し工程での第３回におけるファージ数の測定をした残余のテトラサイクリン含有ＬＢプレート中から任意に４０個のプラークを選択し、他のプラークと混ざらないようにピペットで取り出した。それらプラークの夫々を、各々このコニカルチューブに加え、大腸菌とこのファージとを５時間振盪培養させた。これの１ｍｌをマイクロチューブ２本に分注し、１本はファージクローン保存用に、もう１本はＤＮＡの調製用に保存した。室温下、１３０００ｒｐｍで１分間、ファージクローン保存用のマイクロチューブを遠心した。上清の５００μｌを別なマイクロチューブに移し、５００μｌのグリセリン（和光純薬工業株式会社製）を加え撹拌した。その操作を繰返し、４０種のファージ毎に、ファージクローン含有溶液を調製し、癌細胞株への結合・集積能力の評価に用いるため、複数のマイクロチューブで保存した。
先ずコニカルチューブにＬＢ培地の１０ｍｌを加え、その後大腸菌株ＥＲ２７３８を白金スパーテルでかきとって加え、３７℃で一晩振盪培養させて大腸菌含有ＬＢ培地を作製した。ＬＢ培地の４９．５ｍｌが入っているコニカルチューブに、大腸菌含有ＬＢ培地の０．５ｍｌを加え、攪拌した。これの２ｍｌずつを別なコニカルチューブ４０本に夫々移した。ファージクローンの調製に供するため、前記の調製例１中のバイオパンニングとファージ増幅との繰返し工程での第３回におけるファージ数の測定をした残余のテトラサイクリン含有ＬＢプレート中から任意に４０個のプラークを選択し、他のプラークと混ざらないようにピペットで取り出した。それらプラークの夫々を、各々このコニカルチューブに加え、大腸菌とこのファージとを５時間振盪培養させた。これの１ｍｌをマイクロチューブ２本に分注し、１本はファージクローン保存用に、もう１本はＤＮＡの調製用に保存した。室温下、１３０００ｒｐｍで１分間、ファージクローン保存用のマイクロチューブを遠心した。上清の５００μｌを別なマイクロチューブに移し、５００μｌのグリセリン（和光純薬工業株式会社製）を加え撹拌した。その操作を繰返し、４０種のファージ毎に、ファージクローン含有溶液を調製し、癌細胞株への結合・集積能力の評価に用いるため、複数のマイクロチューブで保存した。
（調製例３ ４０種のファージクローンの癌細胞株への結合・集積能力の評価）
次に、調製例２で得た４０種のファージクローンの中で、最もヒト胆管癌細胞に結合するクローンを特定し、そのファージクローンを用いたヒト癌細胞株への集積能力について、以下のようにして調べた。
次に、調製例２で得た４０種のファージクローンの中で、最もヒト胆管癌細胞に結合するクローンを特定し、そのファージクローンを用いたヒト癌細胞株への集積能力について、以下のようにして調べた。
〔3.1 ＲＢＥ細胞を用いたＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡでのファージ結合測定〕
ＲＢＥ細胞に対するファージクローンの結合能力を確認するために、調製例２で得た４０種のファージクローンについて、ＲＢＥ細胞を用いた酵素結合免疫吸着検定法（enzyme-linked immunosorbent assay；ＥＬＩＳＡ）で試験を行った。５％の二酸化炭素含有加湿大気下、３７℃で、９６穴プレートに１穴あたり１×１０４個に希釈したＲＢＥ細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で２４時間培養した。このＲＢＥ細胞を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳの１００μｌで洗浄し、無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地の１００μｌ中で、３７℃で１時間培養した。４％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳの１００μｌをこのプレートに添加し、２０分間パラホルムアルデヒド中のＲＢＥ細胞を固定した。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（関東化学株式会社製；Ｔｗｅｅｎは登録商標）を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ−０５）で固定後のＲＢＥ細胞を５分間、３回ゆっくり洗浄し、ブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴ−０５）の１００μｌをこのプレートに添加し、３７℃で１時間、ブロッキングバッファー中のＲＢＥ細胞をブロッキングした。調製例２で得た４０種のファージクローン含有溶液を用い、調製例１中の1.3及び1.4の手順に従って、ファージクローンを含む溶液を調製した。その溶液を、それの中のファージの数が１穴あたり１×１０１０ｐｆｕとなるように希釈してブロッキングしたＲＢＥ細胞に添加し、３７℃で１時間、このファージとブロッキングしたＲＢＥ細胞とを結合させた。ＰＢＳＴ−０５で３回ファージが結合したＲＢＥ細胞を洗浄して、ＲＢＥ細胞未結合ファージを除去した。一次抗体として、ブロッキングバッファーで１２００倍に希釈したウサギ由来抗Ｍ１３ファージ抗体であるＢ７７８６（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）を１穴あたり１００μｌずつこのプレートに添加し、室温で６０分間静置し、ＲＢＥ細胞に結合したファージとこの一次抗体とを結合させた。ＰＢＳＴ−０５で一次抗体が結合したＲＢＥ細胞を３回洗浄して後、二次抗体として、ブロッキングバッファーで８０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体であるＡ０５４５（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）を１穴あたり１００μｌずつこのプレートに添加し、室温で６０分間静置し、ＲＢＥ細胞に結合した一次抗体と二次抗体とを結合させた。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回この二次抗体が結合したＲＢＥ細胞を洗浄した後、ペルオキシダーゼの発色基質として、３，３’，５’，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ） Ｌｉｑｉｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（シグマアルドリッチジャパン株式会社の製品名）を１穴あたり１００μｌずつこのプレートに添加し、室温で２０分間ペルオキシダーゼとＴＭＢとを反応させた。ペルオキシダーゼとＴＭＢとの反応停止液として、０．５Ｍの硫酸を１穴あたり１００μｌずつこのプレートに添加し、４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーのＳｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｐｌｕｓ３８４（日本モレキュラーデバイス株式会社の製品名）で測定した。４０種類のファージクローンについて同様に測定を繰返した結果から、その中で最もＲＢＥ細胞に結合するファージクローンの１種に、絞り込んだ。
ＲＢＥ細胞に対するファージクローンの結合能力を確認するために、調製例２で得た４０種のファージクローンについて、ＲＢＥ細胞を用いた酵素結合免疫吸着検定法（enzyme-linked immunosorbent assay；ＥＬＩＳＡ）で試験を行った。５％の二酸化炭素含有加湿大気下、３７℃で、９６穴プレートに１穴あたり１×１０４個に希釈したＲＢＥ細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で２４時間培養した。このＲＢＥ細胞を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳの１００μｌで洗浄し、無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地の１００μｌ中で、３７℃で１時間培養した。４％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳの１００μｌをこのプレートに添加し、２０分間パラホルムアルデヒド中のＲＢＥ細胞を固定した。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（関東化学株式会社製；Ｔｗｅｅｎは登録商標）を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ−０５）で固定後のＲＢＥ細胞を５分間、３回ゆっくり洗浄し、ブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴ−０５）の１００μｌをこのプレートに添加し、３７℃で１時間、ブロッキングバッファー中のＲＢＥ細胞をブロッキングした。調製例２で得た４０種のファージクローン含有溶液を用い、調製例１中の1.3及び1.4の手順に従って、ファージクローンを含む溶液を調製した。その溶液を、それの中のファージの数が１穴あたり１×１０１０ｐｆｕとなるように希釈してブロッキングしたＲＢＥ細胞に添加し、３７℃で１時間、このファージとブロッキングしたＲＢＥ細胞とを結合させた。ＰＢＳＴ−０５で３回ファージが結合したＲＢＥ細胞を洗浄して、ＲＢＥ細胞未結合ファージを除去した。一次抗体として、ブロッキングバッファーで１２００倍に希釈したウサギ由来抗Ｍ１３ファージ抗体であるＢ７７８６（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）を１穴あたり１００μｌずつこのプレートに添加し、室温で６０分間静置し、ＲＢＥ細胞に結合したファージとこの一次抗体とを結合させた。ＰＢＳＴ−０５で一次抗体が結合したＲＢＥ細胞を３回洗浄して後、二次抗体として、ブロッキングバッファーで８０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体であるＡ０５４５（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）を１穴あたり１００μｌずつこのプレートに添加し、室温で６０分間静置し、ＲＢＥ細胞に結合した一次抗体と二次抗体とを結合させた。