JP2024046855A

JP2024046855A - インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有するＤＮＡアプタマー

Info

Publication number: JP2024046855A
Application number: JP2022152183A
Authority: JP
Inventors: 圭佑 ▲浜▼田; 洋一根岸; 雄二山田; 大和吉川; 基義野水
Original assignee: Tokyo University of Pharmacy and Life Sciences
Current assignee: Tokyo University of Pharmacy and Life Sciences
Priority date: 2022-09-26
Filing date: 2022-09-26
Publication date: 2024-04-05

Abstract

【課題】インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有するＤＮＡアプタマーを提供する。【解決手段】以下の（１－１）または（２－１）の塩基配列を含み、インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有する、アプタマー：（１－１）配列番号１～３３からなる群から選択される塩基配列；および（２－１）配列番号１～３３からなる群から選択される塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列。【選択図】なし

Description

本発明は、インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有するＤＮＡアプタマーに関する。

特定のタンパク質特異的に結合する一本鎖核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ；アプタマー）の創製研究は広く行われている。インテグリン受容体に対するアプタマーとして、インテグリンαｖβ３（ＤＮＡアプタマー）、インテグリンα６β４（ＤＮＡアプタマー）、インテグリンα５β１（ＲＮＡアプタマー）などの報告がある（例えば、特許文献１および２）。しかし、インテグリンα７β１受容体選択的に結合するＤＮＡアプタマーの報告はない。

インテグリンα７β１受容体は、筋細胞選択的に高発現することが知られている。例えば、非特許文献１は、筋細胞選択的な一本鎖核酸を同定したものとしてＲＮＡアプタマーを報告しているが、標的分子および受容体は不明である。筋細胞への薬物送達を可能とする分子プローブとしては、抗体、ペプチドなどを用いた例が報告されているが、ＤＮＡアプタマーを用いた例はほとんどない。また、インテグリンα７β１受容体に対して結合する一本鎖核酸配列は同定されていない。

国際公開第２０１７／１１８４５８号国際公開第２０１４／０２１６３０号

Philippou S, Mastroyiannopoulos NP, Makrides N, Lederer CW, Kleanthous M, Phylactou LA. Selection and Identification of Skeletal-Muscle-Targeted RNA Aptamers. Mol Ther Nucleic Acids. 2018 Mar 2;10:199-214.

本発明は、インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有するＤＮＡアプタマーを提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、配列番号１～３３で表される塩基配列を含むＤＮＡアプタマーによって、上記課題を解決することを見出し、本発明の完成に至った。

すなわち、本発明の一形態は、以下の（１－１）または（２－１）の塩基配列を含み、インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有する、アプタマーである：
（１－１）配列番号１～３３からなる群から選択される塩基配列；および
（２－１）配列番号１～３３からなる群から選択される塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列。

本発明によれば、インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有するＤＮＡアプタマーが提供される。

図１は、実施例におけるＤＮＡアプタマー配列のアライメントを示す。図２は、ＤＮＡアプタマー７１Ａｐ－１～４の二次構造予測の結果を示す。図３は、フローサイトメトリーによるインテグリンα７β１リコンビナントタンパク質への結合活性評価の結果を示す。図４は、フローサイトメトリーによる筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２表面への結合活性評価の結果を示す。図５は、分化Ｃ２Ｃ１２細胞に対する結合能評価の結果を示す。図６は、分化Ｃ２Ｃ１２細胞に対する結合能評価の結果を示す。図７は、筋切片（心筋および前脛骨筋）に対する結合能評価の結果を示す。

以下、本発明の一形態に係る実施の形態を説明する。本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。

本明細書において、範囲を示す「Ｘ～Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０～２５℃）／相対湿度４０～５０％ＲＨの条件で測定する。

＜アプタマー＞
本発明の一態様は、以下の（１－１）または（２－１）の塩基配列を含み、インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有する、アプタマーである：
（１－１）配列番号１～３３からなる群から選択される塩基配列；および
（２－１）配列番号１～３３からなる群から選択される塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列。

