JP2014514329A - Ｐｅｇ化オリゴヌクレオチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

治療用ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを調製する方法について記載する。該方法は、治療用オリゴヌクレオチドが調製され得る効率を改善するために設計された、合成、切断および精製ステップを包含する。改善された効率での大規模調製のための方法についても記載する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、参照によりこの全体が本明細書に組み入れられている、２０１１年４月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／４７９，２２６号の利益を主張する。

核酸は従来、生物学的過程において情報を与える役割を主に果たしていると考えられてきた。過去数十年の間に、核酸の三次元構造によって、核酸にタンパク質と相互作用して、タンパク質を調節する能力を与えられることが明らかになった。このような核酸リガンド、即ち「アプタマー」は、高い親和性および特異性で所与のリガンドに結合することができる短いＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーである。クラスとしてアプタマーの三次元構造は十分に可変性であるため、アプタマーは、モノマー性でもポリマー性でも実質的にいずれの化学化合物にも結合してリガンドとして作用できる。アプタマーは、特に癌治療および血液凝固の調節において、有望な新たな診断および治療用化合物として出現した。

何人かの第三者がアプタマーの同定、製造および使用を含む特許を出願および獲得している。ＧｏｌｄおよびＴｕｅｒｋは一般に、アプタマーを単離するためのＳＥＬＥＸ法を最初に開発したと考えられているが、この方法は米国特許第５，６７０，６３７号明細書、同第５，６９６，２４９号明細書、同第５，８４３，６５３号明細書、同第６，１１０，９００号明細書および同第５，２７０，１６３号明細書を含む幾つかの米国特許に記載されている。Ｔｈｏｍａｓ Ｂｒｕｉｃｅらは、米国特許第５，６８６，２４２号明細書でアプタマーの製造方法を報告し、この方法は、スクリーニングシーケンス中に厳密にランダムなオリゴヌクレオチドを用いるため、ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄが報告した元のＳＥＬＥＸ法とは異なっている。米国特許第５，６８６，２４２号明細書でスクリーニングされたオリゴヌクレオチドには、ＳＥＬＥＸ法でスクリーニングされたオリゴヌクレオチドに存在するプライマーが欠如している。

Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ、Ｒｕｓｃｏｎｉ、ＫｏｎｔｏｓおよびＷｈｉｔｅはＷＯ０２／２６９３２で、止血の調節および他の生物学的事象で有用な凝固因子、Ｅ２Ｆファミリ転写因子、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２ならびにこれの断片およびペプチド、転写因子、自己免疫抗体および細胞表面受容体に結合するＲＮＡアプタマーについて記載している。Ｒｕｓｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ８３：８４１−８４８（２０００）、Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０６：９２９−３４（２０００）、Ｉｓｈｉｚａｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２：１３８６−１３８９（１９９６）およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：４１−４５（１９９７）も参照のこと。

アプタマーが治療薬としての使用に好適となるためには、安価に合成され、安全であり、生体内で安定であることが好ましい。あらゆるリボースまたはデオキシリボースヌクレオチドで構成され、ホスホジエステル主鎖には修飾のないＲＮＡおよびＤＮＡアプタマーは、ヌクレアーゼによる分解に対するこれらの感受性のために、通例、生体内で安定ではない。ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性は、２’位に修飾基を組み込むことによって大きく向上させることができる。

ヌクレアーゼによるクリアランスに加えて、オリゴヌクレオチド治療薬は、腎臓濾過による排除を受ける。よって、静脈内投与されたヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドは、濾過を遮断できない限り、通例、１０分未満の生体内半減期を呈する。濾過の遮断は、血流から組織中への急速分散またはオリゴヌクレオチドの見かけの分子量を糸球体の有効サイズカットオフを超えて増加させることのどちらかによって実現できる。小型治療薬をポリアルキレンオキシドポリマーに結合させること（例えばＰＥＧ化）は、循環におけるアプタマーの滞留時間を劇的に延長して、これにより投薬頻度が低下し、血管標的に対する有効性が向上する。

食品医薬品局（ＦＤＡ）および他の国際規制機関が規定した規格を満足するＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの大規模製造は、患者に投与される最終生成物の合成、精製およびキャラクタリゼーションのための多くのステップを包含する。各ステップは、著しい量の時間と費用の両方がかかる。従って、この種類の治療薬の効率的で実現可能な製造方法を最適化する必要がある。

米国特許第５６７０６３７号明細書 米国特許第５６９６２４９号明細書 米国特許第５８４３６５３号明細書 米国特許第６１１０９００号明細書 米国特許第５２７０１６３号明細書 米国特許第５６８６２４２号明細書 国際公開第２００２／２６９３２号

Ｒｕｓｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ８３：８４１−８４８（２０００） Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０６：９２９−３４（２０００） Ｉｓｈｉｚａｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２：１３８６−１３８９（１９９６） Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：４１−４５（１９９７）

一態様において、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）コンジュゲートオリゴヌクレオチドを調製する方法が提供される。一実施形態において、オリゴヌクレオチドはＲＮＡアプタマーであり、アプタマーは２次構造を有する。また別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、中和剤またはアプタマーの活性制御剤である。

一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、固相合成を使用して合成される。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを使用して合成される。

一実施形態において、ＰＡＯコンジュゲートオリゴヌクレオチドを製造する方法は、固体支持体上で非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを合成するステップ、固体支持体から非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを切断して、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを脱保護するステップ、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを脱塩するステップ、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドをＰＥＧ化してＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを生成するステップ、ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを精製するステップおよびＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを脱塩するステップを含む。一実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの脱塩は、限外濾過を含む。

一実施形態において、ＰＡＯコンジュゲートオリゴヌクレオチドを製造する方法は、固体支持体上で非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを合成すること、固体支持体から非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを切断して、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを脱保護すること、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを塩交換すること、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドをＰＥＧ化してＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを生成すること、ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを精製することおよびＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを脱塩することを含む。一実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの塩交換は、限外濾過を含む。

一実施形態において、ＰＡＯコンジュゲートオリゴヌクレオチドを製造する方法は、固体支持体上で非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを合成するステップ、固体支持体から非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを切断して、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを脱保護するステップ、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを脱塩および塩交換するステップ、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドをＰＥＧ化してＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを生成するステップ、ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを精製するステップおよびＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを脱塩するステップを含む。一実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの脱塩および塩交換は、限外濾過を含む。

一実施形態において、該方法は、ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドをフリーズドライするステップをさらに含む。別の実施形態において、凍結乾燥ステップは、限外濾過を使用してＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを脱塩およびさらに精製するステップの後で行う。

別の実施形態において、ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの精製は、ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの分子量未満の分子量カットオフを有する限外濾過膜を用いる限外濾過を使用することを含む。また別の実施形態において、限外濾過膜は、約１０ｋＤ、２０ｋＤまたは３０ｋＤの分子量カットオフを有する。また別の実施形態において、限外濾過膜は、約１０ｋＤから約２０ｋＤの、または約２０ｋＤから約３０ｋＤの分子量カットオフを有する。

一実施形態において、該方法は、固体支持体からの非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの切断および非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの脱保護の後に、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドのイオン交換精製を包含しない。別の実施形態において、該方法は、限外濾過を使用する非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの脱塩および／または塩交換の前に、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドのイオン交換精製を包含しない。

一実施形態において、ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの精製は、アニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の使用を含む。