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回この二次抗体が結合したＲＢＥ細胞を洗浄した後、ペルオキシダーゼの発色基質として、３，３’，５’，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ） Ｌｉｑｉｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（シグマアルドリッチジャパン株式会社の製品名）を１穴あたり１００μｌずつこのプレートに添加し、室温で２０分間ペルオキシダーゼとＴＭＢとを反応させた。ペルオキシダーゼとＴＭＢとの反応停止液として、０．５Ｍの硫酸を１穴あたり１００μｌずつこのプレートに添加し、４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーのＳｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｐｌｕｓ３８４（日本モレキュラーデバイス株式会社の製品名）で測定した。４０種類のファージクローンについて同様に測定を繰返した結果から、その中で最もＲＢＥ細胞に結合するファージクローンの１種に、絞り込んだ。
〔3.2 ヒト癌細胞株を用いたファージの集積〕
ヒト癌細胞株への１種に絞り込まれたファージクローンの集積について、以下のようにして調べた。５％の二酸化炭素含有加湿大気下、３７℃で６穴細胞培養プレートにＲＰＭＩ−１６４０培地でＲＢＥ細胞を培養した。このＲＢＥ細胞がコンフルエントになったら、氷上に３０分間このプレートを静置した。この培地を捨て、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳの１ｍｌでこのＲＢＥ細胞を２回手短に洗浄した。１％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地の１ｍｌを、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで洗浄したＲＢＥ細胞に添加し、このプレートを氷上に置き、３０分間、毎分５０回で振盪培養させた。調製例２で得た内の当該１種類のファージクローン含有上清を、ファージ数が１ｍｌあたり５×１０１０ｐｆｕとなるように希釈して、振盪培養させたＲＢＥ細胞に添加し、４℃で６０分間、このプレートをマイクロインキュベーターに入れて振盪させ、ファージをＲＢＥ細胞に結合させた。ＲＢＥ細胞未結合ファージを含む培地を捨て、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳの１ｍｌで、得られたファージ結合ＲＢＥ細胞を４回洗浄した。このプレートを氷上に置き、１穴あたり０．２Ｍのグリシン塩酸塩水溶液（ｐＨ２．２）の１ｍｌをこのファージ結合ＲＢＥ細胞に添加して、５分間このプレートを静置して、結合相互作用の非特異的解離をさせた後、１穴あたり１Ｍのトリス塩酸塩（ｐＨ９．１）を１５０μｌずつ加え、このプレート中の溶液を中和した。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳでこのファージ集積ＲＢＥ細胞を洗浄し、剥がして、ＲＢＥ細胞に集積したファージクローンを得た。このＲＢＥ細胞に集積したファージクローンと大腸菌とを、Ｘ−ｇａｌとＩＰＴＧとを含む寒天培地プレートで、３７℃で１晩増殖させた。この大腸菌から溶出したこのファージを多段階希釈し、プラークインフェクションアッセイにてこのファージクローンの集積数を求めた。この寒天培地プレート上のプラークを１５時間後に数えた。ＲＢＥ細胞の他に、胆管癌細胞株のＨｕＨ−２８をＭＥＭ Ｅａｒｌｅ’s（インビトロジェン株式会社製)で、同じくＴＦＫ−１をＲＰＭＩ−１６４０培地で、同じくＩＨＧＧＫをＲＰＭＩ−１６４０で、肝癌細胞株のＨｅｐ３ＢをＤＭＥＭで、胃癌細胞株のＡＺ５２１をＤＭＥＭで、大腸癌細胞株のＤＬＤ−１をＲＰＭＩ−１６４０で、ＭＭＮＫ−１をＤＭＥＭで夫々培養して、同様にしてファージクローンの集積数を求めた。
ヒト癌細胞株への１種に絞り込まれたファージクローンの集積について、以下のようにして調べた。５％の二酸化炭素含有加湿大気下、３７℃で６穴細胞培養プレートにＲＰＭＩ−１６４０培地でＲＢＥ細胞を培養した。このＲＢＥ細胞がコンフルエントになったら、氷上に３０分間このプレートを静置した。この培地を捨て、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳの１ｍｌでこのＲＢＥ細胞を２回手短に洗浄した。１％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地の１ｍｌを、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで洗浄したＲＢＥ細胞に添加し、このプレートを氷上に置き、３０分間、毎分５０回で振盪培養させた。調製例２で得た内の当該１種類のファージクローン含有上清を、ファージ数が１ｍｌあたり５×１０１０ｐｆｕとなるように希釈して、振盪培養させたＲＢＥ細胞に添加し、４℃で６０分間、このプレートをマイクロインキュベーターに入れて振盪させ、ファージをＲＢＥ細胞に結合させた。ＲＢＥ細胞未結合ファージを含む培地を捨て、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳの１ｍｌで、得られたファージ結合ＲＢＥ細胞を４回洗浄した。このプレートを氷上に置き、１穴あたり０．２Ｍのグリシン塩酸塩水溶液（ｐＨ２．２）の１ｍｌをこのファージ結合ＲＢＥ細胞に添加して、５分間このプレートを静置して、結合相互作用の非特異的解離をさせた後、１穴あたり１Ｍのトリス塩酸塩（ｐＨ９．１）を１５０μｌずつ加え、このプレート中の溶液を中和した。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳでこのファージ集積ＲＢＥ細胞を洗浄し、剥がして、ＲＢＥ細胞に集積したファージクローンを得た。このＲＢＥ細胞に集積したファージクローンと大腸菌とを、Ｘ−ｇａｌとＩＰＴＧとを含む寒天培地プレートで、３７℃で１晩増殖させた。この大腸菌から溶出したこのファージを多段階希釈し、プラークインフェクションアッセイにてこのファージクローンの集積数を求めた。この寒天培地プレート上のプラークを１５時間後に数えた。ＲＢＥ細胞の他に、胆管癌細胞株のＨｕＨ−２８をＭＥＭ Ｅａｒｌｅ’s（インビトロジェン株式会社製)で、同じくＴＦＫ−１をＲＰＭＩ−１６４０培地で、同じくＩＨＧＧＫをＲＰＭＩ−１６４０で、肝癌細胞株のＨｅｐ３ＢをＤＭＥＭで、胃癌細胞株のＡＺ５２１をＤＭＥＭで、大腸癌細胞株のＤＬＤ−１をＲＰＭＩ−１６４０で、ＭＭＮＫ−１をＤＭＥＭで夫々培養して、同様にしてファージクローンの集積数を求めた。
その結果を図２に示す。ファージ集積数は、胆管癌細胞株であるＨｕＨ−２８細胞株及びＴＦＫ−１細胞株と、ＲＢＥ細胞株とで、略同じであった。一方、胆管癌細胞でない細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ、ＤＬＤ−１、ＡＺ５２１）からのファージの集積数は、ＲＢＥ細胞の集積数よりも有意に低かった。なお、同図中のアスタリスクは、ＲＢＥ細胞へのファージクローンの集積数とそれ以外の細胞株のファージクローンの集積数とを比較した場合に、Ｐ値が０．０５以下であって、統計学的有意差が認められるものを、示している。
（調製例４ ファージクローンＤＮＡの調製とシークエンス）
〔4.1 ファージクローンのＤＮＡの調製〕
調製例２で得たＤＮＡ調製用の溶液から、以下のようにして、ＤＮＡを調製した。この溶液の１０００μｌが入っているマイクロチューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心した。上清５００μｌを新しいマイクロチューブへ移し、ポリエチレングリコール／塩化ナトリウムの２００μｌを加え、室温で１０分間このマイクロチューブを静置した。室温下、１３０００ｒｐｍで１０分間このマイクロチューブを遠心した後、上清を捨て、室温下、１３０００ｒｐｍで１分間このマイクロチューブを再遠心した。このマイクロチューブから、直ぐに上清を完全に除去し、ヨウ素緩衝液（Iodine buffer）の１００μｌをこのマイクロチューブに加え、沈殿物を完全に溶かした後、１００％エタノールの２５０μｌをこのマイクロチューブに加え、攪拌した。１０分間このマイクロチューブを静置した後、室温下、１３０００ｒｐｍで１０分間このマイクロチューブを遠心した。上清を除去し、７０％エタノールの２５０μｌをこのマイクロチューブに加え、室温下、１３０００ｒｐｍで１分間このマイクロチューブを遠心した。上清を完全に除去し、このマイクロチューブを恒温器にて６０℃で乾燥させた後、Ｔｒｉs−ＥＤＴＡ（ＴＥ）ｂｕｆｆｅｒの３０μｌをこのマイクロチューブに加え、絞り込まれたファージクローンのＤＮＡを調製した。
調製例２で得たＤＮＡ調製用の溶液から、以下のようにして、ＤＮＡを調製した。この溶液の１０００μｌが入っているマイクロチューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心した。上清５００μｌを新しいマイクロチューブへ移し、ポリエチレングリコール／塩化ナトリウムの２００μｌを加え、室温で１０分間このマイクロチューブを静置した。室温下、１３０００ｒｐｍで１０分間このマイクロチューブを遠心した後、上清を捨て、室温下、１３０００ｒｐｍで１分間このマイクロチューブを再遠心した。このマイクロチューブから、直ぐに上清を完全に除去し、ヨウ素緩衝液（Iodine buffer）の１００μｌをこのマイクロチューブに加え、沈殿物を完全に溶かした後、１００％エタノールの２５０μｌをこのマイクロチューブに加え、攪拌した。１０分間このマイクロチューブを静置した後、室温下、１３０００ｒｐｍで１０分間このマイクロチューブを遠心した。上清を除去し、７０％エタノールの２５０μｌをこのマイクロチューブに加え、室温下、１３０００ｒｐｍで１分間このマイクロチューブを遠心した。上清を完全に除去し、このマイクロチューブを恒温器にて６０℃で乾燥させた後、Ｔｒｉs−ＥＤＴＡ（ＴＥ）ｂｕｆｆｅｒの３０μｌをこのマイクロチューブに加え、絞り込まれたファージクローンのＤＮＡを調製した。