配列番号１～３３の塩基配列を以下に示す。

アプタマーとは標的物質に特異的に結合する分子を意味する。本発明に係るアプタマーは、核酸アプタマーであり、一本鎖のＤＮＡから構成される。

インテグリンα７β１受容体は、筋細胞選択的に高発現していることが知られている。筋細胞を標的とした薬物送達法の開発には、抗体が汎用されている。しかし、筋細胞表面受容体に強固に結合する抗体を用いた薬物送達法の開発では、抗体の分子量が大きいことに加え、抗体表面の分子修飾が非常に難しく、煩雑な操作を必要とする。よって、より安価かつ簡便に利用可能な筋細胞標的分子プローブの開発が強く望まれている。

本発明者らは、インテグリンα７β１受容体に結合する一本鎖ＤＮＡとして、配列番号１～３３で表される塩基配列を含むアプタマーを見出した。本発明に係るアプタマーは、核酸医薬、低分子化合物などの選択的な筋細胞デリバリー（送達）を可能とする分子プローブとして応用および実用化が可能である。これまで困難であった筋細胞選択的な薬物送達法の開発、各種遺伝性筋疾患に対する新規化学療法剤の創製、ならびに遺伝子治療戦略の確立に大きく貢献することができる。本発明に係るアプタマーは、安価かつ安定的に合成が可能であると同時に、その５’末端および３’末端への化学修飾も容易である。よって、これまでの筋細胞選択的薬物送達に汎用されてきた抗体、ペプチドなどと比べて優位であるといえる。

本明細書において、「１または複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列」における「１または複数個」の範囲は、例えば１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、または１個である。

好ましい実施形態では、本発明に係るアプタマーは、以下の（１－２）または（２－２）の塩基配列を含み、インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有する：
（１－２）配列番号１～４、１１、１８、２０、２５および２７からなる群から選択される塩基配列；および
（２－２）配列番号１～４、１１、１８、２０、２５および２７からなる群から選択される塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列。

さらに好ましい実施形態では、本発明に係るアプタマーは、以下の（１－３）または（２－３）の塩基配列を含み、インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有する：
（１－３）配列番号１～４からなる群から選択される塩基配列；および
（２－３）配列番号１～４からなる群から選択される塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列。

特に好ましい実施形態では、本発明に係るアプタマーは、上記（１－１）の塩基配列、上記（１－２）の塩基配列、または上記（１－３）の塩基配列からなる。

本発明に係るアプタマーの塩基長は、例えば７５～８５ｍｅｒであり、好ましくは７８～８２ｍｅｒであり、より好ましくは７９～８１ｍｅｒであり、特に好ましくは８０ｍｅｒである。

本発明に係るアプタマーは、インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有する。そのため、本発明に係るアプタマーは、ＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment）法と呼ばれるスクリーニング法により取得することができる。ＳＥＬＥＸ法としては、例えばT. Wang et al., A detailed protein-SELEX protocol allowing visual assessments of individual steps for high success rate, Human gene therapy, 30 (1):1-16, 2019に記載のＰｒｏｔｅｉｎ－ＳＥＬＥＸ法を使用することができる。

具体的には、以下の方法により本発明に係るアプタマーを取得することができる：
（１）ランダム配列を含む一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリーを、標的とするインテグリンα７β１リコンビナントタンパク質を表面に担持させた磁気ビーズと結合させる；
（２）洗浄を行い、標的に結合していない、またはアフィニティの弱いｓｓＤＮＡを除去する；
（３）ｓｓＤＮＡを単離後、ＰＣＲにて複製し二本鎖ＤＮＡを得た後、水素結合を乖離させることで再度ｓｓＤＮＡへと変換する；
（４）（１）～（３）の工程を、条件を種々変更しながら繰り返すことで、標的とするインテグリンα７β１リコンビナントタンパク質に対して高親和性に結合する分子を濃縮する；ならびに
（５）ＤＮＡシーケンスを行うことで、インテグリンα７β１受容体に対して高親和性に結合するアプタマー配列を決定する。