一実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾塩基部分を含む。

別の実施形態において、少なくとも１つの修飾塩基部分は、５−フルオロウラシル、５−フルオロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ブロモシトシン、５−クロロウラシル、５−クロロシトシン、５−ヨードウラシル、５−ヨードシトシン、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミン−Ｏ−メチルチオウリジン、５−カルボキシメチルアミン−Ｏ−メチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、６−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミン−Ｏ−メチルウラシル、５−メトキシアミン−Ｏ−メチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、５−メトキシシトシン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、ウラシルオキシ酢酸（ｖ）、ブトキシソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチルチオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシルオキシ酢酸（ｖ）、５−メチルチオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎカルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗおよび２，６−ジアミノプリンから成る群より選択される。

一実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドは、１個以上の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドが１個以上の２’−Ｏ−メチル修飾および１個以上の２’−フルオロ修飾を含有する。

一実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドは２次構造を有する。別の実施形態において、２次構造は、少なくとも１個のステムおよび少なくとも１個のループを含む。別の実施形態において、２次構造は２個のステムおよび３個のループを含む。

一実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドが１個以上の２’−Ｏ−メチルおよび１個以上の２’−フルオロ修飾を含有する。別の実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のステムおよび／または少なくとも１個のループ中に１個以上の２’−Ｏ−メチルおよび／または１個以上の２’−フルオロ修飾を含む。

一実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のステム中の少なくとも１個のグアニンは、ヒドロキシル糖（２’−ＯＨ）を含む。別の実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のステム中の少なくとも１個のウリジンは、２’−フルオロまたは２’−Ｏ−メチルのどちらかによって修飾される。別の実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のステム中の少なくとも１個のシチジンは、２’−フルオロ修飾されている。

一実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドは、スペーサを含む。別の実施形態において、スペーサはグリコールスペーサである。

一実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドは、配列番号１−２０の１つを含む。別の実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドは、配列番号１−２０の１つより成る。また別の実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドは、本明細書の表１および２に記載したような修飾オリゴヌクレオチドの１つを含む。また別の実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドは、本明細書の表１および２に記載したような修飾オリゴヌクレオチドの１つより成る。

一実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドは、ＰＡＯへのコンジュゲーションの前にリンカーにカップリングされて、リンカーコンジュゲート非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを生成する。一実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドは反応性アミノ基を有するリンカーを含み、ポリアルキレンオキシドは活性化エステル基によって官能化されている。別の実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドは、反応性チオ基を有するリンカーを含み、ポリアルキレンオキシドは、マレイミド基によって官能化されている。一実施形態において、活性化エステル基はＮＨＳである。

一実施形態において、ポリアルキレンオキシドは活性化されていない。別の実施形態において、ポリアルキレンオキシドはカルボン酸部分をさらに含む。なお別の実施形態において、ＰＡＯのリンカーコンジュゲート非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドへのコンジュゲーションは、コンジュゲーション反応に水溶性カップリング剤を含めることにより、インサイチューで行われる。一実施形態において、水溶性カップリング剤は、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）である。別の実施形態において、水溶性カップリング剤は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＡＣ）である。

一実施形態において、リンカー含有非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドは、リンカー前駆体をオリゴヌクレオチドにコンジュゲートする、またはさもなければ結合することによって生成される。別の実施形態において、リンカー前駆体は：６−（トリフルオロアセトアミド）ヘキサノール（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト、ＴＦＡ−アミノＣ４ ＣＥＤホスホルアミダイト、５’−アミノ修飾剤Ｃ３ ＴＦＡ、５’−アミノ修飾剤５、５’−アミノ修飾剤Ｃ１２および５’チオール修飾剤Ｃ６（下に示すリンカー）から成る群より選択される。

一実施形態において、リンカーはヘキシルアミノリンカーである。

一実施形態において、ポリアルキレンオキシドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。また別の実施形態において、ＰＥＧは、約２０ｋＤから約６０ｋＤ、約２０ｋＤ、約３０ｋＤ、約４０ｋＤ、約５０ｋＤまたは約６０ｋＤの分子量を有する。

一実施形態において、ＰＡＯコンジュゲートオリゴヌクレオチドを製造する方法は、リンカー含有オリゴヌクレオチドの限外濾過をさらに含む。別の実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの限外濾過は、塩溶液に対するダイアフィルトレーションである。また別の実施形態において、塩はナトリウム塩またはカリウム塩である。

一実施形態において、限外濾過は、精製水の存在下で行う。別の実施形態において、限外濾過は、塩溶液の存在下での限外濾過の後に、精製水の存在下で行う。一実施形態において、塩は１価塩である。別の実施形態において、塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩である。また別の実施形態において、塩は、以下のアニオン：Ｃｌ⁻、ＨＳＯ_３ ⁻、ＢｒＯ_３ ⁻、Ｂｒ⁻、ＮＯ_３ ⁻、ＣｌＯ_３ ⁻、ＨＳＯ_４ ⁻、ＨＣＯ_３ ⁻、ＩＯ_３ ⁻、ＨＰＯ_４ ^２−、ホルメート、アセテートまたはプロピオナートの１つの、ナトリウム、カリウムまたはリチウムである。また別の実施形態において、塩はナトリウムクロリドである。

一実施形態において、最終透過物は、０μＳ／ｃｍを超え約７５μＳ／ｃｍ未満の、約５０μＳ／ｃｍ未満のもしくは約４０μＳ／ｃｍ未満の、または約２０μＳ／ｃｍから約７０μＳ／ｃｍに、約２０μＳ／ｃｍから約５０μＳ／ｃｍに、もしくは約２０μＳ／ｃｍから約４０μＳ／ｃｍに及ぶ導電率を有する。

一実施形態において、最終透過物の重量オスモル濃度は、０ｍＯｓｍを超え約４ｍＯｓｍ以下、約２ｍＯｓｍ以下、約１ｍＯｓｍ以下である。別の実施形態において、最終透過物の重量オスモル濃度は、約０．００１ｍＯｓｍから約１．０ｍＯｓｍまで、約０．５ｍＯｓｍから約２．０ｍＯｓｍまで、または約０．５ｍＯｓｍから約４．０ｍＯｓｍまでに及ぶ。

一実施形態において、限外濾過は、０℃から約５０℃の温度にて、または周囲温度、例えば約１５℃から約３０℃にて行う。

一実施形態において、リンカー含有オリゴヌクレオチドの限外濾過は、約１ｋＤから約１０ｋＤの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有するメンブレンを使用して行う。また別の実施形態において、限外濾過は、１ｋＤメンブレン、２ｋＤメンブレン、３ｋＤメンブレン、５ｋＤメンブレン、８ｋＤメンブレンまたは１０ｋＤメンブレンを使用して行う。別の実施形態において、限外濾過は、約１ｋＤから約５ｋＤまたは約３ｋＤから約５ｋＤの分子量カットオフを有するメンブレンを使用して行う。また別の実施形態において、限外濾過膜は、リンカー含有オリゴヌクレオチドの分子量より小さい分子量カットオフを有する。

一実施形態において、最終透過物の最終導電率は約５０μＳ／ｃｍ以下である。別の実施形態において、最終透過物の最終重量オスモル濃度は、約１．０ｍＯｓｍ以下である。

一実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの濃縮は、リンカー含有非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの限外濾過によって行う。さらなる実施形態において、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの濃縮は、蒸留によって行う。

一実施形態において、ＰＡＯコンジュゲートオリゴヌクレオチドの製造方法は、ポリアルキレングリコール前駆体部分をリンカーコンジュゲート非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドのリンカーにコンジュゲートすることをさらに含む。別の実施形態において、ポリアルキレングリコール前駆体は、ポリエチレングリコールである。