〔4.2 絞り込まれたファージクローンＤＮＡのシークエンス〕
このファージクローンのＤＮＡと、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１／１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ株式会社の製品名；ＢｉｇＤｙｅは登録商標）と、−９６プライマーとを用いて、そのキットの標準手順に従い、絞り込まれたファージクローンのシークエンス用のＤＮＡを調製した。このシークエンス用のＤＮＡを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ株式会社の製品名；ＰＲＩＳＭは登録商標）を用いて解析した。
このファージクローンのＤＮＡと、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１／１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ株式会社の製品名；ＢｉｇＤｙｅは登録商標）と、−９６プライマーとを用いて、そのキットの標準手順に従い、絞り込まれたファージクローンのシークエンス用のＤＮＡを調製した。このシークエンス用のＤＮＡを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ株式会社の製品名；ＰＲＩＳＭは登録商標）を用いて解析した。
（調製例５ ペプチド誘導体の同定）
〔5.1 ＲＢＥ細胞に結合するアミノ酸配列のみからなるペプチド誘導体の同定〕
前記のＤＮＡのシークエンスの結果をもとに、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐの１２アミノ酸配列（１文字表記；ＴＰＶＬＥＴＰＫＬＬＬＷ）からなるペプチド誘導体であると同定した。このアミノ酸配列のペプチド誘導体は、極めて強く、ＲＢＥ細胞に結合するというものである。
〔5.1 ＲＢＥ細胞に結合するアミノ酸配列のみからなるペプチド誘導体の同定〕
前記のＤＮＡのシークエンスの結果をもとに、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐの１２アミノ酸配列（１文字表記；ＴＰＶＬＥＴＰＫＬＬＬＷ）からなるペプチド誘導体であると同定した。このアミノ酸配列のペプチド誘導体は、極めて強く、ＲＢＥ細胞に結合するというものである。
本発明を適用するこの１２アミノ酸配列のみからなるペプチド誘導体と、それの標識化ペプチド誘導体とを、以下のようにして、合成し、理化学評価、及び生物学的評価に用いた。また、生物学的評価の際の対照群とするため、本発明を適用外の１２アミノ酸配列のみからなるペプチド誘導体と、それの標識化ペプチド誘導体とを、合成した。
（合成例１ 本発明の１２アミノ酸配列のみからなるペプチド誘導体の合成）
１２アミノ酸配列（ＴＰＶＬＥＴＰＫＬＬＬＷ）のみからなるペプチド誘導体を、
シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社のAbacus SynthesizerやHighThrough-put Synthesizer（同社製）により、合成した。
１２アミノ酸配列（ＴＰＶＬＥＴＰＫＬＬＬＷ）のみからなるペプチド誘導体を、
シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社のAbacus SynthesizerやHighThrough-put Synthesizer（同社製）により、合成した。
（合成例２ 本発明のビオチン標識化ペプチド誘導体の合成）
合成例１で得たペプチド誘導体をビオチンで標識したビオチン標識化ペプチド誘導体を、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社による通常のビオチン標識化方法で合成した。
合成例１で得たペプチド誘導体をビオチンで標識したビオチン標識化ペプチド誘導体を、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社による通常のビオチン標識化方法で合成した。
（合成例３ 本発明のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体の合成）
合成例１で得たペプチド誘導体を、NHS-Fluoresceinで標識したNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体を、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社による通常の蛍光標識化で合成した。
合成例１で得たペプチド誘導体を、NHS-Fluoresceinで標識したNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体を、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社による通常の蛍光標識化で合成した。
（比較合成例１ 本発明を適用外の１２アミノ酸配列のみからなるペプチド誘導体の合成）
ＲＢＥ細胞に結合しないＨｉｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙの１２アミノ酸配列（一文字表記；ＨＡＫＳＰＥＨＴＴＦＨＧ）のみからなるペプチド誘導体を、シグマ
アルドリッチ ジャパン株式会社によるペプチドシンセサイザーで、合成例１と同様な手法により、合成した。
ＲＢＥ細胞に結合しないＨｉｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙの１２アミノ酸配列（一文字表記；ＨＡＫＳＰＥＨＴＴＦＨＧ）のみからなるペプチド誘導体を、シグマ
アルドリッチ ジャパン株式会社によるペプチドシンセサイザーで、合成例１と同様な手法により、合成した。
（比較合成例２ 本発明を適用外のビオチン標識化ペプチド誘導体の合成）
比較合成例１で得たペプチド誘導体を合成例２と同様にして、ビオチンで標識することにより、ビオチン標識化ペプチド誘導体を、合成した。
比較合成例１で得たペプチド誘導体を合成例２と同様にして、ビオチンで標識することにより、ビオチン標識化ペプチド誘導体を、合成した。
（比較合成例３ 本発明を適用外のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体の合成）
比較合成例１で得たペプチド誘導体を合成例３と同様にして、NHS-Fluoresceinで標識することにより、NHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体を、合成した。
比較合成例１で得たペプチド誘導体を合成例３と同様にして、NHS-Fluoresceinで標識することにより、NHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体を、合成した。
合成例１〜３、及び比較合成例１〜３で得たペプチド誘導体を、以下の調製、各評価及び実施例に供した。
（調製例６ ペプチド誘導体への結合性物質の同定）
ペプチド誘導体への結合性物質の同定のために、合成例２のビオチン標識ペプチド誘導体を用いて、以下のようにしてＰｕｌｌ ｄｏｗｎを行った。
〔6.1 ペプチド誘導体と結合する物質の特定〕
組成が０．２５％又は１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１４２．５ｍＭの塩化カリウム、５ｍＭの塩化マグネシウム・６水和物、１０ｍＭでｐＨ７．６の４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルフォン酸（ＨＥＰＥＳ）、０．２ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、プロテアーゼインヒビターのＣｏｍｐｌｅｔｅ，Ｍｉｎｉ，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社の製品名）の１Ｔ／ｍＬからなる細胞溶解液の１ｍｌを用いて、プレート中のＲＢＥ細胞を溶解した。残っているＲＢＥ細胞の残骸を、コロニー操作用具のラバーポリスマンでプレート表面から完全に除去した後、溶解液をこのプレートから回収したＲＢＥ細胞溶解物を、マイクロチューブに移し、氷上でインキュベートして、超音波破砕して、１３０００ｒｐｍで１５分間このマイクロチューブを遠心して、このＲＢＥ細胞溶解物を清澄した。合成例１のビオチン標識化ペプチド誘導体の２０μｌで抱合されたストレプトアビジン−アガロース（インビトロジェン株式会社製）の４０μｌで、遠心して得られた上清をＰｕｌｌ ｄｏｗｎし、４℃で１時間インキュベートした。インキュベートの後、ストレプトアビジンとビオチンとの結合複合体を、前記の細胞溶解液で４回洗浄し、１分間遠心して上清を捨てた。Ｐｕｌｌ ｄｏｗｎされたタンパク質を９％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて、電気泳動した。クマシーブリリアントブルーでゲルを染色し、１９０ｋＤａ付近に現れたタンパク質のバンド部分をゲルから切り出し、このゲル中のタンパク質をトリプシンで消化した。質量分析計のｎａｎｏ ＬＣ−ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳを用いて、トリプシンで消化したタンパク質を解析し、タンパク質特定ソフトのＭＡＳＣＯＴアルゴリズム（マトリックスサイエンス株式会社の製品；ＭＡＳＣＯＴは登録商標）を用いて、タンパク質データベースのＮＣＢＩｎｒでタンデムマススペクトルを検索し、トリプシンで消化したタンパク質と一致するタンパク質を特定した。その結果、この１９０ｋＤａのヒトタンパク質は、クラスリン重鎖であった。このことから、合成例１のペプチド誘導体は、クラスリン結合性であることが分かった。