上記の方法により得られたアプタマーは、インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有する。

また、本発明に係るアプタマーは、従来公知の方法により化学合成することができる。

アプタマーのインテグリンα７β１受容体に対する結合能を評価する場合には、例えばフローサイトメトリー、蛍光顕微鏡による観察などで評価することができる（実施例参照）。

本発明に係るアプタマーは、その塩基配列に応じて、特有の高次構造を取ることができる。例えば、アプタマーの二次構造予測については、ＮＵＰＡＣＫ（http://www.nupack.org/）にて行うことができる。本発明に係るアプタマーのフォールディングについては、従来公知の方法により行うことができる。例えば、ＰＢＳ（－）、２．５ｍＭＭｇＣｌ_２および４．５ｇ／Ｌグルコースを含むバッファー（ｐＨ７．４）中でアプタマーを１００℃にて１０分間インキュベートした後、氷上にて１０分間急冷することによって、アプタマーのフォールディングを行うことができる。

＜複合体＞
本発明の一実施形態は、本発明に係るアプタマーと機能性物質とを含む、複合体である。本発明に係る複合体は、本発明に係るアプタマーと同様に、インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有する。

本発明に係るアプタマーと機能性物質との間の結合は、複合体がインテグリンα７β１受容体に対する結合能を有する限り、共有結合であってもよく、非共有結合であってもよい。本発明に係るアプタマーと機能性物質とは、直接結合していてもよく、リンカーを介して結合していてもよい。リンカーとしては、従来公知のものを使用することができる。

本発明に係る複合体は、本発明に係るアプタマーと少なくとも１つの機能性物質とが結合している。本発明に係るアプタマーに結合する機能性物質が２以上である場合、機能性物質は、同一の物質であっても異なる物質であってもよい。

本明細書において、機能性物質とは、本発明に係るアプタマーと共に使用され、何らかの機能を有する物質である、または本発明に係るアプタマーが有する特性を変化させうる物質である。

機能性物質としては、例えばタンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、単糖、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド；標識用物質、薬物送達媒体、薬物、親和性物質、酵素、毒素などが挙げられる。

一実施形態では、機能性物質は、標識用物質、薬物送達媒体、薬物、親和性物質、酵素および毒素からなる群から選択される少なくとも１つであり、好ましくは標識用物質、薬物送達媒体、薬物および親和性物質からなる群から選択される少なくとも１つである。

標識用物質としては、例えば蛍光物質、発光物質、放射性同位体などが挙げられる。薬物送達媒体としては、例えばリポソーム、ミクロスフェア、ペプチド、ポリエチレングリコール、コレステロールなどが挙げられる。薬物としては、例えばドキソルビシン、シスプラチンなどの抗悪性腫瘍薬、エキソンスキップ薬に代表される核酸医薬（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、抗体医薬などが挙げられる。親和性物質としては、例えば標的相補配列に対して親和性を有するポリヌクレオチド、抗体などが挙げられる。

＜用途＞
本発明に係るアプタマーは、インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有するため、分子プローブ、好ましくは筋細胞へのターゲティング分子（分子プローブ）として使用することができる。

本発明に係るアプタマーおよび複合体は、例えば医薬（検査薬および診断薬を含む）、試薬、薬物送達システムなどにおいて使用することができる。

本発明の一実施形態は、本発明に係るアプタマーおよび／または複合体を含む、医薬である。

本発明に係るアプタマーおよび複合体は、インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有するため、筋疾患または癌を治療および／または予防するための医薬として有用である。

筋疾患としては、ジストロフィン異常症（デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー）、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、癌増悪に伴う筋萎縮、加齢による筋脆弱などが挙げられる。