一実施形態において、ＰＡＯコンジュゲートオリゴヌクレオチドを製造する方法は、イオン交換クロマトグラフィーによるＰＡＯコンジュゲートオリゴヌクレオチドの精製をさらに含む。一実施形態において、イオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換ＨＰＬＣである。

一実施形態において、ＰＡＯコンジュゲートオリゴヌクレオチドを製造する方法は、イオン交換クロマトグラフィーからの溶離液の限外濾過による精製をさらに含む。一実施形態において、ＰＡＯコンジュゲートオリゴヌクレオチドを製造する方法は、限外濾過による濃縮をさらに含む。一実施形態において、ＰＡＯコンジュゲートオリゴヌクレオチドを製造する方法は、限外濾過による精製の前にアニオン交換精製を用いない、ＰＥＧ化混合物の限外濾過による精製を含む。

一実施形態において、ＰＡＯコンジュゲートオリゴヌクレオチドは、蒸留により濃縮する。

一実施形態において、ＰＡＯコンジュゲートオリゴヌクレオチドを製造する方法は、ＰＡＯコンジュゲートオリゴヌクレオチドをフリーズドライすることをさらに含む。

オリゴヌクレオチド組成物の合成および製造の工程を示す。 オリゴヌクレオチドのＰＥＧ部分へのリンカー部分を介したコンジュゲーションを示す。 オリゴヌクレオチドのＰＥＧ部分へのリンカー部分を介したコンジュゲーションを示す。 ＲＢ００６の構造を示す。 ＲＢ００７の構造を示す。 ＲＢ００６およびＲＢ００７によって形成された複合体を示す。 オリゴヌクレオチド組成物の合成および精製のための工程１の幾つかの実施形態を示す。 オリゴヌクレオチド組成物の合成および精製のための工程２の幾つかの実施形態を示す。 本明細書に記載する工程で見られた幾つかの不純物の構造を示す。 オリゴヌクレオチド組成物の合成および精製のための工程１および工程２の幾つかの実施形態を示す。 ＰＥＧ化反応混合物を分析するために行ったアニオン交換ＨＰＬＣ分析のスペクトルを示す。 ＰＥＧ化反応混合物の限外濾過の後に保持液を分析するために行ったアニオンＨＰＬＣのスペクトルを示す。 ＰＥＧ化反応混合物の限外濾過の後に透過物を分析するために行ったアニオンＨＰＬＣのスペクトルを示す。 ＰＥＧ化反応混合物の限外濾過の後に保持液を分析するために行ったイオン対ＨＰＬＣのスペクトルを示す。

後期臨床試験およびこれに続く商業マーケティングに対応するために必要とされる十分な量の薬剤を生成するために、生成物の品質を維持しながら、製造工程の堅牢性と収率を向上させるために、広範囲に及ぶ努力がなされている。さらに、全体の工程および品質をより良好に制御するために、主要な原料の厳密な制御が行われなければならない。

製造工程を通じて、様々なステップにおける生成物は、工程を通じて必要な品質および量を確保するために詳細にキャラクタリゼーションされる。このキャラクタリゼーションの結果として、さらなる開発および最適化から恩恵を受けることができる工程のステップを特定することが可能となる。

本明細書では、ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドアプタマーを製造するための、改良されたより効率的な方法の開発を開示する。驚くべきことに、ＰＥＧ化反応を行う前の、オリゴヌクレオチド不純物除去のためのアニオン交換クロマトグラフィーを省略すると、アニオン交換精製をＰＥＧ化反応前に行った場合に生成されたものと区別できない最終物質が生じることがわかった。ＰＥＧ化反応の前のアニオン交換精製が工程から省略され、リンカー含有および非リンカー含有オリゴヌクレオチドの未精製混合物を用いてＰＥＧ化反応が行われた場合に、リンカー含有オリゴヌクレオチドが維持されたことも予想外であった。さらに驚くべきことに、限外濾過により、アニオン交換精製でＰＥＧ化オリゴヌクレオチド生成物と共溶離する非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチド種を効率的に除去可能であることもわかった。

治療用オリゴヌクレオチドの製造は、オリゴヌクレオチド鎖の固相化学合成、粗オリゴヌクレオチドの切断および脱保護、分取アニオン交換クロマトグラフィーによる精製、脱塩と続いてのＰＥＧ化、未ＰＥＧ化オリゴヌクレオチド不純物および未反応ＰＡＯを除去するための分取アニオン交換クロマトグラフィーによるＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの精製、脱塩のための限外濾過ならびに最終生成物の濃縮および凍結乾燥を包含する多ステップ工程である。工程全体を図１の工程フローダイヤグラムに概略的に示す。

オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、当分野で周知であるように、スホルアミダイトまたはホスホロチオエートの化学作用によって行うことができる。合成は、活性化モノマーの伸長ポリマーへの連続カップリングを包含し、伸長ポリマーの１つの末端は固体支持体マトリクスに共有結合されている。固相手法によって、固相の簡単な溶媒洗浄による、合成での各ステップにおける反応生成物の精製が容易になる。オリゴヌクレオチドは、支持体結合分子の５’末端を脱保護すること、支持体結合分子を入来するテトラゾール活性化ホスホルアミダイトモノマーと反応させること、生じた亜リン酸トリエステルをリン酸トリエステルに酸化することおよび「欠失配列」を形成する次の入来モノマーとの非連続カップリングを防止するためにいずれの未反応ヒドロキシル基もアセチル化（キャッピング）によって遮断することによって、３’末端から５’’末端に向かって連続的に構築される。このステップのシーケンスは、全長オリゴヌクレオチドが合成されるまで、次のカップリング反応のために反復される。

生体内での安定性が向上した治療用オリゴヌクレオチドの生成では、オリゴヌクレオチドは、当業者に公知の多種多様の修飾を使用して合成される。例えばＣｏｏｋ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，６７０，６３３号明細書および同第６，００５，０８７号明細書は、ＲＮＡまたはＤＮＡ塩基配列に相補的である、熱安定性２’−フルオロオリゴヌクレオチドについて記載している。Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．による米国特許第６，２２２，０２５号明細書および同第５，７６０，２０２号明細書は、２’−Ｏ置換ピリミジンおよび修飾ピリミジンを含有するオリゴマーの合成について記載している。さらなる記載は米国特許第７，５３１，５２４号明細書に見られ、これの内容はこれの全体が参照により組み入れられている。

次に担体部分、例えばポリアルキレンオキシド分子へコンジュゲートさせるために、適切なリンカー部分を添加することによってオリゴヌクレオチドの合成を完了させてよい。例えばアミノリンカー、例えば図２に示すＣ６ヘキシルアミノリンカーは、合成したオリゴヌクレオチドの５’末端に付加されてよい。使用してよい他のリンカーは、以下に記載され、これに限定されるわけではないが：
構造：

の６−（トリフルオロアセトアミド）ヘキサノール（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト、
構造：