ペプチド誘導体への結合性物質の同定のために、合成例２のビオチン標識ペプチド誘導体を用いて、以下のようにしてＰｕｌｌ ｄｏｗｎを行った。
〔6.1 ペプチド誘導体と結合する物質の特定〕
組成が０．２５％又は１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１４２．５ｍＭの塩化カリウム、５ｍＭの塩化マグネシウム・６水和物、１０ｍＭでｐＨ７．６の４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルフォン酸（ＨＥＰＥＳ）、０．２ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、プロテアーゼインヒビターのＣｏｍｐｌｅｔｅ，Ｍｉｎｉ，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社の製品名）の１Ｔ／ｍＬからなる細胞溶解液の１ｍｌを用いて、プレート中のＲＢＥ細胞を溶解した。残っているＲＢＥ細胞の残骸を、コロニー操作用具のラバーポリスマンでプレート表面から完全に除去した後、溶解液をこのプレートから回収したＲＢＥ細胞溶解物を、マイクロチューブに移し、氷上でインキュベートして、超音波破砕して、１３０００ｒｐｍで１５分間このマイクロチューブを遠心して、このＲＢＥ細胞溶解物を清澄した。合成例１のビオチン標識化ペプチド誘導体の２０μｌで抱合されたストレプトアビジン−アガロース（インビトロジェン株式会社製）の４０μｌで、遠心して得られた上清をＰｕｌｌ ｄｏｗｎし、４℃で１時間インキュベートした。インキュベートの後、ストレプトアビジンとビオチンとの結合複合体を、前記の細胞溶解液で４回洗浄し、１分間遠心して上清を捨てた。Ｐｕｌｌ ｄｏｗｎされたタンパク質を９％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて、電気泳動した。クマシーブリリアントブルーでゲルを染色し、１９０ｋＤａ付近に現れたタンパク質のバンド部分をゲルから切り出し、このゲル中のタンパク質をトリプシンで消化した。質量分析計のｎａｎｏ ＬＣ−ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳを用いて、トリプシンで消化したタンパク質を解析し、タンパク質特定ソフトのＭＡＳＣＯＴアルゴリズム（マトリックスサイエンス株式会社の製品；ＭＡＳＣＯＴは登録商標）を用いて、タンパク質データベースのＮＣＢＩｎｒでタンデムマススペクトルを検索し、トリプシンで消化したタンパク質と一致するタンパク質を特定した。その結果、この１９０ｋＤａのヒトタンパク質は、クラスリン重鎖であった。このことから、合成例１のペプチド誘導体は、クラスリン結合性であることが分かった。
〔6.2 クラスリンと結合する物質の特定〕
合成例１のビオチン標識化ペプチド誘導体の量を２０μｍｏｌ、４μｍｏｌ、２μｍｏｌ、０．４μｍｏｌ、０．２μｍｏｌにして、上記と同様の方法でＲＢＥ細胞内のタンパク質を電気泳動して、ゲルを染色した。その結果、このビオチン標識化ペプチド誘導体の量が少ない場合、７８ｋＤａ付近にバンドが現れた。この部分をゲルから切除して、ｎａｎｏ ＬＣ−ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ/ＭＳ、及びＭＡＳＣＯＴを用いて、このゲル中のタンパク質を解析した結果、このタンパク質は分子シャペロンであるＧＲＰ７８であった。
合成例１のビオチン標識化ペプチド誘導体の量を２０μｍｏｌ、４μｍｏｌ、２μｍｏｌ、０．４μｍｏｌ、０．２μｍｏｌにして、上記と同様の方法でＲＢＥ細胞内のタンパク質を電気泳動して、ゲルを染色した。その結果、このビオチン標識化ペプチド誘導体の量が少ない場合、７８ｋＤａ付近にバンドが現れた。この部分をゲルから切除して、ｎａｎｏ ＬＣ−ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ/ＭＳ、及びＭＡＳＣＯＴを用いて、このゲル中のタンパク質を解析した結果、このタンパク質は分子シャペロンであるＧＲＰ７８であった。
以下、本発明を適用するペプチド誘導体と、本発明を適用外のペプチド誘導体とを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生物学的評価をするため、以下のように実施した。
（実施例１）
５％の二酸化炭素含有加湿大気下、３７℃で、８穴チャンバースライドにＲＰＭＩ−１６４０培地でＲＢＥ細胞を培養した。チャンバースライド内で８０％程度コンフルエントになったらこの培地を捨て、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２回このＲＢＥ細胞を洗浄した。１％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地をこのチャンバースライドに加え、３０分、３７℃でこのＲＢＥ細胞を培養した。合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体１０００μＭを、このＲＢＥ細胞に添加し、このチャンバースライドを遮光して、３７℃、２時間このＲＢＥ細胞を培養した。１％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地を吸引し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで、ＦＩＴＣ蛍光標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体が結合したＲＢＥ細胞を３回洗浄した。１：１のメタノール／アセトン溶液の４００μｌを、このチャンバースライドに加え、−２０℃で３分間、このＲＢＥ細胞を固定した後、このメタノール／アセトン溶液を吸引し、固定したＲＢＥ細胞を１０分間乾燥させた。このチャンバースライドのチャンバーを外し、スライドガラスだけにして、乾燥させたＲＢＥ細胞への非特異的結合を防ぐため、１０％ヤギ血清１００μｌを乾燥させたＲＢＥ細胞に添加して、湿潤条件下で２０分間、室温でＲＢＥ細胞をブロッキングした。対比染色をするため、４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；インビトロジェン株式会社製）を１００μｌずつブロッキングしたＲＢＥ細胞に添加し、ブロッキングしたＲＢＥ細胞を室温で１〜３分間、ＤＡＰＩ染色した。ＤＡＰＩ染色したＲＢＥ細胞を３分間、３回ＰＢＳで洗浄し、蛍光退色防止剤であるＳｌｏｗ Ｆａｄｅ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｋｉｔ（インビトロジェン株式会社の製品名）の１００μｌを洗浄したＲＢＥ細胞に添加し、１０分間静置した。蛍光退色防止剤で処理したＲＢＥ細胞を水性の封入剤であるＡｑｕａ Ｐｏｌｙ／Ｍｏｕｎｔ(ポリサイエンス社の製品名)で包埋し、蛍光顕微鏡Ｂｉｏｚｅｒｏ ＢＺ−８０００（株式会社キーエンスの製品名）で観察した。
５％の二酸化炭素含有加湿大気下、３７℃で、８穴チャンバースライドにＲＰＭＩ−１６４０培地でＲＢＥ細胞を培養した。チャンバースライド内で８０％程度コンフルエントになったらこの培地を捨て、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２回このＲＢＥ細胞を洗浄した。１％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地をこのチャンバースライドに加え、３０分、３７℃でこのＲＢＥ細胞を培養した。合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体１０００μＭを、このＲＢＥ細胞に添加し、このチャンバースライドを遮光して、３７℃、２時間このＲＢＥ細胞を培養した。１％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地を吸引し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで、ＦＩＴＣ蛍光標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体が結合したＲＢＥ細胞を３回洗浄した。１：１のメタノール／アセトン溶液の４００μｌを、このチャンバースライドに加え、−２０℃で３分間、このＲＢＥ細胞を固定した後、このメタノール／アセトン溶液を吸引し、固定したＲＢＥ細胞を１０分間乾燥させた。このチャンバースライドのチャンバーを外し、スライドガラスだけにして、乾燥させたＲＢＥ細胞への非特異的結合を防ぐため、１０％ヤギ血清１００μｌを乾燥させたＲＢＥ細胞に添加して、湿潤条件下で２０分間、室温でＲＢＥ細胞をブロッキングした。対比染色をするため、４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；インビトロジェン株式会社製）を１００μｌずつブロッキングしたＲＢＥ細胞に添加し、ブロッキングしたＲＢＥ細胞を室温で１〜３分間、ＤＡＰＩ染色した。ＤＡＰＩ染色したＲＢＥ細胞を３分間、３回ＰＢＳで洗浄し、蛍光退色防止剤であるＳｌｏｗ Ｆａｄｅ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｋｉｔ（インビトロジェン株式会社の製品名）の１００μｌを洗浄したＲＢＥ細胞に添加し、１０分間静置した。蛍光退色防止剤で処理したＲＢＥ細胞を水性の封入剤であるＡｑｕａ Ｐｏｌｙ／Ｍｏｕｎｔ(ポリサイエンス社の製品名)で包埋し、蛍光顕微鏡Ｂｉｏｚｅｒｏ ＢＺ−８０００（株式会社キーエンスの製品名）で観察した。