癌としては、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、食道癌などが挙げられる。

本発明に係る医薬は、薬学的に許容される担体を含むことができる。薬学的に許容される担体としては、特に限定されないが、乳糖、ショ糖、マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等の賦形剤；シリカ、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、デキストリン、ゼラチン等の結合剤；アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、トコフェロール等の酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤；ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸等の緩衝剤；注射用水、生理食塩水、エタノール、プロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、マクロゴール、オリーブ油、トウモロコシ油等の溶媒；プルロニック（登録商標）、ポリエチレングリコール、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート、トリトン（登録商標）、レシチン、コレステロール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤または湿潤剤；塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、ブドウ糖、ソルビトール、マンニトール等の等張化剤；安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン等の保存剤；錯化剤；アミノ酸；抗菌剤；着色剤；フレーバー剤および希釈剤；乳化剤；ナトリウム等の塩形成対イオン；搬送ビヒクル；希釈剤などが挙げられる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ監修，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，１９９０）。

本発明に係る医薬の投与経路は、特に制限されず、経口投与であっても非経口投与であってもよい。

本発明に係る医薬の投与量は、限定されないが、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、投与する患者の体重、年齢、病状等の特性、あるいは医師の判断等に応じて適宜選択される。例えば患者の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ～約１００ｍｇ、好ましくは約０．１μｇ～約１ｍｇ程度の範囲である。投与量は１日１～数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。

本発明の一実施形態は、本発明に係るアプタマーおよび／または複合体を含む、インテグリンα７β１受容体を検出するための試薬である。

本発明に係るアプタマーおよび複合体は、インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有するため、インテグリンα７β１受容体の検出に使用することができる。検出方法としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例えば直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡなど）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的染色法、セルソーティング法などが挙げられる。

本発明の一実施形態は、本発明に係るアプタマーおよび薬物を含む、または本発明に係る複合体を含み、前記複合体は機能性物質として薬物を含む、インテグリンα７β１受容体を発現する細胞に前記薬物を送達するための薬物送達システムである。

インテグリンα７β１受容体を発現する細胞としては、筋細胞、癌細胞（例えば、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、食道癌）などが挙げられる。

本発明に係る薬物送達システムは、本発明に係るアプタマーおよび薬物を含む場合、本発明に係るアプタマーと薬物とが一体化していない形態である。本発明に係るアプタマーと薬物とが相互作用により一体化した形態は、本発明に係る複合体の形態である。複合体の例としては、本発明に係るアプタマーと薬物を封入したリポソームとの複合体、本発明に係るアプタマーと薬物とが直接またはリンカーを介して結合した複合体などが挙げられる。

＜実施形態＞
以下に、本発明の実施形態を例示する。
［１］以下の（１－１）または（２－１）の塩基配列を含み、インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有する、アプタマー：
（１－１）配列番号１～３３からなる群から選択される塩基配列；および
（２－１）配列番号１～３３からなる群から選択される塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列。
［２］以下の（１－２）または（２－２）の塩基配列を含み、インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有する、［１］に記載のアプタマー：
（１－２）配列番号１～４、１１、１８、２０、２５および２７からなる群から選択される塩基配列；および
（２－２）配列番号１～４、１１、１８、２０、２５および２７からなる群から選択される塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列。
［３］以下の（１－３）または（２－３）の塩基配列を含み、インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有する、［１］または［２］に記載のアプタマー：
（１－３）配列番号１～４からなる群から選択される塩基配列；および
（２－３）配列番号１～４からなる群から選択される塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列。
［４］分子プローブとして使用される、［１］～［４］のいずれか１つに記載のアプタマー。
［５］［１］～［４］のいずれか１つに記載のアプタマーと機能性物質とを含む、複合体。
［６］前記機能性物質は、標識用物質、薬物送達媒体、薬物および親和性物質からなる群から選択される少なくとも１つである、［５］に記載の複合体。
［７］［１］～［４］のいずれか１つに記載のアプタマーまたは［５］もしくは［６］に記載の複合体を含む、医薬。
［８］［１］～［４］のいずれか１つに記載のアプタマーまたは［５］もしくは［６］に記載の複合体を含む、インテグリンα７β１受容体を検出するための試薬。
［９］［１］～［４］のいずれか１つに記載のアプタマーおよび薬物を含む、または［５］もしくは［６］に記載の複合体を含み、前記複合体は機能性物質として薬物を含む、インテグリンα７β１受容体を発現する細胞に前記薬物を送達するための薬物送達システム。