のＴＦＡ−アミノＣ４ ＣＥＤホスホルアミダイト、
構造：

の５’−アミノ修飾剤Ｃ３ ＴＦＡ、
構造：

の５’アミノ修飾剤５、
構造：

の５’アミノ修飾剤Ｃ１２、
構造

の５’−チオール修飾剤Ｃ６を含む。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、生体活性化合物にコンジュゲートされて「不活性」担体として作用して、潜在的に（１）循環中の化合物の半減期を延長すること、（２）化合物の分布パターンを変化させること、および／または（３）化合物をカムフラージュすることによって、免疫原性を低下させて、化合物を酵素分解から保護することができる。ＰＥＧは、サイズが５から２００ＫＤの範囲に及ぶことが可能であり、医薬製剤で使用される代表的なＰＥＧは、１０から６０ＫＤの範囲にある。約３０ＫＤまでの直鎖ＰＥＧを生成することができる。３０ＫＤを超えるＰＥＧの場合、複数のＰＥＧを共に結合して（マルチアームまたは「分枝」ＰＥＧ）、所望のサイズのＰＥＧを生成することができる。分枝「ｍＰＥＧ２」アタッチメント（アミノ酸を介して結合された２個のｍＰＥＧ）を有する化合物の一般的な合成は、Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：６２−６９に記載されている。「分枝」ＰＥＧ、即ち共通の反応性基に連結された１を超えるＰＥＧまたはｍＰＥＧを含む化合物では、ＰＥＧまたはｍＰＥＧＳは、アミノ酸、例えばリジンを通じて共に連結することができるか、またはこれらは例えばグリセリンを介して連結することができる。各ｍＰＥＧが約１０、約２０または約３０ＫＤである分枝ＰＥＧでは、総質量は約２０、約４０または約６０ＫＤであり、該化合物はこれの総質量によって呼ばれる（即ち４０ｋＤ ｍＰＥＧ２は、２個の連結された２０ｋＤ ｍＰＥＧである。）。４０ＫＤの総分子量のＰＥＧは、ＰＥＧ化化合物の生成での試薬として使用することができ、これに限定されるわけではないが、例えば、以下の構造の［Ｎ^２−（モノメトキシ２０Ｋポリエチレングリコールカルバモイル）−Ｎ^６−（モノメトキシ２０Ｋポリエチレングリコールカルバモイル）］−リジンＮ−ヒドロキシスクシンイミドが挙げられる：

安定化化合物を調製するために使用できる、さらなるＰＥＧ試薬としては、一般式：

の、４０ｋＤまたは６０ｋＤの総分子量を有する（各ｍＰＥＧが約２０または約３０ｋＤである場合）、他の分枝ＰＥＧ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）が挙げられる。

記載した化合物のためのＰＥＧ試薬としては、一般式：

の、ｍＰＥＧが約２０ｋＤまたは約３０ｋＤである、非分枝ｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオナート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）を挙げることができる。詳細な実施形態において、反応性エステルは、−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＣＯ_２−ＮＨＳである。

さらなるＰＥＧ試薬としては、グリコールを通じて連結された分枝ＰＥＧ：

一般式：

の非分枝スクシンイミジルアルファ−メチルブタノアート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）、
例えば以下の構造：

のニトロフェニルカーボネート連結ＰＥＧが挙げられる。

チオール修飾リンカーと共に使用できるチオール反応性基を有するＰＥＧとしては、ｍＰＥＧが約１０、約２０または約３０ｋＤである、一般構造：

の化合物が挙げられる。加えて、構造は、各ｍＰＥＧが約１０、約２０または約３０ｋＤであり、総質量が約２０、約４０または約６０ｋＤである

のように、分枝することも可能である。

分枝ＰＥＧとしては、一般構造：

の化合物も挙げられる。

ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを製造する改良工程の例として、ＲＢ００６として公知のＰＥＧ化アプタマー生成物の製造のための代わりの工程の説明を以下に記載する。ＲＢ００６は、オリゴヌクレオチドアプタマー：Ｐ−Ｌ−ｇｕｇｇａＣＵａＵａＣＣｇＣｇＵａａＵｇＣｕＧｃＣＵｃｃａｃＴを指し、ここでＰ＝ｍＰＥＧ２−ＮＨＳエステル、分子量４０ｋＤａ；Ｌ＝Ｃ６ ＮＨ_２リンカー；Ｇ＝２−ＯＨ Ｇ；ｇ＝２’−Ｏ−Ｍｅ Ｇ；Ｃ＝２−Ｆ Ｃ；ｃ＝２’−Ｏ−Ｍｅ Ｃ；Ｕ＝２−Ｆ Ｕ；ｕ＝２’−Ｏ−Ｍｅ Ｕ；ａ＝２−Ｏ−Ｍｅ Ａ；およびＴ＝反転２’−Ｈ Ｔ（図３Ａ、配列番号１を参照のこと）。ＲＢ００６は、ＲＥＧ１の薬品構成要素であり、凝固第ＩＸａ因子を高い親和性および特異性で結合する、直接ＦＩＸａ阻害剤である（米国特許第７，３０４，０４１号明細書およびＤｙｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１４：２４９０−９７（２００６）を参照のこと）。ＲＢ００６は、ＦＸのＦＸａへのＦＶＩＩＩａ／ＦＩＸａ触媒変換を遮断することによって抗凝固効果を誘発する。ＲＢ００６は、長さが３１ヌクレオチドの修飾ＲＮＡアプタマーであり、２’−フルオロおよび２’−Ｏ−メチル糖含有残基の存在によりエンドヌクレアーゼ分解に対して安定化され、３’反転デオキシチミジンキャップによりエキソヌクレアーゼ分解に対して安定化されている。アプタマーの核酸部は、これの血中半減期を延長するために、４０キロダルトンのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）担体にコンジュゲートされている。

ＲＢ００６の有利な特徴は、少なくともアプタマー部に相補的であることが可能な活性制御剤の投与によって、ＲＢ００６の生体内効果を逆転させる能力である。本開示の目的のために、ＲＢ００６の活性制御剤は、図３Ｂに示され、（５’−３’）配列：ｃｇｃｇｇｕａｕａｇｕｃｃａｃ（配列番号２）を有する、ＲＢ００７である。他の考えられる活性制御剤は：ｃｇｃｇｇｕａｕａｇｕｃｃｃｃａｕ（配列番号３）；ｃｇｃｇｇｕａｕａｇｕｃｃｃ（配列番号４），ｃｇｃｇｇｕａｕａｇｕｃｃａｕｃ（配列番号５），ｃｇｃｇｇｕａｕａｇｕｃａｇ（配列番号６）、ｃｇｃｇｇｕａｕａｇｕｃａｇｇ（配列番号７）、ｃｇｃｇｇｕａｕａｇｕｃａｇａｇ（配列番号８）もしくはｃｇｃｇｇｕａｕａｇｕｃｃｕｃａｃ（配列番号９）を含む、オリゴヌクレオチド（５’−３’）配列またはこれのいずれかの修飾もしくは誘導体であってよい。ある実施形態において、活性制御剤は、上の配列の１つより本質的に成り、または上の配列の１つより完全に成る。

ＲＢ００７は、ＲＢ００６に効果的に結合して、よってＲＢ００６の抗ＦＩＸａ活性を中和することができる。一実施形態において、ＲＢ００７の２’−Ｏ−メチル修飾は、分子に中程度のヌクレアーゼ耐性を与え、この耐性は分子がＲＢ００６を探して結合できるようにするのに十分な生体内安定性を提供するが、生体内持続性の延長には対応しない。

現在説明している製造方法がいずれのオリゴヌクレオチドまたはアプタマーにも適用できることが理解される。本明細書に開示する方法を使用してＰＥＧ化形で調製できる、さらなるアプタマーおよびオリゴヌクレオチドの例を、下の表１および２に記載する。