（比較例１）
実施例１中のＲＢＥ細胞をＭＭＮＫ−１細胞に、ＲＰＭＩ−１６４０培地をＤＭＥＭに変更した以外は実施例１と同様の方法で、ＭＭＮＫ−１細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
実施例１中のＲＢＥ細胞をＭＭＮＫ−１細胞に、ＲＰＭＩ−１６４０培地をＤＭＥＭに変更した以外は実施例１と同様の方法で、ＭＭＮＫ−１細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
（比較例２）
実施例１中の合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体を、本発明を適用外の比較合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体に変更した以外は実施例１と同様の方法で、ＲＢＥ細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
実施例１中の合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体を、本発明を適用外の比較合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体に変更した以外は実施例１と同様の方法で、ＲＢＥ細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
（比較例３）
実施例１中の合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体を、本発明を適用外の比較合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体に、ＲＢＥ細胞をＭＭＮＫ−１細胞に、またＲＰＭＩ−１６４０培地をＤＭＥＭに、夫々変更した以外は実施例１と同様の方法で、ＭＭＮＫ−１細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
実施例１中の合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体を、本発明を適用外の比較合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体に、ＲＢＥ細胞をＭＭＮＫ−１細胞に、またＲＰＭＩ−１６４０培地をＤＭＥＭに、夫々変更した以外は実施例１と同様の方法で、ＭＭＮＫ−１細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
実施例１及び比較例１〜３での蛍光顕微鏡写真を纏めて図３に示す。実施例１のように本発明を適用するNHS-Fluorescein蛍光標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体をＲＢＥ細胞に添加した場合、NHS-Fluorescein特有の緑色の蛍光が、ＲＢＥ細胞の細胞膜と核周囲の細胞質の辺りに、観察されたが、比較例１のようにＭＭＮＫ−１細胞上には、観察されなかった。一方、比較例２〜３のように本発明適用外のNHS-Fluorescein蛍光標識ペプチド誘導体を用いた場合も、蛍光が観察されなかった。このことからクラスリン結合性ペプチド誘導体は、ＲＢＥ細胞に選択的に集積し易いことが分かった。
（実施例２）
胆管癌患者の病巣及び転移可能性のある胆管・肝臓等の周辺組織を郭清する外科手術により得られたヒト癌肝臓組織を検体として用いた。この検体は１８人の患者から得られたもので、１３人の患者は肝内胆管癌であり、５人の患者は肝外胆管癌であった。患者の平均年齢は６４．７歳（５５〜７１歳）で、１０人は男性であり、８人は女性であった。
胆管癌患者の病巣及び転移可能性のある胆管・肝臓等の周辺組織を郭清する外科手術により得られたヒト癌肝臓組織を検体として用いた。この検体は１８人の患者から得られたもので、１３人の患者は肝内胆管癌であり、５人の患者は肝外胆管癌であった。患者の平均年齢は６４．７歳（５５〜７１歳）で、１０人は男性であり、８人は女性であった。
この内で病理検査した肝内胆管癌組織の２検体と、肝内胆管癌組織の２検体とを、厚さ４μｍの切片にし、スライドガラスに載せた。各切片に、合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体の１００μＭを１００μl添加し、室温で２時間このペプチド誘導体とこの切片とを結合させた。２時間後の切片を１０％ＦＢＳ含有ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳで洗浄した切片を１：１のメタノール／アセトン溶液で−２０℃、３分間、固定した。その後、固定した切片を１０分間乾燥させた。切片に１０％ヤギ血清１００μｌを添加して、湿潤条件下で２０分間、室温でブロッキングした。対比染色をするため、ＤＡＰＩを１００μｌずつブロッキングした切片に添加し、ブロッキングした切片を室温で１〜３分間、ＤＡＰＩ染色した。ＤＡＰＩ染色した切片を３分間、３回ＰＢＳで洗浄し、蛍光退色防止剤であるＳｌｏｗ Ｆａｄｅ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｋｉｔの１００μｌを洗浄した切片に添加し、１０分間静置した。蛍光退色防止剤で処理した切片を水性の封入剤のＡｑｕａ Ｐｏｌｙ／Ｍｏｕｎｔで包埋し、蛍光顕微鏡Ｂｉｏｚｅｒｏ ＢＺ−８０００（株式会社キーエンスの製品名）で観察した。
（比較例４）
実施例２中で用いたヒト癌肝臓組織を、転移可能性があったが癌組織が見付からなかったヒト正常肝臓組織に変更した以外は実施例２と同様の方法で、ヒト正常胆管組織を顕微鏡で観察した。
実施例２中で用いたヒト癌肝臓組織を、転移可能性があったが癌組織が見付からなかったヒト正常肝臓組織に変更した以外は実施例２と同様の方法で、ヒト正常胆管組織を顕微鏡で観察した。
（比較例５）
実施例２中で用いた合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体を、比較合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体に変更した以外は実施例２と同様の方法で、ヒト癌肝臓組織を顕微鏡で観察した。
実施例２中で用いた合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体を、比較合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体に変更した以外は実施例２と同様の方法で、ヒト癌肝臓組織を顕微鏡で観察した。
（比較例６）
実施例２中で用いたヒト癌肝臓組織をヒト正常胆管組織に、合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体を、比較合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体に変更した以外は実施例２と同様の方法で、ヒト正常肝臓組織を顕微鏡で観察した。
実施例２中で用いたヒト癌肝臓組織をヒト正常胆管組織に、合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体を、比較合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体に変更した以外は実施例２と同様の方法で、ヒト正常肝臓組織を顕微鏡で観察した。
実施例２及び比較例４〜６での蛍光顕微鏡写真を纏めて図４に示す。実施例２のように本発明を適用する合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体を、ヒト肝内胆管癌組織とヒト肝外胆管癌組織とに添加した場合、夫々の組織中の細胞の細胞膜上と核周囲の細胞質内とに蛍光が観察された。対照的に、比較例５のように本発明を適用外の比較合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体を添加した場合、夫々の組織に蛍光は観察されなかった。また比較例４，６のようにヒト正常肝臓組織上では、蛍光は観察されなかった。このことからクラスリン結合性ペプチド誘導体は、胆管癌細胞に選択的に集積し易いことが分かった。
（実施例３）
５％の二酸化炭素大気下、３７℃で、９６穴プレートに１穴あたり５×１０３個となるように希釈したＲＢＥ細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。合成例１のクラスリン結合性ペプチド誘導体の１０００μＭをこのＲＢＥ細胞に添加して、２４時間、このＲＢＥ細胞を培養した。生細胞がテトラゾリウム塩を発色物質のホルマザンへ変換することができる性質を利用して、生細胞数を比色定量できるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ株式会社の製品名；ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６は登録商標）の２０μｌを含む無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地の１２０μｌに培地を交換して、このペプチド誘導体添加後のＲＢＥ細胞を３７℃で２時間培養した。この培地を新しい９６穴プレートに１００μｌずつ移し替え、マイクロプレートオートリーダー（日本モレキュラーデバイス株式会社製）を用いて、吸光度４９０ｎｍで培地中のホルマザンを測定し、このＲＢＥ細胞の分裂促進性を評価した。