以下に具体例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。

＜アプタマー取得に用いたプライマーとランダムライブラリー配列＞
実施例で使用したプライマーおよびランダムライブラリー配列を表１に示す。全てのプライマーおよびランダムｓｓＤＮＡライブラリーは、ＩＤＴ社から購入した。

＜ＳＥＬＥＸ法によるインテグリンα７β１受容体に結合するＤＮＡアプタマーの取得＞
インテグリンα７β１受容体に結合するＤＮＡアプタマーの取得は、T. Wang et al., A detailed protein-SELEX protocol allowing visual assessments of individual steps for high success rate, Human gene therapy, 30 (1):1-16, 2019を参考に行った。

（バッファー組成）
結合バッファー：ｐＨ７．４、ＰＢＳ（－）（ナカライテスク株式会社、ｃａｔａｌｏｇ＃０５１５０－４５）、２．５ｍＭＭｇＣｌ_２、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（東京化成工業、ｃａｔａｌｏｇ＃Ｔ０５４３）、およびＳａｌｍｏｎｓｐｅｒｍｓｓＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ｃａｔａｌｏｇ＃１５６３２０１１）（ＳａｌｍｏｎｓｐｅｒｍｓｓＤＮＡはＳＥＬＥＸサイクルごと、および実験ごとに容量を変更した）；
洗浄バッファー：ｐＨ７．４、ＰＢＳ（－）、２．５ｍＭＭｇＣｌ_２、および０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０；
リフォールディングバッファー：ｐＨ７．４、ＰＢＳ（－）、２．５ｍＭＭｇＣｌ_２、および４．５ｇ／Ｌグルコース。

（Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＳＥＬＥＸ）
磁気ビーズ（ＤｙｎａｂｅａｄｓＨｉｓ－ＴａｇＩｓｏｌａｔｉｏｎ＆Ｐｕｌｌｄｏｗｎ、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ｃａｔａｌｏｇ＃ＤＢ１０１０３）（Ｃｙｃｌｅ毎に容量を変更）に対してインテグリンタンパク質（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｍｏｕｓｅｉｎｔｅｇｒｉｎ α７β１ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社、ｃａｔａｌｏｇ＃７９５８－Ａ７－０５０）を結合バッファー中にて１０分室温にて結合させ、ビーズ表面にタンパク質を担持および固定化した。結合バッファー中のＳａｌｍｏｎｓｐｅｒｍｓｓＤＮＡの濃度は、ＳＥＬＥＸのサイクルごとに変更し、１２５μｇ／ｍＬ（１サイクル目）、１６．６６μｇ／ｍＬ（２～４サイクル目）および１０μｇ／ｍＬ（５～８サイクル目）であった。

次に５００μＬの洗浄バッファーにて５回洗浄した。別のチューブにおいて、ＳａｌｍｏｎｓｐｅｒｍＤＮＡを加えた結合バッファーに３ｎｍｏｌのランダムｓｓＤＮＡライブラリーを加え、９５℃で１０分間加熱した後、氷上にて１０分間インキュベートすることにより、ｓｓＤＮＡをフォールディングさせた。