ＧＰＶＩならびに他の治療用アプタマーに結合してこれを調節するＲＢ００６、ＲＢ００７、アプタマーに関連するさらなる教示は、米国特許第７，３００，９２２号明細書；同第７，３０４，０４１号明細書、同第７，３１２，３２５号明細書；および同第７，５３１，５２４号明細書ならびに米国特許出願公開第２０１０／０３１１８２０号明細書に見出すことができ、これらの内容は、これらの全体が参照により本明細書に組み入れられている。

本発明から逸脱することなく多様な変更および修飾を行えることが当業者に明らかであるため、ＲＢ００６を製造するための２つの方法が例証の目的で本明細書に記載されているが、範囲が制限されることを意図するものではない。さらに、下に記載する方法は、上述したように、他の治療用アプタマーならびにアプタマーを結合するオリゴヌクレオチドに使用できる。２つの製造方法は、工程１および工程２と呼び、以下で詳細に説明する。

表３には、工程１および工程２によるＲＢ００６の製造で使用する原料を挙げる。いずれの置換も重要と見なされないのは、試薬の化学反応性が同等であり、変化の影響として生成されたＡＰＩの品質に対する影響は予想されないためである。

工程１
ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの１つの調製方法は、２つのアニオン交換精製ステップを含む。この工程は、本明細書では工程１と呼び、図４Ａに概略を示し、５つの段階で説明する。段階１は、固体支持体上での合成および脱保護である。段階２は、ＰＥＧ化のためのオリゴヌクレオチドを調製する工程を含み、アニオン交換ＨＰＬＣによる精製を含む。精製はナトリウムカチオンを使用して行うため、精製ステップにより、アンモニウム塩およびアルキルアンモニウム塩とナトリウムとの塩交換も生じる。該段階における最終ステップは、ＰＥＧ化反応前のオリゴヌクレオチドの脱塩である。段階３は、ＰＥＧ化およびＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの形成を含む。段階４は、アニオン交換ＨＰＬＣによる精製および段階５でのフリーズドライ前の脱塩ステップを含む。

工程１、段階１
段階１は、ＲＢ００５の固相合成と、続いての切断および脱保護を含んでいた。固相合成による３１塩基オリゴヌクレオチドの構築の間に、カップリング反応の最終ステップは、ＰＥＧ化のための部位特異的結合を提供するヘキシルアミノリンカーの付加である（図２Ａを参照のこと）。ＰＥＧ化前のヘキシルアミノリンカーを有する生じた全長生成物を、非ＰＥＧ化アプタマー（ＲＢ００５）と呼ぶ。粗オリゴヌクレオチドのキャラクタリゼーションによって、２つのクラスの不純物が明らかになった。第１のクラスは、ヘキシルアミノリンカーが欠如しているために非ＰＥＧ化性である。第２のクラスはＰＥＧ化可能であり、ヘキシルアミノリンカーを含有する。非ＰＥＧ化性不純物のキャラクタリゼーションによって、どちらもヘキシルアミノリンカーを含有する、より短い（Ｎ−１）およびより長い（Ｎ＋１）配列が明らかになった。加えて、非ＰＥＧ化アプタマーに密接に関連した分子量を有するＰＥＧ化性不純物も検出された。これらの不純物は、Ｍ−ｘおよびＭ＋ｘと呼ばれ、ＭはＲＢ００５の分子量であり、ｘは分子量の減少または増大である。不純物が非ＰＥＧ化性であるか、またはＰＥＧ化性であるかをキャラクタリゼーションするために、２組の実験を行った。

リンカー不含有オリゴヌクレオチドが非ＰＥＧ化性であることを確認するために、ヘキシルアミノリンカーを用いずに合成した非ＰＥＧ化アプタマー形を用いて実験を行った。このリンカー不含有非ＰＥＧ化アプタマーをｍＰＥＧ２ ＮＨＳエステルと標準反応条件下で化合させると、ＰＥＧ化は示されなかった。粗合成においてＰＥＧ化可能である不純物を評価するために、モデル研究を行い、粗合成生成物ｍＰＥＧ２ ＮＨＳエステルの代用品を標準ＰＥＧ化条件下で反応させて、生成物の分子量を高速液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）によって決定した。代用のＮＨＳエステルは、ｍＰＥＧ２と同じコア構造を有し、同じ反応性を有することが予測されている。ＰＥＧの多分散性およびオリゴヌクレオチドからの電荷状態のために、ＲＢ００５（ＲＢ０６）に結合したｍＰＥＧ２では、同じキャラクタリゼーションを行うことができなかった。生じたキャラクタリゼーションによって、Ｎ−１、Ｍ−ｘ、Ｍ＋ｘおよびＮ＋１はＰＥＧ化性種と同定された。従って、続いて多様な製造段階にてＮ−１、Ｍ−ｘ、Ｍ＋ｘおよびＮ＋１種のレベルを評価することが、該工程のキャラクタリゼーションの焦点である。

オリゴヌクレオチドのキャラクタリゼーションによって、合成サイクルパラメータのさらなる最適化によって、Ｎ−１およびＮ＋１ＰＥＧ化性不純物のレベルがより低下する可能性があることが示唆された。

工程１、段階２
工程１においてＰＥＧ化の前に利用したアニオン交換精製ステップは、非ＰＥＧ化性およびＰＥＧ化性オリゴヌクレオチド不純物を除去して、脱保護ステップから試薬を除去することが予想された。しかし精製前後のサンプルの広範囲にわたる分析により、驚くべきことに、この精製ステップは、薬剤物質の最終品質に影響を及ぼすオリゴヌクレオチド不純物の除去では、部分的にのみ有効であることが指摘された。分析ではＬＣ−ＭＳおよびクロマトグラフィー技法の両方を利用した。

利用したＬＣ−ＭＳ法により、相対イオンカウント％に基づく半定量的データが与えられる。このＬＣ−ＭＳ法による分析により、アニオン交換の結果として、非ＰＥＧ化アプタマーの純度に有意差がないことが確認された。表４に与えたデータは、アニオン交換精製の前後で不純物の分布にわずかな変化があること、しかし全体の純度は比較可能であることを示している。アニオン交換精製後のＭ−ｘ工程関連の不純物の増加と、これに対応するＭ＋９８、Ｎ−１およびＮ＋１不純物の減少がある。Ｍ−ｘ不純物のより詳細な議論を以下で与える。

要約すれば、非ＰＥＧ化アプタマーの合成後の、しかしＰＥＧ化前のアニオン交換ＨＰＬＣは、非ＰＥＧ化アプタマーの品質を最小限改善したと思われる。さらに、ＰＥＧ化ステップに向けて行われた非ＰＥＧ化アプタマーの品質のいずれの有意な改善も、おそらく精製によってではなく、合成品質の継続的な改善によって達成できると考えられる。

工程１、段階３
工程１において、ＰＥＧ化反応を、非ＰＥＧ化アプタマー各当量に対してｍＰＥＧ２ ＮＨＳエステル２当量を使用してアセトニトリルおよびホウ酸三ナトリウムの水性混合物中で行った。この反応は十分であると思われたが、ＰＥＧ化アプタマー（ＲＢ００６）の生成に必要なこの試薬の当量数を減少させるための開発努力が行われ、これにより下流処理の間に除去される未反応ｍＰＥＧ２のレベルが最小化される。ＰＥＧ化速度は、ｐＨ、ｍＰＥＧ２ ＮＨＳエステルの溶解度、非ＰＥＧ化アプタマーの溶解度および反応中に存在する水の量によって変わる。水が多すぎると反応性ＮＨＳエステルの加水分解が生じ、少なすぎるとオリゴヌクレオチドの沈殿が生じる。これらの条件のいずれも薬剤物質の品質に影響を及ぼさないが、ＰＥＧ化反応の効率は損なわれる。