５％の二酸化炭素大気下、３７℃で、９６穴プレートに１穴あたり５×１０３個となるように希釈したＲＢＥ細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。合成例１のクラスリン結合性ペプチド誘導体の１０００μＭをこのＲＢＥ細胞に添加して、２４時間、このＲＢＥ細胞を培養した。生細胞がテトラゾリウム塩を発色物質のホルマザンへ変換することができる性質を利用して、生細胞数を比色定量できるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ株式会社の製品名；ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６は登録商標）の２０μｌを含む無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地の１２０μｌに培地を交換して、このペプチド誘導体添加後のＲＢＥ細胞を３７℃で２時間培養した。この培地を新しい９６穴プレートに１００μｌずつ移し替え、マイクロプレートオートリーダー（日本モレキュラーデバイス株式会社製）を用いて、吸光度４９０ｎｍで培地中のホルマザンを測定し、このＲＢＥ細胞の分裂促進性を評価した。
（比較例７：参考例）
実施例３中の合成例１のクラスリン結合性ペプチド誘導体の添加濃度を、１００μＭに変更した以外は実施例３と同様の方法で、ＲＢＥ細胞の分裂促進性を評価した。
実施例３中の合成例１のクラスリン結合性ペプチド誘導体の添加濃度を、１００μＭに変更した以外は実施例３と同様の方法で、ＲＢＥ細胞の分裂促進性を評価した。
（比較例８）
実施例３中の合成例１のクラスリン結合性ペプチド誘導体を、比較合成例１のペプチド誘導体に変更した以外は、実施例３と同様の方法でＲＢＥ細胞の分裂促進性を評価した。
実施例３中の合成例１のクラスリン結合性ペプチド誘導体を、比較合成例１のペプチド誘導体に変更した以外は、実施例３と同様の方法でＲＢＥ細胞の分裂促進性を評価した。
（比較例９）
実施例３中の合成例１のクラスリン結合性ペプチド誘導体を、比較合成例１のペプチド誘導体に変更してその添加濃度を１００μＭにした以外は、実施例３と同様の方法でＲＢＥ細胞の分裂促進性を評価した。
実施例３中の合成例１のクラスリン結合性ペプチド誘導体を、比較合成例１のペプチド誘導体に変更してその添加濃度を１００μＭにした以外は、実施例３と同様の方法でＲＢＥ細胞の分裂促進性を評価した。
（比較例１０）
実施例３中の合成例１のクラスリン結合性ペプチド誘導体を添加しないこと以外は、実施例３と同様の方法でＲＢＥ細胞の分裂促進性を評価した。
実施例３中の合成例１のクラスリン結合性ペプチド誘導体を添加しないこと以外は、実施例３と同様の方法でＲＢＥ細胞の分裂促進性を評価した。
実施例３及び比較例７〜９の結果を纏めて図５に示す。図５から明らかなとおり、本発明を適用するクラスリン結合性ペプチド誘導体、又は本発明を適用外のペプチド誘導体は、ＲＢＥ細胞の細胞成長において有意な差を生じなかった。
（実施例４）
５％の二酸化炭素含有加湿大気下、３７℃で８穴チャンバースライドに１穴あたり８０％コンフルエントになるように、２４時間ＲＢＥ細胞を培養した。トランスフェクション試薬のＰｒｏｆｅｃｔ−２（ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ社の製品名）の１μｌと、合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体の１．３μｇとを、無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地の２０μｌに混合させて混合物を調製した。この混合物を室温に２０分間静置してこのペプチド誘導体とトランスフェクション試薬との複合体を形成させて、無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地の２００μｌで希釈した。希釈した混合物をこのＲＢＥ細胞の培地中に添加して、３７℃で２時間、このＲＢＥ細胞を培養した。ＲＰＭＩ−１６４０培地で２回、トランスフェクションしたＲＢＥ細胞を洗浄した後、無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地をこのチャンバースライドに加え、ＲＢＥ細胞を、蛍光顕微鏡のＢｉｏｚｅｒｏ ＢＺ−８０００で観察した。
５％の二酸化炭素含有加湿大気下、３７℃で８穴チャンバースライドに１穴あたり８０％コンフルエントになるように、２４時間ＲＢＥ細胞を培養した。トランスフェクション試薬のＰｒｏｆｅｃｔ−２（ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ社の製品名）の１μｌと、合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体の１．３μｇとを、無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地の２０μｌに混合させて混合物を調製した。この混合物を室温に２０分間静置してこのペプチド誘導体とトランスフェクション試薬との複合体を形成させて、無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地の２００μｌで希釈した。希釈した混合物をこのＲＢＥ細胞の培地中に添加して、３７℃で２時間、このＲＢＥ細胞を培養した。ＲＰＭＩ−１６４０培地で２回、トランスフェクションしたＲＢＥ細胞を洗浄した後、無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地をこのチャンバースライドに加え、ＲＢＥ細胞を、蛍光顕微鏡のＢｉｏｚｅｒｏ ＢＺ−８０００で観察した。
（比較例１１）
実施例４中のトランスフェクション試薬を用いないこと以外は、実施例４と同様の方法でＲＢＥ細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
実施例４中のトランスフェクション試薬を用いないこと以外は、実施例４と同様の方法でＲＢＥ細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
（比較例１２）
実施例４中で、合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体を、比較合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体に変更した以外は、実施例４と同様の方法でＲＢＥ細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
実施例４中で、合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体を、比較合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体に変更した以外は、実施例４と同様の方法でＲＢＥ細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
（比較例１３）
実施例４中のトランスフェクション試薬を用いないこと、及び合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体を、比較合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体に変更した以外は、実施例４と同様の方法でＲＢＥ細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
実施例４中のトランスフェクション試薬を用いないこと、及び合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体を、比較合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体に変更した以外は、実施例４と同様の方法でＲＢＥ細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
実施例４及び比較例１１〜１３での蛍光顕微鏡写真を纏めて図６に示す。実施例４のように本発明を適用する本発明を適用する合成例３のNHS-Fluorescein蛍光標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体をトランスフェクションしたＲＢＥ細胞は、その細胞の細胞膜上と核周囲の細胞質中とにNHS-Fluorescein特有の緑色の蛍光色素が観察され、このペプチド誘導体がＲＢＥ細胞内に取り込まれていた。一方、比較例１１〜１３のようにNHS-Fluorescein蛍光標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体を用いるがトランスフェクション試薬を用いない場合と、本発明を適用外のNHS-Fluorescein蛍光標識化ペプチド誘導体を用いてトランスフェクション試薬を用い又は用いなかった場合とは、ＲＢＥ細胞内の蛍光色素強度が弱く、トランスフェクション試薬を用いた場合の方が、クラスリン結合性ペプチド誘導体は、胆管癌細胞内部に選択的に導入され易いことが分かった。
（実施例５）
細胞が死滅して溶解したときに放出されるラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を測定できるキットであるＣｙｔｏＴｏｘ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（プロメガ株式会社の製品名；ＣｙｔｏＴｏｘ９６は登録商標）を用いて、５−ＦＵ添加後のＲＢＥ細胞における細胞毒性を評価した。５％の二酸化炭素含有加湿大気下、３７℃で９６穴プレートに１穴あたり６×１０３個に希釈して、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地でＲＢＥ細胞を培養した。トランスフェクション試薬のＰｒｏｆｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ社の製品名）の０．５μｌを用いて、合成例１のクラスリン結合性ペプチド誘導体の０．６５μｇをこのＲＢＥ細胞にトランスフェクションした。５−ＦＵの１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌを夫々１００μｌずつ、トランスフェクション後のＲＢＥ細胞に添加した。３６時間後、５−ＦＵ添加後の培地を回収して、その５０μｌを新しい９６穴プレートに移し、このキットのＳｕｂｓｔｒａｔｅ ＭｉｘをこのキットのＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒで溶解したものの５０μｌを、夫々５−ＦＵ添加後の培地に加えた。室温で３０分間、新しいプレートを静置し、マイクロプレートオートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定した。