次に、上記で準備したインテグリンタンパク質を結合させた磁気ビーズと混合し、１時間、室温にてインキュベートした。５００μＬの洗浄バッファーにて複数回洗浄（サイクル毎に変更）した後、１００μＬのＴＥバッファーを加えて、ＰＣＲテンプレートとした（ビーズ懸濁液）。ＰＣＲには、ＫＯＤＤａｓｈ（登録商標）（東洋紡株式会社、ｃａｔａｌｏｇ＃ＬＤＰ－１０１）を用いた。ＰＣＲの実行には、ＴａｋａｒａＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅＤｉｃｅ（タカラバイオ株式会社）を用いた。ＫＯＤＤａｓｈのプロトコールに従って、ビーズ懸濁液２μＬを使ってＰＣＲを行った（１ｓｔＰＣＲ）。ＰＣＲは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて９４℃ ２分、（９４℃ ３０秒、５１．６℃ ４０秒、６８℃ ４５秒）、６８℃、５分にて実施した。サイクル数は、８回、１０回、１２回、１４回、１６回、または１８回と変更することで、適切なサイクル数を選択した。

次に、決定したサイクル数を用いて、残りの９８μＬのビーズ懸濁液を用いた２ｎｄＰＣＲを実施した。１ｓｔＰＣＲと同条件にてＰＣＲを実施し、ＰＣＲ反応終了後、全ての反応溶液を回収した。得られたＰＣＲ産物を１２％尿素ページにて分離し、目的のＤＮＡサイズのバンドを切り出した。続けて３．５ｋＤａのカットオフ値を有する透析膜に入れた後、０．５ＸＴＢＥバッファー中にて１００Ｖ、１時間で電気溶出した。得られたＰＣＲ産物は、スピードバックにて濃縮した後、エタノール沈澱を行うことによって、１ｓｔＳＥＬＥＸサイクル産物とした。

以降のＳＥＬＥＸ反応は、得られたＳＥＬＥＸ産物を各々の濃度に調整し同様の手法で行い合計８サイクル行った。

ＳＥＬＥＸ条件を表２に示す。

＜ＴＡクローニング＞
上記のＰｒｏｔｅｉｎ－ＳＥＬＥＸを８サイクル行った後、得られたＳＥＬＥＸ産物を用いて、ＴＡクローニングを行った。ＴＡクローニングは、ＴＡｒｇｅｔＣｌｏｎｅ（東洋紡株式会社）を用いて、添付プロトコールに従って実施した。コンピテントセルには大腸菌ＤＨ５αを用い、得られたコロニー４９種類を回収後、ＬＢ培地にて再度培養した。得られた大腸菌からＴＡクローニング後のプラスミドをＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製し、ＤＮＡシーケンスをＥｕｒｏｆｉｎｇｅｎｏｍｉｃｓ社にて受託で行った。得られたシーケンス結果を基に、４９種類のＤＮＡアプタマー配列（Ｎｏ．１～６および８～５０）を得た（表３）。

ＤＮＡアプタマー配列のアライメントをＣｌｕｓｔａｌＸソフトウェアを用いて実施した。結果を図１に示す。図１に示すように、３３種類のＤＮＡアプタマー配列が得られた。

ＤＮＡアプタマー配列のうち、その相同性の高い配列から順に７１Ａｐ－１（配列番号１の塩基配列からなるアプタマー）、７１Ａｐ－２（配列番号２の塩基配列からなるアプタマー）、７１Ａｐ－３（配列番号３の塩基配列からなるアプタマー）、および７１Ａｐ－４（配列番号４の塩基配列からなるアプタマー）とした。

＜二次構造予測＞
７１Ａｐ－１～４の二次構造予測は、ＮＵＰＡＣＫ（http://www.nupack.org/）にて３７℃条件下で行った。結果を図２に示す。

図２に示すように、７１Ａｐ－１～４は、それぞれ異なる二次構造を取り得ることが予測される。

＜蛍光分子修飾ＤＮＡアプタマー７１Ａｐ－１～４の合成＞
各ＳＥＬＥＸ産物をテンプレートに、蛍光修飾結合フォワードプライマー１または２およびリバースプライマーを用いて、Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＳＥＬＥＸと同条件にてＰＣＲを行った。尿素ページ、電気溶出、濃縮、およびエタノール沈澱を行うことによって、蛍光修飾ＳＥＬＥＸ産物を得た。得られた蛍光修飾ＳＥＬＥＸ産物をリフォールディングバッファーに適切な濃度で溶解し、１００℃にて１０分間インキュベートした後、氷上にて１０分間急冷することによってリフォールディングさせた。