工程１、段階４
工程１で使用したＰＥＧアプタマーのアニオン交換精製は、この精製が過剰なｍＰＥＧ２および非ＰＥＧ化性不純物を除去する能力を評価された。ｍＰＥＧ２の非アニオン性の性質によって、アニオン交換カラムが非反応性ｍＰＥＧ２を効率的に除去できるようになる。短い非ＰＥＧ化性オリゴヌクレオチド不純物は、段階２のアニオン交換ステップ中に除去された。段階２で除去されなかった、非ＰＥＧ化アプタマーに密接に関連する非ＰＥＧ化性オリゴヌクレオチド不純物が、分取アニオン交換精製により段階４で効果的に除去されるのは、ＰＥＧ化アプタマーのＰＥＧ部分によって、ＰＥＧ化アプタマーが非ＰＥＧ化アプタマーに密接に関連する非ＰＥＧ化性オリゴヌクレオチド不純物よりもはるかに早く溶離されるためである。

バイアル内でＲＢ００６をフリーズドライするための包装要件に対応するためのＰＥＧ化アプタマーのさらなる濃縮は、水の蒸留によって達成された。

工程１、段階５
凍結および１次乾燥のための適切な貯蔵温度を決定するために、ＰＥＧ化アプタマーの生理化学的特徴をフリーズドライ工程のスケールアップの一環として評価した。

工程２
工程１の多様な段階のキャラクタリゼーションに基づいて、後述のようにＰＥＧ化アプタマー製造の効率を上昇させるための変化を施した。工程１および工程２の並列比較を図４Ｂに示す。

工程２の製造工程を再び５段階で説明する。段階１は、固体支持体上での合成および脱保護である。段階２は、ＰＥＧ化のための非ＰＥＧ化アプタマーを調製する工程を含み、ＰＥＧ化反応の前の限外濾過による生成物の脱塩を含む。段階３は、ＰＥＧ化およびＰＥＧ化アプタマーの形成を含む。段階４は、アニオン交換ＨＰＬＣによる精製ならびに段階５でのフリーズドライ前の限外濾過を使用する精製および脱塩を含む。

工程２、段階１
工程１では、非ＰＥＧ化アプタマーの合成を３ｍｍｏｌスケールで行った。臨床研究および商業化の可能性のための物質要件により、工程２のスケールを拡大する必要があった。工程２における合成は、１０および２０ｍｍｏｌで行い、開発過程を通じて２５０ｍｍｏｌスケールおよび３００ｍｍｏｌ、３５０ｍｍｏｌまたは４００ｍｍｏｌスケールなどのさらなるスケールアップが可能である。工程２では、より大規模なスケールの合成装置を利用した。合成の化学経路は、開始モノマーと共に不変のままであった。合成段階での純度は、工程１で達成された純度と比べて上昇した。表５に、合成のスケール、アニオンＨＰＬＣによる純度およびＯＤ／ｍｍｏｌで報告された全長生成物（ＦＬＰ）の収率をまとめる。使用目的および製造工程も示す。スケールアップ手順からの物質は、より小規模なスケールで生成した物質に匹敵する。粗品質は、前の臨床ロットと比較して、ロット＃５で６％高かった。

工程２、段階２
工程１では、アニオン交換クロマトグラフィーを使用して非ＰＥＧ化性不純物を除去して、脱保護反応からのアミン塩をナトリウム塩と交換した。工程２では、非ＰＥＧ化性不純物を段階４でアニオン交換と限外濾過の組合せによって除去した。表６において、非ＰＥＧ化性不純物の除去工程を比較する。

オリゴヌクレオチドの溶液を限外濾過メンブレンに通過させることによって限外濾過を行い、これにより合成および切断および脱保護からの残留物として存在し得る低分子量不純物、例えばアンモニウムおよびアルキルアンモニウム塩および溶媒がメンブレンを通過し、オリゴヌクレオチドはメンブレンを通過せずに保持される。限外濾過は、より低い分子量の不純物の、オリゴヌクレオチドに対する比を低下させる役割を果たす。限外濾過は、限外濾過メンブレンを通過する量を置き換えるための新たな溶媒（一般に水）を添加すること、または通過した量よりも少ない水を添加することによらずに、溶液中のオリゴヌクレオチドの濃度を上昇させるような方法で操作することができる。または、メンブレンを通過した溶媒と同等のまたはより多い量の溶媒を添加することが可能である。溶液は一般に、圧力上昇によって限外濾過膜を強制的に通過させられる。

限外濾過ステップは、望ましいナトリウム塩形のオリゴヌクレオチドを形成するためにおよびアルキルアンモニウムを含む、いずれの残留アンモニウムイオンも移動させるために、ナトリウム塩水溶液、例えばナトリウムクロリド溶液の存在下で行ってよい。

必要に応じて、複数回の限外濾過を行ってもよい。幾つかの実施形態において、限外濾過は、精製水の存在下で、特に限外濾過ステップの後にナトリウム塩の存在下で行う。精製水を用いた限外濾過は、一般に、オリゴヌクレオチドからアンモニウムおよび残留無機ナトリウム塩が実質的になくなるまで行う。

残留イオンの濃度は、導電率測定によって監視することが多く、最終透過物中の値は、７５μＳ／ｃｍ未満、５０μＳ／ｃｍまたは４０μＳ／ｃｍ未満、または約２０μＳ／ｃｍから約５０μＳ／ｃｍに及ぶ。別の実施形態において、最終透過物の最終重量オスモル濃度は、約４ｍＯｓｍ以下、約２ｍＯｓｍ以下、約１ｍＯｓｍ以下であり、約０．００１から約１．０ｍＯｓｍの、約０．５ｍＯｓｍから約２．０ｍＯｓｍの、または約０．５ｍＯｓｍから約４．０ｍＯｓｍの範囲に及ぶ。

上述の工程で使用した限外濾過メンブレンは、オリゴヌクレオチドの分子量よりも低くなるように選択された分子量カットオフを有することができる。アルキルアンモニウムイオンを溶液から除去することが望ましい実施形態において、アルキルアンモニウムイオンの分子量よりも高い分子量カットオフを用いてよい。多くの実施形態において、例えばおよそ４．５から１２ｋＤの分子量を有する代表的な１５から４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドによって、１ｋＤから３ｋＤの範囲の分子量カットオフが用いられる。

本発明による工程は、０℃から約５０℃の温度にて、または周囲温度、例えば約１５℃から約３０℃にて行うことが多い。

工程２の段階４で非ＰＥＧ化性不純物のアニオン交換精製を行うための根拠は、ｍＰＥＧ２ ＮＨＳエステルのヘキシルアミノリンカーとの反応の特異性によって左右される。合成の初期品質の改善およびＭ−ｘ不純物の減少は、ＬＣ−ＭＳ分析によって裏付けられる。工程２は、工程１と比較して、非ＰＥＧ化アプタマーの全体の品質を維持する。

工程間非ＰＥＧ化アプタマーについて生成されたデータを表７にまとめる。非ＰＥＧ化の分子量は理論的分子量と一致し、観測値は両方の工程で一致している。配列決定データにより、工程２は予想された配列に影響を及ぼさないことが指摘されている。工程１および工程２から生成された物質の純度をこの段階で直接比較できないのは、工程１のアニオン交換ステップで除去した不純物が工程２で存在しているためである。工程２において、不純物は段階４の終わりに除去される。