細胞が死滅して溶解したときに放出されるラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を測定できるキットであるＣｙｔｏＴｏｘ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（プロメガ株式会社の製品名；ＣｙｔｏＴｏｘ９６は登録商標）を用いて、５−ＦＵ添加後のＲＢＥ細胞における細胞毒性を評価した。５％の二酸化炭素含有加湿大気下、３７℃で９６穴プレートに１穴あたり６×１０３個に希釈して、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地でＲＢＥ細胞を培養した。トランスフェクション試薬のＰｒｏｆｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ社の製品名）の０．５μｌを用いて、合成例１のクラスリン結合性ペプチド誘導体の０．６５μｇをこのＲＢＥ細胞にトランスフェクションした。５−ＦＵの１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌを夫々１００μｌずつ、トランスフェクション後のＲＢＥ細胞に添加した。３６時間後、５−ＦＵ添加後の培地を回収して、その５０μｌを新しい９６穴プレートに移し、このキットのＳｕｂｓｔｒａｔｅ ＭｉｘをこのキットのＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒで溶解したものの５０μｌを、夫々５−ＦＵ添加後の培地に加えた。室温で３０分間、新しいプレートを静置し、マイクロプレートオートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定した。
（比較例１４）
実施例５中の合成例１のクラスリン結合性ペプチド誘導体を、比較合成例１のペプチド誘導体に変更した以外は、実施例５と同様の方法で、細胞毒性を評価した。
実施例５中の合成例１のクラスリン結合性ペプチド誘導体を、比較合成例１のペプチド誘導体に変更した以外は、実施例５と同様の方法で、細胞毒性を評価した。
（比較例１５）
実施例５中の合成例１のクラスリン結合性ペプチド誘導体を、使用しないこと以外は、実施例５と同様の方法で、細胞毒性を評価した。
実施例５中の合成例１のクラスリン結合性ペプチド誘導体を、使用しないこと以外は、実施例５と同様の方法で、細胞毒性を評価した。
実施例５及び比較例１４〜１５での結果を図７に示す。図７から明らかなとおり、実施例５のように本発明を適用する蛍光標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体をトランスフェクションした場合でのＲＢＥ細胞における５-ＦＵによる細胞毒性即ち抗癌効果は、比較例１４〜１５のように本発明を適用外の蛍光標識化ペプチド誘導体を使用した場合、又は本発明のペプチド誘導体を使用しない場合と比較して、高かった。このことから、本発明を適用するクラスリン結合性ペプチド誘導体は、抗癌剤との相乗効果により、高い抗癌作用を奏することが分かった。
次に、本発明のペプチド組込みファージと、本発明のペプチド誘導体を持たない本発明を適用外のファージとのＲＢＥ細胞、及び胆管癌組織の結合を評価するため、以下の実験を行った。
（作製例１ 本発明のクラスリン結合性ペプチド誘導体が結合したファージの作製）
調製例３中の3.1の手順で選んだ最もＲＢＥ細胞に結合するファージクローンを、調製例１中の1.3及び1.4の手順に従って調製して、本発明を適用するペプチド組込みファージを作製した。
調製例３中の3.1の手順で選んだ最もＲＢＥ細胞に結合するファージクローンを、調製例１中の1.3及び1.4の手順に従って調製して、本発明を適用するペプチド組込みファージを作製した。
（比較作製例１ 本発明を適用外のファージの作製）
アミノ酸配列がコードされていないファージであるインサートレスファージを、本発明を適用外のファージとした。
アミノ酸配列がコードされていないファージであるインサートレスファージを、本発明を適用外のファージとした。
（実施例６）
５％の二酸化炭素含有加湿大気下、３７℃で８穴チャンバースライドにＲＰＭＩ−１６４０培地でＲＢＥ細胞を培養した。このＲＢＥ細胞が８０％程度コンフルエントになったら、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳでこのＲＢＥ細胞を２回洗浄した。１％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地をこのチャンバースライドに加えた後、作製例１のクラスリン結合性のペプチド組込みファージの数を１×１０１０ｐｆｕとなるように希釈して、洗浄後のＲＢＥ細胞に加え、１時間４℃で洗浄後のＲＢＥ細胞を培養した。このチャンバースライド中の内容液を吸引し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２回、このファージが結合したＲＢＥ細胞を洗浄して、固定液として１：１のメタノール／アセトン溶液の４００μ１を洗浄後のＲＢＥ細胞に添加し、−２０℃で３分間、洗浄後のＲＢＥ細胞を固定した。この固定液を吸引し、固定したＲＢＥ細胞を１０分間乾燥させた。このチャンバースライドのチャンバーをはずし、スライドガラスだけにして、ブロッキング剤として１０％ヤギ血清の１００μｌを乾燥させたＲＢＥ細胞に添加して、湿潤条件下で２０分間、室温で１０％ヤギ血清添加ＲＢＥ細胞をブロッキングした。一次抗体として、ＰＢＳで希釈した２％ヤギ血清を用いて、６００倍に希釈したウサギ由来坑Ｍ１３ファージ抗体の１００μｌを、ブロッキング処理後のＲＢＥ細胞に添加し、１時間室温でブロッキング処理後のＲＢＥ細胞と一次抗体とを結合させた。一次抗体が結合したＲＢＥ細胞をＰＢＳで３分間、３回洗浄した後、二次抗体として、２％ヤギ血清で１００倍に希釈した標識ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体の１００μｌを、洗浄したＲＢＥ細胞に添加し、遮光して１時間室温で一次抗体と二次抗体とを結合させた。二次抗体が結合したＲＢＥ細胞をＰＢＳで３分間、３回洗浄した後、ＤＡＰＩの１００μｌを洗浄したＲＢＥ細胞に添加し、１〜３分間室温でＤＡＰＩ添加ＲＢＥ細胞を染色した。ＤＡＰＩ染色後のＲＢＥ細胞をＰＢＳで３分間、３回洗浄して、蛍光退色防止剤の１００μｌを洗浄したＲＢＥ細胞に添加し、１０分間静置した。水性封入剤で蛍光退色防止処理後のＲＢＥ細胞を包埋して、水性封入剤で封入したＲＢＥ細胞を、蛍光顕微鏡のＢｉｏｚｅｒｏ ＢＺ−８０００で観察した。
５％の二酸化炭素含有加湿大気下、３７℃で８穴チャンバースライドにＲＰＭＩ−１６４０培地でＲＢＥ細胞を培養した。このＲＢＥ細胞が８０％程度コンフルエントになったら、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳでこのＲＢＥ細胞を２回洗浄した。１％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地をこのチャンバースライドに加えた後、作製例１のクラスリン結合性のペプチド組込みファージの数を１×１０１０ｐｆｕとなるように希釈して、洗浄後のＲＢＥ細胞に加え、１時間４℃で洗浄後のＲＢＥ細胞を培養した。このチャンバースライド中の内容液を吸引し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２回、このファージが結合したＲＢＥ細胞を洗浄して、固定液として１：１のメタノール／アセトン溶液の４００μ１を洗浄後のＲＢＥ細胞に添加し、−２０℃で３分間、洗浄後のＲＢＥ細胞を固定した。この固定液を吸引し、固定したＲＢＥ細胞を１０分間乾燥させた。このチャンバースライドのチャンバーをはずし、スライドガラスだけにして、ブロッキング剤として１０％ヤギ血清の１００μｌを乾燥させたＲＢＥ細胞に添加して、湿潤条件下で２０分間、室温で１０％ヤギ血清添加ＲＢＥ細胞をブロッキングした。一次抗体として、ＰＢＳで希釈した２％ヤギ血清を用いて、６００倍に希釈したウサギ由来坑Ｍ１３ファージ抗体の１００μｌを、ブロッキング処理後のＲＢＥ細胞に添加し、１時間室温でブロッキング処理後のＲＢＥ細胞と一次抗体とを結合させた。一次抗体が結合したＲＢＥ細胞をＰＢＳで３分間、３回洗浄した後、二次抗体として、２％ヤギ血清で１００倍に希釈した標識ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体の１００μｌを、洗浄したＲＢＥ細胞に添加し、遮光して１時間室温で一次抗体と二次抗体とを結合させた。二次抗体が結合したＲＢＥ細胞をＰＢＳで３分間、３回洗浄した後、ＤＡＰＩの１００μｌを洗浄したＲＢＥ細胞に添加し、１〜３分間室温でＤＡＰＩ添加ＲＢＥ細胞を染色した。ＤＡＰＩ染色後のＲＢＥ細胞をＰＢＳで３分間、３回洗浄して、蛍光退色防止剤の１００μｌを洗浄したＲＢＥ細胞に添加し、１０分間静置した。水性封入剤で蛍光退色防止処理後のＲＢＥ細胞を包埋して、水性封入剤で封入したＲＢＥ細胞を、蛍光顕微鏡のＢｉｏｚｅｒｏ ＢＺ−８０００で観察した。
（比較例１６）
実施例６中の作製例１のクラスリン結合性のペプチド組込みファージを、比較作製例１のインサートレスファージに変更した以外は実施例６と同じ方法でＲＢＥ細胞を観察した。
実施例６中の作製例１のクラスリン結合性のペプチド組込みファージを、比較作製例１のインサートレスファージに変更した以外は実施例６と同じ方法でＲＢＥ細胞を観察した。