＜フローサイトメトリーによるインテグリンα７β１リコンビナントタンパク質への結合活性評価＞
上記Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＳＥＬＥＸと同様の手法により、磁気ビーズに対してインテグリンα７β１タンパク質を結合させた後、結合バッファー（ＳａｌｍｏｎｓｐｅｒｍｓｓＤＮＡ濃度：０．２μＬ／ｍＬ）に対して、リフォールディングしたＡｌｅｘａ４８８修飾ＤＮＡアプタマー７１Ａｐ－１～４を最終濃度２００ｎＭとなるように添加し、３７℃にて３０分間インキュベートした。その後、洗浄バッファーにて３回洗浄し、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ（ＢＤ社）にて結合能を測定した。得られたデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ社）にて解析した。結果を図３に示す。コントロールとして、Ａｌｅｘａ４８８修飾のランダムｓｓＤＮＡライブラリー（陰性コントロール）を使用した。

図３に示すように、７１Ａｐ－１～４は、インテグリンα７β１タンパク質へ結合することが分かる。

＜フローサイトメトリーによる筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２表面への結合活性評価＞
Ｃ２Ｃ１２細胞を９０％コンフルエントとなるように培養し、ＰＢＳ（－）にて洗浄後、アキュターゼを用いて細胞をプレートから剥離した。得られた細胞（１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を、グルコース（４．５ｇ／Ｌ）およびＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）含有の結合バッファー（ＳａｌｍｏｎｓｐｅｒｍｓｓＤＮＡ濃度：０．２ｍｇ／ｍＬ）に懸濁し、ＦＡＭ修飾ＤＮＡアプタマー７１Ａｐ－１を２５００ｎＭ、１２５０ｎＭ、６２５ｎＭ、３１２．５ｎＭ、１５６．２５ｎＭ、７８．１２５ｎＭまたは０ｎＭ添加した後、３７℃にて３０分間インキュベートした。細胞を３回洗浄バッファーにて洗浄したのち、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ（ＢＤ社）にて結合能を測定した。得られたデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ社）にて解析した。結果を図４に示す。図４中、ＦＡＭ－ｌｉｂｒａｒｙは、ＦＡＭ修飾ＤＮＡアプタマー７１Ａｐ－１の代わりにＦＡＭ修飾ランダムｓｓＤＮＡライブラリーを使用した結果を示す。

図４に示すように、７１Ａｐ－１は、Ｃ２Ｃ１２細胞表面に結合し、その結合は濃度依存的であることが分かる。

＜分化Ｃ２Ｃ１２細胞に対する結合能評価＞
（Ｃ２Ｃ１２細胞の筋管への分化誘導）
Ｃ２Ｃ１２細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中にて９０％コンフルエントとなるように培養した。ＰＢＳ（－）にて１度洗浄後、分化誘導培地（ＤＭＥＭ＋２％ウマ血清）へと置換した。２日毎に培地交換を行い、１０日経過後、活性評価に用いた。

（結合能評価）
分化誘導を行ったＣ２Ｃ１２細胞をＰＢＳ（－）にて１度洗浄後、１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ／ＰＢＳ（－）にてブロッキングを行った。その後、１０００倍希釈のＤＡＰＩ溶液を加えて、１０分室温にてインキュベートすることで核染色を行った後、２回洗浄バッファーにて洗浄した。続けて、リフォールディングしたＦＡＭ修飾ＤＮＡアプタマー７１Ａｐ－１～４を最終濃度５μＭにて添加し、室温にて１時間インキュベートした。２回洗浄バッファーにて洗浄したのち、オールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ８００（株式会社キーエンス製）を用いて顕微鏡観察を行った。結果を図５に示す（スケールバー：５０μｍ）。図５中、コントロールは、アプタマー溶液を添加していないもの（陰性コントロール）を使用した結果を示す。すなわち、細胞そのものであり、ＤＡＰＩ以外の処理においてＦＡＭ修飾ＤＮＡアプタマー７１Ａｐ－１～４を添加せず、それ以外はすべて同様の処理を行ったものであった。また、ＦＡＭ－ｌｉｂｒａｒｙは、ＦＡＭ修飾ランダムｓｓＤＮＡライブラリーを使用した結果を示す。