上で論じたように、ヘキシルアミノリンカーを含有する不純物のみがＰＥＧ化性であり、工程１のアニオン交換精製ステップは、これらの不純物の除去に対して有する影響は最小限であった。ＬＣ−ＭＳ分析を使用して、この段階の工程１および工程２によって生成された物質中に存在するＰＥＧ化性不純物を同定および比較した。利用したＬＣ−ＭＳ法により、相対イオンカウント％に基づく半定量的データが得られる。ＬＣ−ＭＳデータにより、工程１および工程２からのＰＥＧ化生成物中に同じタイプの不純物が予想されることが示された。表８に、ＰＥＧ化性不純物の算出質量および暫定的同一性を工程１および工程２の両方の相対的な純度レベルと共に示す。表８に、工程１および工程からの相対的な２Ｎ−１、Ｍ−ｘ、非ＰＥＧ化アプタマー、Ｍ＋ｘおよびＮ＋１種をまとめる。Ｍ−ｘおよびＭ＋ｘという呼称は、非ＰＥＧ化アプタマーに質量で密接に関連している不純物を指し、Ｍは非ＰＥＧ化アプタマーの質量であり、ｘは質量の損失または増加である。Ｎ＋１およびＮ−１という呼称は、追加のヌクレオチドが１個存在する種、またはヌクレオチドが１個消失した種のどちらかを指す。非ＰＥＧ化性不純物は反応しないことが示されているため、これらは分析に含めず、データを非ＰＥＧ化アプタマーに関して正規化する。

不純物
両方の工程において、ヘキシルアミノリンカーを含有するＮ＋１およびＮ−１不純物が観測された。不純物のＮ＋１ファミリは二重カップリングから、Ｎ−１ファミリは内部欠失から生じる。Ｍ−９４、Ｍ−５２およびＭ−２０種は、製造工程中に起こる２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンの修飾と一致している。熱および塩基性ｐＨによる溶解は、これらの不純物のレベルを上昇させることが示されている。工程に関連する不純物の分子量（Ｍ−ｘ）は、以下の構造と一致している：

種は、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンの分解と一致している。

工程１において、不純物のＭ＋９８は、リンカー出発物質に関連する不純物と一致している。出発物質の不純物は、２官能性ヘキシルアミノリンカーホスホルアミダイトと暫定的に同定された。工程１では、この不純物は、ＰＥＧ化の前に分取アニオン交換精製によって除去した。工程２では、以後、出発物質中のこの不純物の制御のためにガスクロマトグラフィー／ＦＩＤ ＱＣ法が行われてきた。この不純物は、原料段階で良好に制御され、工程２によって生成されたいずれのバッチにも存在していない。

要約すれば、まとめたＬＣ−ＭＳおよびクロマトグラフィーデータにより、精製工程から生じたＭ−ｘＰＥＧ化性不純物の減少および第１のアニオン交換精製ステップが除去されたときにＮ−１およびＮ＋１の最小限の増加があることが示されている。ＬＣ−ＭＳによるバッチ分析を表８に示す。同様に、工程２によって生成された臨床バッチ中に存在するすべての不純物は、以前のバッチに同等のまたはより低いレベルで存在している。工程２から生成された物質のＬＣ−ＭＳによる全体の純度は、工程１よりも良好である。

工程１において、アニオン交換精製を使用して、精製ステップ中に塩交換を行い、粗非ＰＥＧ化アプタマーから１級アミンを除去した。アミン塩の存在下ではコンジュゲーションが進行しないため、これは重要な操作である。１ｋＤ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）メンブレンを使用して限外濾過を行った。工程２では、非ＰＥＧ化性不純物の除去を段階４に移したため、ナトリウムクロリドに対するダイアフィルトレーションを含むように限外濾過ステップを変化させて、効率的なＰＥＧコンジュゲーションに必要な塩交換を行った。加えて、１ｋＤメンブレンを５ｋＤ ＭＷＣＯメンブレンに代えて、流束速度を改善した。

工程２、段階３
工程１において、非ＰＥＧ化アプタマー各当量に対してＰＥＧ−ＮＨＳエステル２当量を使用し、ＰＥＧ化反応を、アセトニトリルおよびホウ酸三ナトリウムの混合物中で行った。ＰＥＧ化アプタマーの生成に必要なこの試薬の当量数を減少させるための開発努力を行った。反応時間、温度、ｐＨ、ＰＥＧ−ＮＨＳ当量および溶媒を含む、ＰＥＧ化のための多種多様の条件を評価した。研究の結果により、ＰＥＧ化効率が異なる条件によって変化したが、生成されたＰＥＧ化生成物の不純物プロフィールは一定のままであることが示唆された。工程２において、ＡＣＮ：ＤＭＳＯおよびホウ酸三ナトリウムの混合物中でＰＥＧ−ＮＨＳエステル１．５−１．７５当量を使用して、ＰＥＧ化アプタマーを生成する。新たなＰＥＧ化条件の特異性を非リンカー含有非ＰＥＧ化アプタマーおよびｍＰＥＧ２ ＮＨＳエステルを用いて評価した。先に論じたように、リンカーなしのアプタマーは、ＰＥＧ化条件下では非反応性であった。工程１に対する工程２によって生成された工程間物質の比較は、工程２に存在する非ＰＥＧ化性不純物により複雑である。非ＰＥＧ化性不純物を段階４で除去する。従って、２つの工程を使用して生成した物質の直接比較は、段階３では不可能であった。結果として、両方の工程によって生成された物質の品質の比較は、上述のようなバッチ履歴、表１０およびさらなる分析キャラクタリゼーションに示したデータの検討によって達成される。

工程２、段階４
製造工程１において、段階４の精製のための分取アニオン交換ＨＰＬＣ条件は、段階２の間に用いた条件と同様であった。製造工程２において、段階４での精製条件は、工程１で使用した条件から最適化した；変化は、精製のための勾配の調節および段階３から生じた反応混合物の添加より成っていた。工程２で生成された工程間物質の工程１との比較は、非ＰＥＧ化性不純物が存在することによって複雑であり、このため２つの工程を使用して生成した物質の直接比較は行わなかった。

製造工程１において、ＰＥＧ化後の限外濾過は、５ｋＤ ＭＷＣＯメンブレンを使用して行った。工程１での限外濾過ステップの主要な役割は、フリーズドライ前にＲＢ００６を脱塩および濃縮することであった。工程２において、すべての非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドがフリーズドライ前に除去されるように、ＭＷＣＯメンブレンを１０または３０ｋＤに変化させた。加えて、分子量カットオフのこのような上昇により、ダイアフィルトレーション中の流束速度が改善するという利点が加わる。製造工程２の開発で重要な要素は、工程の非ＰＥＧ化性不純物を除去する機能を評価することであった。これらの不純物の大部分はＰＥＧ化アプタマーのアニオン交換精製で除去されるが、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドがＰＥＧ化生成物と共溶離して、最終ＡＰＩまで搬送できる可能性がある。３０ｋＤ ＭＷＣＯメンブレンが２ｋＤ−１０ｋＤの非ＰＥＧ化性不純物を除去可能な範囲の試験を行うために、段階３からのＰＥＧ化反応混合物を、通常の精製工程を受けさせずに、３０ｋＤ ＭＷＣＯメンブレンに添加した。工程２に対する評価工程の概略図を図６に示す。