実施例６及び比較例１６での蛍光顕微鏡写真を纏めて図８に示す。実施例６のように本発明を適用するペプチド組込みファージは、ＲＢＥ細胞に選択的に集積し易いものであることから、ＲＢＥ細胞の細胞膜上に特有の緑色の蛍光が観察された。一方、比較例１６のように本発明を適用外のインサートレスファージを用いた場合、ＲＢＥ細胞に緑色の蛍光は観察されなかった。このことから本発明を適用するペプチド組込みファージは、胆管癌病巣への薬物輸送材料の有効成分として、有用であることが分かった。
（実施例７）
ヒト胆管癌組織を、凍結組織切片作製用包埋剤のＯＣＴコンパウンド（サクラファインテックジャパン株式会社の製品名）で冷凍保存した後、凍結切片作製装置のクライオスタットで薄切して、切片を作製した。この切片をスライドガラスに載せ、適量の１％ＢＳＡ含有ＴＢＳで５分間、２回洗浄した。作製例１のペプチド組込みファージの数を２×１０９ｐｆｕとなるように希釈して、１％ＢＳＡ含有ＴＢＳで洗浄した切片に添加し、１時間室温でこの組織とこのファージとを結合させた。このファージが結合した切片を適量の１％ＢＳＡ含有ＴＢＳで３回洗浄した後に、無水エタノールで５分固定した。この切片の内因性ペルオキシダーゼをブロッキングするため、３％過酸化水素水をこの切片に添加し、室温下、１０分間３％過酸化水素水中で切片を静置した。ブロッキング後の切片を適量の１％ＢＳＡ含有ＴＢＳで５分間、３回洗浄し、一次抗体として、６００倍に希釈したウサギ由来坑Ｍ１３ファージ抗体の１００μｌを洗浄した切片に添加し、１時間室温で切片に結合したファージと一次抗体とを結合させた。一次抗体が結合した切片を適量の１％ＢＳＡ含有ＴＢＳで５分間、３回洗浄し、二次抗体として、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍ Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ−ＨＲＰ ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ（ダコ・ジャパン株式会社の製品名）の１２０μｌを、１％ＢＳＡ含有ＴＢＳで洗浄した。一次抗体結合切片に添加し、１時間室温で切片に結合した一次抗体と二次抗体とを結合させた。二次抗体が結合した切片を適量の１％ＢＳＡ含有ＴＢＳで５分間、３回洗浄し、Ｔｒｉｓの６．０５ｇ／Ｌと、塩酸の３７．５ｍｌ／Ｌ（共に和光純薬工業株式会社製）と、超純水１ＬとからなるＴｒｉｓ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎの１２５ｍｌと、３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ；株式会社同仁化学研究所製）の１ｇと、エチレングリコールモノメチルエーテルの５０ｍｌと、アジ化ナトリウムの１ｇとからなるＤＡＢ溶液の１．２５ｍｌと、３０％過酸化水素水の６．５μｌとからなるペルオキシダーゼ発色基質を調製して、１％ＢＳＡ含有ＴＢＳで洗浄した二次抗体結合切片に添加した。水で２分間、発色基質で処理した切片を洗浄した後、ヘマトキシリン液を洗浄した切片に添加して、１分間ヘマトキシリン液中の切片の細胞の核を染色した。ヘマトキシリン染色後の切片を流水中で２分間洗浄した後、流水中で洗浄した切片をＴＢＳで１０秒間洗浄して、ＴＢＳ洗浄した切片を発色させた。発色した切片を流水中で５分間洗浄し、アルコールで脱水した。アルコールで脱水した切片を透徹し、封入して、光学顕微鏡で観察した。
ヒト胆管癌組織を、凍結組織切片作製用包埋剤のＯＣＴコンパウンド（サクラファインテックジャパン株式会社の製品名）で冷凍保存した後、凍結切片作製装置のクライオスタットで薄切して、切片を作製した。この切片をスライドガラスに載せ、適量の１％ＢＳＡ含有ＴＢＳで５分間、２回洗浄した。作製例１のペプチド組込みファージの数を２×１０９ｐｆｕとなるように希釈して、１％ＢＳＡ含有ＴＢＳで洗浄した切片に添加し、１時間室温でこの組織とこのファージとを結合させた。このファージが結合した切片を適量の１％ＢＳＡ含有ＴＢＳで３回洗浄した後に、無水エタノールで５分固定した。この切片の内因性ペルオキシダーゼをブロッキングするため、３％過酸化水素水をこの切片に添加し、室温下、１０分間３％過酸化水素水中で切片を静置した。ブロッキング後の切片を適量の１％ＢＳＡ含有ＴＢＳで５分間、３回洗浄し、一次抗体として、６００倍に希釈したウサギ由来坑Ｍ１３ファージ抗体の１００μｌを洗浄した切片に添加し、１時間室温で切片に結合したファージと一次抗体とを結合させた。一次抗体が結合した切片を適量の１％ＢＳＡ含有ＴＢＳで５分間、３回洗浄し、二次抗体として、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍ Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ−ＨＲＰ ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ（ダコ・ジャパン株式会社の製品名）の１２０μｌを、１％ＢＳＡ含有ＴＢＳで洗浄した。一次抗体結合切片に添加し、１時間室温で切片に結合した一次抗体と二次抗体とを結合させた。二次抗体が結合した切片を適量の１％ＢＳＡ含有ＴＢＳで５分間、３回洗浄し、Ｔｒｉｓの６．０５ｇ／Ｌと、塩酸の３７．５ｍｌ／Ｌ（共に和光純薬工業株式会社製）と、超純水１ＬとからなるＴｒｉｓ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎの１２５ｍｌと、３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ；株式会社同仁化学研究所製）の１ｇと、エチレングリコールモノメチルエーテルの５０ｍｌと、アジ化ナトリウムの１ｇとからなるＤＡＢ溶液の１．２５ｍｌと、３０％過酸化水素水の６．５μｌとからなるペルオキシダーゼ発色基質を調製して、１％ＢＳＡ含有ＴＢＳで洗浄した二次抗体結合切片に添加した。水で２分間、発色基質で処理した切片を洗浄した後、ヘマトキシリン液を洗浄した切片に添加して、１分間ヘマトキシリン液中の切片の細胞の核を染色した。ヘマトキシリン染色後の切片を流水中で２分間洗浄した後、流水中で洗浄した切片をＴＢＳで１０秒間洗浄して、ＴＢＳ洗浄した切片を発色させた。発色した切片を流水中で５分間洗浄し、アルコールで脱水した。アルコールで脱水した切片を透徹し、封入して、光学顕微鏡で観察した。
（比較例１７）
実施例７中のペプチド組込みファージを比較作製例１のインサートレスファージに変更した以外は、実施例７と同じ方法でヒト胆管癌組織切片を観察した。
実施例７中のペプチド組込みファージを比較作製例１のインサートレスファージに変更した以外は、実施例７と同じ方法でヒト胆管癌組織切片を観察した。
実施例７及び比較例１７での光学顕微鏡写真を纏めて図９に示す。実施例７のように本発明を適用するクラスリン結合性のペプチド組込みファージは、胆管癌組織に集積し易いものであることから、ヒト胆管癌組織の細胞膜上にペルオキシダーゼとＤＡＢとの反応による褐色の色素が観察された。一方、比較例１７のように本発明を適用外のインサートレスファージを用いた場合、褐色の色素が観察されなかった。このことから、本発明を適用するクラスリン結合性のペプチド組込みファージは、胆管癌病巣への選択的な薬物輸送材料やその有効成分として、有用であることが分かった。
なお、実施例及び比較例で用いた組織の使用にあたり信州大学医学部倫理委員会の承認と全患者からの承諾とが得られている。統計学的データは、何れもｎ＝３であり、平均値、標準偏差及びスチューデントのｔ検定による有意差を表示してある。
本発明のクラスリン結合性ペプチド誘導体は、癌、特に胆管癌の診療のために、用いられる。このクラスリン結合性ペプチド誘導体は、癌の治療剤として、またその薬効成分として、有用であり、さらに、採取した胆汁中の癌細胞の有無を診断するような診断薬の有効成分として有用であり、胆管ドレナージチューブからの投与により胆管癌の進展範囲の診断に有効である。本発明のファージは、胆管癌組織へ特異的に集積させて、癌を治療したり、診断したりする薬物輸送材料を調製するために用いられる。本発明の薬物輸送材料は、癌治療剤や癌診断剤を包含させて癌病巣へ輸送し、癌を治療したり、診断したりするのに用いられる。
Claims (7)
- Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐのアミノ酸配列を含むことを特徴とするクラスリン結合性ペプチド誘導体。
- 前記アミノ酸配列のみからなることを特徴とする請求項１に記載のクラスリン結合性ペプチド誘導体。
- 前記アミノ酸配列に、ビオチン含有化合物、及び／又は蛍光色素が結合されている標識化クラスリン結合性ペプチド誘導体であることを特徴とする請求項１に記載のクラスリン結合性ペプチド誘導体。
- Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐのアミノ酸配列を含むクラスリン結合性ペプチド誘導体が、ファージのコートタンパク質の末端に、化学的結合によって延長されていることを特徴とするペプチド組込みファージ。
- Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐのアミノ酸配列を含むクラスリン結合性ペプチド誘導体、又はそれがファージのコートタンパク質の末端に化学的結合によって延長されているペプチド組込みファージが、含有されていることを特徴とする薬物輸送材料。
- 前記クラスリン結合性ペプチド誘導体又は前記ペプチド組込みファージが、コロイド粒子、造影材料及び／又は磁性粒子に、含有、結合又は共存され、その表面に前記クラスリン結合性ペプチド誘導体が露出していることを特徴とする請求項５に記載の薬物輸送材料。
- 前記コロイド粒子、造影材料及び／又は磁性粒子が、癌治療剤、又は癌診断剤を含んでいることを特徴とする請求項６に記載の薬物輸送材料。
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