図５は、蛍光顕微鏡による観察画像であり、図６は、相対ＦＡＭ染色エリア（倍率）を示すグラフである。図５および図６に示すように、７１Ａｐ－１～４は、コントロールおよびＦＡＭ－ｌｉｂｒａｒｙと比べて、分化Ｃ２Ｃ１２細胞表面に強く結合することが分かる。

＜筋切片（心筋および前脛骨筋）に対する７１Ａｐ－１～４の結合能評価＞
以下のマウスを用いた動物実験に関しては、東京薬科大学実験動物施設管理運営委員会
の承認（承認番号：Ｐ２０－５５）を得て実施した。

オスの７週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（東京実験動物株式会社から購入）から心筋および前脛骨筋それぞれの凍結組織をスライスした後、１０分間冷風にて固定した。１０ｍｇ／ｍＬＢＳＡ溶液にて１時間室温にてインキュベートすることによってブロッキングを行い、ＰＢＳ（－）にて２回洗浄した。続けて、１０００倍希釈のＤＡＰＩ溶液を加え、室温にて１０分間インキュベートすることにより核染色を行った後、ＰＢＳ（－）にて２回洗浄した。その後、フォールディングしたＦＡＭ修飾ＤＮＡアプタマー７１Ａｐ－１～４を最終濃度５μＭにて添加し、１時間室温にてインキュベートした。その後、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄａｎｔｉｆａｄｅｍｏｕｎｔｉｎｇｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂ製）にて包埋処理を行い、オールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ８００（株式会社キーエンス製）を用いて蛍光顕微鏡にて観察を行った。結果を図７に示す。図７中、ＦＡＭ－ｌｉｂｒａｒｙは、ＦＡＭ修飾ランダムｓｓＤＮＡライブラリーを使用した結果を示す。

図７に示すように、７１Ａｐ－１～４は、ＦＡＭ－ｌｉｂｒａｒｙと比べて、心筋および前脛骨筋の筋細胞表面に強く結合することが分かる。また、７１Ａｐ－１～４は、筋管に沿って適切に結合することが分かる。

Claims

以下の（１－１）または（２－１）の塩基配列を含み、インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有する、アプタマー：
（１－１）配列番号１～３３からなる群から選択される塩基配列；および
（２－１）配列番号１～３３からなる群から選択される塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列。
以下の（１－２）または（２－２）の塩基配列を含み、インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有する、請求項１に記載のアプタマー：
（１－２）配列番号１～４、１１、１８、２０、２５および２７からなる群から選択される塩基配列；および
（２－２）配列番号１～４、１１、１８、２０、２５および２７からなる群から選択される塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列。
以下の（１－３）または（２－３）の塩基配列を含み、インテグリンα７β１受容体に対する結合能を有する、請求項１に記載のアプタマー：
（１－３）配列番号１～４からなる群から選択される塩基配列；および
（２－３）配列番号１～４からなる群から選択される塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列。
分子プローブとして使用される、請求項１に記載のアプタマー。
請求項１に記載のアプタマーと機能性物質とを含む、複合体。
前記機能性物質は、標識用物質、薬物送達媒体、薬物および親和性物質からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項５に記載の複合体。
請求項１に記載のアプタマーまたは請求項５に記載の複合体を含む、医薬。
請求項１に記載のアプタマーまたは請求項５に記載の複合体を含む、インテグリンα７β１受容体を検出するための試薬。
請求項１に記載のアプタマーおよび薬物を含む、または請求項５に記載の複合体を含み、前記複合体は機能性物質として薬物を含む、インテグリンα７β１受容体を発現する細胞に前記薬物を送達するための薬物送達システム。