ＡＸ−ＨＰＬＣ アニオン交換ＨＰＬＣ）を使用して、ＰＥＧ化反応混合物、ＵＦ透過物溶液およびＵＦ透過物溶液を分析した。結果を図７から図９に示す。限外濾過後の物質の分析ＨＰＬＣによって、工程がＰＥＧ化アプタマーと共溶離する種を含む非ＰＥＧ化性不純物を除去する能力が明らかに示されている。図７に非精製ＰＥＧ化反応混合物を示す。ＰＥＧ化アプタマーの保持時間は１４．３分である。１９−２０分の保持時間は、およそ１０，０００ｋＤの分子量を有する全長生成物（Ｎ−１、Ｎ−２．．．リンカーなし）に密接に関連する非ＰＥＧ化性不純物に相当する。図８には、保持液の分析により、ＰＥＧ化反応混合物からの多数の種が除去されることが示されている。１９−２０分の保持時間を有する不純物は、ＵＦ工程によって除去される。加えて、図９には、透過物の分析を示す。透過物は、ＰＥＧ化アプタマーに似た保持時間を持つ非ＰＥＧ化性種も除去されることを示している。ＩＰ−ＨＰＬＣおよびＡＸ−ＨＰＬＣは、限外濾過工程中に非ＰＥＧ化性不純物の除去を監視するために組合せて使用される。

製造工程での１０ｋＤ ＭＷＣＯの使用を評価するために、ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドをアニオン交換ＨＰＬＣ（工程の段階３）によって精製し、次に１０ｋＤメンブレンを使用して限外濾過を受けさせた。次に物質を分析ＩＰ−ＨＰＬＣによって分析し、この物質は非ＰＥＧ化およびＰＥＧ化オリゴヌクレオチドに対して選択的であった。非ＰＥＧ化性オリゴヌクレオチドは、２から６分の間で検出される。図１０は、非ＰＥＧ化性オリゴヌクレオチドが存在しないこと、ならびにＨＰＬＣ精製および１０ｋＤメンブレンを利用する工程によって非ＰＥＧ化性オリゴヌクレオチドが除去されることを示している。

段階４の終わりに工程２によって生成された物質の純度は、工程１によって生成された物質の純度に匹敵している。

工程２、段階５
工程１において、ＰＥＧ化アプタマーを個々のバイアル中でフリーズドライした。工程２において、ｐＲＢ００６の物理的キャラクタリゼーションに基づいてフリーズドライのパラメータを最適化し、リオガードトレーを使用して物質をバルクでフリーズドライした。リオガードトレーの使用および生理化学的キャラクタリゼーションによって、バイアル中でのフリーズドライに対応するために必要とされるよりも低い濃度でＰＥＧ化アプタマーをフリーズドライすることが可能となった。各変化の根拠および生成物の品質に対する変化の潜在的影響について論じる。変化は、生成物の品質にほとんどまたは全く影響を及ぼすことなく、より強力な工程、スケールアップの可能性、より高い製造柔軟性および作業者の安全性に適応するように行った。工程１を使用して生成した物質および工程２を使用して生成した物質は、品質仕様を満足し、同様の不純物プロフィールを含有し、全体的な純度は同様であった。工程２を開発するために工程１の全５段階で行った変化により、生成物の品質は維持または改善されると同時に、スケールアップの容易さおよび実現可能性が高まった。

方法は、アニオン交換ＨＰＬＣ、イオン対クロマトグラフィー逆相ＨＰＬＣおよび２カラムＧＰＣによる分析を含む。改善されたアニオン交換方法では、トリス緩衝剤／アセトニトリル／メタノール／ｐＨ８システムおよびナトリウムクロリド勾配、ディオネックスＤＮＡＰａｃ ＰＡ−１００（４×２５０ｍｍ）カラムを４０℃にて１．５ｍＬ／分のフローで使用する。２５９ｎｍにおいて検出する。該方法は、幾つかの合成により調製されたＮ＋１およびＮ−１ ＰＥＧ化不純物、ＲＢ００６切断生成物ならびに２０ｋＤａおよび３０ｋＤａ種によってＰＥＧ化されたＲＢ００６を分割することが示されている。該方法は、公称濃度（２．０ｍｇ／ｍＬ）の５０％−１２０％および０．１％−１０％の範囲にわたって線形である。改善された２カラムＧＰＣ方法は、直列にしたウォーターズウルトラハイドロゲル１０００および５００（７．８×３００ｍｍ）カラムおよび２０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ７．４を、周囲温度にて０．４ｍＬ／分のアイソクラティック溶離により使用する。検出は、蒸発光散乱（５０℃ドリフト管、４０ ＰＳＩ窒素、ＥＳＩ冷却）および２５９ｎｍのＵＶによる。該方法は、分子量決定のために７２ｋＤａから１２ｋＤの範囲に及ぶ、一連のポリエチレンオキシドおよびポリエチレングリコール標準を利用する。該方法は質量範囲にわたって線形であり、検出限界は０．２％である。ＲＢ００６の改善されたイオン対ＨＰＬＣ（ＩＰ−ＨＰＬＣ）分析は、３５℃のカラム温度にて、ｐＨ８．５の、移動相Ａ：１００ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７．２、５％メタノールおよび移動相Ｂ：１００ｍ ＴＥＡＡ、ｐＨ ７．２、５０％アセトニトリル、３０％イソプロパノールの勾配を用いて、ウォーターズエクスブリッジＢＥＨ３００ Ｃ４（４．６×１００ｍｍ、３．５μｍ）カラムを使用して行う。流速は１．０ｍＬ／分であり、検出は２５９ｎｍのＵＶによる。

別途定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって普通に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと類似したまたは同等のいずれの方法および物質も本発明の実施または試験で使用できるが、例示的な方法および物質をここで記載する。本明細書で言及したすべての刊行物は、刊行物が関連して引用される方法および／または物質を開示および記載するために、参照により本明細書に組み入れられている。

Claims (11)

1. 治療用ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを調製する方法であって、
   （ａ）固体支持体上で非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを合成するステップ、
   （ｂ）固体支持体から非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを切断するおよびオリゴヌクレオチドを脱保護するステップ、
   （ｃ）限外濾過を使用して非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを脱塩するステップ、
   （ｄ）ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを生成するために非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドをＰＥＧ化するステップ、
   （ｅ）アニオン交換ＨＰＬＣを使用してＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを精製するステップならびに
   （ｆ）限外濾過を使用してＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを脱塩およびさらに精製するステップを含み、
   非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドのイオン交換精製がステップ（ｂ）と（ｃ）の間で行われる、方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、（ｇ）最終生成物をフリーズドライするステップをさらに含む、方法。
3. 請求項１に記載の方法であって、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドが２次構造を含む、方法。
4. 請求項３に記載の方法であって、２次構造がステムおよびループを含む、方法。
5. 請求項１に記載の方法であって、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドが修飾ヌクレオチドを含む、方法。
6. 請求項５に記載の方法であって、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、方法。
7. 請求項５に記載の方法であって、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドが２’−フルオロ修飾ヌクレオチドを含む、方法。
8. 請求項１に記載の方法であって、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドがステップｄの前にリンカーにカップリングされる、方法。
9. 請求項１に記載の方法であって、非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドがＲＢ００５を含む、方法。
10. 請求項１に記載の方法であって、ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドがＲＢ００６を含む、方法。
11. 請求項１に記載の方法であって、ステップ（ｆ）が約１０ｋＤから約２０ｋＤまたは約２０ｋＤから約３０ｋＤの分子量カットオフを有する限外濾過膜を使用する、方法。

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